[0001] 领域
[0002] 本
发明涉及药物分析领域，具体涉及一种电化学改性的液相色谱对手性异构体的分离方法。
[0003] 背景
[0004] 液相色谱技术是用来分离混合物的关键技术之一。多种类型的复杂混合物质(如血清、药物制剂、废液等)可以通过流动相和固定相的组合使之分离，然而，因为物质的不同特性，通常需要开发更多的固定相。
[0005] 电化学调制液相色谱技术(简称EMLC)，通过施加电位至固定相上，从而改变固定相表面的性质，最终改变色谱的分离能
力。早期的EMLC主要侧重在金属
电子沉积和
氧化还原反应影响分离。最近的研究中，EMLC更多地应用于通过使用多孔
石墨烯作为固定相进行化合物手性异构体地分离。这种分离，主要依托电位的变化，影响供体和受体的特性。即如电位为正，多孔
石墨烯成为强的受体，化合物则为供体在体系上呈现强保留。如电位为负，则反之。
[0006] 概述
[0007] 一方面，本公开涉及一种电化学改性的液相色谱对手性异构体的分离方法，其步骤包括：
[0008] 通过在液相色谱固定相上施加电位，固定相包括多孔石墨烯和手性异构体，流动相包括乙腈
水溶液和β-环糊精溶液；以及
[0009] 使用所述液相色谱对所述手性异构体进行分离。
[0010] 另一方面，本公开涉及色谱柱的制备方法，包括：
[0011] 将不锈
钢管依次于甲醇溶液和LiClO4溶液中煮沸；
[0012] 将多孔石墨烯分散在二甲
氨基甲烷/乙腈溶液中得第一混合物；
[0013] 填料：将第一混合物装填至
不锈钢管中。
[0015] 图1示出了本公开某些实施方案的在不同电位下供体和受体化合物之间的相互作用。
[0016] 图2示出了本公开某些实施方案的色谱柱结构示意图。
[0017] 图3示出了本公开某些实施方案的海索比妥手性异构体在流动相中不加β-环糊精和加β-环糊精，以及不同电位下地分离效果图。
[0018] 图4示出了本公开某些实施方案的美芬妥英手性异构体在流动相中不加β-环糊精和加β-环糊精，以及不同电位下地分离效果图。
[0019] 详述
[0020] 在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其他方法、部件、材料等的情况下仍实现实施方案。
[0021] 除非本公开中另有要求，在整体
说明书和所附的
权利要求中，词语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
[0022] 在整体说明书中提到的“一实施方案”、“实施方案”、“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同
位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案，此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
[0023] 定义
[0024] 在本公开中，β-环糊精是由7个吡喃型
葡萄糖分子组成的环状结构化合物，具有特殊的筒状结构，可以与多孔无机、有机分子结合成主客体包络物。
[0025] 在本公开中，海索比妥分子式为C12H16N2O3，是一种具有
镇静和
催眠效果的巴比妥衍
生物。
[0026] 在本公开中，美芬妥英分子式为C12H14N2O2，化学名5-乙基于-3-甲基-5-苯基乙内酰脲，是一种抗
癫痫病、抗
心律失常药。
[0027] 在本公开中，工作
电极是指在测试过程中可引起试液中待测组分浓度明显变化的电极。
[0028] 在本公开中，参比电极是指测量各种电极电势时作为参照比较的电极。在参比电极上进行的电极反应必须是单一的可逆反应，电极电势稳定和重现性好。通常多用微溶盐电极作为参比电极，氢电极只是一个理想的但不易于实现的参比电极。
[0029] 在本公开中，
对电极为反电极，对电极的作用是和
工作电极组成回路以通过电极。
[0030] 在本公开中，手性化合物是指分子量、分子结构相同，但左右排列相反，如实物与其镜中的映体。
具体实施方式
[0031] 一方面，本公开涉及一种电化学改性的液相色谱对手性异构体的分离方法，其步骤包括：
[0032] 通过在液相色谱固定相上施加电位，固定相包括多孔石墨烯和手性异构体，流动相包括乙腈水溶液和β-环糊精溶液；以及
[0033] 使用所述液相色谱对所述手性异构体进行分离。
[0034] 在某些实施方案中，流动相还包括LiClO4溶液和
磷酸盐缓冲液。
[0035] 在某些实施方案中，流动相中乙腈体积分数浓度为20％至30％。
[0036] 在某些实施方案中，流动相中乙腈体积分数浓度为20％。
[0037] 在某些实施方案中，流动相中β-环糊精浓度为10mM至20mM。
[0038] 在某些实施方案中，流动相中β-环糊精浓度为15mM。
[0039] 其中，通过β-环糊精与手性识别固定相中的多孔石墨烯(PGC)表层的电
吸附作用实现分离，这种分离主要依托电位的变化调节分离效果。
[0040] 在某些实施方案中，流动相中LiClO4浓度为0.05M至0.15M。
[0041] 在某些实施方案中，流动相中LiClO4浓度为0.1M。
[0042] 在某些实施方案中，流动相中磷酸盐缓冲液浓度为10mM至30mM。
[0043] 在某些实施方案中，流动相中磷酸盐缓冲液浓度为20mM。
[0044] 在某些实施方案中，流动相用磷酸盐缓冲液调PH为2至3.45。
[0045] 在某些实施方案中，流动相用磷酸盐缓冲液调PH为2。
[0046] 在某些实施方案中，电位通过构建电化学改性的色谱柱施加。
[0047] 在某些实施方案中，工作电极为多孔石墨烯颗粒，对电极为不锈钢管，参比电极为含有饱和NaCl溶液的Ag/AgCl电极。
[0048] 在某些实施方案中，电位设置范围为+0.5V至-1.0V。
[0049] 在某些实施方案中，多孔石墨烯作为二维基面上具有
纳米级孔隙的
碳材料，具有优良的
导电性，孔的存在促进了物质运输效率的提高，特别是
原子级别的孔可以起到筛分不同尺寸的离子/分子的作用。
[0050] 在某些实施方案中，液相色谱的进样体积为0.5μL。
[0051] 在某些实施方案中，液相色谱的流速为0.9ml/min。
[0052] 在某些实施方案中，液相色谱的洗脱时间为30分钟。
[0053] 在某些实施方案中，液相色谱的柱温为30℃至40℃。
[0054] 在某些实施方案中，液相色谱的柱温为30℃。
[0055] 另一方面，本公开涉及色谱柱的制备方法，包括：
[0056] 将不锈钢管依次于甲醇溶液和LiClO4溶液中煮沸；
[0057] 将多孔石墨烯分散在二甲氨基甲烷/乙腈溶液中得第一混合物；
[0058] 填料：将第一混合物装填至不锈钢管中。
[0059] 其中，不锈钢管为附有Nafion交换膜地多孔不锈钢管。
[0060] 在某些实施方案中，不锈钢管于甲醇溶液和LiClO4溶液中煮沸时间均为0至30分钟。
[0061] 在某些实施方案中，不锈钢管于甲醇溶液和LiClO4溶液中煮沸时间均为10分钟。
[0062] 在某些实施方案中，二甲氨基甲烷/乙腈溶液中，二甲氨基甲烷与乙腈的体积比为10：5至10:9。
[0063] 在某些实施方案中，二甲氨基甲烷/乙腈溶液中，二甲氨基甲烷与乙腈的体积比为10:7。
[0064] 在某些实施方案中，填料压力为300bar至400bar。
[0065] 在某些实施方案中，填料压力为345bar。
[0066] 在某些实施方案中，液相色谱的色谱柱规格为长为9.2cm、内径为0.4cm。
[0068] 将一根附有Nafion交换膜的多孔不锈钢管(9.2cm×0.4cm)在甲醇溶液中煮沸10分钟，然后转移至1M LiClO4溶液中煮沸10min。将多孔石墨烯分散在二甲氨基甲烷/乙腈(10：7,v/v)中形成稀泥状，然后在345bar压力下装填至色谱柱中，其中导电的石墨烯颗粒作为工作电极，色谱柱作为对电极。
[0069] 色谱条件：流动相分成两种，一种含β-环糊精：20％乙腈(0.1M LiClO4)和80％水溶液(含15mMβ-环糊精，0.1M LiClO4,20mM磷酸盐缓冲液，pH2.0)
[0070]
电压设置：采用包含Ag/AgCl/饱和NaCl电极的的180mV的开路电压，工作电为设置范围为+0.5～-1.0V。
[0071] 溶液配制：用流动相配制500ppm的HE或者ME的样品溶液。
[0072] 进样体积：0.5μl
[0073] 洗脱时间：30min。
[0074] 如图1所示，为在不同电位下供体和受体化合物之间的相互作用，即如电位为正，多孔石墨烯成为强的受体，化合物则为供体在体系上呈现强保留。如电位为负，则反之。
[0075] 如图2所示，为色谱柱的结构，包括：
注射器1，LC
泵2，实心不锈钢管3，多孔石墨烯颗粒(工作电极)4，
电解液玻璃容器5，含有饱和NaCl溶液的Ag/AgCl电极(参比电极)6，多孔不锈钢管(对电极)7。
[0076] 海索比妥(HE)测试结果如图3所示，上半部分A结果是未添加β-环糊精的，手性异构体没有分离；下半部分为B结果，添加15mMβ-环糊精至流动相中，异构体d和I在负电位分离效果不佳(分离因子1.08)，在0和+0.5V正电位时，异构体d和I分离因子分别位1.12和1.28。正电位和负电位时，异构体d和I的出峰顺序相反。
[0077] 美芬妥英(ME)测试结果如图4所示，上半部分A结果是未添加β-环糊精的，手性异构体没有分离；下半部分为B结果，添加15mMβ-环糊精至流动相中，异构体d和I在负电位分离效果不佳(分离因子1.06)，在0和+0.5V正电位时，异构体d和I分离因子分别位1.10和1.21。正电位和负电位时，异构体d和I的出峰顺序相反。
[0078] 测试结果表明，在流动相中添加β-环糊精，有助于实现手性异构体的分离，且分离的效果根据点位的调整会发生显著变化，这与我们前文所述的图1中的描述，电位的变化引起电子受体与供体的变化，从而增强或者削弱某些化合物的保留，最终影响手性异构体的洗脱顺序。
[0079] 从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本公开的具体实施方案，但是在不偏离本公开的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种
变形或改进、这些变形或
修改都应落入本公开所附权利要求的范围。
