使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的方法
阅读：0发布：2021-03-27
专利汇可以提供使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于制备L‑甲硫 氨 酸的方法，其中O‑ 磷酸 ‑L‑高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L‑甲硫氨酸和H3PO4。所述转化通过称为依赖O‑磷酸‑L‑高丝氨酸(OPHS)的甲硫氨酸合酶实现。还描述了依赖O‑磷酸‑L‑高丝氨酸(OPHS)的甲硫氨酸合酶，即能将O‑磷酸‑L‑高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L‑甲硫氨酸和H3PO4的 蛋白质 以及已经过基因修饰从而能从O‑磷酸‑L‑高丝氨酸和甲硫醇制备L‑高丝氨酸的 微 生物 。还描述了用于筛选催化O‑磷酸‑L‑高丝氨酸和甲硫醇至L‑甲硫氨酸和H3PO4的转化的酶的方法。，下面是使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇根据以下反应方案通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4：
O-磷酸-L-高丝氨酸+CH3-SH<＝>L-甲硫氨酸+H3PO4；
其中所述通过酶的转化通过使用依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶实现，所述依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶是通过突变衍生自胱硫醚γ合酶(EC2.5.1.48)的蛋白质，并且所述依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:
6-21和29所示的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其是在体外进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法通过使用产生如权利要求1所定义的蛋白质的微生物进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法通过使用产生如权利要求1所定义的蛋白质的微生物进行。
5.具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的酶活性的蛋白质用于将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的用途，并且所述蛋白质的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6-21和29所示的序列。
6.具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的酶活性的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6-21和29所示的序列。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其还显示了将O-磷酸-L-高丝氨酸和硫化物转化为L-高半胱氨酸和H3PO4的酶活性。
8.编码权利要求6或7所述的蛋白质的核酸分子，所述蛋白质具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的酶活性。
9.包含权利要求8所述的核酸分子的载体。
10.包含权利要求8所述的核酸分子或权利要求9所述的载体的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其表达权利要求6或7所述的蛋白质。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞用于将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的用途。
13.用于制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其包括权利要求1至4任一项所述的用于制备L-甲硫氨酸的方法并还包括将L-甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸的步骤。
14.用于制备半胱氨酸的方法，其包括权利要求1至4任一项所述的用于制备L-甲硫氨酸的方法并还包括将L-甲硫氨酸转化为半胱氨酸的步骤。
15.用于制备谷胱甘肽的方法，其包括权利要求1至4任一项所述的用于制备L-甲硫氨酸的方法并还包括将L-甲硫氨酸转化为谷胱甘肽的步骤。
16.用于制备2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的方法，其包括权利要求1至4任一项所述的用于制备L-甲硫氨酸的方法并还包括将L-甲硫氨酸转化为2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的步骤。
使用突变的胱硫醇γ-合酶从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制
备L-甲硫氨酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4。所述转化通过称为依赖O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)的甲硫氨酸合酶的酶实现。本发明还提供了依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶，即能够将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的蛋白质。本发明还涉及已经过基因修饰从而能从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的微生物。
[0002] 所述酶和方法也能有利地用于合成甲硫氨酸的衍生物如S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸和甲硫腺苷。本发明还提供了筛选催化O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇至L-甲硫氨酸和H3PO4转化的酶的方法。
背景技术
[0003] L-甲硫氨酸是源自从通过激活L-天冬酰磷酸接着还原至L-天冬氨酸半醛和L-高丝氨酸的L-天冬氨酸的代谢中必需的氨基酸。在细菌以及真菌中，L-高丝氨酸经过O-乙酰化作用来形成琥珀酰酯或乙酰酯，所述酯本身经过直接用硫化物(SH2)的硫缩合作用以形成L-高半胱氨酸或在转化为高丝氨酸之前间接用L-半胱氨酸以形成L-光硫醚。接着使用甲基四氢叶酸使高半胱氨酸甲基化以形成甲硫氨酸。
[0004] 在植物中，作为胱硫醚前体使用的L-高丝氨酸酯为O-磷酸-L-高丝氨酸。通过胱硫醚β裂合酶的作用，之后将胱硫醚转化为高半胱氨酸。高半胱氨酸的甲基化之后形成甲硫氨酸。O-磷酸-L-高丝氨酸也存在于通过磷酸-吡哆醛酶苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)作用的细菌、植物、真菌和哺乳细胞的代谢中，作为L-苏氨酸的直接前体。在植物中，存在严格的调控功能从而将碳通量在O-磷酸-L-高丝氨酸分叉点控制在蛋氨酸和苏氨酸(Amir等，TRENDS Plant Science 7(2002)，153)。文献(详见例如Kreft等，Plant Physiol，104(1994)，1215；Ravanel等，Arch.Biochem.Biophys.316(1995)，572)中已报道了随着O-磷酸-L-高丝氨酸转化为L-胱硫醚和L-高半胱氨酸，同时释放磷酸，L-半胱氨酸和硫化物(SH2)都可以通过植物胱硫醚γ合酶缩合。还报道了非常限制硫基底物的范围，除了L-半胱氨酸，只有少数底物能被接受。
[0005] 虽然其为必需的氨基酸，在动物中，甲硫氨酸并不是初始合成的，动物必须摄取甲硫氨酸或包含甲硫氨酸的蛋白质或相关的含硫化合物。特别地，甲硫氨酸对于家禽和牲畜喂养是必需的并在家禽和牲畜食用的蔬菜中存在量不足。有效饲养因而需要外部甲硫氨酸供应。至今，如果并非全部那么绝大多数用于喂养动物的甲硫氨酸源自石油化工。制备甲硫氨酸的一个局限在于还原硫消耗的能量成本。因此，需要能提供其他制备此氨基酸的途径，优选通过使用可再生来源，其能允许使用微生物，在所使用的微生物中甲硫氨酸的合成适应工业规模生产。
发明内容
[0006] 本发明通过提供用于制备L-甲硫氨酸的方法来说明此需要，所述方法中O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4。在所述方法中，硫的来源是甲硫醇。在此化合物中，硫通过已经还原的硫化物提供。此外，与取决于使用乙酰化的或琥珀酰化的高丝氨酸衍生物的标准代谢途径相比，使用O-磷酸-L-高丝氨酸作为前体，每分子合成的甲硫氨酸节省了至少两个碳原子。总体而言，此途径在合成甲硫氨酸及其衍生物中允许较佳产量。
[0007] 因此，本发明涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中L-甲硫氨酸按照以下反应方案通过酶制备：
[0008] O-磷酸-L-高丝氨酸+CH3-SH<＝>L-甲硫氨酸+H3PO4
[0009] 目前没有报告表示天然存在具备将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的能力的蛋白质。本发明的发明人考虑以节省成本的方法从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-甲硫氨酸的选择并为此目的，设计不是天然存在的并具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质。从所附实施例显而易见，本发明的发明人开发的体系允许制备具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的能力的酶。此外，本发明的发明人已经成功通过引用此体系产生新的酶变体，所述酶变体衍生自已存在的酶，所述酶突变体具有将O-磷酸-L–高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的能力。为此目的，其从已存在的未显示将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力的酶开始，从所述存在的酶制备突变体并选择显示将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力的酶。因此，本发明的发明人能确定之前并未描述过的新的酶活性并提供用于制备相应酶的可靠的并可再生的方法。在本发明的上下文中，相应的酶指依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶。
[0010] 因此，本发明特别涉及用于制备L-甲硫氨酸的方法，其中O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇按照以下反应方案通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4：
[0011] O-磷酸-L-高丝氨酸+CH3-SH<＝>L-甲硫氨酸+H3PO4其中通过酶的转化通过使用依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶实现。
[0012] 原则上，任意依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶，即，任意具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力的蛋白质可用于根据本发明的方法。本发明首次描述了显示此能力的蛋白质并提供了用于提供其他显示此能力的蛋白质的方法。特别地，本发明公开了有可能从天然不具备将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的能力的植物胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)，通过突变和选择制备具有此能力的变体。
[0013] 将在下文根据本发明的蛋白质的部分中进一步描述依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶并且在根据本发明的方法中，可以使用任意所述的依赖O-磷酸-L-高丝氨酸的甲硫氨酸合酶。
[0014] 从所附实施例中显而易见，本发明的发明人成功制备了显示出将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力的几种不同的蛋白质。这些蛋白质的序列在SEQ ID No：6至29中显示。这些蛋白质通过如实施例中描述的来自植物胱氨酸γ合酶(EC 2.5.1.48)的筛选体系中的突变和选择制备，所述胱氨酸γ合酶天然不具备将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的能力。
[0015] 此外，从SEQ ID No：6至29中显示的序列，有可能提供其他保留了将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的活性的蛋白质。例如，有可能进一步增加蛋白质与底物O-磷酸-L-高丝氨酸和/或至底物甲硫醇的亲和性或改进如下进一步描述的蛋白质的其他特性。因此，在根据本发明的方法的优选实施方案中，O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸和H3PO4通过使用蛋白质实现，所述蛋白质选自组成如下的群组：
[0016] (a)包括SEQ ID No：6至29中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质；和
[0017] (b)具备与SEQ ID No：6至29中任一个至少60％的序列等同性并具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的酶活性的蛋白质。
[0018] 将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的酶活性可以例如通过所附实施例中描述的试验评估。为此目的，例如，有可能使具有甲硫氨酸营养缺陷型表型的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。此类菌株的例子是其中高丝氨酸转乙酰酶和高半胱氨酸合酶被移除或使其机能障碍的菌株。优选地，将两种酶全部移除或使其全部机能障碍。如图1所示，酿酒酵母取决于必须使用的O-乙酰基-高丝氨酸来合成高半胱氨酸，高半胱氨酸之后被转化为甲硫氨酸。所述酶，负责合成O-乙酰基高丝氨酸的高丝氨酸转乙酰酶由MET2基因编码。在MET2失去活性后，高丝氨酸不能再被转化为O-乙酰基高丝氨酸并且所有的高丝氨酸通量向磷酸高丝氨酸转化。由于MET2催化反应是酵母中仅有的O-乙酰基高丝氨酸来源，MET2基因的失活导致了酵母菌株表现为严格的甲硫氨酸营养缺陷型表型。但是，高半胱氨酸(最后的甲硫氨酸前体)可衍生自半胱氨酸(通过转硫作用途径)或衍生自S-腺苷甲硫胺酸的再循环。为了确保完全不会合成甲硫氨酸，MET6，编码负责从高半胱氨酸和甲基四氢叶酸合成甲硫氨酸的高半胱氨酸甲基转移酶的基因也被删除。
[0019] 因此，在用于检测蛋白质将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力的试验中，可以优选使用酿酒酵母菌株，其中将MET2和/或MET6基因删除或破坏，优选将两者都删除或破坏。双met2Δmet6Δ破坏的菌株不能在没有甲硫氨酸的存在下生长并且特别不能在甲硫醇作为硫源存在下生长。所述菌株不再能合成O-乙酰基高丝氨酸但是产生O-磷酸-高丝氨酸。可以之后将此类酵母菌株用编码蛋白质的核酸分子转化，待测所述蛋白质将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的能力。所述菌株在介质中/上生长，所述介质包含甲硫醇作为唯一的硫源并且在此类介质上的生长能力表示表达的蛋白质能将O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4。甚至更优选使用其中编码苏氨酸合酶的基因也例如通过删除或破坏而机能障碍的菌株。在met2Δmet6Δ菌株中，在通过THR1基因编码的高丝氨酸激酶催化的反应中合成OPHS，但由于OPHS通过THR4基因编码的苏氨酸合酶活性转化为苏氨酸，OPHS不可能充分聚集。所述三方met2Δmet6Δthr4Δ突变体菌株因而允许检测非常低的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的活性并已经用作细胞的首次筛选来分离赋予依赖OPHS的甲硫氨酸合酶活性的新的蛋白质。
[0020] 此酶的活性也可以进一步地通过体外的试验确定，其中O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇在体外适宜条件下用源自表达待测蛋白质的酵母菌株的非细胞提取物或用待测的(部13
分地)纯化的蛋白质培育，并且其中通过液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)，使用C 甲硫氨酸作为内部对照(Ravanel等。Archives of Biochemistry and Biophysics 316(1995)，572-
584)检测到甲硫氨酸的制备。
分地)纯化的蛋白质培育，并且其中通过液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)，使用C 甲硫氨酸作为内部对照(Ravanel等。Archives of Biochemistry and Biophysics 316(1995)，572-
584)检测到甲硫氨酸的制备。
[0021] 在所述体外试验中作为底物使用的O-磷酸-L-高丝氨酸可以通过例如图2所示的方法(Barclay等，J.Chem.Soc，Chem.Com(1994)815-816)提供。
[0022] 如上所述，显示将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的酶活性的蛋白质的例子是那些具备SEQ ID No：6至29中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法使用包括SEQ ID No：6至29中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质。但是，当然也有可能使用这些蛋白质的变体，即蛋白质的氨基酸序列显示与SEQ ID No：6至29中任一个所示的氨基酸序列的高度序列等同性，并且其显示出将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的酶活性。与SEQ ID No：6至29中任一个所示的序列的序列等同性至少为60％，优选至少为70％，甚至更优选至少80％，至少85％，至少90％或至少95％并最优选至少96％、97％、98％或99％。优选地，等同性的程度通过将相应序列与SEQ ID No：6至29中任一个所示的氨基酸序列对比确定。当对比的序列不具备同样的长度，等同性程度优选指在较短序列中氨基酸残基与在较长序列中氨基酸残基等同的百分比或指在较长序列中氨基酸残基与在较短序列中氨基酸残基等同的百分比。序列等同性的程度可以根据本领域熟知的方法，优选使用适宜的计算机程序如CLUSTAL确定。
[0023] 当使用CLUSTAL分析方法来确定特定的序列是否例如80％等同于参照的序列，可以使用默认设置或优选以下设置：矩阵：代矩阵30；开放空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延迟失真：40；空位分离距离：8，用于对比氨基酸序列。对于核苷酸序列对比，延伸空位罚分优选设置在5.0。
[0024] 优选地，在序列的完整长度上计算等同性程度。此外，如果在本发明的上下文中使用“同源性”，此术语优选表示“序列等同性”。
[0026] 因此，本发明还涉及用于制备S-腺苷甲硫氨酸的方法，其包括如上所述的根据本发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中将L-甲硫氨酸根据以下反应进一步转化为S-腺苷甲硫氨酸：
[0027] 甲硫氨酸+ATP＝>S-腺苷甲硫氨酸+PPi+Pi
[0028] 此通过酶的反应在本领域中已知并且催化此反应的酶在本领域中已知。这些酶被称为S-腺苷甲硫氨酸合酶(EC 2.5.1.6)。对应酶的实施例为酵母中的SAM1和SAM2。因此，在所述方法在生物体中进行的情况下，所述生物体优选过度表达对应的能将L-甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸的酶。
[0029] 也可能有利地将所述生物体进一步修饰从而避免S-腺苷甲硫氨酸的通量进入其他代谢途径。在酵母中，例如有可能有利地失活腺苷激酶的活性(EC 2.7.1.20，在酵母中通过ADO1基因编码)从而将S-腺苷甲硫氨酸的通量降低至S-腺苷高半胱氨酸。
[0030] 此外，本发明还涉及用于制备半胱氨酸的方法，其包括如上所述的根据本发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸被进一步转化为半胱氨酸。本领域已知L-甲硫氨酸至半胱氨酸的转化并且该转化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现。例如，可以首先将L-甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸，其之后进一步根据以下反应被转化为S-腺苷高半胱氨酸：
[0031] S-腺苷甲硫氨酸+甲基受体＝>S-腺苷高半胱氨酸+甲基化受体
[0032] 此反应通过依赖S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶催化。
[0033] S-腺苷高半胱氨酸可以之后根据以下反应被进一步转化为L-高半胱氨酸：
[0034] S-腺苷高半胱氨酸<＝>L–高半胱氨酸+腺苷
[0036] 之后L-高半胱氨酸可以根据以下反应被转化为L-胱硫醚：
[0037] L-高半胱氨酸+L-丝氨酸<＝>L-胱硫醚+H2O
[0038] 此反应通过胱硫醚β合酶(EC 4.2.1.22)催化。
[0039] 最终，L-胱硫醚根据以下反应被转化为半胱氨酸：
[0040] L-胱硫醚+H2O<＝>L-半胱氨酸+NH3+氧代丁酸酯
[0041] 此反应通过胱硫醚γ-裂合酶催化(EC 4.4.1.1)。
[0042] 如果所述方法在酵母中进行，有利地过度表达以下基因：SAM1、SAM2、SAH1、STR4和STR1。此外，应将编码酵母胱硫醚γ合酶的基因STR2删除从而降低从半胱氨酸至高半胱氨酸的反向合成。类似地，所述酵母还有利地包括MET突变，其废除依赖甲基四氢叶酸的甲硫氨酸合酶以及去除DUG2基因，其在主要的谷胱甘肽降解途径中涉及。
[0043] 此外，本发明还涉及用于制备谷胱甘肽的方法，其包括上述根据本发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中将L-甲硫氨酸进一步转化为谷胱甘肽。本领域中已知L-甲硫氨酸至谷胱甘肽的转化并且该转化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现。例如，L-甲硫氨酸可以首先被转化为S-腺苷甲硫氨酸，其之后进一步如上所述被转化为胱氨酸并且由此制备的胱氨酸根据以下反应被进一步转化为Glu-Cys(γ-L-谷酰基-L-胱氨酸)：
[0044] ATP+L-谷氨酸酯+L-胱氨酸<＝>γ-L-谷酰基-L-胱氨酸+ADP+Pi
[0045] 此反应通过谷氨酸半胱氨酸连接酶(EC 6.3.2.2)催化。
[0046] 由此制备的Glu-Cys之后根据以下反应被进一步转化为谷胱甘肽：
[0047] ATP+γ-L-谷酰基-L-胱氨酸+甘氨酸＝谷胱甘肽+ADP+Pi
[0048] 此反应通过谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)催化。
[0049] 如果所述反应在酵母中进行，优选联系用于制备胱氨酸的方法如上设计酵母并且所述酵母也应过度表达在胱氨酸至谷胱甘肽的转化中涉及的基因GSH1和GSH2。在特别优选的实施方案中，GSH1基因表达了耐反馈的酶。
[0050] 此外，本发明还涉及用于制备2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的方法，其包括根据如上所述的本发明的用于制备L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸根据以下反应被进一步传化为2-氧代-4-甲硫基丁酸酯：
[0051] 甲硫氨酸+2-氧代酸＝>2-氧代-4-甲硫基丁酸酯+L-氨基酸
[0052] 本领域已知此通过酶的反应并且本领域已知催化此反应的酶。这些酶被称为甲硫酸氨转氨酶(EC 2.6.1.88)。对应的酶的例子是酵母中的ARO8、BAT1、BAT2。因此，在所述方法在生物体中进行的情况下，所述生物体优选过度表达能将L-甲硫氨酸转化为2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的对应的酶。
[0053] 也有可能有利地将所述生物体进一步修饰从而避免2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的通量进入其他代谢途径。在酵母中，例如有可能有利地失活苯丙酮酸脱羧酶的活性(EC4.1.1.43，通过酵母中ARO10基因编码)或丙酮酸脱羧酶的活性(EC4.1.1.1，通过酵母中PDC1、PDC5和PDC6基因编码)从而将2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的通量降低至3-(甲硫基)丙醛。
[0054] 根据本发明的方法可以在体外或体内进行。体外反应被理解为是其中不使用细胞的反应，即，非细胞的反应。因此，体外优选表示没有细胞的体系。在一个实施方案中，术语“体外”表示存在分离的酶。在一个实施方案中，在方法中使用的酶以纯化的形式使用。
[0055] 为了在体外进行所述方法，用于反应的底物和酶在使酶具有活性并且使通过酶的转化发生的条件下(缓冲液，温度等)培育。使所述反应进行足够的时间以制备L-甲硫氨酸。L-甲硫氨酸的制备可以通过本领域已知的方法测量。
[0056] 所述酶可以是任意使通过酶的反应发生的适宜形式。其可以被纯化或部分纯化或以粗细胞提取物的形式或部分纯化的提取物的形式。也有可能将酶固定在适宜的载体上。
[0057] 在另一个实施方案中，根据本发明的方法在培养液中，在生物体，优选微生物的存在下进行，制备的蛋白质具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的能力。此蛋白质是本文中所述的蛋白质。
[0058] 在所述方法中使用的生物体优选为本文所述的根据本发明的宿主细胞。
[0059] 本发明还涉及具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的能力的蛋白质。在本发明的上下文中，所述酶指依赖OPHS的甲硫氨酸合酶。如上所述，目前没有报道表明天然存在具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质并且本发明是首次提供此类允许如上文所述的根据本发明的方法制备L–甲硫氨酸的蛋白质。
[0060] 在优选的实施方案中，根据本发明的具有将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的能力的蛋白质通过突变衍生自胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)。所述突变可以是在胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)的氨基酸序列中，一个或更多个氨基酸残基的取代和/或一个或更多个氨基酸残基的删除和/或一个或更多个氨基酸残基的加入。
[0061] 已知并描述了用于各种生物体的胱硫醚γ合酶。例如，对于植物，已知大于350个用于胱硫醚γ合酶的序列，尤其是用于拟南芥、烟草、小麦、番茄、稀脉萍、马铃薯、菠菜、总状紫云英、双沟黄芪、紫云英和抱茎假含羞草。
[0062] 还已知来自细菌和真菌的胱硫醚γ合酶。对于细菌，已经描述了大于22000个序列并且对于细菌和真菌序列的例子是源自酿酒酵母、粗糙链孢霉、肠道沙门氏菌、大肠杆菌、根癌土壤杆菌、粪产碱菌、解硫胺素芽孢杆菌属、短小芽胞杆菌、枯草杆菌、谷氨酸棒状杆菌、幽门螺杆菌、球形芽孢杆菌芽孢杆菌、结核分枝杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、德阿昆合假单孢菌、恋臭假单胞菌、产褐色链霉菌。
[0063] 用于提供显示将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的活性的蛋白质的方法在所附实施例中描述并将在下文更详细地描述。原则上，可以使用任意的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)作为初始材料来提供显示将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的活性的蛋白质。优选将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸和H3PO4的活性的蛋白质，其衍生自胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)，显示与天然存在的胱硫醚γ合酶至少70％，优选至少80％，甚至更优选至少90％和最优选至少95％的序列等同性。
[0064] 在一个优选的实施方案中，从其衍生依赖OPHS甲硫氨酸合酶的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)为植物胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)，优选来自拟南芥的胱硫醚γ合酶(EC
2.5.1.48)CGS1，最优选的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)显示SEQ IDNo：1所示的氨基酸序列。在甚至更优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶衍生自SEQ ID No:2显示的序列。除了实际上在84位上的甘氨酸残基通过丝氨酸残基替换，此序列对应SEQ ID No：1。此替换，即mto突变，解除了通过S-腺苷甲硫氨酸在CGS1上施加的翻译抑制(Onoue等，Journal of Biological Chemistry 286(2011)，14903-14911)。在特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶衍生自SEQ ID No：3显示的序列。除了实际上胺基位于末端的以叶绿体为目标的序列(氨基酸残基1至
57)已被移除并且将甲硫氨酸残基在N-末端加入，此序列对应SEQ ID No:2。
2.5.1.48)CGS1，最优选的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)显示SEQ IDNo：1所示的氨基酸序列。在甚至更优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶衍生自SEQ ID No:2显示的序列。除了实际上在84位上的甘氨酸残基通过丝氨酸残基替换，此序列对应SEQ ID No：1。此替换，即mto突变，解除了通过S-腺苷甲硫氨酸在CGS1上施加的翻译抑制(Onoue等，Journal of Biological Chemistry 286(2011)，14903-14911)。在特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶衍生自SEQ ID No：3显示的序列。除了实际上胺基位于末端的以叶绿体为目标的序列(氨基酸残基1至
57)已被移除并且将甲硫氨酸残基在N-末端加入，此序列对应SEQ ID No:2。
[0065] 能在根据本发明的方法中使用的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的例子为
[0066] (i)通过取代或删除在SEQ ID NO：3中至少一个氨基酸残基，衍生自胱硫醚γ合酶的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶，其具有在SEQ ID NO：3中显示的氨基酸序列，所述氨基酸残基选自组成如下的群组：
[0067] (a)脯氨酸10；
[0068] (b)天冬酰胺11；
[0069] (c)谷氨酰胺15；
[0070] (d)异亮氨酸27；
[0071] (e)丙氨酸30；
[0072] (f)亮氨酸45；
[0073] (g)丝氨酸47；
[0074] (h)缬氨酸60；
[0075] (i)丙氨酸68；
[0076] (j)苯丙氨酸150；
[0077] (k)苏氨酸178；
[0078] (l)天冬氨酸183；
[0079] (m)异亮氨酸185；
[0080] (n)苏氨酸220；
[0081] (o)甲硫氨酸232；
[0082] (p)缬氨酸245；
[0083] (q)丙氨酸257；
[0084] (r)天冬酰胺259；
[0085] (s)苯丙氨酸261；
[0086] (t)苯丙氨酸275；
[0087] (u)异亮氨酸287；
[0088] (v)组氨酸289；
[0089] (w)酪氨酸324；
[0090] (x)甘氨酸326；
[0091] (y)脯氨酸356；
[0092] (z)苏氨酸371；
[0093] (aa)缬氨酸396；
[0094] (bb)脯氨酸405；
[0095] (cc)天冬氨酸431；
[0096] (dd)异亮氨酸436；
[0097] (ee)异亮氨酸457；
[0098] (ff)天冬氨酸459；
[0099] (gg)脯氨酸470；
[0100] (hh)谷氨酸472；
[0101] (ii)丙氨酸506；
[0102] (jj)异亮氨酸507。
[0103] 或
[0104] (ii)通过取代或删除至少一个对应以上列出的SEQ ID No：3中(a)至(jj)任一个氨基酸残基，衍生自胱硫醚γ合酶的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶，其氨基酸序列显示与SEQ ID No：3中显示的氨基酸序列至少60％的序列等同性。优选地，序列等同性为至少70％，甚至更优选至少80％和最优选至少90％。
[0105] 术语“取代”表示在所指的位置上存在的氨基酸用另一氨基酸残基取代。在本发明的上下文中，“用另一氨基酸残基取代”表示在所指位置上各自的氨基酸残基可以用任意其他可能的氨基酸残基取代，优选用选自由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的群组的氨基酸残基取代。用于某些位置的优选取代在下文中进一步指明。
[0106] 本领域技术人员通过本领域已知的方法可以确定所处位置对应选自由以上列出的在SEQ ID NO：3中显示的氨基酸序列中的位置(a)至(jj)组成的群组的位置上的氨基酸残基。例如，所述氨基酸残基可以通过用SEQ ID No:3显示的序列校准有疑问的序列来确定和通过确定对应以上所指的SEQ ID No:3位置的位置。所述校准可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现，例如通过使用已知的计算机程序，如Lipman-Pearson方法(Science 227(1985)，1435)或CLUSTAL程序。优选在所述校准中，向氨基酸序列中存在的保留的氨基酸残基分配最大同源性。
[0107] 当通过所述方法校准氨基酸序列时，不论在氨基酸序列中存在的插入或删除，给定序列中对应的氨基酸残基的位置能确定。
[0108] 根据一个实施方案，本发明的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶具有的氨基酸序列中
[0109] (i)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置10或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用亮氨酸取代；和/或
[0110] (ii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置11或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用天冬氨酸取代；和/或
[0111] (iii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置15或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用精氨酸取代；和/或
[0112] (iv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置27或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0113] (v)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置30或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0114] (vi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置45或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0115] (vii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置47或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0116] (viii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置60或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用天冬氨酸取代；和/或
[0117] (ix)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置68或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0118] (x)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置150或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用亮氨酸取代；和/或
[0119] (xi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置178或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用异亮氨酸取代；和/或
[0120] (xii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置183或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用谷氨酸取代；和/或
[0121] (xiii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置185或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用缬氨酸取代；和/或
[0122] (xiv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置220或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0123] (xv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置232或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用亮氨酸取代；和/或
[0124] (xvi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置245或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丙氨酸取代；和/或
[0125] (xvii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置257或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0126] (xviii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置259或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用天冬氨酸或丝氨酸取代；和/或
[0127] (xiv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置261或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0128] (xx)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置275或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用亮氨酸取代；和/或
[0129] (xxi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置287或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用缬氨酸或苯基丙氨酸取代；和/或
[0130] (xxii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置289或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用酪氨酸或精氨酸取代；和/或
[0131] (xxiii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置324或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苯基丙氨酸取代；和/或
[0132] (xxiv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置326或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0133] (xxv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置356或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0134] (xxvi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置371或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丙氨酸取代；和/或
[0135] (xxvii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置396或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丙氨酸取代；和/或
[0136] (xxviii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置405或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0137] (xxix)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置431或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用甘氨酸取代；和/或
[0138] (xxx)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置436或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用苏氨酸取代；和/或
[0139] (xxxi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置457或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用亮氨酸取代；和/或
[0140] (xxxii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置459或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用天冬氨酸取代；和/或
[0141] (xxxiii)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置470或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用丝氨酸取代；和/或
[0142] (xxxiv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置472或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用甘氨酸取代；和/或
[0143] (xxxv)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置506或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用甘氨酸取代；和/或
[0144] (xxxvi)在SEQ ID No:3中显示的氨基酸序列中位置507或在对应此位置的位置上的氨基酸残基，用缬氨酸取代。
[0147] 在一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID No：3中显示的氨基酸序列的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶或具有与SEQ ID No:3至少60％的序列等同性的氨基酸序列，其中在SEQ ID No：3中显示的氨基酸序列中在356位置上或在对应此位置的位置上的氨基酸残基用另一个氨基酸残基取代。在优选的实施方案中，本发明涉及的蛋白质中至少另一个氨基酸残基在选自位置10、11、15、27、28、30、32、45、47、60、68、104、150、178、183、185、220、232、245、257、259、261、275、287、289、324、326、371、396、405、431、436、457、459、470、472、506和
507，优选选自位置10、11、15、30、32、45、47、68、104、150、178、183、185、220、232、245、257、
259、261、275、287、289、326、371、396、405、431、436、459、470、472、506和507，甚至更优选选自残基275和396的位置被取代。
507，优选选自位置10、11、15、30、32、45、47、68、104、150、178、183、185、220、232、245、257、
259、261、275、287、289、326、371、396、405、431、436、459、470、472、506和507，甚至更优选选自残基275和396的位置被取代。
[0148] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：
[0149] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置10、27、60、324和457。
[0150] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32、287、289和356。
[0151] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置10、232、245、259、356、431和436。
[0152] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置11、15、30、45、47、68、178、356、371和459。
[0153] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32和356。
[0154] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32、60、324和457。
[0155] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32、287、289和356。
[0156] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32、232、245、259、356、431和436。
[0157] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置32、45、47、68、178、356、371和459。
[0158] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置232、245、259、356、431和436。
[0159] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置178、356、371和459。
[0160] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置150、257、259、261、275、289、356和506。
[0161] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置185、356和405。
[0162] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、356、396和472。
[0163] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、326、356和396。
[0164] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置220、275、356和396。
[0165] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置183、275、356、396和507。
[0166] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、287、356、396和507。
[0167] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、356、396和470。
[0168] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、356和507。
[0169] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、356和396。
[0170] 在一个实施方案中，其中存在取代和/或删除的位置如下：位置275、287和356。
[0171] 在这些位置上优选的取代是如上所指的那些取代。
[0172] 可以用于根据本发明的方法中的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶也是能通过删除一个或更多个对应SEQ ID No：3中显示的氨基酸序列的氨基酸1至103的N-末端氨基酸，衍生自任意上述依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的酶。如在实施例中所示，上述依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的截短型式，例如其中与SEQ ID No:3相比，31氨基酸残基或103氨基酸残基从N-末端被删除的截短型式，也还显示有效的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的活性。
[0173] 在优选的实施方案中，根据本发明的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶也显示了将O-磷酸-L-高丝氨酸和硫化物转化为L-高丝氨酸和H3PO4的酶活性。优选地，硫化物是金属硫化物如Na2S。在此情况下，所述转化根据以下反应方案进行：
[0174] O-磷酸-L-高丝氨酸+Na2S<＝>L–高半胱氨酸+H3PO4
[0175] 将O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)和金属硫化物转化为L-高丝氨酸和H3PO4的活性可以在与上述基本相同的试验中检测，联系将O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)和甲硫醇转化为L-高丝氨酸和H3PO4的活性检测。在此情况下，使用双met2Δmet25Δ酵母菌株并且所述菌株在用Na2S作为唯一硫酸盐的来源的介质中生长。实际上，MET25编码在酵母中唯一已知活性的高半胱氨酸合酶，用硫化物催化O-乙酰基-L-高丝氨酸的缩合。已经可以通过使用被设计为除了双met2met25突变，包括引发O-磷酸-L-高丝氨酸聚集的thr4突变的酿酒酵母改进试验的敏感性。
[0176] 此酶活性也可以进一步通过体外试验确定，其中O-磷酸-L-高丝氨酸和Na2S在体外适宜的条件下用来自表达待测蛋白质的酵母菌株的非细胞提取物或用(部分)纯化的待测蛋白质培育并且其中通过比色法(Becker等，Journal of Biochemical Chemistry 244(1969)，2418)检测高半胱氨酸的制备。
[0177] 本发明还涉及编码根据本发明的蛋白质的核苷酸分子。所述核苷酸分子可以是DNA或RNA，优选为DNA。
[0178] 此外，本发明涉及包括根据本发明的核酸分子的载体。在优选的实施方案中，载体是允许表达根据本发明的核酸的载体从而允许根据本发明制备蛋白质。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的核酸可操作地与表达控制序列相关联，表达控制序列允许在所期望的宿主细胞或宿主细胞体系中表达。贯穿本说明书中使用的术语“操作性关联”或“可操作地关联”，指一个或更多个表达控制序列之间的连接并且在核酸分子中的编码区域待以在与表达控制序列相适应的条件下实现的方式表达。
[0179] 表达包括异源DNA序列的转录，优选转为可翻译的mRNA。确保在植物细胞、动物细胞和真菌以及细菌中表达的调控元素是本领域技术人员熟知的。其包括启动子、增强子、终止信号、靶信号等。下文结合有关于载体的详细解释进一步提供了实施例。
[0180] 用于与核酸分子相关联的启动子根据其来源和/或根据待表达的基因可以是同源的或异源的。适宜的启动子例如是将其本身提供在组成型表达中的启动子。但是，也可以使用仅通过外部影响确定的位置适时激活的启动子。人造和/或化学诱导的启动子可以在此上下文中使用。
[0181] 可将根据本发明的载体引入(微)生物从而将其表达并导致能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质的制备。
[0182] 不同的表达体系的概述例如包含在Methods in Enzymology 153(1987)，385-516，在Bitter等(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544)和在Sawers等(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456-
463)，Griffiths等，(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)。酵母表达体系的概述例如提供在Hensing等(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等(Developments in Biological Standardization 83(1994)，13-19)，Gellissen等(Antonie van Leuwenhoek62(1992)，79-93，Fleer(Current Opinion in Biotechnology
3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)。
463)，Griffiths等，(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)。酵母表达体系的概述例如提供在Hensing等(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等(Developments in Biological Standardization 83(1994)，13-19)，Gellissen等(Antonie van Leuwenhoek62(1992)，79-93，Fleer(Current Opinion in Biotechnology
3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)。
[0183] 在文献中已经广泛描述了表达载体。作为规则，其不仅包含选择标志基因和复制源，确保在所选宿主中的复制，还包含细菌或病毒启动子，以及在绝大多数情况下，用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间，通常存在至少一个限制位点或多聚连接子，其实现编码DNA序列的插入。如果其在所选的宿主生物体中是有活性的，可以使用天然控制对应基因的转录的DNA序列作为启动子序列。但是，也可以将此序列替换为其他启动子序列。有可能使用启动子确保基因的组合型表达和诱导启动子，其允许基因表达的计划性控制。细菌和病毒启动子序列具有的这些性质在文献中详细描述。在文献中充分描述了用于在微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等，Rodriguez和Chamberlin(Eds)中，Promoters，Structure and Function；Praeger，New York，(1982)，462-481；DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等，Gene 42(1986)，97-100)。诱导性启动子优选用于合成多肽。这些启动子通常造成比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳含量的多肽，通常使用两个阶段的方法。首先，在最佳培养条件下培养宿主细胞至相对高的细胞密度。在第二步骤中，取决于使用的启动子类型诱导转录。为此目的，tac启动子特别适合，其可以通过乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1983)，21-25)。在文献中还描述了转录的终止信号。
[0184] 根据本发明的使用核苷或载体的宿主细胞的转化可以通过如在Sambrook and Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA；Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990中描述的标准方法进行。宿主细胞在符合所用特定宿主细胞要求，特别是pH值、温度、盐浓度、曝气、抗生素、维生素、微量元素等方面中的营养介质里培养。
[0185] 本发明还涉及宿主细胞，根据本发明，其包含核酸分子或载体或用核酸分子或载体转化。在优选的实施方案中，所述宿主细胞表达了根据本发明的并能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质。原理上，宿主细胞可以是任意可能的宿主细胞，例如动物细胞、植物细胞、真菌细胞或细菌细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞。在特别优选的实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，例如埃希氏杆菌、棒状杆菌、梭菌、芽孢杆菌或不动杆菌属，更优选大肠杆菌、棒状杆菌、谷氨酸棒杆、枯草芽孢杆菌)或不动杆菌维蓝蒂属。
[0186] 在另外优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，例如酵母、假丝酵母、阿舒囊霉菌、克鲁维酵母、毕赤醇母、耶氏酵母、接合酵母、曲霉菌、德巴利酵母或球拟酵母属，更优选酿酒酵母、酿酒马克西姆斯(Saccharomyces maximus)、麦芽糖假丝酵母、来自棉桃阿舒氏囊霉、克鲁维酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂假丝酵母、黑曲霉、构巢曲霉、汉逊德巴利酵母或圆酵母种。在特别优选的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。
[0187] 如上所述，本发明还涉及用于制备核酸分子的方法，所述核酸分子编码能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸的蛋白质。所述方法包括以下步骤：
[0188] (i)在编码胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)的核酸中产生突变从而制备突变的胱硫醚γ合酶；
[0189] (ii)在宿主细胞中并在允许选择编码能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的蛋白质的核酸分子的培养条件下，表达获自步骤(i)的突变的核酸分子；
[0190] (iii)确定这些表达能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-高丝氨酸的蛋白质的宿主细胞；和
[0191] (iv)从步骤(iii)确定的宿主细胞中获得编码能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的突变的胱硫醚γ合酶的核酸分子。
[0192] 本发明还涉及用于制备能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的蛋白质的方法，所述方法包括表达获自根据本发明的上述方法获得的核酸分子并再生编码的蛋白质的步骤。
[0193] 术语“胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)”指任意具有胱硫醚γ合酶的酶活性的酶。胱硫醚γ合酶是催化以下反应的酶
[0194]
[0195] 可以通过本领域已知的方法测量活性(Ravanel，Biochem.J.331(1998)，639-648)。
[0196] 根据上述本发明的方法的步骤(i)，制备了编码胱硫醚γ合酶的突变形式的核酸分子从而产生突变的胱硫醚γ合酶。用于诱变处理核酸分子的方法是本领域技术人员熟知的。因此，有可能将不同类型的突变通过通常用于分子生物领域的方法(参见例如Sambrook and Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)插入，造成具有与初始序列相比突变的氨基酸序列的胱硫醚γ合酶的合成。原理上，核酸分子水平上的任意突变类型如删除、添加和/或取代都是可能的。在优选的实施方案中，在核酸上产生的突变造成在氨基酸序列水平上的氨基酸取代。
[0197] 有可能每个核酸分子仅产生一个突变，但是当然也有可能在核酸分子中产生一个或更多个突变导致在氨基酸水平上一个或更多个突变。原理上不存在对于突变数目的上限。但是，突变的核酸分子优选具有与编码用于上述方法步骤(i)的胱硫醚γ合酶的初始序列至少仍然60％的序列等同性，更优选至少70％的序列等同性，甚至更优选至少80％的序列等同性，特别优选至少90％的序列等同性并最优选至少95％的序列等同性。
[0198] 在优选的实施方案中，获自方法步骤(i)的诱变处理的核酸分子编码突变形式的胱硫醚γ合酶，其显示了与通过初始的核酸分子编码的胱硫醚γ合酶相比，不多于20个氨基酸残基的变化，或优选不多于15个变化，甚至更优选不多于10个变化并特别优选不多于5个变化。
[0199] 在根据本发明的方法步骤(i)中，术语“编码胱硫醚γ合酶(EC2.5.1.48)的核酸分子”指编码具有如上具体说明的胱硫醚γ合酶的酶活性的蛋白质的核酸分子。原理上，任意编码此类酶的核酸分子可作为初始材料用于根据本发明的方法。上文已经详细描述了胱硫醚γ合酶及其天然的存在。编码任意这些胱硫醚γ合酶的任意核酸可用于根据本发明方法的步骤(i)。在优选的实施方案中，用于步骤(i)的核酸分子是编码植物胱硫醚γ合酶的核酸分子。甚至更优选，胱硫醚γ合酶来自拟南芥，优选SEQ ID No:1所示的编码拟南芥胱硫醚γ合酶的核酸序列。
[0200] 可以调整在步骤(i)中使用的核酸分子的核酸序列以用于在步骤(ii)中使用的宿主细胞。例如，有可能改变密码子的使用从而更接近地对应所用宿主细胞的翻译机制的密码子的使用。因此，可以修饰核酸分子从而显示与步骤(ii)中所用的宿主细胞相关联的最佳密码子的使用。
[0201] 此外，为了调整某些核酸分子，如用于根据本发明的方法的编码植物胱硫醚γ合酶的核酸分子，其他改变可以是必要或期望的。例如，植物胱硫醚γ合酶通常包含在氨基末端的以叶绿体为目标的序列，其将蛋白质指向叶绿体。根据步骤(ii)中使用的宿主细胞，有可能必须或期望去除此目标序列。例如，如果步骤(i)中使用酵母细胞，期望去除此以叶绿体为目标的序列。此外，植物胱硫醚γ合酶可包含调节区域(也称为mto区域)，其允许通过增加植物细胞内的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)池来介导的翻译调节。SAM能翻译中在凹处结合至初始的胱硫醚γ合酶钛，所述凹处通过此mto区域和核糖体的一部分形成，从而造成翻译的停止。当实践根据本发明的方法时，有可能期望避免上此调节。因此，在优选的实施方案中，在步骤(i)中，使用修饰的植物胱硫醚γ合酶编码序列从而避免通过SAM的调节。现有技术，例如Onoue等(Journal of Biological Chemistry 286(2011)，14903-14911)中已经描述了所述突变。此外，也有可能作为初始核酸分子使用序列，所述序列造成更稳定的胱硫醚γ合酶形式。已知第二N末端氨基酸的等同性决定整个蛋白质的稳定性(Varshavsky，Annual Review of Biochemistry 81(2012)，167-176)。因此，有利地是避免不稳定的残基(特别是Tyr、Gln、Leu、Phe、Asp、Lys、Arg)并优选稳定的残基如Val或Ser(Varshavsky，Annual Review of Biochemistry 81(2012)，167-176)。
[0202] 根据方法的步骤(ii)的突变核酸分子的表达可以通过本领域技术人员已知的方法实现。上文已经关联根据本发明的载体和宿主细胞描述了表达体系。
[0203] 在根据本发明的方法的步骤(ii)中，使用宿主细胞来表达突变的胱硫醚γ合酶，所述酶允许选择编码能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的蛋白质的核酸分子。在此情况下，如果宿主细胞能将O-磷酸-L高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸，例如有可能使用在包含作为唯一硫源的甲硫醇的介质中生长时能存活的宿主细胞。此类宿主细胞的一个例子是已经过基因修饰的酿酒酵母细胞，从而至少缺少met2的功能。MET2基因编码高丝氨酸转乙酰酶，其催化高丝氨酸和乙酰基-CoA至O-乙酰基高丝氨酸和CoA的转化。MET2基因的失活造成酵母菌株成为甲硫氨酸营养缺乏的表型。优选地，在所述缺乏MET2功能的酵母菌株中也应使met6基因失活。MET6基因编码高半胱氨酸甲基转移酶，所述酶将高半胱氨酸和甲基四氢叶酸转化为甲硫氨酸。由于酿酒酵母，除了从高丝氨酸合成基本的氨基酸甲硫氨酸，不具备任意其他方式，缺乏MET2功能(并还任选MET6功能)的酿酒酵母仅当其能通过其他方式制备甲硫氨酸时存活。
[0204] 也调整在步骤(ii)中的培养条件使得宿主细胞仅能在当其能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-高丝氨酸时存活。这也可通过提供甲硫醇作为培养介质中的唯一硫源来实现。
[0205] 甚至更优选的是，除了MET2和MET6基因，THR4基因也失活。此失活的目的在于增加细胞内的OPHS池。在此情况下，转化的宿主细胞生长在补充苏氨酸和甲硫醇代替甲硫氨酸的介质中。如果使用此类宿主细胞，有可能分离仅显示非常弱的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶活性的突变体。
[0206] 之后使用在方法的步骤(iii)中确定的宿主细胞从而获得编码突变的胱硫醚γ合酶的核酸分子，所述酶能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸。这可以通过本领域技术人员已知的方法实现。
[0207] 之后可以使用分离的核酸分子从而表达相应的酶或可将分离的核酸分子引入其他宿主细胞。
[0208] 在优选的实施方案中，用于制备编码能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-甲硫氨酸的蛋白质的核酸分子的方法包括几个回合的筛选，即将显示所期望的活性的相应突变体的突变和分离。
[0209] 在此条件下，优选在第一个筛选回合中，使用其中MET2，MET6和THR4基因失活的宿主细胞。如上解释的，通过使用此类宿主细胞，有可能分离仅显示非常弱的依赖OPHS的甲硫氨酸合酶活性的突变体。分离的突变体之后经过另一回合的突变并最终选择宿主细胞中依赖OPHS的甲硫氨酸合酶活性的，所述宿主细胞中仅MET2和MET6基因失活但具有活性thr4基因。由于部分OPHS通过苏氨酸合酶使用，所述筛选更为紧迫。在此情况下，用于选择具有期望的酶的性质的克隆的宿主细胞在补充了甲硫醇作为硫源的介质中生长。
[0211] 图1显示了在酿酒酵母中的甲硫氨酸生物合成途径的简化视图(源自：Thomas D.和Y.Surdin-Kerjan；Microbiological and Molecular Reviews61(1997)；Metabolism of sulfur amino-acids in Saccharomyces cerevisiae.，第503-532页)。
[0212] 图2显示了用于合成O-磷酸-L-高丝氨酸的化学途径。
[0213] 图3显示了用作制备突变形式的酶的初始材料的截短形式的CGS1的示意代表图。
[0214] 图4显示了在补充有0.05mM的甲硫氨酸的介质A中菌株YA246-4A的增长，YA246-4A表达AD242或AD328CGS1变体或进行控制载体pAL06。
[0215] 图5显示了在补充有0.01mM的甲硫醇的介质A中，分别基于YA246-4A表达的CGS1-4(A)、CGS1-5(B)和CGS1-1(C)突变体家族的菌株的生长。CGS1-4(G84S)和用pAL06空载体的阴性对照在所有图表中显示。
[0216] 图6显示了在补充有1mM(A)或0.1mM(B)的甲硫醇的介质A中，基于YA247-5A表达的CGS1-4突变体家族AD242、AD328、MUT24和MUT27的菌株的生长。CGS1-4(G84S)和用pAL06的阴性对照在所有图表中显示。
[0217] 图7显示了所确定的CGS1突变体的排布。
[0218] 序列的描述：
[0219] SEQ ID NO：1显示了来自拟南芥(AAC25687.1)的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)CGS1的氨基酸序列。
[0220] SEQ ID NO：2显示了来自拟南芥(AAC25687.1)的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)CGS1的氨基酸序列，其中甘氨酸84通过丝氨酸替换。此序列也指CGS1、G 84S或CGS1-0。
[0221] SEQ ID NO：3显示了来自拟南芥(AAC25687.1)的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)CGS1的氨基酸序列，其中甘氨酸84通过丝氨酸替换，并且其中N-末端的57氨基酸已经去除并且将甲硫氨酸残基在N-末端加入。此序列也指CGS11-4G84S。
[0222] SEQ ID NO：4显示了来自拟南芥(AAC25687.1)的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)CGS1的截短形式的氨基酸序列，其中N-末端88氨基酸已经去除并将甲硫氨酸残基在N-末端加入。此序列也指CGS11-5G84S。
[0223] SEQ ID NO：5显示了来自拟南芥(AAC25687.1)的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)CGS1的截短形式的氨基酸序列，其中N-末端160氨基酸已经去除并将甲硫氨酸残基在N-末端加入。此序列也指CGS11-1G84S。
[0224] SEQ ID NO：6显示了突变体MUT02的序列。
[0225] SEQ ID NO：7显示了突变体MUT04的序列。
[0226] SEQ ID NO：8显示了突变体MUT13的序列。
[0227] SEQ ID NO：9显示了突变体MUT18的序列。
[0228] SEQ ID NO：10显示了突变体MUT19的序列。
[0229] SEQ ID NO：11显示了突变体AD309的序列。
[0230] SEQ ID NO：12显示了突变体AD310的序列。
[0231] SEQ ID NO：13显示了突变体AD311的序列。
[0232] SEQ ID NO：14显示了突变体AD312的序列。
[0233] SEQ ID NO：15显示了突变体AD313的序列。
[0234] SEQ ID NO：16显示了突变体AD242的序列。
[0235] SEQ ID NO：17显示了突变体AD328的序列。
[0236] SEQ ID NO：18显示了突变体AD329的序列。
[0237] SEQ ID NO：19显示了突变体MUT24的序列。
[0238] SEQ ID NO：20显示了突变体MUT27的序列。
[0239] SEQ ID NO：21显示了突变体MUT67的序列。
[0240] SEQ ID NO：22显示了突变体MUT68的序列。
[0241] SEQ ID NO：23显示了突变体MUT70的序列。
[0242] SEQ ID NO：24显示了突变体MUT71的序列。
[0243] SEQ ID NO：25显示了突变体MUT72的序列。
[0244] SEQ ID NO：26显示了突变体MUT74的序列。
[0245] SEQ ID NO：27显示了突变体MUT75的序列。
[0246] SEQ ID NO：28显示了突变体MUT78的序列。
[0247] SEQ ID NO：29显示了突变体MUT79的序列。
[0248] 本文引用文献的内容通过将其全部内容作为引文形式并入本文。
[0249] 本发明的其他方面和优势将在以下实施例中描述，提供以下实施例的目的在于解释说明而非限制。
具体实施方式
[0250] 实施例
[0251] 实施例1：作为制备突变体的初始材料使用的截短形式的CGS1的制备
[0252] CGS1-4基因是合成基因。合成通过Eurofins MWG Operon，(Ebersgerg)使用GENEius算法进行从而优化用于改进其在酿酒酵母中表达的密码子使用。使用的酿酒酵母密码子使用表源自Kazusa Codon Usage Detabase(http://www.kazusa.or.jp/codon)。截短形式的CGS1-5和CGS1-1已经通过使用CGS1-4作为基质，使用正向寡核苷酸，用于CGS1-5的GTACCGCTCGAGATGGTTGCTGGTAAGTGGTCTAACAATC和用于CGS1-1的GTACCGCTCGAGATGTCTGTTCAATTGACCGATTCTAAG，PCR制备。对于CGS1-5和CGS1-1形式，使用等同的反向寡核苷酸AGTACGGGATCCTCAAATGGCTTCCA。
[0253] 图3中示意性表示了所述的截短的修饰形式的CGS1。
[0254] 实施例2：CGS1的截短形式的突变体的制备
[0255] 将截短形式的CGS1基因克隆为pAL06质粒，衍生自pRS316载体的酵母复制载体(Sikorski RS&Hieter P.，Genetics.1989，122：19-27)。pAL06质粒允许在强酵母启动子TEF1的控制下表达克隆的基因。偏三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)浓度下，使用Vartanian JP等描述的实验方案(Nucleic Acids Res.199624:2627-2631)通过高突变PCR，形成CGSA库。
[dTTP]>[dCTP]和[dGTP]>[dATP]偏差都在突变PCR中使用。在0.5mM的MnCl2下使用[dTTP]/[dCTP]＝[dGTP]/[dATP]＝1000μM/200μM或[dTTP]/[dCTP]＝[dGTP]/[dATP]＝1000μM/150μM。
[dTTP]>[dCTP]和[dGTP]>[dATP]偏差都在突变PCR中使用。在0.5mM的MnCl2下使用[dTTP]/[dCTP]＝[dGTP]/[dATP]＝1000μM/200μM或[dTTP]/[dCTP]＝[dGTP]/[dATP]＝1000μM/150μM。
[0256] 实施例3：可以从O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇制备L-高丝氨酸的突变体的筛选[0257] 在酵母菌株YA247-5A(MAT-α、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、trp1、ura3)或YA246-4A(MAT-a、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、thr4::loxP、trp1、ura3)中在补充有甲硫氨酸但缺乏尿嘧啶的基本培养基中转化CGS1库以选择质粒标识。生长48小时之后，将细胞收集、清洗并再悬浮于含甲烷硫醇作为硫源的基本液体培养基中。7天之后，将培养物收集并用同样的液体介质稀释，至OD600nm约0.2。进行三个连续的稀释循环。
[0258] 之后提取在形成的生长酵母细胞中存在的质粒，扩大为大肠杆菌并将形成的DNA用于再转化菌株YA247-5A(MAT-α、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、trp1、ura3)或YA246-4A(MAT-a、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、thr4::loxP、trp1、ura3)。之后在包含甲硫氨酸但缺乏尿嘧啶的固体基本培养基上选择转化的酵母。通过在包含甲硫醇作为硫源的液体介质中生长单独的菌落评估每个单独的菌落用甲烷硫醇作为硫源的生长能力。在每个演变循环上，在甲硫醇存在时具有最佳生长速率的酵母菌落中包含的质粒被提取并序列化。将所选的突变体在YA247-5A菌落中转化用于体外分析并用作新高突变PCR的初始材料。
[0259] 使用上述筛选过程已经确定了很多CSG1突变体，所述突变体能在甲硫醇作为唯一硫源时生长并且因此被认为能将O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇转化为L-甲硫氨酸。这些突变体的序列已经确定并且将突变体总结在下表1A中，其中参照SEQ ID NO：3(CGS1-4)中提供的序列指出突变位置。还在图7中总结了突变体，其中突变体排成一行。
[0260] 表1A
[0261]氨基酸 位置 突变
P 10 L
N 11 D
Q 15 R
I 27 S
A 30 T
L 45 S
S 47 T
V 60 D
A 68 T
F 150 L
T 178 I
D 183 E
I 185 V
T 220 S
M 232 L
V 245 A
A 257 T
N 259 D、S
P 10 L
N 11 D
Q 15 R
I 27 S
A 30 T
L 45 S
S 47 T
V 60 D
A 68 T
F 150 L
T 178 I
D 183 E
I 185 V
T 220 S
M 232 L
V 245 A
A 257 T
N 259 D、S
[0262]F 261 S
F 275 L
I 287 V、F
H 289 Y、R
Y 324 F
G 326 S
P 356 T
T 371 A
V 396 A
P 405 S
D 431 G
I 436 T
I 457 L
D 459 N
P 470 S
E 472 G
A 506 G
I 507 V
F 275 L
I 287 V、F
H 289 Y、R
Y 324 F
G 326 S
P 356 T
T 371 A
V 396 A
P 405 S
D 431 G
I 436 T
I 457 L
D 459 N
P 470 S
E 472 G
A 506 G
I 507 V
[0263] 下表1B列出了所有被分析的突变体并指出了相对于SEQ ID NO:1(CGS1)全长序列的发现突变的位置。相对于对应初始序列的位置在括号中指出。
[0264] 表1B
[0265]
[0266]
[0267] 初始序列1-4对应SEQ ID NO：3
[0268] 初始序列1-5对应SEQ ID NO：4
[0269] 初始序列1-1对应SEQ ID NO：5
[0270] 以下表1C列出了所有被分析的突变体并指出了相对于SEQ ID NO:3(CGS1-4)序列的发现突变的位置。相对于对应初始序列的位置在括号中指出。
[0271] 表1C
[0272]
[0273]
[0274] 实施例4：在酵母酿酒酵母中的酶活性的检测
[0275] 任意上述突变体在酿酒酵母菌株YA247-5A(MAT-α、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、trp1、ura3)和YA 246-4A(MAT-a、ade2、his3、leu2、met2::loxP、met6::HIS3、thr4::loxP、trp1、ura3)中的表达将菌株从其甲硫氨酸营养缺乏型中释放。
[0276] 换言之，在表达了任意上述突变体后，酵母菌株YA247-5A和YA246-4A对于在补充有腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的基本培养基上的甲硫氨酸合成生长是有缺陷的。
[0277] 检测的实验设计：
[0278] 将突变体核酸序列分别克隆为复制质粒pAL06(pRS316的衍生物)，转录启动子(pTEF1)的下游和转录终止子(tADH1)的上游。
[0279] 如上获得的十二个质粒各自在酵母菌株YA247-5A和YA246-4A中转化。转化体在补充有0.2mM的甲硫氨酸的介质A(DifcoTM Yeast Nitrogen Base 6.7％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.3mM、亮氨酸0.75mM、组氨酸1.3mM、色氨酸0.1mM)中生长。
[0280] 之后将每个转化体在补充有0.05mM的甲硫氨酸的介质A中接种(OD590＝0.015)，或在补充有0.1或1mM的甲硫醇的介质A中接种
[0281] 通过以下在590nm下的光学密度(OD590)监测生长。将在两种介质中的每个菌落各自的生长与用空载体pAL06转化的阴性对照的YA246-4A或YA247-5A的生长相对比。在具有甲硫氨酸的介质A中，所有检测的菌株具有的世代时间为约4h。例如，图4中表示了表达突变体CGS 1-4(G84S)、AD242和AD328的菌株YA246-4A的生长和对照pAL06载体。
[0282] 在聚集磷酸高丝氨酸的环境下的生长：
[0283] 基于YA246-4A的菌落的生长在图5中显示，YA246-4A在补充有0.1mM的甲硫醇的介质A中，聚集磷酸高丝氨酸并表达CGS1蛋白质突变体。
[0284] 在所有的情况下，对于参照CGS1-4(G84S)和具有pAL06质粒的菌株，没有观察到生长。
[0285] 对于CGS1-4家族(图5A)，包括的世代时间在对于MUT19为13h和对于MUT02为42h之间。对于CGS1-5家族(图5B)，包括的世代时间在对于AD312和AD313为9.5h对于AD310为12.5h之间。对于CGS1-1家族(图5C)，世代时间在对于AD242、AD328和AD329为约9.5h。
[0286] 没有磷酸高丝氨酸的聚集的环境下的生长：
[0287] 图6A和6B分别显示了基于在补充有1mM的甲硫醇或0.1mM的甲硫醇的介质A中，不聚集磷酸高丝氨酸并表达CGS1蛋白质突变体的YA247-5A的菌株的生长。
[0288] 在有1mM的甲硫醇时，没有观察到CGS1-1和阴性对照用pAL06空载体转化的生长。世代时间约为对于AD242或AD328是21h，对于MUT27是10.5h和对于MUT24是8h。具有0.1mM的甲硫醇，仅观察到用MUT24和MUT27突变体的生长。世代时间分别为19h和40h。
[0289] 实施例5：依赖OPHS的甲硫氨酸合酶的体外活性
[0290] 在酵母的粗溶菌产物中检测酵母中表达的酶的体外活性。
[0291] 通过监测在O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)和甲硫醇(CH3SNa)的存在下，在溶菌产物中甲硫氨酸的合成跟踪活性。溶菌产物源自酵母细胞YA246-5A，YA246-5A装载空质粒pAL06，YA246-5A表达CGS1-4并对比YA246-5A表达的突变体AD246、AD239、MUT24、MUT27、MUT67或MUT79。
[0292] 实验方案：
[0293] 溶菌产物制备
[0294] 酵母细胞首先在完全培养基中生长。此第一培养物用于接种100ml的介质A(OD590nm＝0.3)，所述介质A在28℃搅拌16小时下培育。
[0295] 使用Bradford试验确定蛋白质的总含量。
[0296] 为开始反应，将0.03至0.06mg的总的蛋白质在37℃下，在100mM的Tris pH8，0.2mM的磷酸吡哆醛，5mM的CH3SNa和25mM的OPHS在总体积为100μl中培育15分钟。在15分钟和60分钟收集反应混合物10μl的等分试样并且通过加入90μl的过氯酸停止反应。通过LCMS使用13CMet作为内部标准确定在这些等分试样中的甲硫氨酸的含量。形成的甲硫氨酸的含量通过试验中使用的蛋白质的量标准化。
[0297] 结果如下表2所示：
[0298] 表2
[0299]
[0300] 实施例6：用于检测高半胱氨酸合酶活性的体外试验
[0301] 在使用酵母的粗溶菌产物的体外试验中，检测在酵母中表达的酶的高半胱氨酸合酶的活性。
[0302] 通过监测在O-磷酸-L-高丝氨酸(OPHS)和甲硫醇(CH3SNa)的存在下，在溶菌产物中甲硫氨酸的合成跟踪活性。溶菌产物来自酵母细胞YA246-5A，YA246-5A装载空质粒pAL06，YA246-5A表达CGS1-4并对比YA246-5A表达的突变体AD242、AD328、MUT24、MUT27、MUT67或MUT79。
[0303] 实验方案：
[0304] 溶菌产物制备
[0305] 酵母细胞首先在完全培养基中生长。此第一培养物用于接种100ml的介质A(OD590nm＝0.3)，所述介质A在28℃搅拌16小时下培育。使用Bradford试验确定蛋白质的总含量。通过比色分析确定形成的高半胱氨酸的量。
[0306] 为开始反应，将0.03至0.06mg的总的蛋白质在30℃下，在0.1mM的Tris pH8，0.2mM的磷酸吡哆醛，10mM的Na2S，12.5mM的OPHS在100μl中培育15分钟。
[0307] -加入500μl的1％的NaNO2(溶解于H2SO4，0.4N)，培育5分钟
[0308] -加入100μl的NH4SO3NH2，培育2分钟
[0309] -加入750μl的1体积的HgCl2
[0310] -加入4体积的磺胺
[0311] -加入2体积的N-(1-萘基)乙二胺二氢氯化物
[0312] 培育15分钟
[0313] 读取450nm的OD(随着高半胱氨酸的数量成比例增加-通过与已知范围的高半胱氨酸获得的结果的对比确定含量)。
[0314] 结果如下表3所示。
[0315] 表3：
[0316]
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