一种水生产碱菌及其获取方法与应用
阅读：100发布：2021-06-03
专利汇可以提供一种水生产碱菌及其获取方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 水 生产 碱 菌及其获取方法与应用，所述的水生产碱菌为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019665。获取方法包括分离、筛选程序，首先从烟株组织中分离能降解尼古丁的菌株，再用以NNK为唯一 碳 源和氮源的培养基筛选即得。菌株的应用包括 发酵 、接种、降解工序，首先将菌株在28~30℃下培养36~72 h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按 烟草 重量的3~5%喷施，保持4~7 d（烤烟）、45~50 d（晾烟）的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。，下面是一种水生产碱菌及其获取方法与应用专利的具体信息内容。
1.一株水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019665。
2.根据权利要求1所述的水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101菌株可在以4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮（NNK）为唯一碳源的培养基中生长。
3.根据权利要求1所述的水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNK、NAB、NAT和NNN的总降解率为
6.1 27.1%（烤烟）、14.5 30.6%（晾烟）。
~ ~
4.一种权利要求1 3任一所述的水生产碱菌的获取方法，其特征在于包括分离、筛选和~
纯化步骤，具体包括：
A、分离：将采集的烟株组织经清洗、消毒、剪成小段置于磷酸钾缓冲液中，超声处理、过滤得到滤液，将滤液再经真空过滤、洗脱、收集菌体，菌体溶于无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48 72h，挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次~
接种于NIM培养基中于温度25 30℃下培养36 50h验证其能够以尼古丁为唯一碳源生长的~ ~
特性得到尼古丁降解菌；
所述的分离培养基以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl
0.48~0.52，MgSO4 0.10~0.14，CaCl2 0.08~0.12，尼古丁0.48~0.52，琼脂13~16；
B、筛选：筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接尼古丁降解菌于平板上，置于培养箱中于温度25 35℃下培养42 50h，筛选获得~ ~
一株生长较好的菌株；
所述的筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl 0.48~0.52，MgSO4 0.10~0.14，CaCl2 0.08~0.12，尼古丁 0.48~0.52，琼脂13~16；
C、纯化：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中于温度25
30℃下培养36 50 h获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C~ ~
低温冰箱保存；
所述的纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0~ ~ ~
6.0、琼脂13 18，pH 7.0 7.4。
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5.根据权利要求4所述的获取方法，其特征在于所述的烟株组织为烤烟K326的叶片。
6.一种权利要求1 3任一所述的水生产碱菌的应用，其特征在于所述的水生产碱菌在~
烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的水生产碱菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用包括发酵、接种和降解步骤，具体包括：
A、发酵：将菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；用无菌牙签挑取单菌落于盛有5 mL的种子培养液的50 mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；将菌株05-101种子液以3 5 v/v%加入发酵培养液，恒温振荡培~
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养，当菌体浓度达10 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
B、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3 5%进行喷施；
~
C、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4 7天（烤烟）、40 50 天（晾烟）的降解时~ ~
间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×109 1×~
1010个/mL。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于C步骤所述的降解对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30~
40%，并于25 35℃的条件下保持5天的降解时间。
~
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于C步骤所述的降解在喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4 7天的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为总降解~
率为6.1 27.1%（烤烟）、14.5 30.6%（晾烟）。
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一种水生产碱菌及其获取方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 烟草特有亚硝胺（Tobacco-specific N-nitrosamines, TSNAs）是烟草中特有的一类N-亚硝基类化合物，具有潜在的致癌作用，是烟叶中重要的有害成分，对吸烟者的健康存在严重影响。目前，被鉴定出8种物质，其中4-（N-甲基-亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）、N-亚硝基去甲基烟碱（NNN）以及N-亚硝基假木贼碱（NAB）是烟草和烟气中主要的TSNAs，尤其NNN与NNK均为动物强致癌物，危害极大。因此，降低TSNAs含量是提高烟草安全性的极为重要。TSNAs是生物碱与亚硝酸盐在微生物的作用下形成，因此可通过降低生物碱或亚硝酸盐的含量而调控TSNAs的形成。影响烟草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等。通过这些影响因子的改变可以调控TSNAs的形成量，但目前关于微生物降解TSNAs报道还不多。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，选择适宜的施用方法，对于提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
发明内容
[0003] 本发明的第一目的在于提供一株水生产碱菌；第二目的在于提供所述的水生产碱菌的获取方法；第三目的在于提供所述的水生产碱菌的应用。
[0004] 本发明的第一目的是这样实现的，一株水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis），命名为05-101，经鉴定为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：武汉，武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCC NO: M 2019665。
[0005] 本发明的第二目的是这样实现的，一种所述水生产碱菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：A、分离：将采集的5 g烟株组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后在75%酒精中浸泡30 sec，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2 3 cm的小段，置于45 ml磷酸钾缓冲液中(0.1 M，pH 7.2)，用超~
声波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48 72 ~
h。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
声波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48 72 ~
h。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
[0006] 培养条件为25 30°C，时间36 50 h；~ ~
分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，尼古丁0.48 0.52，琼脂13 16；
~ ~ ~ ~ ~
B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；
培养条件为25 35°C，时间42 50 h；
~ ~
筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8 6.2，KH2PO4 2.8 3.2，NH4Cl 0.8 1.2，NaCl ~ ~ ~
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，NNK 0.05 0.15，琼脂13 16；
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C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。
分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，尼古丁0.48 0.52，琼脂13 16；
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B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；
培养条件为25 35°C，时间42 50 h；
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筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8 6.2，KH2PO4 2.8 3.2，NH4Cl 0.8 1.2，NaCl ~ ~ ~
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，NNK 0.05 0.15，琼脂13 16；
~ ~ ~ ~ ~
C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。
[0007] 培养条件为25 30°C，时间36 50 h；~ ~
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
13 18，pH 7.0 7.4。
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纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
13 18，pH 7.0 7.4。
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[0008] 本发明的第三目的是这样实现的：一种所述水生产碱菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：a、发酵：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；用无菌牙签挑取单菌落于盛有5 mL的种子培养液的50 mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；将菌株05-101种子液以3 5 v/v%加入发酵培养液，~
恒温振荡培养，当菌体浓度达1010 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
活化培养条件为：温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~
种子液培养条件为：转速200 260 r/min，温度为25 30°C，时间20 36 h；
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发酵培养条件为：转速200 260 r/min，温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~ ~
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
15.0 19.0，pH 7.0 7.4；
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种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0，pH ~ ~ ~
7.0 7.4；
~
发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0，pH ~ ~ ~
7.0 7.4。
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恒温振荡培养，当菌体浓度达1010 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
活化培养条件为：温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~
种子液培养条件为：转速200 260 r/min，温度为25 30°C，时间20 36 h；
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发酵培养条件为：转速200 260 r/min，温度25 30°C，时间36 60 h；
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活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
15.0 19.0，pH 7.0 7.4；
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种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0，pH ~ ~ ~
7.0 7.4；
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发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0，pH ~ ~ ~
7.0 7.4。
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[0009] b、接种：在烟株组织调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3 5%~进行喷施；
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4 7 d（烤烟）、40 50 d（晾烟）的降解时~ ~
间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4 7 d（烤烟）、40 50 d（晾烟）的降解时~ ~
间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
[0010] 本发明所述水生产碱菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点：1、本发明所述水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达6.1 27.1%（烤烟）、14.5 30.6%（晾烟）。
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[0011] 2、本发明所述水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101大量存在于烟株中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。
[0012] 3、本发明所述水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101能在含有0～8.0 g/L NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为25～37℃，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。
具体实施方式
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO: M 2019665。
[0015] 所述菌株为革兰氏阴性，菌落淡黄色，表面色泽光滑，中央凸起，圆形，边缘整齐。细胞呈杆状，具周身鞭毛，大小为0.5 1.3 µm×0.6 2.5 µm。该菌株可在含有0～8.0 g/L ~ ~
NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，适宜生长温度为25～37℃。
NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，适宜生长温度为25～37℃。
[0016] 所述菌株可在以NNK为唯一碳源和氮源的培养基中生长。
[0017] 所述NNK指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮。
[0018] 所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为6.1~27.1%（烤烟）、14.5 30.6%（晾烟）。
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[0019] 一种所述水生产碱菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：A、分离：将采集的5 g烟株组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后在75%酒精中浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2 3 cm的小段，置于45 mL磷酸钾缓冲液中(0.1 M，pH 7.2)，用超声~
波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，培养能在培养基表面生长的菌株。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，培养能在培养基表面生长的菌株。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
[0020] 培养条件为25 30°C，时间36 50 h；~ ~
分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，尼古丁0.48 0.52，琼脂13 16；
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B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；
培养条件为25 35°C，时间42 50 h；
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筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8 6.2，KH2PO4 2.8 3.2，NH4Cl 0.8 1.2，NaCl ~ ~ ~
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，NNK 0.05 0.15，琼脂13 16；
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C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。
分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8~6.2，KH2PO4 2.8~3.2，NH4Cl 0.8~1.2，NaCl
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，尼古丁0.48 0.52，琼脂13 16；
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B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；
培养条件为25 35°C，时间42 50 h；
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筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 5.8 6.2，KH2PO4 2.8 3.2，NH4Cl 0.8 1.2，NaCl ~ ~ ~
0.48 0.52，MgSO4 0.10 0.14，CaCl2 0.08 0.12，NNK 0.05 0.15，琼脂13 16；
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C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。
[0021] 培养条件为25 30°C，时间36 50 h；~ ~
纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
13 18，pH 7.0 7.4。
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纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
13 18，pH 7.0 7.4。
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[0022] 步骤A所述的烟株组织为烟株的叶片或茎。
[0023] 步骤A所述的烟株组织优选为烤烟K326的叶片或茎。
[0024] 步骤A所述的培养条件优选为30℃，培养48 h。
[0025] 步骤B及步骤C所述的NNK指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮。
[0026] 步骤B所述的培养条件优选为28℃，时间48 h。
[0027] 步骤B所述的筛选培养基优选由不加葡萄糖的M9培养基加入0.1% NNK制成。
[0028] 步骤C所述的培养条件优选为28℃，时间48 h。
[0029] 一种所述水生产碱菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：a、发酵：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；用无菌牙签挑取单菌落于盛有5 mL的种子培养液的50 mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；将菌株05-101种子液以3 5 v/v%加入发酵培养液，~
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恒温振荡培养，当菌体浓度达10 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
活化培养条件为：温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~
种子液培养条件为：转速200 260 r/min，温度为25 30°C，时间20 36 h；
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发酵培养条件为：转速200 260 r/min，温度25 30°C，时间36 60 h；
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活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
15.0 19.0，pH 7.0 7.4；
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种子培养液和发酵培养液组分相同，成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5~ ~
3.5、氯化钠4.0 6.0，pH 7.0 7.4；
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b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3 5%进行喷施；
~
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4 7 d（烤烟）、40 50 d（晾烟）的降解时~ ~
间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
10
恒温振荡培养，当菌体浓度达10 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
活化培养条件为：温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~
种子液培养条件为：转速200 260 r/min，温度为25 30°C，时间20 36 h；
~ ~ ~
发酵培养条件为：转速200 260 r/min，温度25 30°C，时间36 60 h；
~ ~ ~
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5 3.5、氯化钠4.0 6.0、琼脂~ ~ ~
15.0 19.0，pH 7.0 7.4；
~ ~
种子培养液和发酵培养液组分相同，成分以g/L计为：蛋白胨8.0 12.0、牛肉浸膏2.5~ ~
3.5、氯化钠4.0 6.0，pH 7.0 7.4；
~ ~
b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3 5%进行喷施；
~
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4 7 d（烤烟）、40 50 d（晾烟）的降解时~ ~
间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。
[0030] 步骤a所述的发酵，摇瓶转速为200 260 rpm。~
[0031] 步骤a所述的活化培养条件优选为28℃，时间48 h。
[0032] 步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×109 1×1010 CFU/mL。~
[0033] 步骤b所述的接种也可以在烟叶调制前进行。
[0034] 步骤b及步骤c所述的烟叶包括白肋烟、烤烟或晒烟中的任一种。
[0035] 步骤b及步骤c所述的烟叶优选白肋烟。
[0036] 步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程和晾晒烟的晾晒过程。
[0038] 步骤c所述的降解，对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30 40%，并于25 35℃的条件下保持5天的~ ~降解时间。
[0039] 步骤c所述的降解，喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4 7 d（烤烟）、40 50 d（晾~ ~烟）的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总降解率为6.1 27.1%（烤烟）、14.5~ ~
30.6%（晾烟）。
30.6%（晾烟）。
[0040] 下面通过实施例加以说明：实施例1
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的获取与鉴定
（1）水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的获取
A、分离：将采集的5 g烟株组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后在75%酒精中浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2 3 cm的小段，置于45 mL磷酸钾缓冲液中(0.1 M，pH 7.2)，用超声~
波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上(Whatman, Germany)。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁(Sigma-Aldrich，Germany)为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48 72 h。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单~
菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的获取与鉴定
（1）水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的获取
A、分离：将采集的5 g烟株组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后在75%酒精中浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2 3 cm的小段，置于45 mL磷酸钾缓冲液中(0.1 M，pH 7.2)，用超声~
波处理30 min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2 µm滤膜上(Whatman, Germany)。将滤膜至于10 mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000 r/min离心20 min收集菌体，溶于1 mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁(Sigma-Aldrich，Germany)为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48 72 h。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单~
菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。
[0041] 培养条件为28°C，时间48 h；分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 6.0，KH2PO4 3.0，NH4Cl 1.0，NaCl 0.5，MgSO4
0.12，CaCl2 0.1, nicotine 0.5，agar 15.0。
0.12，CaCl2 0.1, nicotine 0.5，agar 15.0。
[0042] B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1 g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；培养条件为26°C，时间48 h；
筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 6.0，KH2PO4 3.0，NH4Cl 1.0，NaCl 0.5，MgSO4
0.12，CaCl2 0.10，NNK 0.1，琼脂 15.0。
筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO4 6.0，KH2PO4 3.0，NH4Cl 1.0，NaCl 0.5，MgSO4
0.12，CaCl2 0.10，NNK 0.1，琼脂 15.0。
[0043] C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。
[0044] 培养条件为28°C，时间48 h；纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0、琼脂17.0，pH 7.2。
[0045] （2）水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的鉴定对上述选育的菌株05-101，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物8F/R1492，常规条件扩增，扩增产物经TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，连接于载体pMD18-T Vector，转化感受态细胞Escherichia coli DH5α，挑取白色菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
[0046] 以上实验结果记录如下：1、形态、生长特征：淡黄色菌落，菌落表面色泽光滑，中央凸起，圆形，边缘整齐。革兰氏染色为阴性。细胞呈杆状，具周身鞭毛，大小为0.5 1.3 µm×0.6 2.5 µm。该菌株可在含有0~ ~
～8.0 g/L NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，适宜生长温度为25～37℃，最适宜pH值为
7.2 7.4。
~
～8.0 g/L NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，适宜生长温度为25～37℃，最适宜pH值为
7.2 7.4。
~
[0047] 2、16S rDNA序列分析：通过序列比对和生理生化特性，将05-101菌株鉴定为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）。
[0049] （3）水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101的保藏通过上述鉴定结果，确认菌株05-101为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）的一个株系，命名为05-101。于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：武汉，武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCC NO: M 2019665。
[0050] 实施例2——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对烟碱的降解实验
实验方法：将菌株05-101接种于含0.2％烟碱的检测培养液（Na2HPO4 6.0 g/L，KH2PO4
3.0 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4 0.12 g/L，CaCl2 0.1 g/L, nicotine 2.0 g/L，琼脂 15.0 g/L）中，150 r/min 30℃振荡培养72 h。实验设置两次重复。用750U紫外/可见分光光度计比色，测定OD600值。用台式离心机1000 r/min离心5 min，取0.5 mL上清液加入3.5 mL 5％的乙酸，混合均匀，送到分析测试中心，用自动化学分析仪检测烟碱含量。
实验方法：将菌株05-101接种于含0.2％烟碱的检测培养液（Na2HPO4 6.0 g/L，KH2PO4
3.0 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4 0.12 g/L，CaCl2 0.1 g/L, nicotine 2.0 g/L，琼脂 15.0 g/L）中，150 r/min 30℃振荡培养72 h。实验设置两次重复。用750U紫外/可见分光光度计比色，测定OD600值。用台式离心机1000 r/min离心5 min，取0.5 mL上清液加入3.5 mL 5％的乙酸，混合均匀，送到分析测试中心，用自动化学分析仪检测烟碱含量。
[0051] 实验结果：由表1可见，经菌株05-101处理72 h后，培养液中的烟碱下降了97.79%。由此可见菌株05-101可有效降解烟碱。
[0052] 表1 菌株05-101对烟碱的降解效果实施例3
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对烟草浸提液中TSNAs的降解实验实验方法：按白肋烟丝：蒸馏水=1：10的比例混匀，超声波浸提30 min后过滤，滤液加入酵母膏（1.5 g/L），调节pH至7.2 7.4，300 mL三角瓶分装100 mL灭菌，分别挑取一环筛选的~
降解菌接种，150 r/min振荡培养48 h，以不接菌的处理为对照（CK），取菌液8000 r/min常温离心10 min，取滤液进行HPLC-MS/MS分析（范多青等，中国烟草学报，2012，18（6）：10-
16）。
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对烟草浸提液中TSNAs的降解实验实验方法：按白肋烟丝：蒸馏水=1：10的比例混匀，超声波浸提30 min后过滤，滤液加入酵母膏（1.5 g/L），调节pH至7.2 7.4，300 mL三角瓶分装100 mL灭菌，分别挑取一环筛选的~
降解菌接种，150 r/min振荡培养48 h，以不接菌的处理为对照（CK），取菌液8000 r/min常温离心10 min，取滤液进行HPLC-MS/MS分析（范多青等，中国烟草学报，2012，18（6）：10-
16）。
[0053] 实验结果：由表2可知，菌株05-101对白肋烟浸提液中的TSNAs降解效果良好。经菌剂处理48 h，浸提液中TSNAs含量较对照降低了21.1%。其中，NAT、NAB和NNK较对照分别降低了69.5%、21.4%和38.1%。
[0054] 表2 菌株05-101对烟丝中TSNAs的降解效果实施例4
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对烤烟烟叶中TSNAs的降解实验a、活化：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；
培养条件为：温度28°C，时间48 h；
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0、琼脂17.0，pH 7.2。
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对烤烟烟叶中TSNAs的降解实验a、活化：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；
培养条件为：温度28°C，时间48 h；
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0、琼脂17.0，pH 7.2。
[0055] b、种子液：用无菌牙签挑取单菌落于盛有5 mL的种子培养液的50 mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；培养条件为：转速250 r/min，温度为28°C，时间24 h；
种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
[0056] c、发酵：将菌株05-101种子液以3 5 v/v%加入发酵培养液，恒温振荡培养，当菌体~浓度达1010 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
培养条件为：转速250 r/min，温度28°C，时间48 h；
发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
培养条件为：转速250 r/min，温度28°C，时间48 h；
发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
[0057] d、接种与降解：将发酵菌剂用无菌水稀释10倍，稀释液按烟叶重量的4%均匀喷洒于红花大金元烟叶表面，以无菌水为对照组。烘烤结束后取样测定TSNAs（范多青等，中国烟草学报，2012，18（6）：10-16）。
[0058] 实验结果：由表3可见，经菌剂05-101处理鲜烟叶再烘烤的烟叶中TSNAs的含量较无菌水对照组降低了晾制前的烟叶，晾制后处理组烟叶中TSNAs总体较对照组降低了24.3%。其中，NNK、NAB、NAT和NNN均有降低，分别下降了23.9%、27.1%、6.1%和23.0%。由此可见，菌株05-101在烤烟烤前处理烟叶，可有效降解烟叶中的TSNAs。
[0059] 表3 烤烟烘烤前喷施菌剂 TSNAs含量变化实施例5
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对晾烟烟叶中TSNAs的降解实验实验方法：
a、活化：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；
培养条件为：温度28°C，时间48 h；
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0、琼脂17.0，pH 7.2。
——水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05-101对晾烟烟叶中TSNAs的降解实验实验方法：
a、活化：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；
培养条件为：温度28°C，时间48 h；
活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0、琼脂17.0，pH 7.2。
[0060] b、种子液：用无菌牙签挑取单菌落于盛有5 mL的种子培养液的50 mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；培养条件为：转速250 r/min，温度为28°C，时间24 h；
种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
[0061] c、发酵：将菌株05-101种子液以3 5 v/v%加入发酵培养液，恒温振荡培养，当菌体~浓度达1010 CFU/mL时，即为发酵菌剂；
培养条件为：转速250 r/min，温度28°C，时间48 h；
发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
培养条件为：转速250 r/min，温度28°C，时间48 h；
发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、氯化钠5.0，pH 7.2。
[0062] d、接种与降解：实验在烟叶调制前处理，选择大田烤烟K326烟叶。将烟株整株砍收。将菌株05-101的发酵菌剂用无菌水稀释10倍，稀释液按烟叶重量的4%均匀喷洒于烟叶表面，以无菌水为对照组。晾制45 d时取样中部叶测定TSNAs（范多青等，中国烟草学报，2012，18（6）：10-16）。
[0063] 实验结果：由表4可知，经菌剂05-101处理晾制前的烟叶，晾制后处理组烟叶中TSNAs总体较对照组降低了21.9%。其中，NNK、NAB、NAT和NNN分别下降了18.4%、14.5%、16.5%和30.6%。由此可见，菌株05-101在晾制期处理烟叶，可有效降解烟叶中的TSNAs，有较好的开发应用价值。
[0064] 表4 晾制期施用菌剂05-101对烟叶中TSNAs含量的影响
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