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伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法和应用

阅读：576发布：2021-06-03

专利汇可以提供伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种伪狂犬病毒基因缺失株，该基因缺失株是由野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列缺失若干个碱基引起阅读框移码突变而构建成的伪狂犬病毒gE基因缺失株。本发明还公开了一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：构建伪狂犬病毒gE基因缺失株；训化猪睾丸细胞并将其悬浮培养；接种伪狂犬病毒gE基因缺失株，当细胞有80％-90％以上病变时，收获细胞培养物，得含上清液的细胞毒液；取上清液测定毒价，将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内灭活；灭活后的细胞毒液与佐剂混合，得猪伪狂犬病灭活疫苗。本发明制备的猪伪狂犬病灭活疫苗，免疫原性好、免疫周期长，免疫后无副反应、安全可靠，能有效保护伪狂犬病毒流行株的感染。，下面是伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述基因缺失株是由野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列缺失若干个碱基引起阅读框移码突变而构建成的伪狂犬病毒gE基因缺失株。
2.根据权利要求1所述的伪狂犬病毒基因缺失株，其特征在于，所述基因缺失株的gE基因序列是在SEQ ID NO.1所示野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列上缺失第829-830位AG两个碱基的核酸序列。
3.一种猪伪狂犬病灭活疫苗，其特征在于，以权利要求1或2所述伪狂犬病毒基因缺失株为种毒而制成。
4.一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建伪狂犬病毒gE基因缺失株；
(2)训化猪睾丸细胞并将其悬浮培养；
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(3)当猪睾丸细胞密度达到3*10个/ml以上时，接种伪狂犬病毒gE基因缺失株，当所述猪睾丸细胞有80％-90％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融2次以上，得到含上清液的细胞毒液；
(4)取上清液测定毒价，然后将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入灭活剂，充分摇匀，灭活；
(5)将步骤(4)灭活后的细胞毒液与佐剂混合均匀，得到猪伪狂犬病灭活疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中猪睾丸细胞悬浮培养的温度为36-37℃，溶解氧浓度为50％，搅拌速度为80-110r/min，pH为7.2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中灭活剂是重量百分浓度为35-38％的甲醛溶液，该步骤(4)中细胞毒液与甲醛溶液的体积比为100︰0.1～0.2，灭活温度为35～37℃，灭活时间为28～38小时。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的佐剂为MERCKINADE SDA 28佐剂。
8.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的权利要求1或2所述的伪狂犬病毒基因缺失株。
9.权利要求1或2所述的伪狂犬病毒基因缺失株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。
10.一种区分权利要求1或2所述伪狂犬病毒基因缺失株疫苗免疫与伪狂犬病毒野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含伪狂犬病毒gE蛋白抗体。

说明书全文

伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法

和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病毒基因缺失株、猪伪狂犬病灭活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 伪狂犬病(Pseudo rabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的发生于家畜及野生哺乳动物中以发热、奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎为主要症状的烈性传染病。该病是典型的自然疫源性疾病，猪是其主要宿主和传染源，给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟。在除猪以外的其他动物中，该病多以散发的形式发生，疾病发生以后，均以死亡而告终。

[0003] 由于伪狂犬病所引起的损失仅次于口蹄疫及猪瘟，己成为欧洲一些国家重点防疫的猪病之一，PR分布具有世界性，20世纪中期PR在东欧及巴尔干半岛的国家流行较广，60年代之前，猪被感染后其症状比较温和，在养猪业中未造成重大经济损失；60-70年代由于强毒株的出现，猪场爆发PR的数量显著增加，而且各种日龄的猪均可感染，其症状明显加剧，这种变化不仅存在于美国，在西欧各国如德国、法国、意大利、比利时、爱尔兰等国家也同样存，在几年之后此病相继传入新西兰、日本、我国的台湾及南美的一些国家和地区。而国内的情况是:60年代以前猪被感染后症状比较温和，病例也比较少见，70年代本病只有零星散发，80年代以后出现地方流行和零星散发流行；90年代则表现地方流行和暴发的趋势，由于强毒株的出现，猪场爆发PR的数量显著增加，症状明显加剧，现在已有40多个国家报道40多种动物感染该病，在我国已有24个省市报道发生此病。近几年PR在我国许多省(市)种猪场呈爆发流行趋势。

[0004] 伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。PRV gE基因的N端包含有机体免疫系统能识别的主要靶抗原，gE是PRV复制的非必需基因，已有研究表明，gE的缺失能降低病毒的嗜神经性且不影响其免疫原性。

[0005] 虽然目前国内伪狂犬病毒有许多分离株，但具有较强免疫原性伪狂犬病病毒的分离却不多，且不同的地区不同时间段分离的毒株也有些差异。具有较强免疫原性伪狂犬病病毒的分离，可以为研制伪狂犬病灭活疫苗打下良好基础，本实验室分离到的猪伪狂犬病病毒(PRV-sh株)就具有毒力强、免疫原性好等特点。

[0006] 由于伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)血清型单一、免疫原性高，使得疫苗接种成为控制PRV感染的一种行之有效的方法。目前研制的PRV疫苗有灭活疫苗与弱毒活疫苗，两者在临床应用时均有缺陷。灭活疫苗虽然安全性好，但它具有免疫效力不佳、接种剂量较大，而且在接种24小时后偶尔出现过敏反应等缺陷。在弱毒苗方面，各国培育的弱毒苗品系很多，最常用的为Bartha株、Bucharest株。弱毒疫苗免疫原性好，在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排出和形成潜伏感染，另外是否可造成毒力返强，还有待进一步研究。

[0007] 从2011年开始河南、河北、北京、山东，2012年江苏、安徽、上海、广东、广西以及2013年中东部数十省份的猪场陆续出现母猪返情、流产、死胎，小猪出现腹泻和神经症状，死亡率高，有的猪场育肥猪也发生死亡，经临床诊断和实验室检测确定为猪伪狂犬病，2014年全国多数省份也都爆发了猪伪狂犬病的流行。该病给猪场带来很大的经济损失，而且这次伪狂犬病发病程度也比以往发病程度要严重、来势更加凶猛。以前伪狂犬病表现为母猪流产，不孕，死胎多，哺乳仔猪多数一周内死亡，不咳嗽，其他猪正常；现在猪群哺乳前期正常，后期表现为腹泻等，死亡率高。最严重的表现为20日龄以后的猪，先咳后喘，流鼻涕流眼泪常被误认为气喘病或感冒；病毒能够导致育肥猪发病死亡，且育肥猪发病率和死亡率都远高于以往。现有的疫苗免疫不能提供完全保护，显示我国猪场中流行的PRV发生变异。为了有效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的PRV疫苗。

[0008] 2017年复旦大学华山医院感染科通报一起人感染PRV的病例，不仅检测到PRV抗体且序列测定显示，所得病毒株与中国近年来流行的PRV高毒力变异株高度同源；北京协和医院也通报了6例人感染PRV的病例。这些都提示了病毒变异所致人兽共患稳定病毒株形成的可能，再次证实了PRV对人类健康具有潜在的威胁。因此,提高对疱疹病毒引发人兽共患病的认识,及早建立相应预警机制,对有效防控疱疹病毒跨种间传播是必要的。

发明内容

[0009] 本发明要解决目前国内出现PRV变异株，而现有PRV疫苗对变异株保护效果差，亟需开发新的PRV疫苗的技术问题，提供一种伪狂犬病毒基因缺失株，该基因缺失株是由伪狂犬病毒流行毒株构建的gE基因缺失株，利用该基因缺失株制备的猪伪狂犬病灭活疫苗免疫原性好，免疫效果明显增强。

[0010] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

[0011] 在本发明的一个方面，提供了一种伪狂犬病毒基因缺失株，该基因缺失株是由野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列缺失若干个碱基引起阅读框移码突变而构建成的伪狂犬病毒gE基因缺失株。

[0012] 优选的，所述基因缺失株的gE基因序列是在SEQ ID NO.1所示野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列上缺失第829-830位AG两个碱基的核酸序列。

[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种猪伪狂犬病灭活疫苗，以上述伪狂犬病毒基因缺失株为种毒而制成。

[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0015] (1)构建伪狂犬病毒gE基因缺失株；

[0016] (2)训化猪睾丸细胞并将其悬浮培养；

[0017] (3)当猪睾丸细胞密度达到3*106个/ml以上时，接种伪狂犬病毒gE基因缺失株，当所述猪睾丸细胞有80％-90％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融2次以上，得到含上清液的细胞毒液；

[0018] (4)取上清液测定毒价，然后将检测合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入灭活剂，充分摇匀，灭活；

[0019] (5)将步骤(4)中灭活后的细胞毒液与佐剂混合均匀，得到猪伪狂犬病灭活疫苗。

[0020] 优选的，所述步骤(2)中猪睾丸细胞悬浮培养的温度为36-37℃，溶解氧浓度为50％，搅拌速度为80-110r/min，pH为7.2。

[0021] 优选的，所述步骤(3)接种的伪狂犬病毒gE基因缺失株，其毒价TCID50≥108.0/ml，并将该毒株的重量百分浓度稀释至0.05-0.2％。

[0022] 优选的，所述步骤(4)中灭活剂选自：甲醛溶液、β-丙内酯、或二乙烯亚胺溶液。

[0023] 更优选的，所述步骤(4)中灭活剂是重量百分浓度为35-38％的甲醛溶液，该步骤(4)中细胞毒液与甲醛溶液的体积比为100︰0.1～0.2，灭活温度为35～37℃，灭活时间为28～38小时。

[0024] 优选的，所述步骤(5)的佐剂包括铝胶佐剂、MERCKINADE SDA 28佐剂、206佐剂。

[0025] 更优选的，所述步骤(5)的佐剂为MERCKINADE SDA 28佐剂，所述细胞毒液与MERCKINADE SDA 28佐剂按重量比3-4︰1混合。

[0026] 在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，该组合物包含与佐剂或药用载体混合的上述的伪狂犬病毒基因缺失株。

[0027] 在本发明的另一方面，还提供了上述伪狂犬病毒基因缺失株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。

[0028] 在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒基因缺失株疫苗免疫与伪狂犬病毒野毒株感染的检测试剂盒，包含伪狂犬病毒gE蛋白抗体。

[0029] 通过检测感染猪体的gE抗体，能区分鉴别出本发明的伪狂犬病毒gE基因缺失株疫苗免疫与野毒株的感染。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0031] (1)配制疫苗用的毒株具有较强的毒力：伪狂犬病毒gE基因缺失株接种单层细胞后，一般可在18-24h出现细胞病变，细胞病变最明显的时期为接种后32-48h，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞圆缩、脱落；接种悬浮细胞后在50h左右收毒；伪狂犬病毒gE基因缺失株接种兔子后三十多小时兔子开始死亡，将毒株稀释107倍后接种兔子仍有半数以上死亡；

[0032] (2)配制疫苗用的毒株病毒效价高：伪狂犬病毒gE基因缺失株接种单层细胞后，其他毒株的病毒效价仅为107.0/ml而分离出的毒株(PRV株)的病毒效价可以达到108.0/ml，悬浮培养可达108.75/ml；

[0033] (3)猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫原性好：将繁殖的病毒灭活后配制成灭活疫苗，效果优于市场上现有的单相灭活疫苗，市场上现有的灭活疫苗使用传统病毒株制备，不能有效保护流行株的感染；

[0034] (4)安全性好：市场上现有的灭活疫苗使用的佐剂是油佐剂且油的成分大于41％，免疫猪时注射的阻力大，注射器的针筒和针头易于脱离造成免疫剂量不准确；对猪的应激反应比较大，尤其是对有着亚健康猪群的猪场；本发明使用的佐剂油的成分只占17％，易注射，免疫后无副反应；且免疫周期长，免疫猪后抗体可持续4个月；

[0035] (5)采用的制备方法工艺合理，价格较低，极大降低养殖业的成本负担。附图说明

[0036] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0037] 图1是本发明实施例1的Cas9/gRNA的活性检测结果图；

[0038] 图2是本发明实施例1的T7E1酶切鉴定突变毒株结果图；

[0039] 图3是本发明实施例1的T7E1酶切鉴定纯化后的突变毒株结果图；

[0040] 图4是本发明实施例1的测序结果比对图；

[0041] 图5是本发明实施例6的免疫猪PRV特异性抗体变化曲线图。

具体实施方式

[0042] 本发明的猪伪狂犬病灭活疫苗，采用构建的具有较强免疫原性的伪狂犬病毒gE基因缺失株，免疫效果好；在工艺生产中采用悬浮培养的病毒液生产工艺，提高了病毒的毒价；采用MERCKINADE SDA 28佐剂，不仅避免了现有油乳剂灭活疫苗在免疫后出现的不良反应，还提高了细胞免疫反应，增强了疫苗的免疫效果，同时降低了疫苗的免疫剂量。

[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

[0044] 实施例1伪狂犬病毒gE基因缺失株的构建

[0045] 设计针对PRV gE基因的gRNA，通过CRISPR/Cas9编辑系统成功编辑PRV gE基因，利用蚀斑纯化得到一株gE基因缺失的突变毒株，利用T7E1核酸酶酶切鉴定正确，并通过测序发现在设计位点上缺失了AG两个碱基，从而造成了阅读框的移码突变，成功构建了伪狂犬病毒gE基因缺失株。

[0046] 1.材料与方法

[0047] 1.1材料

[0048] 1.1.1种毒、细胞

[0049] 伪狂犬病毒PRV株由上海市农业科学院畜牧兽医研究所分离所得。ST细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存。

[0050] 1.1.2实验试剂及耗材

[0051] 猪伪狂犬病毒gB和gE抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。胎牛血清，胰酶和DMEN为Invitrogen公司产品。细胞培养耗材购自上海生工生物科技有限公司。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)购自天根生化科技(北京)有限公司。Cas9/gRNA构建试剂盒(VK001-02)，gRNA靶点效率试剂盒(VK007)，T7E1核酸酶均购自北京唯尚立德生物科技有限公司。

[0052] 1.2试验方法

[0053] 1.2.1 gE基因Cas9/gRNAs载体的构建

[0054] 利用在线gRNA设计网站(http://crispr.mit.edu/)设计4对针对PRV gE基因的gRNAs：

[0055] gRNA1：

[0056] F:5’-3’:CCCTGGCGCTCTCCACCG(SEQ ID NO.3)；

[0057] R:5’-3’:CGGTGGAGAGCGCCAGGG(SEQ ID NO.4)；

[0058] gRNA2:

[0059] F:5’-3’:CCTCAACGGCGACCTCGA(SEQ ID NO.5)；

[0060] R:5’-3’:TCGAGGTCGCCGTTGAGG(SEQ ID NO.6)；

[0061] gRNA3:

[0062] F:5’-3’:CGTTGAGGTCATCGTCGT(SEQ ID NO.7)；

[0063] R:5’-3’:ACGACGATGACCTCAACG(SEQ ID NO.8)；

[0064] gRNA4:

[0065] F:5’-3’:CGGACACGTTCACCAGAT(SEQ ID NO.9)；

[0066] R:5’-3’:ATCTGGTGAACGTGTCCG(SEQ ID NO.10)。

[0067] 利用商品化的CRISPR/Cas9构建试剂盒构建同时表达Cas9和gRNA的Cas9/gRNA载体。

[0068] 1.2.2病毒基因组的提取

[0069] 取200μL病毒悬液于1.5mL离心管中，反复冻融3次，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)说明书提取病毒DNA。

[0070] 1.2.3T7E1酶切试验

[0071] 设计1对能扩增出带有突变位点DNA片段的引物(F:CACCATCGCAGAGGAACAATA(SEQ ID NO.11)；R:TTGTGGGTCATCACGAGCAC(SEQ ID NO.12))，将扩增得到的野生型和突变型PCR产物混合后进行加热沸腾使其变性、自然冷却至室温复性，复性完成后加入0.5μL T7E1酶，混匀后37℃反应30min，65℃灭活，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0072] 1.2.4测序分析

[0073] 将得到的PCR产物进行胶回收后，送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与野生型PRV gE基因进行比对，明确PRV gE基因中的突变位置和突变类型。

[0074] 2结果

[0075] 2.1Cas9/gRNAs-gE载体构建

[0076] 对合成好的Cas9/gRNA进行活性检测，与标准品1和标准品2进行对比，结果显示gRNA1的酶切效率为50％(图1第1泳道)，gRNA2酶切效率为80％(图1第2泳道)，gRNA3酶切效率为60％(图1第3泳道)，gRNA4酶切效率为95％(图1第4泳道)。选用活性较高的gRNA靶点(gRNA2和gRNA4)进行后续细胞试验。图1中，M：marker；1：gRNA1；2：gRNA2；3：gRNA3；4：gRNA4；5：NC；6：标准品1；7：标准品2；M：marker；1：gRNA1；2：gRNA2；3：gRNA3；4：gRNA4；5：NC；
6：standard 1；7：standard 2。

[0077] 2.2突变毒株的纯化

[0078] T7E1核酸酶能够识别错配的杂合双链并进行剪切。为了得到突变的毒株，转染构建好的Cas9/gRNAs-gE入ST细胞，转染后接种PRV，待细胞出现细胞病变(CPE)时收集上清及细胞，提取病毒DNA，如图2第3泳道结果所示PCR扩增出带有突变位点DNA片段，长度1202bp(SEQ ID NO.2)，退火经T7E1酶切后出现800bp和400bp的两条突变型条带，说明该毒株含有突变。在图2中，1：野生型PCR产物；2：酶切野生型PCR产物；3：酶切突变体PCR；4：酶切突变体PCR与野生型PCR混合物；M：marker。

[0079] 在此基础上进行几轮蚀斑纯化，筛选得到纯的突变毒株，如图3中第3，4泳道所示，T7E1酶切鉴定得到纯的突变毒株。这些结果表明应用CRISPER/Cas9编辑得到了突变毒株。在图3中，1：野生型PCR产物；2：酶切野生型PCR产物；3：酶切突变体PCR；4：酶切突变体PCR与野生型PCR混合物；M：marker。

[0080] 2.3测序分析

[0081] 为验证突变的具体位置及突变类型，对纯化后的突变毒株的PCR产物进行测序。结果显示得到了一株突变毒株，该突变毒株在野生型伪狂犬病毒PRV株gE基因序列(SEQ ID NO.1)上缺失了第829-830位的AG两个碱基，从而造成了阅读框的移码突变(见图4)。

[0082] 实施例2猪伪狂犬病灭活疫苗的制备

[0083] 猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0084] (1)将猪睾丸细胞培养在生物反应器中进行悬浮培养，悬浮培养控制温度为37℃，DO为50％,搅拌速度为100r/min，pH为7.2；

[0085] (2)当细胞密度为3*106时，接种实施例1构建的伪狂犬病毒gE基因缺失株，其毒价8.75
TCID50≥10 /ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.1％；

[0086] (3)当上述猪睾丸细胞有80％-90％以上出现病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

[0087] (4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥108.0TCID50为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为37％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100︰0.15，充分摇匀，37℃灭活36h；

[0088] (5)将检验合格的细胞毒液加适量的VSP后与MERCKINADE SDA28佐剂按重量比为3︰1混合，300rpm乳化10分钟，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

[0089] 应用本发明研制的猪伪狂犬病灭活疫苗，每头份病毒含量应≥108.0TCID50。猪免疫后5个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，免疫持续期至少可维持4个月，2～8℃保存期为12个月。

[0090] 猪体接种疫苗后无不良临床反应。免疫猪食欲、体温正常，精神状态良好，安全性好。接种母猪的生产性能得到了提高，产生了良好的社会和经济效益，对于预防猪伪狂犬病引起的母猪繁殖障碍起到了积极的作用。

[0091] 本发明制得的疫苗的使用：

[0092] 1.作用与用途

[0093] 用于预防猪伪狂犬病。

[0094] 2.用法与用量

[0095] 颈部肌肉注射。仔猪，断奶时每头2ml，种猪每头2ml，间隔28天后加强免疫接种1次以后每隔半年加强免疫一次。怀孕母猪产前一个月加强免疫一次。

[0096] 实施例3猪伪狂犬病灭活疫苗的制备

[0097] 猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0098] (1)将猪睾丸细胞培养在生物反应器中进行悬浮培养，悬浮培养控制温度为37℃，DO为50％,搅拌速度为100r/min，pH为7.2；

[0099] (2)实施例1构建的伪狂犬病毒gE基因缺失株，其毒价TCID50≥108.75/ml，将该毒株6
稀释至重量百分浓度为0.1％，接种到步骤(1)得到的密度为3*10的悬浮的猪睾丸细胞中，在温度为37℃，DO为50％,搅拌速度为90r/min，pH为7.2；

[0100] (3)当80％-90％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

[0101] (4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥108.0TCID50为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为36％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100︰0.2，充分摇匀，37℃灭活28h；

[0102] (5)将检验合格的细胞毒液加适量的VSP后与MERCKINADE SDA 28佐剂按重量比为4︰1混合，300rpm乳化10分钟，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

[0103] 应用本发明研制的猪伪狂犬病灭活疫苗，每头份病毒含量应≥108.0TCID50。仔猪免疫后4.5个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，免疫持续期定为4个月，2～8℃保存期为12个月。

[0104] 实施例4猪伪狂犬病灭活疫苗的制备

[0105] 猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0106] (1)将猪睾丸细胞培养在生物反应器中进行悬浮培养，悬浮培养控制温度为35℃，DO为40％,搅拌速度为80r/min，pH为7.2；

[0107] (2)实施例1构建的伪狂犬病毒gE基因缺失株，其毒价TCID50≥108.75/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.1％，接种到步骤(1)得到的密度为3*106的悬浮的猪睾丸细胞中，在温度为35℃，DO为40％,搅拌速度为80r/min，pH为7.2；

[0108] (3)当80％-90％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

[0109] (4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥108.0TCID50为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为35％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100︰0.15，充分摇匀，35℃灭活32h；

[0110] (5)将检验合格的细胞毒液加适量的VSP后与MERCKINADE SDA28佐剂按重量比为3︰1混合，300rpm乳化10分钟，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

[0111] 实施例5猪伪狂犬病灭活疫苗的制备

[0112] 猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0113] (1)将猪睾丸细胞培养在生物反应器中进行悬浮培养，悬浮培养控制温度为36℃，DO为50％,搅拌速度为110r/min，pH为7.2；

[0114] (2)实施例1构建的伪狂犬病毒gE基因缺失株，其毒价TCID50≥108.75/ml，将该毒株稀释至重量百分浓度为0.1％，接种到步骤(1)得到密度为3*106的悬浮的猪睾丸细胞中，在温度为36℃，DO为50％,搅拌速度为110r/min，pH为7.2；

[0115] (3)当80％-90％以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，将该细胞毒液置于-20℃以下保存，保存期限不超过30天；

[0116] (4)取上清液测定毒价，每头份病毒含量≥108.0TCID50为合格，将合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入重量百分浓度为38％的甲醛，细胞毒液与甲醛的体积比为100︰0.1，充分摇匀，37℃灭活36h；

[0117] (5)将检验合格的细胞毒液加适量的VSP后与MERCKINADE SDA28佐剂按重量比为3.5︰1混合，300rpm乳化10分钟，配制成猪伪狂犬病灭活疫苗。

[0118] 应用本发明研制的猪伪狂犬病灭活疫苗，每头份病毒含量应≥108.0TCID50。猪免疫后4.5个月攻毒仍能抵抗PRV强毒的攻击，免疫持续期至少可维持4个月，2～8℃保存期为12个月。

[0119] 实施例6动物免疫试验

[0120] 1.血清中gB和gE抗体水平检测

[0121] 10头21日龄的PRV抗体阴性的三元猪仔猪购自南京某猪场。将仔猪随机分成2组，第一组接种伪狂犬病灭活疫苗，每头2mL；第二组每头接种2mLPBS溶液作为对照。免疫28d后加强免疫一次，分别采取免疫后0、14、28、42、56d的血清，检测血清中gB和gE抗体水平。

[0122] PRV gB抗体检测结果显示(图5A)：免疫组免疫14d后gB抗体均呈阳性，并在免疫42d后达到强阳性，S/N值为小于0.05且离散度小；对照组gB抗体均为阴性。全部试验猪PRV gE抗体在整个试验过程均呈阴性(图5B)。图5中，S/N值小于0.6判定为抗体阳性。

[0123] 2.小鼠免疫实验

[0124] 用体重20g小鼠30只各皮下注射疫苗0.3ml，14日进行二免，14天后将免疫小鼠和对照小鼠用皮下注射检验用强毒，攻毒剂量每只0.1ml(含50LD50)，观察7天，对照组全部死亡，免疫本发明研制疫苗30只小鼠保护率为86％。结果见表1。

[0125] 表1小鼠免疫攻毒结果

[0126]

[0127] 3.猪免疫有效期试验

[0128] 猪免疫有效期试验测定结果见下表2：15日龄猪免后14天有抗体产生，ELISA抗体S/N是0.050-0.073，到免后42天时抗体水平达到最高峰，之后90-140天抗体下降但较平稳仍有较高的抗体，由此表明猪的免疫持续期应在4.5个月以上，所以有效期定为4个月。

[0129] 表2疫苗有效期试验

[0130]

[0131]

[0132] 注：ELISA表示S/N值。①S＝样品孔OD630值，N＝阴性对照孔平均OD630值②S/N≤0.6,样品判为PRV抗体阳性；S/N﹥0.7,样品判为PRV抗体阴性。

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