一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置
专利汇可以提供一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种贴壁细胞的提取方法，包括聚丙烯酰胺 水 凝胶预处理，贴壁细胞的培养，细胞及粘连凝胶的整体挖取以及去表面凝胶等步骤。同时本发明还设置一种适用于上述提取方法的贴壁细胞的提取装置。本发明提取方法操作方便易行，不需要繁琐的步骤便可以完成对于贴壁细胞的提取，减少了出错的可能性；同时采用的提取装置结构简单，成本低廉。另外本发明对于贴壁细胞的破坏很小，对于细胞研究具有重要意义。，下面是一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置专利的具体信息内容。
1.一种贴壁细胞的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
在细胞培养孔板上铺上聚丙烯酰胺水凝胶，并使用磷酸缓冲盐溶液浸泡聚丙烯酰胺水凝胶；
将聚丙烯酰胺水凝胶在磷酸缓冲盐溶液浸泡的条件下，在紫外线下照射；之后吸走磷酸缓冲盐溶液，采用Sulfo-Sanpah溶液处理所述聚丙烯酰胺水凝胶；之后紫外线照射，再静置；之后吸走Sulfo-Sanpah溶液，采用无血清培养基孵育水凝胶，最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养；
细胞贴壁后，通过倒置显微镜物镜选取单个细胞；调节取样针到所述细胞位置；将取样针插入所述细胞周围的水凝胶中；移动取样针，破坏所述细胞周围的水凝胶，最终将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶整体取出；
采用培养液将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶从取样针上冲洗到指定位置；之后采用胰蛋白酶消化处理，去除所述水凝胶；最后将含有细胞的胰蛋白酶移到培养基对细胞进行培养。
2.根据权利要求1所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺水凝胶由丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和水制成。
3.根据权利要求2所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺水凝胶由
30-45wt%的丙烯酰胺水溶液、1.5-3wt%的甲叉双丙烯酰胺水溶液、5-15wt%的过硫酸铵水溶液、四甲基乙二胺和水制成；所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液以及水的总体积和过硫酸铵水溶液、四甲基乙二胺的体积比为1000：10-20：0.5-2；所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液与水的体积比为1：0.8-2.5：0.8-1.5。
4.根据权利要求3所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺水凝胶通过以下步骤制成：
a.分别配置丙烯酰胺的水溶液、甲叉双丙烯酰胺的水溶液以及过硫酸铵的水溶液；
b.按比例称取丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺和水；混合均匀后加入Bio-Rad垂直灌胶架，在20-30℃条件下静置至少2小时。
5.根据权利要求1所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺水凝胶应铺满培养孔板的底面，铺设厚度为0.5-2mm；磷酸缓冲盐溶液浸泡聚丙烯酰胺水凝胶的时间至少7天。
6.根据权利要求1所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺水凝胶在磷酸缓冲盐溶液浸泡的条件下，在紫外线下照射时间至少为20分钟；采用Sulfo-Sanpah溶液处理聚丙烯酰胺水凝胶的时间至少为1小时；采用Sulfo-Sanpah溶液处理聚丙烯酰胺水凝胶后，再进行紫外线照射的时间至少为20分钟，之后静置的时间至少为1小时；采用无血清培养基孵育水凝胶的时间至少为6小时；
其中：所述紫外线的波长为313-340nm，紫外线辐照度为356-480μW·cm-2；Sulfo-Sanpah溶液应将聚丙烯酰胺水凝全部浸渍，Sulfo-Sanpah溶液的浓度为0.5-0.75mg/ml。
7.根据权利要求1所述的贴壁细胞的提取方法，其特征在于：所述胰蛋白酶消化处理时间至少为1分钟。
8.一种用于如权利要求1-7任一所述的贴壁细胞提取方法的提取装置，其特征在于：包括光源、细胞培养孔板、取样针、三轴支架、旋钮以及倒置显微镜物镜；所述光源、三轴支架分别设置于细胞培养孔板的上方，所述倒置显微镜物镜设置于细胞培养孔板的下方；所述旋钮设置在三轴支架上，所述取样针偏心设置在旋钮上，可随着旋钮的转动，而绕旋钮的中心转动。
9.根据权利要求8所述的提取装置，其特征在于：所述取样针为圆筒状、刀状或者挖勺状。
10.根据权利要求8所述的提取装置，其特征在于：所述取样针与细胞培养孔板倾斜设置。
一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置
技术领域
背景技术
发明内容
将聚丙烯酰胺水凝胶在磷酸缓冲盐溶液浸泡的条件下，在紫外线下照射；之后吸走磷酸缓冲盐溶液，采用Sulfo-Sanpah溶液处理所述聚丙烯酰胺水凝胶；之后紫外线照射，再静置；之后吸走Sulfo-Sanpah溶液，采用无血清培养基孵育水凝胶，最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养；
细胞贴壁后，通过倒置显微镜物镜选取单个细胞；调节取样针到所述细胞位置；将取样针插入所述细胞周围的水凝胶中；移动取样针，破坏所述细胞周围的水凝胶，最终将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶整体取出；
采用培养液将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶从取样针上冲洗到指定位置；之后采用胰蛋白酶消化处理，去除所述水凝胶；最后将含有细胞的胰蛋白酶移到培养基对细胞进行培养。
所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液以及水的总体积和过硫酸铵水溶液、四甲基乙二胺的体积比为1000：10-20：0.5-2；所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液与水的体积比为1：0.8-2.5：0.8-1.5。
b.按比例称取丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺和水；混合均匀后加入Bio-Rad垂直灌胶架，在20-30℃条件下静置至少2小时。
具体实施方式
当转动旋钮5时，取样针3可绕旋钮5的中心转动。
（1）在细胞培养孔板的底面铺满聚丙烯酰胺水凝胶，铺设厚度为1mm；使用磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）浸泡聚丙烯酰胺水凝胶7天，以消除水凝胶对细胞的毒性。
之后吸走PBS缓冲液，采用Sulfo-Sanpah溶液浸渍处理聚丙烯酰胺水凝胶1小时，Sulfo-Sanpah溶液是一种交联剂，可在聚丙烯酰胺水凝胶和细胞之间起到桥梁作用，从而使细胞更好地贴壁于水凝胶；Sulfo-Sanpah溶液的用量为铺满培养孔板的底面，将聚丙烯酰胺水凝全部浸渍即可，Sulfo-Sanpah溶液的浓度为0.5mg/ml；
之后紫外线照射20分钟进行再次灭菌处理，再静置1小时；
之后吸走Sulfo-Sanpah溶液，采用无血清培养基孵育水凝胶表面6小时；
最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养，培养条件为37℃，5%CO2。
b.称取1.5ml的丙烯酰胺溶液、3.3ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、1.2ml的水、60μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺；混合均匀后加入Bio-Rad垂直灌胶架，在25℃条件下静置2小时。
（1）在细胞培养孔板的底面铺满聚丙烯酰胺水凝胶，铺设厚度为0.75mm；使用磷酸缓冲盐溶液（PBS缓冲液）浸泡聚丙烯酰胺水凝胶15天。
之后紫外线照射40分钟，再静置2.5小时；
之后吸走Sulfo-Sanpah溶液，采用无血清培养基孵育水凝胶表面12小时；
最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养，培养条件为37℃，5%CO2。
b.称取1.5ml的丙烯酰胺溶液、2.5ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、2ml的水、60μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺；混合均匀后加入Bio-Rad垂直灌胶架，在20℃条件下静置6小时。
a.将丙烯酰胺配置成30wt%的水溶液，将甲叉双丙烯酰胺配置成3wt%的水溶液，将过硫酸铵配置成5wt%的水溶液，备用；
b.称取2ml的丙烯酰胺溶液、1.7ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、2.3ml的水、120μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺；混合均匀后加入Bio-Rad垂直灌胶架，在30℃条件下静置4小时。
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