一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用专利检索-齐墩果酸羧酸酸，碱，盐，酸酐和碱专利检索查询-专利查询网

一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用

阅读：358发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于植物提取分析技术领域，特别涉及一种软枣猕猴桃根提取物，提取分离方法及其应用；该提取物包含以下21种化学组分：7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基- 酮，3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮，儿茶素，β-sitosterol，槲皮素，异槲皮苷，齐墩果酸，乌苏酸，2α，3β-二羟基齐墩果烷-12烯-28酸，2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12烯-28-酸，胡萝卜苷等。本发明的提取物在制备改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药物中具有美好的应用前景。，下面是一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种软枣猕猴桃根根提取物，其特征在于，该提取物包含以下组分：7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮；3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-
6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮；儿茶素；β-sitosterol；槲皮素；异槲皮苷；
齐墩果酸；2β,3β,23α-三羟基齐墩果烷-12-烯-28-酸；Arjunolicacid；Euscaphicacid；2α,
3β,19α,23-quahydroxyusu-12-en-28-acid-28-O-β-D-pyranglucosidase；乌苏酸；2α,3β-二羟基齐墩果烷-12烯-28酸；2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12烯-28-酸；3β-羟基-20-烯-乌苏烷；科罗索酸；2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28-酸；2α,3β,19α,23-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸；2α,3β,23-三羟基乌苏烷-12,20(30)-二烯-28-酸；2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12,
20(30)-二烯-28-酸；胡萝卜苷。
2.如权利要求1所述的软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将软枣猕猴桃根预处理后完全浸没于体积分数为90％的乙醇溶液中，浸泡48h，并在浸泡过程每隔2h充分搅拌一次，过滤得提取液，浓缩得浸膏；
其中，软枣猕猴桃根与乙醇溶液的料液比为3g：10mL；
S2：将S1得到的浸膏完全溶解于水中，加入3倍浸膏体积的乙酸乙酯溶剂，进行4次萃取，合并全部乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取浸膏；
S3：采用100-200目的硅胶进行第一步粗分，将乙酸乙酯浸膏样品自然干燥后粉碎，过
100目筛，然后干法上样，采用甲醇-二氯甲烷溶液进行柱层析，再使用高效液相色谱法以及薄层色谱法进行分析，将样品划分为8段，即得到8个馏分；最后将8个馏分进行层析分离，得到21个软枣猕猴桃根化合物组分。
3.如权利要求2所述的软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，其特征在于，S3中甲醇-二氯甲烷溶液的体积比为1∶100～1。
4.如权利要求2所述的软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，其特征在于，S3中层析分离方式为：使用硅胶，聚酰胺，CHP，Sephadex LH-20填料中的一种或多种进行反复层析分离；
S3中层析分离使用的洗脱液为：石油醚-乙酸乙酯溶液，氯仿-甲醇溶液，二氯甲烷-甲醇溶液，氯仿-丙酮溶液，甲醇-水溶液、二氯甲烷-甲醇溶液中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，其特征在于，S1中预处理的具体过程为：将软枣猕猴桃干燥，粉碎为颗粒；
S1中软枣猕猴桃根粉末顶部比乙醇溶液的液面低10cm。
6.如权利要求2所述的软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，其特征在于，S2中减压浓缩的条件为温度40～45℃、真空度0.09～0.10Mpa，时间5.5～6.5h。
7.如权利要求1所述的软枣猕猴桃根提取物的应用，其特征在于，所述提取物在制备为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的软枣猕猴桃根提取物的应用，其特征在于，所述软枣猕猴桃根提取物中7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮，3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3',4'-四羟基黄酮，儿茶素，槲皮素，异槲皮苷，齐墩果酸，乌苏酸在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性、乙酰胆碱酯酶，酪氨酸酶活性药物中的应用。

说明书全文

一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物提取分离技术领域，具体涉及一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用。

背景技术

[0002] 猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)又名“奇异果”为大型落叶类藤本植物。因其含有丰富的营养价值，又被誉为“水果之王”。猕猴桃属类植物种类繁多，大约有50多种，现在市场上广泛流传的多指中华猕猴桃，软枣猕猴桃为猕猴桃科猕猴桃属植物，与中华猕猴桃为同属不同种类植物，软枣猕猴桃根为植物软枣猕猴桃(Actinidia arguta(Sieb.et Zucc)Planch.ex Miq.)的根部。古代就有前人使用软枣猕猴桃根为药，古书记载软枣猕猴桃根具有清热，凉血，利尿的功效。现代研究表明软枣猕猴桃根具有降血糖，降血脂，和抗肿瘤细胞的药理作用。现今科学研究主要集中在对猕猴桃科猕猴桃属植物中华猕猴桃的全株化学成分研究以及生物活性研究方面，对同属植物软枣猕猴桃研究较少，所以提供一种软枣猕猴桃根的提取分离方法十分必要。

发明内容

[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种软枣猕猴桃根提取物、提取分离方法及其应用，本发明利用石油醚、乙酸乙酯等溶剂萃取，结合运用硅胶、CHP-20P、 Sephadex LH-20等柱层析技术对软枣猕猴桃根提取物进行了分离，并将软枣猕猴桃根提取物与药品结合应用在为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药理作用的研究中。

[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

[0005] 一种软枣猕猴桃根根提取物，该提取物包含以下组分：

[0006] 7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮；3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3',4'-四羟基黄酮；儿茶素；β-sitosterol；槲皮素；异槲皮苷；齐墩果酸；2β,3β,23α-三羟基齐墩果烷-12- 烯-28-酸；Arjunolicacid；Euscaphicacid； 2α,3β,19α,23-quahydroxyusu-12-en-28-acid-28-O-β-D-pyranglucosidase；乌苏酸；2α,3β-二羟基齐墩果烷-12烯-28酸；2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12烯-28- 酸；3β-羟基-20-烯-乌苏烷；科罗索酸；2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28- 酸；2α,3β,19α,23-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸；2α,3β,23-三羟基乌苏烷-12， 20(30)-二烯-28-酸；2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12,20(30)-二烯-28-酸；胡萝卜苷。

[0007] 本发明还保护上述软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，包括如下步骤：

[0008] S1：将软枣猕猴桃根预处理后完全浸没于体积分数为90％的乙醇溶液中，浸泡48h，并在浸泡过程中每隔2h充分搅拌一次，过滤得提取液，浓缩得浸膏；

[0009] 其中，软枣猕猴桃根粉末与乙醇溶液的料液比为3g：10mL；

[0010] S2：将S1得到的浸膏完全溶解于水中，加入3倍浸膏体积的乙酸乙酯溶剂，进行4次萃取，合并全部乙酸乙酯萃取液；减压浓缩，得乙酸乙酯萃取浸膏；

[0011] S3：采用100-200目的硅胶进行第一步粗分，将乙酸乙酯浸膏样品自然干燥后粉碎，过100目筛，然后干法上样，采用甲醇-二氯甲烷溶液进行柱层析，使用高效液相色谱法以及薄层色谱法进行分析，将样品划分为8段，即得到8 个馏分；最后将8个馏分进行层析分离，得到21个软枣猕猴桃根化合物组分。

[0012] 优选的，S3中甲醇-二氯甲烷溶液的体积比为1∶100～1。

[0013] 优选的，S3中层析分离方式为：使用硅胶，聚酰胺，CHP，Sephadex LH-20 填料中的一种或多种进行反复层析分离

[0014] S3中层析分离使用的洗脱液为：石油醚-乙酸乙酯溶液，氯仿-甲醇溶液，二氯甲烷-甲醇溶液，氯仿-丙酮溶液，甲醇-水溶液、二氯甲烷-甲醇溶液中的一种或多种。

[0015] 优选的，S1中预处理的具体过程为：将软枣猕猴桃干燥，粉碎为颗粒；

[0016] S1中软枣猕猴桃根粉末顶部比乙醇溶液的液面低10cm。

[0017] 优选的，S2中减压浓缩的条件为温度40～45℃、真空度0.09～0.10Mpa，时间5.5～6.5h。

[0018] 本发明还保护上述软枣猕猴桃根提取物的应用，具体为提取物在制备为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药物中的应用。

[0019] 优选的，所述软枣猕猴桃根提取物中7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮，3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮，儿茶素，槲皮素，异槲皮苷，齐墩果酸，乌苏酸在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性、乙酰胆碱酯酶，酪氨酸酶活性药物中的应用。

[0020] 本发明具有以下有益效果：

[0021] 本发明利用乙酸乙酯等溶剂萃取，结合运用硅胶、CHP-20P、大孔树脂、 Sephadex LH-20等柱层析技术对软枣猕猴桃根提取物进行了分离，其中部分提取物具有良好的酪氨酸酶，乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，可应用于与药品结合为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药理作用的研究。附图说明

[0022] 图1为本发明软枣猕猴桃根提取物的部分提取分离图；

[0023] 图2为本发明软枣猕猴桃根提取物8个馏分中Fr2、Fr4和Fr7的层析分离过程；

[0024] 图3为本发明软枣猕猴桃根提取物8个馏分中Fr1、Fr3的层析分离过程；

[0025] 图4为本发明软枣猕猴桃根提取物8个馏分中Fr5、Fr6的层析分离过程；

[0026] 图5为本发明软枣猕猴桃根提取物中5种化合物分析时的高效液相色谱图；

[0027] 图6为本发明软枣猕猴桃根提取物中5种化合物分析时的高效液相色谱图。

[0028] 其中，图5和图6中5种化合物分别为：7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮(1)；3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮(2)；儿茶素(3)；槲皮素(5)；异槲皮素(6)。

具体实施方式

[0029] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0030] 实施例1

[0031] 一种软枣猕猴桃根提取物的提取分离方法，包括以下步骤：

[0032] S1：12kg软枣猕猴桃根晒干除去水分之后用粉碎机粉碎成颗粒状，加入 90％的乙醇溶剂40L，溶剂需要没过药材10cm左右，加入溶剂后需要浸泡48h 并且在浸泡过程中需要每隔2h充分搅拌一次，后将提取液取出浓缩得浸膏；

[0033] S2：加入水溶解S1得到的浸膏，加入3倍浸膏体积的乙酸乙酯溶剂，进行4次萃取，合并全部乙酸乙酯萃取液。在40℃、0.09Mpa下减压回收，得乙酸乙酯萃取浸膏。

[0034] S3：采用100-200目的硅胶进行第一步粗分，将乙酸乙酯浸膏样品风干后碾磨成细分，过100目筛，之后干法上样，采用浓度梯度为1∶(100～1)的甲醇：二氯甲烷溶剂进行柱层析，使用高效液相色谱法(HPLC)以及薄层色谱法 (TLC)进行分析，最后将样品划分为8段，即得到8个馏分。之后将得到的 8段样品，分别命名为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8；

[0035] 图1为软枣猕猴桃根提取物的部分提取分离图，图2、图3和图4为8个馏分的层析分离过程图，如图所示：

[0036] 样品Fr1，为淡黄色固体，易溶于乙酸乙酯中。将Fr1段样品经TLC分析，使用(200-300目)硅胶为填料，采用柱层析的方法，样品干法上样，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，洗脱比例为(20：1，10：1，5：1，1：1)收集洗脱液，每100mL收集一次。将收集到的洗脱剂，每5瓶进行一次TLC 分析，合并化合物相似的溶剂，共收集得到20个组分。合并组分1～5得 Fr1-1(2.2g)，合并组分6～20得Fr1-2(4.5g)，将两组组分进步一进行TLC 分析，使用硅胶(300-
400目)为填料继续对Fr1-1进行分离操作使用石油醚 -乙酸乙酯为洗脱剂(20:1,15:1,9:
1,1:1)洗脱液每20mL收集一次，最终得化合物RZT-1(15.93mg)，RZT-2(19.25mg)。对Fr1-2也使用硅胶300-400 目进行柱层析，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂(10：1，5：1，3：1，1：1)，洗脱液每20mL收集一次，最终得化合物RZT-3(43.51mg)。

[0037] 样品Fr2，易溶于乙酸乙酯中。选用硅胶200-300目为填料进行柱层析，选取石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂比例(20：1，10：1，1：1)。洗脱溶液每100ml 收集一次，每收集四瓶洗脱液进行一次TLC检测分析。实验一共得到20个组分，合并组分1-15得Fr2-1，以及合并组分6-20得Fr2-2。对样品Fr2-1使用葡萄糖聚凝胶(LH-20)为填料进行进一步的柱层析实验，氯仿-甲醇(10：1) 为洗脱剂进行洗脱，洗脱溶液每20mL收集一次，进行TLC分析，最终得到白色固体化合物RZT-4。

[0038] 样品Fr3，易溶于甲醇中。选用硅胶200-300目作为填料进行柱层析，根据样品的性质以及TLC分析，选择二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂进行洗脱。洗脱比例为(50：1，30：1，15:1，8：1，3：1，1：1)洗脱溶剂每100mL收集一次，每收集400mL进行一次TLC分析，实验一共收集到
32个组分。经分析，合并组分1-6得Fr3-1，合并组分7-20得Fr3-2，合并组分21-32得Fr3-3。
对样品Fr3-1继续使用硅胶进行反复柱层析实验洗脱溶剂以及洗脱比例不变，最终得到化合物RZT-5。对样品Fr3-2也使用硅胶进行反复柱层析实验，洗脱比例为(15：1，5：1)最终得化合物RZT-6，对样品Fr3-3也使用硅胶进行反复柱层析实验洗脱溶剂不变，洗脱比例为(5：
1，3：1，1：1)最终得到化合物RZT-7。

[0039] 样品Fr4，易溶于丙酮中。选用硅胶200-300目为填料进行柱层析实验。选取氯仿-丙酮作为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂比例为(20：1，10：1，5：1，1：1)洗脱溶剂每50mL收集一次。每收集200mL进行一次TLC分析，最终得组分15个，经分析合并组分1-3得Fr4-1，合并组分4-
9得Fr4-2，合并组分10-15得Fr4-3。选取硅胶作为填料对样品Fr4-1进行反复柱层析实验，洗脱溶剂和洗脱比例不变，最终得化合物RTZ-8。同样使用硅胶对样品Fr4-2进行反复柱层析实验，洗脱比例为(10：1，5：1)每10mL收集一次，每收集40mL 进行一次TLC分析，最终合并类似组分得到化合物RZT-9。对样品Fr4-3使用硅胶做反复柱层析实验，洗脱溶剂不变，洗脱比例为(5：1，1：1)。最终得到化合物RZT-10。

[0040] 样品Fr5，易溶于甲醇。选用CHP为填料进行柱层析实验。洗脱剂选用甲醇-水为洗脱剂进行洗脱。洗脱剂比例为(1：10～1：1)洗脱溶剂每100mL 收集一次，每400mL进行一次TLC分析，最终一共收集组分17个，经分析合并组分1-7得Fr5-1，合并组分8-17得Fr5-2。继续选用CHP作为填料对Fr5-1 进行柱层析实验，洗脱溶剂不变洗脱比例不变，最终得化合物RZT-11。选取硅胶(300-400目)为填料对FRr5-2继续进行柱层析实验，选用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行洗脱比例为(20：1，10：1，5：1)每25mL收集一次每100mL 进行一次TLC分析，最终合并相同组分溶剂得化合物RZT-12，化合物RZT-13。

[0041] 样品Fr6，易溶于甲醇溶剂。选用硅胶(100-200目)为填料进行柱层析分离实验。洗脱剂选用二氯甲烷-甲醇溶剂比例为(20：1，15：1，8：1，2： 1)每100mL收集一次，每收集400mL进行一次TLC分析，最终一共得到组分10个。经实验分析合并组分1-3得化合物RZT-
14，合并组分4-6得样品Fr6-1，合并组分7-10得样品Fr6-2。对于样品Fr6-1选用葡萄糖聚凝胶(LH-20)进行柱层析实验，选用甲醇-水为洗脱剂洗脱比例(1：10～1：1)，洗脱溶剂每
20mL收集一次，每80mL进行一次TLC分析，经过反复柱层析实验，最终得到了4个组分，经分析合并组分1-2得化合物RZT-15，合并组分3-4得化合物RZT-16。对样品Fr-6-2样品选用硅胶(300-400目)作为填料进行柱层析，洗脱溶剂以及洗脱梯度均保持不变，经过反复柱层析实验最终得化合物RZT-17。

[0042] 样品Fr7为黄色固体，易溶于甲醇溶剂。选用硅胶(100-200目)作为填料进行柱层析实验。实验分析后选择使用二氯甲烷-甲醇溶剂作为洗脱剂，洗脱溶剂的洗脱比例为(15：1，10：1，5：1，1：1)洗脱溶剂每100mL收集一次，每收集400mL进行一次TLC分析，本次实验一共得到组分12个，经实验分析后合并组分1-3得样品Fr7-1，合并组分4-9得样品Fr7-2，合并组分10-12得到化合物RZT-18。经实验分析，选用葡萄糖聚凝胶(LH-20)作为填料对样品Fr7-1进行反复柱层析实验，洗脱溶剂选用甲醇-水溶剂(1：10～1： 1)。洗脱溶剂每10mL收集一次，每收集40mL进行一次TLC分析，本次实验一共收集组分3个，经实验分析，合并组分
1-2得化合物RZT-19。组分3 浓缩之后放置冷却得化合物RZT-20。实验对于样品Fr7-2选用硅胶(300-400 目)作为填料进行柱层析实验，洗脱剂选用二氯甲烷-甲醇溶剂，洗脱比例为 (10：1，5：1)洗脱溶剂每20mL收集一次，每80mL进行一次TLC分析，最终合并相同成分的组分，得到化合物RZT-21。

[0043] 为鉴定21种化合物结构，对提取的21种化合物分别通过核磁共振技术 (1HNMR、l3CNMR、1H-1H COSY、DEPT、HMBC、HMQC)，紫外光谱技术(UV)，质谱技术(MS)等现代波谱技术确定了具体结构，表1为21 种化合物的名称和结构式，如表1所示，这21种化合物分别为：7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮，3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮，儿茶素，β-sitosterol，槲皮素，异槲皮苷，齐墩果酸，2β,3β,23α-三羟基齐墩果烷-12-烯-28-酸， Arjunolicacid，Euscaphicacid，

[0044] 2α,3β,19α,23-quahydroxyusu-12-en-28-acid-28-O-β-D-pyranglucosidase，乌苏酸，2α,3β-二羟基齐墩果烷-12烯-28酸，2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12烯-28- 酸，3β-羟基-20-烯-乌苏烷，科罗索酸，2α,3β,24-三羟基乌苏烷-12-烯-28- 酸，2α,3β,19α,23-四羟基乌苏烷-12-烯-28-酸，2α,3β,23-三羟基乌苏烷-12,20(30)-二烯-28-酸，2α,3α,24-三羟基乌苏烷-12,20(30)-二烯-28-酸，胡萝卜苷。

[0045] 表1化合物的名称和结构式

[0046]

[0047]

[0048]

[0049] 本发明还提供上述软枣猕猴桃根提取物中5种物质的分析方法，包括如下步骤：

[0050] 1、购买各物质的标准品：7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1, 8-二羟基-3-甲氧基-酮(1)；3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′, 4′-四羟基黄酮(2)；儿茶素(3)；槲皮素(5)；异槲皮素(6)；用甲醇配制成浓度为 10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL和200μg/mL 将配好的样品加入到样品瓶中使用保鲜膜封口，低温下保存。

[0051] 2、用高效液相色谱仪分别对5种标准品溶液进行检测，选择不同的流动相梯度洗脱方法，根据检测结构不断调整色谱条件，本实验的软枣猕猴桃根乙醇提取液的HPLC方法中，使用的仪器为：安捷伦1260型，自动进样器为 G1128B，DAD检测器，检测波长为210nm，230nm，280nm，320nm，380nm。色谱柱为Phenomenex Luna C-18(250mm*4.8mm 5um)。进样量为10μL，柱体温度为28℃，溶液流速为1mL/min。四元泵为G1321B。HPLC使用方法中流动相为A：0.2％磷酸水；B：甲醇。溶剂的洗脱梯度为：0～10min， A:90％～80％,B:10％～20％；10～20min，A：80％～60％，B：20％～40％；20～30min， A：60％～30％，B：40％～70％；30～
40min，A：30％～0％，B：70％～100％；40～50min， A：0％～30％，B：100％～70％；50～
60min，A：30％～70％，B：70％～30％；60～70min， A：70％～90％，B：30％～10％；

[0052] 用高效液相色谱器分析上述配制的各化合物的系列标准溶液，分别记录各化合物的峰面积，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标(x)，其对应的峰面积响应值(mAu)为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算回归方程，标准曲线、相关系数和线性范围，5个成分均呈良好线性关系(R2>0.99)。

[0053] 图5，图6为7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3- 甲氧基-酮(1)；3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮(2)；儿茶素(3)；槲皮素(5)；异槲皮素(6)5种化合物进行HPLC分析后所得的高效液相色谱图，表2即为各化合物标准曲线及其参数。

[0054] 表2软枣猕猴桃根提取物的标准曲线公式

[0055]

[0056]

[0057] 3、称取软枣猕猴桃根5.0g，放入100mL带塞锥形瓶中，加入90％的乙醇溶液40mL，超声提取12h，将上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取1mL注入 HPLC样品瓶中，4℃下保存待用。

[0058] 分别吸取25μL各对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，找出各对照品化合物对应的峰，记录其峰面积并用标准曲线法计算各化合物的含量，结果见表3。计算公式为：

[0059]

[0060] 表3各化合物含量

[0061]

[0062] 本发明还保护上述软枣猕猴桃根提取物的应用，也就是将上述软枣猕猴挑根提取物与药品结合后在为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药理作用的研究方面的应用。为验证其功效，作如下实验：

[0063] 1、α-葡萄糖苷酶活性抑制实验

[0064] 测定方法：将提取物溶于DMSO配成浓度为1.0mg/mL的溶液，在96孔板中，1、2、3列24孔中均加入20μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)、20μL 待测样品和20μLα-葡萄糖苷酶，作为样品组；4、5、6列24孔中均加入40μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)和20μL待测样品，作为控制组。

[0065] 7、8、9列3孔中均加入40μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)和20μL α-葡萄糖苷酶作为空白组；在37℃下培养15min后，每孔加入20μL 2.5mmol/L PNPG糖苷，再在37℃下培养15min后，每孔加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应。用酶标仪测定在405nm波长处的吸光值大小。用阿卡波糖作为阳性对照，抑制率％＝[1-(OD样品-OD控制)/OD空白]×
100％。结果如表3

[0066] 2、乙酰胆碱酯酶活性抑制实验

[0067] 测定方法：将提取物溶于DMSO配成浓度为1.0mg/mL的溶液，在96孔板中，1、2、3列24孔中均加入140μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为7.4)、 20μL待测样品和20μL乙酰胆碱酯酶，作为样品组；4、5、6列24孔中均加入160μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为7.4)和20μL待测样品，作为控制组； 7、8、9列3孔中均加入160μL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH为7.4)和20μL乙酰胆碱酯酶，作为空白组；在4℃下培养20min后，每孔加入10μL 15mM ACTI 和10μL 2mM DTNB，再在37℃下培养20min后，用酶标仪测定在412nm波长处的吸光值大小。用石杉碱甲作为阳性对照，抑制率％＝[1-(OD样品-OD控制)/OD空白]×100％。

[0068] 3、酪氨酸酶活性抑制实验

[0069] 将提取物溶于DMSO配成浓度为1.0mg/mL的溶液，再用DMSO稀释到不同浓度梯度；在试管中，每30μL样液，用970μL 0.05mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)稀释，接着加入1mL 1mg/mL的L-酪氨酸溶液，最后加入1.0mL蘑菇酪氨酸酶溶液(200U/mL)；分别用30μL DMSO和30μL曲酸溶液作为空白对照和阳性对照；测试混合物(3.0mL)漩涡混合后，在490nm测定初始吸光度， 37℃下孵育20min，同样在490nm测定吸光度；酪氨酸酶活性抑制率计算公式如下：

[0070] 抑制率％＝[(A2－A1)－(B2－B1)]/(A2－A1)×100％

[0071] 注：A1—0min 时空白组在490nm下的初始吸光度值；

[0072] A2—20min时空白组在490nm下的吸光度值；

[0073] B1—0min时试样在490nm下的初始吸光度值；

[0074] B2—20min时试样在490nm下的吸光度值。

[0075] 表4酶活性实验数据

[0076]

[0077]

[0078] 表4为三种酶活性实验数据，表4中的化合物序号1-12与权利要求1中化合物的前后关系一致，通过对分离得到的化合物进行酶实验活性的研究，探究具有生物活性的化合物。实验研究发现化合物7具有较高的生物活性，其中对于α-葡萄糖苷酶的抑制效果达到了577.44％，具有较高的生物活性以及应用前景。化合物2、5以及6都有各自不错抑制酶的生物活性，本实验通过对酶活性成分的研究，为后期软枣猕猴桃根提取物在与药品结合为改善癌症患者晚期生活水平的抗癌药理作用的研究。

[0079] 本发明还对实验方法的稳定性进行了验证：

[0080] 本实验开始后，在48小时内每间隔2小时进行一次HPLC分析，实验记录下每一个标准品的峰面积和其对应的响应值，然后依次计算其中化合物的含量，取平均值。进行三次平行对照实验。计算出RSD值后发现结果≤1.95％证明该实验稳定性良好。

[0081] 实验的日间精密度验证，样品需要经过3天的高效液相色谱分析，并且需要保证每天在相同的时间下进行测定，测定时候需要保持一致的进样量5μL，然后记录下对应的峰面积以及响应值，然后计算平均值，从而得到RSD值，计算结果表明RSD值均≤2.1％，由此证明日间精密度良好。

[0082] 实验的日内精密度验证需要用HPLC进行相同的平行测定同一样品的同一种标准溶剂，需要一直不断重复分析6次，每次进样量5μL需保持一致，然后记录数据计算得到RSD值，实验结果表明RSD值均小于1.38％，由此证明实验日内精密度良好。

[0083] 实验的重复性及回收率方法

[0084] 实验的重复性方法，取软枣猕猴桃根4份，每份2.5g依照同样的方法对样品进行高效液相色谱分析，每一种样品都需要进行3次相同的平行实验，进样量也需要保持一致10μL，记录下实验对应的数据，计算平均值，从而得出 RSD值，实验结果表明RSD值均小于3.2％，所以由此证明该试验的重复性保持良好。

[0085] 实验的回收率方法，取软枣猕猴桃根4份，每份0.1g，然后向每份样品中加入7-O-[β-D-吡喃木糖-(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]-1,8-二羟基-3-甲氧基-酮(1), 3-O-[β-D-吡喃鼠李糖-(1-6)-β-D-吡喃半乳糖]-5,7,3′,4′-四羟基黄酮(2)，儿茶素(3)，槲皮素(5)，异槲皮素(6)适量。用同样的方法将样品制备成溶液，然后计算回收率，实验发现计算所得的RSD值均小于3.35，并且发现实验所计算出的回收率均在96.8-103.5之间，因此实验结果表面，本次实验的高效液相色谱所设置的数据可行性良好，实验结果理论充分。本次实验所得到的结果和数据均如下表5所示。

[0086] 表5实验分析数据

[0087]

[0088] 本实验说明，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改

[0089] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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