用于提高基因组编辑效率的化合物
阅读：272发布：2021-07-31
专利汇可以提供用于提高基因组编辑效率的化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及适于提高在真核靶细胞或靶 生物 体中的精确基因组编辑效率的化合物、组合物和 试剂 盒 。，下面是用于提高基因组编辑效率的化合物专利的具体信息内容。
1.下列各项用于在真核靶细胞，特别是哺乳动物靶细胞中的基因组编辑的用途：
(i)DNA蛋白激酶催化亚基，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整，并且与野生型序列相比包含至少一个突变，
(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子，和/或
(iii)包含或能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的真核细胞。
2.权利要求1所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含基于人NCBI参考序列NP_008835.5的催化环(氨基酸3917-3927)、P-环(氨基酸3729-3735)或邻近区域(氨基酸3736-3760)中的至少一个突变，所述突变包括导致截短的突变(例如，Y4046*)，所述导致截短的突变使所述激酶活性减少或失活，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
3.权利要求1或2所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含基于人NCBI参考序列NP_008835.5的位置K3753、位置D3922、位置T3950和/或位置F3946处的至少一个突变，其中氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
4.权利要求3所述的用途，其中所述突变在位置K3753处，特别是在K3753R处，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
5.权利要求1所述的用途，其中无催化活性但结构完整的DNA蛋白激酶催化亚基包含磷酸化簇中的至少一个突变，所述突变正常地是其自身磷酸化功能的靶标，包括失活突变，例如但不限于用于PQR簇(S2023和/或S2029和/或S2041和/或S2053和/或S2056)的丙氨酸，和/或激活(模拟磷酸化)突变，例如但不限于用于ABCDE簇(T2069和/或S2612和/或T2620和/或S2624和/或T2638和/或T2647)和/或N簇(S56和/或S72)和/或JK簇(T946和/或S1003)的天冬氨酸，其中所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
6.权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是真核靶细胞，包括脊椎动物靶细胞。
7.权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是哺乳动物靶细胞，包括啮齿类动物靶细胞或人靶细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述靶细胞是干细胞，所述干细胞包括真核靶生物体的诱导性多能干细胞或胚胎多能干细胞，特别是人诱导性多能干细胞或人胚胎多能干细胞。
9.权利要求1-8中任一项所述的用途，进一步包括将
(a)为HDAC抑制剂的化合物(I)，
(b)为NAE抑制剂的化合物(II)，
(c)为DNA-PK抑制剂的化合物(III)，或
(d)为RPA抑制剂的化合物(IV)
或所述化合物中的至少2种、至少3种或4种的组合引入至所述靶细胞中。
10.权利要求1-9中任一项所述的用途，其中
所述化合物(I)是曲古抑菌素A，和/或
所述化合物(II)是MLN4924，和/或
所述化合物(III)是NU7026和/或
所述化合物(IV)是NSC15520。
11.权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将交错切口,特别是具有5’突出端的交错切口，或平端切口引入至所述靶细胞的双链基因组中。
12.权利要求1-11中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括在所述靶细胞中存在DNA裂解酶，例如(i)存在CRISPR/Cas9D10A酶，或(ii)存在CRISPR/Cpf1酶，或(iii)存在Cas9核酸酶。
13.权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将携带所需要的突变的供体DNA分子引入至所述靶细胞中，所述供体DNA分子是单链或双链DNA分子，特别是单链DNA分子。
14.权利要求1-13中任一项与敲低靶细胞中的内源性DNA-PKcs组合的用途。
15.一种编辑真核靶细胞或靶生物体的基因组的方法，包括将(i)无催化活性但结构完整的并且与野生型序列相比包含至少一个突变的DNA蛋白激酶催化亚基，或(ii)编码(i)组合的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子引入至所述靶细胞或靶生物体中。
16.下述组合用于在真核靶细胞，特别是在哺乳动物靶细胞，更特别地在人靶细胞中的基因组编辑的体外用途：
(a)至少一种为DNA-PK抑制剂的化合物(III)，和
(b)至少一种为HDAC抑制剂的化合物(I)、至少一种为NAE抑制剂的化合物(II)和/或至少一种为RPA抑制剂的化合物(IV)，
其中所述基因组编辑包括将交错切口引入至所述靶细胞的双链基因组中。
17.权利要求16所述的用途，其中
所述化合物(I)是曲古抑菌素A，和/或
所述化合物(II)是MLN4924,和/或
所述化合物(III)是NU7026和/或
所述化合物(IV)是NSC15520。
18.权利要求16和17所述的用途，其中所述组合包含：
-至少一种化合物(III)，
-至少一种化合物(I)和/或
-至少一种化合物(II)和
-任选地至少一种化合物(IV)。
19.权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将带有5’突出端的交错切口引入到所述靶细胞的双链基因组中。
20.权利要求16-19中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括：(i)所述靶细胞中存在CRISPR/Cas9D10A酶，或(ii)所述靶细胞中存在CRISPR/Cpf1酶。
21.权利要求16-20中任一项所述的用途，用于干细胞中的基因组编辑，所述干细胞包括真核靶生物体的诱导性多能干细胞或胚胎多能干细胞，特别是人诱导性多能干细胞或人胚胎多能干细胞。
22.权利要求21所述的用途，其中所述组合包含至少一种化合物(III)、至少一种化合物(I)、至少一种化合物(II)和至少一种化合物(IV)。
23.权利要求16-20中任一项所述的用途，用于在造血细胞或造血祖细胞中的基因组编辑。
24.权利要求23所述的用途，其中所述组合包含至少一种化合物(III)、至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(IV)，特别是缺少化合物(II)。
25.权利要求16-20中任一项所述的用途，用于在永生化细胞中的基因组编辑。
26.权利要求25所述的用途，其中所述组合包含至少一种化合物(III)、至少一种化合物(I)和至少一种化合物(IV)，特别是缺少化合物(II)。
27.权利要求16-26中任一项所述的用途，其中所述组合进一步包含：
(i)DNA蛋白激酶催化亚基，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整；并且与野生型序列相比包含至少一个突变，特别是突变的亚基K3753R，
(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子，和/或
(iii)能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的真核细胞。
28.权利要求16-27中任一项所述的用途，其中所述基因组编辑包括将携带所需要的突变的供体DNA分子引入至所述靶细胞中，所述供体DNA分子是单链或双链DNA分子，特别是单链DNA分子。
29.一种组合，其包含：
(a)至少一种为DNA-PK抑制剂的化合物(III)，和
(b)至少一种为HDAC抑制剂的化合物(I),至少一种为NAE抑制剂的化合物(II)和/或至少一种为RPA抑制剂的化合物(IV)，
所述组合用于一种方法中的药物，所述药物包括人用药物或兽医用药物，所述方法包括在真核靶细胞或靶生物体，特别是在哺乳动物靶细胞或靶生物体，更特别地在人靶细胞或靶生物体中进行基因组编辑，其中所述基因组编辑包括将交错切口引入到所述靶细胞或靶生物体的双链基因组中。
30.一种编辑真核靶细胞或靶生物体的基因组的方法，包括将下述的组合：
(a)至少一种为DNA-PK抑制剂的化合物(III),和
(b)至少一种为HDAC抑制剂的化合物(I),至少一种为NAE抑制剂的化合物(II)和/或至少一种为RPA抑制剂的化合物(IV)，引入至所述靶细胞或靶生物体中，其中所述基因组编辑包括将交错切口引入至所述靶细胞或靶生物体的双链基因组中。
用于提高基因组编辑效率的化合物
技术领域
背景技术
[0002] CRISPR是对抗病毒DNA的细菌核酸酶免疫系统，其已经被采用用来准确地切割真核细胞中的染色体DNA序列。这样的DNA断裂需要通过两个竞争通路来修复：非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。
[0003] 在NHEJ中，结合DNA末端的第一个蛋白是Ku70/Ku80，接着是DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)(Shrivastav等人，2008)。该激酶磷酸化自身以及修复位点处的其他下游效应器。几种蛋白质如Artemis的征集和磷酸化通过连接酶IV(LIG4)、X-射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)和非同源末端连接因子1(XLF)产生末端加工连接(Dueva,Iliakis 2013)。
[0004] 如果此典型的NHEJ通路被遏制，则备选的NHEJ通路(A-NHEJ)变得有活性(Nussenzweig,Nussenzweig 2007)。除其他蛋白之外，其需要多聚(ADP-核糖)-聚合酶1(PARP-1)、沃纳综合征ATP-依赖性(WRN)解旋酶和DNA连接酶3(LIG3)或DNA连接酶I(LIG1)。MRN-复合物(Mre11、Rad50和Nbs1)与双链断裂(DSB)的结合启动HDR(Shrivastav等人，
2008)。与其他蛋白如DNA核酸内切酶RBBP8(CtIP)、Bloom解旋酶(BLM)和核酸外切酶1(EXO1)一起，移除5'端的末端核苷酸，在DNA的断裂的两侧上生成长的3'单链DNA(ssDNA)突出端(Dueva,Iliakis 2013)。然后这些尾部被包裹以复制蛋白A(RPA)复合物并被其稳定，接着是乳腺癌2(BRCA2)辅助生成Rad51核蛋白丝(Shrivastav等人，2008)。Rad52促进与ssDNA结合的RPA被Rad51替换并促进ssDNA退火(Grimme等人，2010)。利用供体DNA的链入侵以及后续通过聚合酶的DNA合成最终产生了精确修复的DNA。蛋白激酶毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)在HDR中具有重要作用，因为它磷酸化至少12种修复蛋白(Shrivastav等人，2008)。
2008)。与其他蛋白如DNA核酸内切酶RBBP8(CtIP)、Bloom解旋酶(BLM)和核酸外切酶1(EXO1)一起，移除5'端的末端核苷酸，在DNA的断裂的两侧上生成长的3'单链DNA(ssDNA)突出端(Dueva,Iliakis 2013)。然后这些尾部被包裹以复制蛋白A(RPA)复合物并被其稳定，接着是乳腺癌2(BRCA2)辅助生成Rad51核蛋白丝(Shrivastav等人，2008)。Rad52促进与ssDNA结合的RPA被Rad51替换并促进ssDNA退火(Grimme等人，2010)。利用供体DNA的链入侵以及后续通过聚合酶的DNA合成最终产生了精确修复的DNA。蛋白激酶毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ATM)在HDR中具有重要作用，因为它磷酸化至少12种修复蛋白(Shrivastav等人，2008)。
[0005] CRISPR Cas9-诱导的DSB的NHEJ是易错的，并且经常在切口位点处引入插入和缺失(插入/缺失(indel))。因此其可用于敲除被靶向的基因。相反，HDR通过使用同源供体DNA序列允许精确地修复DSB。如果此供体序列在实验中被提供并且携带突变，则这些突变将被引入到基因组中。
[0006] 对于通过Cas9引入DSB的要求是DNA中的NGG序列(PAM位点)。对Cas9的靶向通过结合的向导RNA(gRNA)来确定，所述向导RNA与邻接PAM位点的20个核苷酸互补。然而，Cas9核酸酶也可以切割在携带与由gRNA所靶向的那些序列相似的序列的位点处的基因组(Fu等人2013)。那些脱靶的双链切口意味着不期望的突变可以与所需的突变一起出现在基因组中的别处。
[0007] 减少这样的脱靶切口的一种策略是使用突变的Cas9，所述突变的Cas9引入了单链缺口代替DSB，诸如Cas9 D10A(Shen等人，2014)。使用两个gRNA在相对的DNA链上彼此靠近地引入两个缺口将在所需的基因座处产生DSB，同时减少了在基因组中别处出现的两个脱靶缺口靠的足够近从而引起DSB的风险。另一策略是使用Cpf1(Zetsche等人，2015)。此核酸酶在富T的PAM位点处引入交错切口并且已经显示产生较少的脱靶效应(Kim等人，2016)(Kleinstiver等人，2016)。
[0008] 以目前的方式，精确基因组编辑(PGE)效率，特别是对于干细胞中靶向的核苷酸置换，通常很低，范围为0.5-15％(Yu等人，2015)(Gonzalez等人，2014)。几名研究者通过尝试促进HDR或减少NHEJ解决了精确基因组编辑的低效率问题。
[0009] 利用单链寡脱氧核苷酸(ssODN)供体显示细胞周期同步化至G2/M期在HEK293T细胞中提高PGE(从26％至38％)，在人原代新生儿成纤维细胞中提高PGE(从检测不到至0.6％)以及在人胚胎干细胞(hESC)中提高PGE(从检测不到至1.6％)(Lin等人，2014)，以及利用双链寡脱氧核苷酸(dsODN)供体在hESC中提高PGE(在分选后从7至41％)(Yang等人，
2016),因为同源重组限于此期且其蛋白上调。
2016),因为同源重组限于此期且其蛋白上调。
[0010] 此外，通过利用siRNA遏制关键蛋白如Ku70/80和连接酶IV(从5至25％)或在HEK293/TLR细胞中使用dsODN供体共表达腺病毒5型蛋白4E1B55K和E4orf6(从5至36％)实现了效率提高(Chu等人，2015)。除其他靶标以外，E1B55K和E4orf6蛋白介导LIG4的泛素化和蛋白酶体降解。
[0011] 提高基因组编辑的常见策略是使用小分子。小分子连接酶IV抑制剂SCR7被认为在小鼠胚胎中阻断NHEJ并提高PGE的效率(从5至22.7％)(Maruyama等人，2015)。其他研究人员记述了在HEK293/TLR细胞中类似的提高，在HEK293A中微小的但是显著的提高，或在小鼠胚胎、兔胚胎和人干细胞中没有发现显著效应(Chu等人，2015)(Pinder等人，2015)(Song等人，2016)(Yang等人，2016)(Zhang等人，2017)。近年来，Greco等人重新分析了SCR7的结构和抑制特性(Greco等人，2016)。他们得出结论SCR7及其衍生物既不是人LIG4的选择性抑制剂，也不是其强力抑制剂。
[0012] 小分子NU7441、KU-0060648和U7026对NHEJ-通路中的一个关键蛋白复合物DNA-PK的药理学抑制在以下细胞中显示减少NHEJ的频率并提高PGE：利用dsODN供体在HEK293/TLR细胞中(从1.9至3.8％)、在HEK293细胞中(从3至7.6％)以及在人诱导性多能干细胞(hiPSC)中(从13至16％)提高PGE，并且利用ssODN供体在小鼠胚胎成纤维细胞中提高PGE(从3至10％)(Robert等人，2015)(Suzuki等人，2016)(Zhang等人，2017)。
[0013] 此外，记载了利用CRISPR-Cas9增强同源重组的小分子。RAD51刺激性化合物RS-1在兔胚胎中(从4.4至26.1％)、在HEK293A细胞中(从3.5至21％)以及在U2OS细胞中(从1.9至2.4％)提高PGE(Song等人，2016)(Pinder等人，2015)，但在hiPSC中不提高PGE(Zhang等人，2017),上述全部都利用dsODN供体。在猪胎儿成纤维细胞中使用ssODN供体发现RS-1对PGE效率没有作用(Wang等人，2016)。
[0014] 此外，使用大约4000个小分子的文库筛选，Yu等人发现β3-肾上腺素能受体激动剂L755507在hiPSC中使用ssODN供体提高PGE(从0.35至3.13％)，在小鼠ESC中使用dsODN供体提高PGE(从17.7至33.3％)，而该分子的修复通路靶标还是未知的(Yu等人，2015)。其他研究人员在HEK293A细胞或hiPSC中没有发现L755507对PGE的显著刺激作用(Pinder等人，2015)(Zhang等人，2017)。Pinder等人比较了SCR7、RS-1和L755507单独地和一起的作用，发现与单独RS-1相比，加入SCR7和L755507与RS-1一起没有累加效应。
[0015] 从对增强CRIPR-Cas9基因组编辑的小分子的当前现有技术概况，我们了解了在CRIPR-Cas9基因组编辑中DNA-PK可以提高PGE，但SCR7、L755507和RS-1的效应在细胞系和基因座之间并不一致。我们还了解了以前测试的小分子组合没有显示累加效应。
发明内容
[0016] 本发明的发明人已经发现，某些化合物，特别是当作为两种或更多种不同的化合物的组合应用时，提高精确基因组编辑效率。具体地，本发明人已经发现，选自NEDD8活化酶(NAE)的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、DNA-依赖性蛋白激酶(DNA-PK)特别是其催化亚基(DNA-PKcs)的抑制剂和复制蛋白A(RPA)的抑制剂的化合物，以及选自这些不同类抑制剂的化合物的组合，能够提高基因组编辑效率。这些化合物及其组合适合于非医药应用(如作为研究工具)或适合于医药应用(例如用于体内或离体用途)二者。
[0017] 此外，本发明的发明人已经发现无催化活性但结构完整的DNA-PKcs不依赖于如上所述的化合物的存在而提高精确基因组编辑效率。在多个不同的基因组编辑系统中发现此效应，因此该效应可广泛应用。
[0018] 在第一个方面，本发明涉及一种化合物，所述化合物是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制剂，在下文中被标注为化合物(I)，该化合物用于基因组编辑中。
[0019] HDAC抑制剂已知是通过诱导细胞周期停滞、分化和/或细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖的细胞生长抑制剂。HDAC抑制剂通常通过结合HDAC的含锌催化结构域来起作用。它们可以根据与锌离子结合的化学结构部分来进行分类。适宜的HDAC抑制剂类别的实例为：
[0020] (1)异羟肟酸化合物，
[0021] (2)经由巯基与锌离子结合的环状四肽和酯肽(depsipeptide)，
[0022] (3)苯甲酰胺化合物，
[0023] (4)亲电酮类，和
[0024] (5)脂族酸化合物。
[0025] 例如，Khan&La Thangue(Immunol.Cell Biol.90(2012),85-94)和Falkenberg&Johnstone(Nature Rev.Drug Discovery 13(2014)673-691)对HDAC抑制剂进行了综述，这些综述通过引用并入本文。
[0026] 根据本发明，HDAC抑制剂优选地选自合成的非核苷类化合物，例如，分子量为1500Da或更小或1000Da或更小的小分子。HDAC抑制剂的具体实例选自：曲古抑菌素A、伏林司他(Vorinostat)、恩替司他(Entinostat)、帕比司他(Panobinostat)、莫替司他(Mocetinostat)、贝利司他(Belinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、MC1568、盐酸Tubastatin A(Tubastatin A HCl)、Givinostat、LAQ824、CUDC-101、二盐酸奎诺司他(Quisinostat 2HCl)、Pracinostat、PCI-34051、Droxinostat、PCI-24781、RGFP966、AR-42、Rocilinostat、丙戊酸、CI994、CUDC-907、Tubacin、M344、Resminostat、RG2833、双丙戊酸钠、Scriptaid、苯丁酸盐、Tubastatin A、CAY10603、Nexturastat A、BG45、LMK-235、Santacruzamate A、BRD73954、HPOB、TMP269、他喹莫德(Tasquinimod)和4SC-202以及它们的盐或溶剂化物，特别是它们的药学上可接受的盐或溶剂化物。
[0027] 优选的化合物(I)是曲古抑菌素A，包括其盐和溶剂化物。
[0028] 在第二个方面，本发明涉及一种化合物，所述化合物是NEDD8活化酶(NAE)的抑制剂，所述化合物在下文中标注为化合物(II)，该化合物用于基因组编辑中。
[0029] 如例如由Nawrocki等人(Exp Opin Investing Drugs 21(2012),1564-1573)所综述，NAE抑制剂已知是抗肿瘤药，或如例如由Le-Trilling等人(Sci.Rep.6(2016),doi:19977)所综述，其是抗病毒药，上述综述通过引用并入本文。
[0030] 根据本发明，NAE抑制剂优选地选自合成的非核苷类化合物，例如分子量为1500Da或更小或1000Da或更小的小分子。优选的NAE抑制剂是MLN4924(Pevonedistat)或其任意的盐或溶剂化物，特别是其任意的药学上可接受的盐或溶剂化物。
[0031] 在第三个方面，本发明涉及一种化合物，所述化合物是DNA-依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的抑制剂，特别是其催化亚基(DNA-PKcs)的抑制剂，这些化合物在下文中标注为化合物(III)，其用于基因组编辑中。
[0032] 如例如由Davidson等人(Front.Pharmacol.4(2013),doi:13 3389)所综述，DNA-PK抑制剂已知是化疗剂，该综述通过引用并入本文。
[0033] 根据本发明，DNA-PK抑制剂优选地选自合成的非核苷类化合物，例如，分子量为1500Da或更小或1000Da或更小的小分子。DNA-PK抑制剂的具体实例是NU7026、NU7441、PIK-
75和PI-103以及它们的盐或溶剂化物，特别是它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
75和PI-103以及它们的盐或溶剂化物，特别是它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0034] 在优选的实施方案中，化合物(III)是NU7026，包括其盐和溶剂化物。
[0035] 在第四个方面，本发明涉及一种化合物，所述化合物是复制蛋白A(RPA)的抑制剂，所述化合物在下文中标注为化合物(IV)，其用于基因组编辑。
[0036] 如例如由Neher等人(Mel.Cancer Ther.10(2011),1756-1806)所综述，RPA抑制剂已知是抗肿瘤药，上述综述通过引用并入本文。
[0037] 根据本发明，RPA抑制剂优选地选自合成的非核苷类化合物，例如，分子量为1500Da或更小或1000Da或更小的小分子。RPA抑制剂的具体实例是NSC15520、TDRL-505和NSC111847，以及它们的盐或溶剂化物，特别是它们的药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0038] 化合物(IV)的优选实施方案是NSC15520，包括其盐和溶剂化物。
[0040] 具体地，本发明的发明人发现化合物(I)、(II)、(III)和/或(IV)当一起施用时具有累加效应。具体地，当使用由化合物曲古抑菌素A、MLN4924、NSC15520和NU7026组成的组合时，实现的精确基因组编辑的提高至多达6.7倍或几乎50％的被编辑的染色体，就发明人的知识而言，这是至今有记载的对人多能干细胞的最高基因组编辑效率。此外，当在多能干细胞中与无催化活性的DNA蛋白激酶催化亚基，特别是突变体K3753R一起使用上述化合物的组合时，实现了几乎完全正确的基因组编辑，达到82％的被编辑的染色体或提高19.2倍。此外，在少于2周的时间内它们无选择性地在三个基因的两条染色体上均实现了多重精确基因组编辑(MPGE)，并且第一次在哺乳动物系统中显示MPGE。三分之一的被分析克隆在三个基因的两条染色体上均具有靶向核苷酸置换。
[0041] 与核酸酶(例如，Cpf1)或能够在DNA双链(例如，染色体DNA)中在所需的基因座处引入交错切口的切口酶系统(例如，Cas9D10A)一起使用，施用化合物(I)、(II)、(III)和(IV)中的两个或更多个的组合，特别是至少一种化合物(III)和至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(II)和/或至少一种化合物(IV)的组合，发现了特别强的累加效应。
[0042] 在进一步的实施方案中，在造血细胞，例如T细胞，诸如CD4+T细胞或造血前体细胞，例如CD34+细胞中，与核酸酶(例如，Cpf1)或能够在DNA双链(例如，染色体DNA)中在所需的基因座处引入交错切口的切口酶系统(例如，Cas9D10A)一起使用，施用至少一种化合物(III)和至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(IV)的组合，特别是在缺少化合物(II)的条件下发现有强效应。
[0043] 在人胚胎肾细胞系HEK293和白血病细胞系K562中，当与核酸酶(例如，Cpf1)或能够在DNA双链(例如，染色体DNA)中在所需的基因座处引入交错切口的切口酶系统(例如，Cas9D10A)一起使用时，施用至少一种化合物(III)，任选地与至少一种化合物(I)和/或至少一种化合物(IV)一起，特别是在缺少化合物(II)的条件下发现有强效应。
[0044] 因此，本发明的一个方面涉及一种组合，例如，包含(a)化合物(I)、(b)化合物(II)、(c)化合物(III)和(d)化合物(IV)中的至少两种的组合物或试剂盒。一个优选的实施方案是其中化合物(I)是曲古抑菌素A，和/或化合物(II)是MLN4924，和/或化合物(III)是NU7026，和/或化合物(IV)是NSC15520的组合。具体地，本发明的组合意在用于基因组编辑，包括在非医药应用和医药应用中对两条染色体的多重基因组编辑。
[0045] 在本发明的上下文中，术语“组合”涵盖包含如上所述的至少两种化合物的组合物以及任选地与合适的载体混合在一起，所述载体例如药学上可接受的载体。术语“组合”还涵盖包含独立形式的如上所述的至少两种化合物的试剂盒，所述化合物各自任选地与合适的载体一起，所述载体例如药学上可接受的载体。
[0046] 此外，本发明涉及一种组合，例如包含下列各项的组合或试剂盒：(i)至少一种化合物(I)和至少一种化合物(II)，(ii)至少一种化合物(I)和至少一种化合物(III),(iii)至少一种化合物(I)和至少一种化合物(IV),(iv)至少一种化合物(II)和至少一种化合物(III),(v)至少一种化合物(II)和至少一种化合物(IV),或(vi)至少一种化合物(III)和至少一种化合物(IV)。优选的化合物(I)、(II)、(III)和/或(IV)如上所述。
[0047] 此外，本发明涉及一种组合，例如包含下列各项的组合物或试剂盒：(i)至少一种化合物(I)，至少一种化合物(II)，和至少一种化合物(III)，(ii)至少一种化合物(I)，至少一种化合物(II)，和至少一种化合物(IV),或(iii)至少一种化合物(II)，至少一种化合物(III)，和至少一种化合物(IV)。优选的化合物(I)、(II)、(III)和/或(IV)如上所述。
[0048] 此外，本发明涉及一种组合，例如包含下列各项的组合或试剂盒：至少一种化合物(I)，至少一种化合物(II)，至少一种化合物(III)和至少一种化合物(IV)。优选的化合物(I)、(II)、(III)和/或(IV)如上所述。
[0049] 在特别优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种化合物(III)和至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(II)和/或至少一种化合物(IV)的组合。在一些实施方案中，化合物(II)不存在。
[0050] 在进一步的特别优选的实施方案中，本发明涉及包含化合物(I)和化合物(IV)中的至少一种以及至少一种化合物(III)的组合。在一些实施方案中，化合物(II)不存在。
[0051] 如所述的本发明的组合可以进一步包括一种或多种附加的化合物。在一个实施方案中，所述组合可以包括用于使细胞同步化在G2/M期的化合物诸如诺考达唑(Nocodazole)和ABT-751(Yang等人,2016)，紫杉醇(Shu等人，Apoptosis 2(1997),463-470)，或秋水仙碱或长春新碱(Blajeski等人,J.Clin.Invest.110(2002),91-95),或它们的盐或溶剂化物。在进一步的实施方案中，所述组合可以包括Alt-NHEJ抑制剂诸如NSC19630或其盐或溶剂化物，特别是与无催化活性的DNA蛋白激酶催化亚基一起。
[0052] 本发明的组合例如组合物或试剂盒适合于用于真核靶细胞，特别是如下所述的真核靶细胞中的基因组编辑，所述真核靶细胞包括动物靶细胞诸如哺乳动物靶细胞，例如人靶细胞，以及来自非人动物诸如小鼠或斑马鱼的靶细胞，包括干细胞，例如，人干细胞，例如胚胎干细胞或多能干细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是真核靶生物体的干细胞，包括诱导性或胚胎多能干细胞，诸如人诱导性或胚胎多能干细胞以及来自非人动物的诱导性或胚胎多能干细胞。在其他实施方案中，所述靶细胞是造血细胞或造血祖细胞。在另外其他的实施方案中，所述靶细胞是永生化细胞诸如癌细胞。
[0053] 本发明的组合例如组合物或试剂盒特别适合在基因组编辑程序中，所述程序包括将交错切口，特别是具有5’突出端的交错切口引入到靶细胞的基因组中。为了实现此结果，靶细胞可以包括CRISPR/Cas9的突变切口酶形式，诸如CRISPR/Cas9 D10A或CRISPR/Cas9 H840A酶，CRISPR/Cas9 D10A或CRISPR/Cas9 H840A酶是CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1酶的突变切口酶形式。可选地，可以存在有其他基因组编辑酶，例如，CRISPR、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶蛋白、嗜热链球菌(Thermus thermophiles)Argonaute(TtAgo)、重组酶、或兆碱基大范围核酸酶或其他酶，特别是在双链靶DNA中提供交错切口的酶。本发明还适合与上述酶的断裂-融合形式一起，例如，与Cas9或Cas9 D10A的断裂-融合形式一起(Zetsche等人，2015)。一种或多种酶可以按原样被引入至靶细胞中，例如，作为蛋白或核糖核蛋白或作为编码各个酶的核酸分子被引入至靶细胞中。核酸分子可以作为与用于在靶细胞中瞬时或稳定表达的适宜的表达控制元件可操作连接的表达载体(诸如质粒)引入。用于将蛋白或核酸引入至真核靶细胞中的合适转染技术在本领域中是熟知的，并且包括脂质转染，电穿孔，例如核转染，基于磷酸钙或基于病毒的方法。
[0054] 在具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种化合物(III)和至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(II)和/或至少一种化合物(IV)的组合用于在真核靶细胞中的基因组编辑的用途，所述真核靶细胞是干细胞，包括诱导性或胚胎多能干细胞，诸如人诱导性或胚胎干细胞，其中所述基因组编辑程序包括将交错切口，特别是具有5’突出端的交错切口引入到靶细胞的基因组中。交错切口可以通过如前所述的酶引入到靶细胞的基因组中。
[0055] 在进一步具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种化合物(III)和至少一种化合物(I)和任选地至少一种化合物(IV)的组合，特别是在不存在化合物(II)的条件下，用于在真核靶细胞中的基因组编辑的用途，所述真核靶细胞是造血细胞，诸如T细胞，例如CD4+T细胞或造血祖细胞，诸如CD34+细胞，其中所述基因组编辑程序包括将交错切口，特别是具有5’突出端的交错切口引入到靶细胞的基因组中。交错切口可以通过如前所述的酶引入到靶细胞的基因组中。
[0056] 在进一步具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种化合物(III)任选地与化合物(I)和/或化合物(IV)中的至少一种的组合，特别是在不存在化合物(II)的条件下，用于在真核靶细胞中的基因组编辑的用途，所述真核靶细胞是哺乳动物永生化细胞，例如HEK293或K562，其中所述基因组编辑程序包括将交错切口，特别是具有5’突出端的交错切口引入到靶细胞的基因组中。交错切口可以通过如前所述的酶引入到靶细胞的基因组中。
[0057] 本发明的组合例如组合物或试剂盒可以进一步包含(i)DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整，(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子和/或(iii)包含或能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基(包括其断裂-融合形式)的真核细胞。优选地，无催化活性但结构完整的突变体具有与对应的野生型序列(例如人序列NP_008835.5)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且包含与所述野生型序列相比的至少一个导致减少的激酶活性的突变。合适的结构完整的无催化活性的突变体和用于检测此类突变体的测试例如由Neal等人,2001描述，该文通过引用并入本文。
[0058] 无催化活性但结构完整的DNA-PKcs亚基可以作为蛋白或编码各个亚基的核酸引入到靶细胞中用于在所述靶细胞中瞬时或稳定表达。此种方式可以与敲低靶细胞中的内源性DNA-PKcs基因组合使用，所述敲低例如通过靶向的同源重组或通过使用RNA干扰，例如siRNA来完成。此外，此种方式可以用于没有内源性DNA-PKcs的细胞中，例如通过使用来自不同物种(例如，进化上密切相关的物种)的DNA-PKcs突变体。
[0059] 具体地，DNA-PKcs突变体包含基于NCBI参考序列NP_008835.5在催化环(氨基酸3919-3927)(包括催化三联体(triade，N3927,D3922,H3924))中、或在P-环(氨基酸3729-
3735)中或在邻近区域(氨基酸3736-3760)(包括氨基酸F3946,T3950，特别是K3753)中的至少一个突变。其还可以包括基于NCBI参考序列NP_008835.5导致截短的突变(例如，Y4046*)，所述导致截短的突变使所述激酶活性减少或失活。所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
3735)中或在邻近区域(氨基酸3736-3760)(包括氨基酸F3946,T3950，特别是K3753)中的至少一个突变。其还可以包括基于NCBI参考序列NP_008835.5导致截短的突变(例如，Y4046*)，所述导致截短的突变使所述激酶活性减少或失活。所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
[0060] 甚至更具体地，DNA-PKcs突变体包含基于NCBI参考序列NP_008835.5的位置K3753(例如，突变K3753R和/或K3753H)、位置D3922(例如，突变D3922A)、位置T3950(例如，T3950D)和/或位置F3946(例如，F3946D)处的至少一个突变。所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
[0061] 此外，DNA-PKcs可以包括磷酸化簇中的至少一个突变，所述突变正常地是其自身磷酸化功能的靶标。这些突变可以包括失活突变，例如但不限于基于NCBI参考序列NP_008835.5的用于PQR簇(S2023和/或S2029和/或S2041和/或S2053和/或S2056)的丙氨酸，和/或激活(模拟磷酸化)突变，例如但不限于基于NCBI参考序列NP_008835.5的用于ABCDE簇(T2069和/或S2612和/或T2620和/或S2624和/或T2638和/或T2647)和/或N簇(S56和/或S72)和/或JK簇(T946和/或S1003)的天冬氨酸。所述氨基酸的位置可以在不同于人的其他物种中在DNA-PKcs或其直系同源物中发生变化。
[0062] 所述组合，例如组合物或试剂盒适合于与所有种类的供体核酸分子一起使用，所述供体核酸分子包括但不限于单链分子或双链DNA分子，无论是体内或体外扩增的还是化学合成的。供体核酸分子的长度通常在约20-2000nt或更大的范围内，例如，约80-120nt、50-200nt或500-2000nt。供体核酸分子被设计为考虑野生型序列包括至少一种所需的突变，所述突变将通过基因组编辑被引入到靶细胞的基因组中。所述突变可以是单核苷酸突变或涵盖多个核苷酸的突变。就此而言，术语突变是指单一核苷酸或多个核苷酸的置换、缺失或插入。
[0063] 上述的多个方面包括体内的用途，例如在分离的细胞或细胞簇中，以及在体外的用途，在靶生物体的细胞中。所述组合可以应用于如上所述的细胞类型以及与如上所述的基因组编辑程序一起应用，特别是包括使用能够在DNA双链中引入交错切口的DNA裂解酶系统。这个方面还包括在医药(包括人用医药或兽医用医药)中的用途。
[0064] 本发明的进一步的方面涉及(i)DNA蛋白激酶催化亚基，如上所述，所述DNA蛋白激酶催化亚基无催化活性但结构完整，特别是突变的亚基K3753R，(ii)编码(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的核酸分子和/或(iii)包含或能够表达(i)的DNA蛋白激酶催化亚基的真核细胞，用于在真核靶细胞，特别是在脊椎动物靶细胞，例如哺乳动物靶细胞中的基因组编辑的用途，所述哺乳动物靶细胞包括啮齿类动物、人或非人靶细胞，包括人干细胞。
[0065] 此方面包括体内的用途，例如在分离的细胞或细胞簇中，以及在体外的用途，在靶生物体的细胞中。DNA-PKcs突变体可以应用于如上所述的所有细胞类型以及与如上所述的所有类型的基因组编辑程序一起应用，例如包括使用任意的DNA裂解酶，例如能够在DNA双链中引入交错切口的酶系统，还包括其他酶系统，例如能够引入平端切口的酶系统。这个方面还包括在医药(包括人用医药或兽医用医药)中的用途。
[0066] 本发明的又另一个方面是所述组合，例如，包含至少两种不同的化合物(I)、(II)、(III)和(IV)的组合物或试剂盒在医药(包括人用医药或兽医用医药)中的用途。除了用于制备药物组合物的生理学上可接受的载体、稀释剂和/或辅料以外，使用根据本发明的化合物或其盐、溶剂化物或其前药的有效剂量。活性化合物的剂量可以根据给药途径、患者的年龄和体重、待治疗的疾病的性质和严重性以及类似的因素而发生变化。日剂量可以作为单次剂量给予，即一次施用，或可以被细分成两个或更多个日剂量，通常为0.001-2000mg。特别优选的是施用0.1-500mg,例如0.1-100mg的日剂量。
[0067] 合适的施用形式是口服、肠胃外、静脉内、经皮、局部、吸入、经鼻和舌下制剂。特别优选的是使用根据本发明的化合物的口服、肠胃外(例如，静脉内或肌内)、经鼻制剂(例如，干粉)或舌下制剂。可以使用常规的盖仑制剂形式，诸如片剂、糖包衣片剂、胶囊剂、分散性粉剂、颗粒剂、水溶液、含醇水溶液、水性或油性混悬液、糖浆剂、汤剂(juices)或滴剂。
[0068] 固体药物形式可以包括惰性组分和载体物质，诸如碳酸钙、磷酸钙、磷酸钠、乳糖、淀粉、甘露醇、藻酸盐、明胶、瓜尔胶、硬脂酸镁、硬脂酸铝、甲基纤维素、滑石、高分散硅酸、硅油、高分子量脂肪酸(诸如硬脂酸)、明胶、琼脂或植物或动物脂肪和油，或固体高分子量聚合物(诸如聚乙二醇)；如果需要，适合于口服给药的制剂可以包含附加的风味剂和/或增甜剂。
[0070] 用于肠胃外给药的制剂可以以单独的剂量单位形式存在，诸如安瓿或小瓶。使用的制剂优选地由活性化合物的溶液，优选水溶液，且特别是等渗溶液以及混悬液制成。这些注射形式可以被制成为可作为即用型制剂获得，或仅在使用前通过将活性化合物(例如，冻干物，适当时含有其他固体载体物质)与所需的溶剂或混悬剂混合来直接制备。
[0071] 经鼻制剂可以作为水性溶液或油性溶液或作为水性混悬液或油性混悬液存在。它们也可以作为冻干物存在，在使用前使用合适的溶剂或混悬剂制备。
[0072] 可吸入制剂可以作为粉末、溶液或混悬液存在。优选地，可吸入制剂为粉末的形式，例如作为活性成分与合适的配方助剂诸如乳糖的混合物。
[0073] 所述制剂在常规的抗菌和无菌条件下生产、分装和密封。
[0074] 本发明的化合物可以单独施用或与另外的活性剂一起作为联合疗法施用。
[0075] 本发明的组合的医药用途特别地涵盖靶向基因疗法，例如，治疗与需要所述治疗的患者的不合乎需要的基因型相关的病症。例如，所述病症是代谢功能障碍或癌症。依靠本发明，来自患者的细胞可以在如上所述的组合的存在下接受基因组编辑程序，由此提高精确基因组编辑效率。此程序可以在体内执行，即，通过将所述组合施用于患者，或离体地与从所述患者分离的细胞一起，分离的细胞在成功进行基因组编辑后再植入至所述患者中。所述患者可以是脊椎动物诸如哺乳动物，优选人患者。最后，本发明的组合也适合用于在植物细胞或植物中的基因组编辑。
附图说明
[0077] 图1:基因组编辑和分析流程图。iCRISPR 409-B2 iPSC用2μg/ml多西环素处理至少2天以诱导Cas9或Cas9D10A表达。用RNAiMAX、gRNA(每种7.5nM)、ssODN(10nM)和待评价的小分子在96孔板中进行反向转染1天。使用的细胞量达到～80％汇合。然后定期更换培养基扩充细胞3天。收获后，接着进行DNA提取，对靶向基因座的PCR扩增，Illumina测序和对插入/缺失的量以及精确基因组编辑的CRISPResso(Pinello等人，2016)序列分析。
[0078] 图2：为人和尼安德特人的最近共同祖先的古老状态设计用于人CALD1、KATNA1和SLITRK1的精确基因组编辑(PGE)的gRNA和ssODN。示出了CALD1、KATNA1和SLITRK1的各个基因座以及用于生成DSB的gRNA和它们的效率评分(sc)(sgRNA scorer 1.0，Chari等人，2015)。PAM位点是灰色的，靶序列是蓝色的，待改变的碱基是红色的。用箭头指示由Cas9D10A(Cas9n)产生的缺口点或由Cas9产生的DSB。而两个向导均用于利用Cas9n的编辑，CALD1 g1、KATNA1 g2和SLITRK1g2用于利用Cas9的编辑。还示出了用于利用两个Cas9变体编辑的各个ssODN。所需的突变标记为绿色，其他的突变为橙色。“Block”表示用来防止对基因座的再切割的Cas9-阻断突变。所有Cas9D10A供体在缺口后具有50nt同源臂，而所有Cas9供体总计90nt，所需突变在中间部分居中。全部序列显示在表2中。
[0079] 图3：对于不同的小分子浓度对利用iCRISPR Cas9D10A对CALD1、KATNA1和SLITRK1的基因组编辑的溶剂效应和影响的第一次筛选。显示了精确基因组编辑(PGE)和分别具有绿色圆圈(三角形)或蓝色菱形的插入/缺失。每个符号代表一次技术重复。各个均值显示为黑线。每个skull指示通过相差光学显微镜确定的达到20％的细胞死亡。利用1μM和0.1μM曲古抑菌素A使所有细胞死亡。选择用于进一步试验的浓度用蓝绿色标记。
[0080] 图4:小分子对利用Cas9D10A和Cas9在CALD1、KATNA1和SLITRK1中的精确基因组编辑(PGE)效率的效应。PGE效率以相对单位(RU)表示，对照的均值设为1，以说明不同基因座中的不同效率。显示了n次独立试验的技术重复。灰色和黑色条分别代表对照的均值和各个小分子的均值。使用的浓度为：20μM NU7026，0.01μM曲古抑菌素A(TSA)，0.5μM MLN4924,1μM NSC 19630,5μM NSC 15520,20μM AICAR,1μM RS-1,1μM白藜芦醇,1μM SCR7,5μM L755507,5μM STL127685和20μM B02。
[0081] 图5:小分子组合对利用Cas9D10A和Cas9在CALD1、KATNA1和SLITRK1中和利用Cpf1在HPRT和DMNT1中的精确基因组编辑(PGE)效率的影响。在409-B2 iCRISPR iPSC系中小分子对利用Cas9D10A的PGE效率有累加效应(A)，但对利用Cas9的PGE效率没有累加效应(B)。在409-B2 hiPSC中使用CRISPY混合物也提高利用重组Cpf1对HPRT和DMNT1的PGE效率(C)。
使用CRISPY混合物，在SC102A1 hiPSC和H9 hESC中利用质粒递送的Cas9n-2A-GFP(富含GFP-FACS)，以及在黑猩猩SandraA ciPSC中利用重组Cpf1，PGE效率也提高(D)。分别用绿色、灰色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示对于A、B和C的三次技术重复以及对于D的两次技术重复的标准差。使用的浓度为：20μM NU7026，0.01μM曲古抑菌素A(TSA)，0.5μM MLN4924,1μM NSC 19630,5μM NSC 15520,20μM AICAR和1μM RS-1。
CRISPY混合物表示NU7026、TSA、MLN4924和NSC 15520的小分子混合物。基因敲入效率改变的显著性使用对三个基因CALD1、KATNA1、SLITRK1所汇总的双因素ANOVA和Tukey多重比较来确定。多个基因和多种处理分别作为随机和固定效应进行处理。分析包括对每个基因的3次技术重复。对于多重比较调整P值(**P≤0.01,***P≤0.001)。
使用CRISPY混合物，在SC102A1 hiPSC和H9 hESC中利用质粒递送的Cas9n-2A-GFP(富含GFP-FACS)，以及在黑猩猩SandraA ciPSC中利用重组Cpf1，PGE效率也提高(D)。分别用绿色、灰色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示对于A、B和C的三次技术重复以及对于D的两次技术重复的标准差。使用的浓度为：20μM NU7026，0.01μM曲古抑菌素A(TSA)，0.5μM MLN4924,1μM NSC 19630,5μM NSC 15520,20μM AICAR和1μM RS-1。
CRISPY混合物表示NU7026、TSA、MLN4924和NSC 15520的小分子混合物。基因敲入效率改变的显著性使用对三个基因CALD1、KATNA1、SLITRK1所汇总的双因素ANOVA和Tukey多重比较来确定。多个基因和多种处理分别作为随机和固定效应进行处理。分析包括对每个基因的3次技术重复。对于多重比较调整P值(**P≤0.01,***P≤0.001)。
[0082] 图6:CRISPY混合物和小分子组合对在非多能性细胞类型中利用Cpf1在HPRT中的精确基因组编辑(PGE)效率的影响。显示了用于HEK293和K562细胞的CRISPY混合物组分的所有可能组合(A)。尽管NU7026提高PGE效率，但TSA和NSC15520没有明显的效应，MLN4924在具有癌症特征的那些细胞系中有明显的破坏效应。MLN4924对原代细胞中的PGE效率也有破坏效应(B)。在CD4+T和CD34+祖细胞中，没有MLN4924的CRISPY混合物对PGE效率的效应比单独NU7026更高。在原代人表皮角质形成细胞(HEKa)中，NU7026和NSC15520对PGE效率也具有破坏效应。分别用绿色、灰色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示对于A的两个独立实验以及对于B的两个独立实验中的每一个的两次技术重复的标准差。CRISPY混合物指示为20μM NU7026、0.01μM曲古抑菌素A(TSA)、0.5μM MLN4924和5μM NSC
15520小分子混合物。
15520小分子混合物。
[0083] 图7:CRISPY混合物及其组分的毒性。在(A)中显示了在具有和不具有RNAiMax、gRNA和ssODN的条件下，与来自图4和图5的小分子以及组合孵育24h后来自409-B2-iCRISPR-Cas9n细胞的刃天青测定。刃天青被细胞脱氢酶转化成荧光resorfin，得到的荧光(激发：530-570nm,发射：590-620nm)被认为是细胞活力的标志物(O’Brien等人，2000)。CRISPY混合物用黑边突出显示，具有轻微毒性，其组分没有累加的毒性作用。误差条显示两次技术重复的标准差。在(B)中显示了与CRISPY混合物和模拟处理一起经5轮传代细胞后的核型分析。使用胰蛋白酶诱导的吉姆萨染色分析大量(bulk)的至少20个中期细胞以及每种条件下5个克隆。没有鉴定到数值上或大规模的染色体畸变，除了与CRISPY混合物(25个细胞中期多倍体中有3个)和模拟处理(25个细胞中期多倍体中有4个)对应的来自两个单一克隆的一小组中期细胞以外。
[0084] 图8:CRISPY混合物及其组分NU7026对在人诱导性多能干细胞中的BFP插入(ssODN)效率的影响。在(A)中显示了mtagBFP2(Subach等人，2011)ssODN供体和iCRISPR系统的设计。在杂合的AAVS1 iCRISPR基因座(409-B2 iCRISPR-Cas9n hiPSC)中，我们插入了871nt(包括50nt同源臂)序列，所述序列编码2A-自裂解肽和在其后的蓝色荧光蛋白(BFP)，紧接在BFP之后的是Cas9n的N-末端核定位信号序列(NLS)。如果插入了该序列，多西环素将导致输入核中的BFP的表达。在(B)中在BFP表达7天后模拟处理、NU7027、和CRISPY混合物处理的代表性图像显示为相差(PC)、碘化丙啶细胞核染色(PI)、mtagBFP2表达(BFP)以及PI和BFP的合并。来自对各个处理的三次技术重复的每一个的两个图像(放大50倍，白色尺寸条为200μm)用来使用ImageJ定量具有BFP插入的细胞的百分比(C)。
[0085] 图9:无催化活性的DNA-PKcs(K3753R)促进同源定向修复(HDR)并阻断非同源末端连接(NHEJ)。在被例如CRISPR Cas9或Cpf1(淡蓝色与灰色gRNA)诱导双链断裂(DSB)后，DNA末端被Ku70/80(橙色)覆盖，接着结合DNA-PKcs(青色)，两者在每个DSB端上构成DNA-PK复合物(A)。DNA-PKcs的自身磷酸化导致下游NHEJ蛋白的征集和活化。当DNA-PKcs具有催化活性时，NHEJ超过HDR。如果DNA-PKcs是无催化活性的(例如，通过K3753R突变),自身磷酸化不会发生，并且NHEJ通路被阻断。激酶失活的DNA-PKcs导致对DSB的优先HDR修复。DNA-PKcs的组织结构连同其磷酸化簇、与其激酶(紫色)和K3753R突变(深蓝色)显示在(B)中(修改自Neal等人，2014)。4128aa(～470kDa)长的酶具有下列的由丝氨酸/苏氨酸组成的磷酸化簇：N(残基56和72)、JK(残基946和1003)、PQR(2023和2056之间的5个残基)和ABCDE(2609和
2647之间的6个残基)。一些簇当磷酸化时活化DNA-PKcs，而其他簇则解除NHEJ或甚至使激酶失活(Neal等人，2014)。N簇的磷酸化以及T3950和K3753R突变已经显示使激酶活性失活(Neal等人，2011,Shrivastav等人，2008,Douglas等人，2007)。DNA-PKcs及其在K3753附近的序列在脊椎动物中是进化保守的(C)(Kent等人，2002)。
2647之间的6个残基)。一些簇当磷酸化时活化DNA-PKcs，而其他簇则解除NHEJ或甚至使激酶失活(Neal等人，2014)。N簇的磷酸化以及T3950和K3753R突变已经显示使激酶活性失活(Neal等人，2011,Shrivastav等人，2008,Douglas等人，2007)。DNA-PKcs及其在K3753附近的序列在脊椎动物中是进化保守的(C)(Kent等人，2002)。
[0086] 图10:无催化活性的DNA-PKcs(K3753R)引起DNA双链断裂几乎完全地转变为精确基因组编辑(PGE)。与野生型DNA-PKcs相比，KR突变体在409-B2 hiPSC中引起提高的PGE，无论所引入的双链断裂的类型是什么。显示了利用Cas9n双切口对CALD1、KATNA1、SLITRK1和PRKDC(R3753K)(A)，以及利用Cas9对CALD1或利用Cpf1对HPRT(B)的PGE提高。分别用绿色、浅绿色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示对于A的两个独立实验中的每一个的三次技术重复以及对于B的两次技术重复的标准差。细胞与多西环素孵育3天以表达Cas9n用于A的双切口。
[0087] 图11:对CALD1、KATNA1和SLITRK1的有效多重精确基因组编辑(MPGE)。在409-B2 hiPSC中利用DNA-PKcs KR突变，gRNA和ssODN DNA供体的电穿孔允许对所有三个基因实现稳定的大量精确基因组编辑(PGE)效率(A)。分别用绿色、浅绿色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示两次技术重复的标准差，细胞与多西环素孵育4天以表达Cas9n用于双切口。古老突变和沉默阻断突变不总是一起掺入到染色体中，其中发生靶向核苷酸置换(TNS)并且远离其他突变的阻断突变可以作为唯一TNS被掺入(B)。用于各个基因的双切口引导靶标(蓝色)和突变(绿色)按比例显示。在33个被分析的克隆的携带CALD1、KATNA1和SLITRK1的染色体中基因组编辑事件(TNS和/或插入/缺失)的热图显示在(C)中。对于所有三个基因，大多数克隆仍然保持野生型或被精确编辑。热图对单一基因呈现两个染色体或对所有三个基因呈现6个染色体，其中掺入了插入/缺失以及掺入了任意的TNS，无论是阻断突变还是古老突变(左侧图),或至少掺入了古老突变(右侧图)。如果使用一小部分刚刚电穿孔的细胞进行单细胞稀释接种，则在少于两周内有可能产生MPGE克隆(D)。在挑选的56个克隆中，45个存活，这些中的12个源自超过一种细胞(基于DNA测序读取比例)，留下33个克隆用于分析。
[0088] 图12:CRISPY混合物和DNA-PKcs(K3753R)对利用Cas9D10A在CALD1、KATNA1和SLITRK1中的精确基因组编辑(PGE)效率的累加效应。与野生型(WT)相比，利用DNA-PKcs KR突变体(KR)，PGE效率大大提高，并且对于单一基因通过添加CRISPY混合物而PGE效率进一步提高(A)，对于多重PGE则甚至更高(B)，在多重PGE的情况下效率一般较低。分别用绿色、浅绿色或蓝色条显示PGE、PGE+插入/缺失以及插入/缺失。误差条显示三次技术重复的标准差。CRISPY混合物表示为20μM NU7026、0.01μM曲古抑菌素A(TSA)、0.5μM MLN4924和5μM NSC 15520的小分子混合物。细胞与多西环素孵育2天(孵育4天用于多重用途)以表达Cas9n用于双切口。
[0089] 图13:在培养3个月后具有DNA-PKcs KR突变的409-B2 iCRISPR hiPSC的代表性染色体组型。在通过胰蛋白酶诱导的吉姆萨染色分析的25个中期细胞中，所有都显示健康的核型(46,XX)。没有鉴定到数值上或大规模的染色体畸变(条带数目350,灰度3)。
[0090] 方法
[0091] 细胞培养
[0092] 培养用于此项目的干细胞系包括人409-B2 hiPSC(女性,Riken BioResource Center)和SC102A1 hiPSC(男性,BioCat GmbH),黑猩猩SandraA ciPSC(雌性,Mora-Bermúdez等人，201637),以及H9 hESC(雌性,WiCell Research Institute,Ethics permit AZ 3.04.02/0118)。干细胞系在基质胶基质(Corning,35248)上生长，并且含有mTeSR1补充剂(StemCell Technologies,05852)的mTeSR1(StemCell Technologies,05851)用作培养基。
使用的非多能性细胞类型以及它们各自的培养基为：HEK293(ECACC,85120602)使用补充了
10％FBS(SIGMA,F2442)和1％NEAA(SIGMA,M7145)的DMEM/F-12(Gibco,31330-038)；K562+
(ECACC,89121407)使用补充了10％FBS的IMDM(ThermoFisher,12440053)；CD4 T细胞(HemaCare,PB04C-1)使用补充了10％FBS的RPMI 1640(ThermoFisher,11875-093)，并用Dynabeads人T-激活剂(CD3/CD28)(ThermoFisher,11131D)活化；CD34+祖细胞(HemaCare,M34C-1)使用补充了StemSpan CC110(StemCell,02697)的StemSpan SFEM(Stemcell,
09600)；以及HEKa(Gibco,C0055C)使用Medium 154(ThermoFisher,M154500)和人角质细胞生长添加剂(ThermoFisher,S0015)。细胞在37℃在充有5％CO2的加湿孵箱中生长。对干细胞每天更换培养基，对非多能性细胞系每两天更换培养基。细胞培养维持4-6天，直至～
80％汇合，并且以1:6-1:10的稀释度进行继代培养。使用EDTA(VWR,437012C)使贴壁细胞解离。在细胞分裂一天后在培养基中补充10μM Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632(Calbiochem,688000)以提高细胞存活。
使用的非多能性细胞类型以及它们各自的培养基为：HEK293(ECACC,85120602)使用补充了
10％FBS(SIGMA,F2442)和1％NEAA(SIGMA,M7145)的DMEM/F-12(Gibco,31330-038)；K562+
(ECACC,89121407)使用补充了10％FBS的IMDM(ThermoFisher,12440053)；CD4 T细胞(HemaCare,PB04C-1)使用补充了10％FBS的RPMI 1640(ThermoFisher,11875-093)，并用Dynabeads人T-激活剂(CD3/CD28)(ThermoFisher,11131D)活化；CD34+祖细胞(HemaCare,M34C-1)使用补充了StemSpan CC110(StemCell,02697)的StemSpan SFEM(Stemcell,
09600)；以及HEKa(Gibco,C0055C)使用Medium 154(ThermoFisher,M154500)和人角质细胞生长添加剂(ThermoFisher,S0015)。细胞在37℃在充有5％CO2的加湿孵箱中生长。对干细胞每天更换培养基，对非多能性细胞系每两天更换培养基。细胞培养维持4-6天，直至～
80％汇合，并且以1:6-1:10的稀释度进行继代培养。使用EDTA(VWR,437012C)使贴壁细胞解离。在细胞分裂一天后在培养基中补充10μM Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632(Calbiochem,688000)以提高细胞存活。
[0093] iCRISPR细胞系的产生和验证
[0094] 如由Gonzalez等人(Gonzalez等人，2014)所述使用人409-B2 iPSC来建立iCRISPR-Cas9系。为了产生iCRISPR-Cas9D10A系，使用Q5诱变试剂盒(New England Biolabs,E0554S)对Puro-Cas9供体进行定点诱变。引物购自IDT(Coralville,USA)并显示在表2中。使用PSC 4-标志物免疫细胞化学试剂盒(Molecular Probes,A24881)验证多能性标志物SOX2、OCT-4、TRA1-60和SSEA4在iCRISPR系中的表达(数据未显示)。使用定量PCR来确认多西环素诱导性Cas9或Cas9D10A表达，使用数字PCR来排除iCRISPR盒的脱靶整合(数据未显示)。
[0095] 小分子
[0096] 在此研究中使用的市售小分子为NU7026(SIGMA,T8552)、TSA(SIGMA,T8552)、MLN4924(Adooq BioScience,A11260)、NSC 19630(Calbiochem,681647)、NSC 15520(ChemBridge,6048069)、AICAR(SIGMA,A9978)、RS-1(Calbiochem,553510)、白藜芦醇(Selleckchem,S1396)、SCR7(XcessBio,M60082-2s)、L755507(TOCRIS,2197)、B02(SIGMA,SML0364)和STL127685(Vitas-M)。STL127685是不能商购的STL127705的4-氟苯基类似物。使用二甲基亚砜(DMSO)(Thermo Scientific,D12345)制备15mM(或对于NU7026为10mM)的母液。溶解度是NU7026浓度的限制因素。对不同的浓度制备合适的工作溶液使得每个小分子的添加占培养基中0.08％(或对于NU7026为0.2％)DMSO的终浓度。所有小分子的添加将形成0.7％DMSO的终浓度。
[0097] gRNA和ssODN的设计
[0098] 我们选择在三个基因CALD1、KATNA1和SLITRK1中引入一个所需的突变，返回到人和尼安德特人的最近的共同祖先(Prüfer等人，2013)的状态。选择用于利用Cas9D10A缺口酶编辑的gRNA对，以在距离所需突变和距离各个配对的sgRNA的短距离处有效率地切割。采用sgRNA scorer 1.0tool(Chari等人，2015)以百分位数等级评分评估效率。设计用于切口酶编辑的供体ssODN以便具有所需的突变和Cas9-阻断突变以防止基因座的再切割，并且在每个切口的上游和下游具有至少30nt的同源臂(图2)。使用较靠近所需突变切割的切口酶gRNA对的gRNA与位于所需突变中央并且含有Cas9-阻断突变的90nt ssODN一起用于Cas9核酸酶编辑(图2)。设计用于使用Cpf1编辑HPRT和DMNT1的ssODN以便含有在PAM位点附近的阻断突变和在切口附近的附加突变。gRNA(crRNA和tracR)和ssODN购自IDT(Coralville,USA)。ssODN和crRNA靶标显示在表2中。
[0099] 寡核苷酸的脂质转染
[0100] 在脂质转染前2天，将细胞用含有2μg/ml多西环素(Clontech,631311)的培养基孵育。使用alt-CRISPR生产厂商的实验规程(IDT)以7.5nM终浓度的每个gRNA和10nM的各个ssODN完成脂质转染(反向转染)。简言之，0.75μl RNAiMAX(Invitrogen,13778075)和各个寡核苷酸各自分别地在25μl OPTI-MEM(Gibco,1985-062)中稀释并在室温孵育5min。将两种稀释液混合以产生50μl包含RNAiMAX、gRNA和ssODN的OPTI-MEM。脂质转染混合物在室温孵育20-30min。在孵育期间，使用EDTA分离细胞5min，并使用Countess Automated Cell Counter(Invitrogen)计数。将100μl含有在补充有Y-27632的mTeSR1中的25.000个解离细胞的脂质转染混合物、2μg/ml多西环素和各个待测小分子充分混合，并放置在覆盖以基质胶基质(Corning,35248)的96孔的一个孔中。在24小时后将培养基更换为常规mTeSR1培养基。
[0101] 寡核苷酸和核糖核蛋白电穿孔(核转染)
[0102] 重组A.s.Cpf1和S.p.Cas9蛋白和电穿孔增强剂购自IDT(Coralville,USA)，除了下列的改动以外，使用生产厂商的实验规程完成核转染。使用Nucleofector 2b装置(Lonza)的B-16程序(或对于CD4+T细胞使用U-14)在小杯中完成核转染，使用100μl人干细胞核转染缓冲液(Lonza,VVPH-5022),或人T细胞核转染缓冲液用于CD4+T细胞(Lonza,VPA-1002)，以及人CD34细胞核转染缓冲液用于CD34+祖细胞(Lonza,VPA-1003),包含各个细胞系的100万个细胞、78pmol电穿孔增强剂、160pmol每种gRNA(对于Cas9为crRNA/tracR双链体和对于Cpf1为crRNA)(320pmol用于利用两种gRNA对一个基因进行双切口)、200pmol ssODN供体、252pmol CRISPR蛋白。对于多重应用，仅gRNA和单链DNA供体被电穿孔，因为使用表达Cas9n的iCRISPR-Cas9n hiPSC系。使用Countess Automated Cell Counter(Invitrogen)对细胞计数。
[0103] FACS-分选
[0104] 使用Nucleofector 2b装置(Lonza)的B-16程序在小杯中将2μg质粒DNA(pSpCas9n(BB)-2A-GFP(PX461),Addgene#48140)引入到不能被诱导表达Cas9的细胞中，使用100μl含有100万个SC102A1 iPSC或H9ESC的人干细胞核转染缓冲液(Lonza,VVPH-5022)。使用Countess Automated Cell Counter(Invitrogen)对细胞计数。核转染后24h，使用Accutase(SIGMA,A6964)解离细胞，过滤获得单细胞溶液，并进行荧光相关细胞分选(FACS)，分选GFP表达细胞。在采用BD FACSAria III(Becton-Dickinson)分选期间，细胞在补充有Y-27632的mTeSR1中保持于4℃。分选后48h，利用sgRNA、ssODN和小分子处理对细胞进行脂质转染。
[0105] Illumina文库制备和测序
[0106] 脂质转染后3天，使用Accutase(SIGMA,A6964)将细胞解离、离心沉淀并重新悬浮在15μl QuickExtract(Epicentre,QE0905T)中。在65℃孵育10min,在68℃孵育5min以及最后在98℃孵育5min，产生ssDNA作为PCR模板。用于CALD1、KATNA1和SLITRK1的每个靶向基因座的包含用于Illumina测序的连接物(adapter)的引物购自IDT(Coralville,USA)。PCR在T100热循环仪(Bio-Rad)中使用备有缓冲液B的KAPA2G Robust PCR试剂盒(Peqlab,07-KK5532-03)和3μl细胞提取物以25μl的总体积完成。PCR的热循环计划为：95℃ 3分钟；34x(95℃ 15秒,65℃ 15秒,72℃ 15秒)；72℃ 60秒。在第二个PCR反应中使用Phusion HF MasterMix(Thermo Scientific,F-531L)以及0.3μl的第一PCR产物，加入具有样品特异性指标的P5和P7 Illumina连接物(Kircher等人，2012)。PCR的热循环计划为：98℃ 30秒；25x(98℃ 10秒,58℃ 10秒,72℃ 20秒)；72℃ 5分钟。使用EX凝胶(Invitrogen,G4010-11)通过尺寸分离的琼脂糖凝胶电泳验证扩增。使用固相可逆固定(SPRI)珠(Meyer,Kircher 2010)纯化指标索引的扩增子。在MiSeq(Illumina)上对双重指标索引的文库测序，得出2x
150bp的配对末端序列。在使用Bustard(Illumina)进行碱基判定后，使用leeHom将连接物截掉(Renaud等人，2014)。
150bp的配对末端序列。在使用Bustard(Illumina)进行碱基判定后，使用leeHom将连接物截掉(Renaud等人，2014)。
[0107] 序列数据分析
[0108] 使用CRISPresso(Pinello等人，2016)分析来自CRISPR基因组编辑实验的测序数据中野生型、靶向核苷酸置换(TNS)、插入/缺失以及TNS和插入/缺失的混合体的百分比。用于分析的参数为‘-w 20’、‘--min_identity_score 70’和‘--ignore_substitutions’(分析限于与野生型序列具有最小70％相似性的扩增子以及来自每个gRNA的20bp的窗口；忽略置换，因为测序错误将被错误地表征为NHEJ-事件)。通过使用SAMtools评价实际读取(read)序列进一步分析来自单细胞接种后的集落的测序数据(图3B和C)。使用序列读取(read)比例将克隆集落与混合集落相区分。如果读数(reads)的绝对多数由单一序列组成(纯合形式)或由相似读数计数(read count)的两条序列组成(杂合形式)，则集落作为克隆被计数。假设每个孔具有两条染色体，因为我们显示为健康的核型。对克隆的细胞的每条染色体标注整合的阻断突变、古老突变以及插入/缺失。
[0109] 统计学分析
[0110] 使用对三个基因CALD1、KATNA1、SLITRK1所汇总的双因素ANOVA和Tukey多重比较来确定TNS效率改变的显著性。多个基因和多种处理分别作为随机和固定效应进行处理。因此，我们测试了处理对其与基因的相互作用的效应(Zar 1999)。分析包括对每个基因的3次技术重复。我们检查了对QQ-plot的目测(Field 2005)和针对拟合值作图的残差(Quinn&Keough 2002)是否满足正常分布和同质性的残差的假设。这些显示了大致对称分布但具有长尾的残差(即，太大的正残差和负残差)，并且与同质性假设没有显著的偏差。对多重比较调整P值。使用R完成统计学分析。
[0111] 刃天青测定
[0112] 将409-B2 iCRISPR-Cas9n hiPSC与或不与编辑试剂(对于KATNA1编辑，为RNAiMax、gRNA和ssODN供体)一起接种，如“寡核苷酸的脂质转染”中所述。向培养基补充小分子或小分子的组合，并且每种条件一式两份地进行。24h后，吸出培养基，并加入100μl新鲜培养基以及10μl刃天青溶液(Cell Signaling,11884)。刃天青被细胞脱氢酶转化成荧光resorfin，得到的荧光(激发：530-570nm,发射：590-620nm)被认为是细胞活力的线性标志物(O’Brien等人，2000)。细胞与刃天青在37℃孵育。使用Typhoon 9410成像仪(Amershamn Biosciences)通过吸光度读数每小时测量氧化还原反应。5h后吸光度扫描显示良好的对比度，没有被饱和，并且用来使用ImageJ和“ReadPlate”插件量化吸收度。具有培养基和刃天青但没有细胞的复孔用作空白。
[0113] 显微镜和图像分析
[0114] 409-B2 iCRISPR-Cas9n hiPSC用gRNA和蓝色荧光蛋白(BFP)单链寡聚体(图(8A,330ng)进行核转染，对于模拟处理、NU7026处理和CRISPY混合物处理中的每一个做两次技术重复。向培养基补充2μg/ml多西环素(Clontech,631311)持续7天，以允许在精确编辑的细胞中表达输入核的BFP。然后，用在DPBS(ThermoFisher,A24881)中的4％甲醛固定细胞
15min，用在补充了100μg/ml RNAseA(ThermoFisher,EN0531)和40μg/ml碘化丙啶(ThermoFisher,P3566)的DPBS(ThermoFisher,A24881)中的1％皂苷在37℃透化45min，并用DPBS洗涤三次。插入了碘化丙啶的核酸用来复染细胞核。使用荧光显微镜Axio Observer Z(Zeiss)从对各个处理进行的三次技术重复中的每一个获取两个图像(放大50倍)，所述荧光显微镜由下列组成：相差，HcRed通道(BP 580-604nm,BS 615nm,BP625-725nm,
10.000ms)，和DAPI通道(BP 335-383nm,BS 395nm,BP420-470nm,20.000ms)。对图像设盲，并且使用Adobe Photoshop CS5计数工具对BFP阳性细胞核计数。使用ImageJ通过用细胞核的面积(默认阈值)除以单个细胞核的平均面积对碘化丙啶阳性细胞核量化。
15min，用在补充了100μg/ml RNAseA(ThermoFisher,EN0531)和40μg/ml碘化丙啶(ThermoFisher,P3566)的DPBS(ThermoFisher,A24881)中的1％皂苷在37℃透化45min，并用DPBS洗涤三次。插入了碘化丙啶的核酸用来复染细胞核。使用荧光显微镜Axio Observer Z(Zeiss)从对各个处理进行的三次技术重复中的每一个获取两个图像(放大50倍)，所述荧光显微镜由下列组成：相差，HcRed通道(BP 580-604nm,BS 615nm,BP625-725nm,
10.000ms)，和DAPI通道(BP 335-383nm,BS 395nm,BP420-470nm,20.000ms)。对图像设盲，并且使用Adobe Photoshop CS5计数工具对BFP阳性细胞核计数。使用ImageJ通过用细胞核的面积(默认阈值)除以单个细胞核的平均面积对碘化丙啶阳性细胞核量化。
[0115] 核型分析
[0116] 在胰蛋白酶诱导的吉姆萨染色后完成对核型的显微镜分析。根据‘Inkubator für klinische Translation’(Leipzig,Germany)的国际质量指南(ISCN
2016:An International System for Human Cytogenetic Nomenclature48)进行分析。
2016:An International System for Human Cytogenetic Nomenclature48)进行分析。
[0117] 研究设计
[0118] 我们的目的是在iPSC中测试几种小分子的精确基因组编辑效率。在文献中化合物SCR7、L755507和RS-1已经被认为是潜在的CRISPR-Cas效应物，而其他测试化合物还未知用于此目的。测试化合物显示在表1中。
[0119] 表1:在此研究中被评价的小分子的概况。显示了被靶向的蛋白、其功能，以及其各自的通路和小分子的功能。带有星号的参考文献表示小分子是CRISPR-Cas效应物。缩写：替代NHEJ(Alt-NHEJ),损害依赖性信号传导(DDS)。
[0120]
[0121]
[0122] 作为分析小分子对HDR效率的效应的工具，我们生成了允许多西环素诱导的Cas9或Cas9D10A表达以及有效地递送ssODN和向导RNA(gRNA)的iCRISPR-Cas9和iCRISPR-Cas9D10A iPSC系(Gonzalez等人，2014)。基因组编辑和分析流程图显示在图1中。在编辑三个示例基因CALD1、KATNA1和SLITRK1中使用的gRNA、ssODN和引物的设计显示在图2和表2中。
[0123] 表2:在本研究中使用的寡核苷酸。显示了用于编辑CALD1、KATNA1、SLITRK1、HPRT、DMNT1、AAVS1-iCRISPR和PRKDC的gRNA(crRNA靶标)和单链DNA供体(ssODN)，以及用于Cas9 iCRISPR供体质粒的分析和Q5定点诱变的引物。突变以粗体字母表示，并且祖先突变还加下划线。供体KATNA1 Cas9D10A 2和SLITRK1 Cas9D10A 2具有不同的沉默突变，并且用于图10-12。
[0124]
[0125]
[0126]
[0127] 我们选择用来测试其阻断NHEJ的能力的小分子是SCR7、STL127685(其是Ku70/80抑制剂STL127705的4-氟苯基类似物(Weterings等人，2016)和DNA-PK抑制剂NU7026(Suzuki等人，2016)。为了阻断Alt-NHEJ，我们选择了WRN解旋酶抑制剂NSC 19630(Aggarwal等人，2011)。NEDD8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924显示抑制CtIP的类泛素化，这增加了在链断裂处DNA末端切除的程度，由此调节DNA双链断裂修复通路选择优先经历HDR(Jimeno等人，2015)。在经历同源搜索和重组之前，DNA切除留下了被RPA包覆和稳定的ssDNA。我们假定增加RPA的可用性可以有助于HDR。富马海松酸(Fumaropimaric acid，NSC15520)防止RPA与p53和RAD9的缔合(Glanzer等人，2011)(Glanzer等人，2013)，可能增加了对ssDNA可用的RPA的丰度。RAD51对利用双链DNA(dsDNA)的同源重组是至关重要的，而RAD52对于ssDNA的退火是必需的(Grimme等人，2010)。因此我们选择测试RAD52抑制剂AICAR(Sullivan等人，2016)、RAD51抑制剂B02(Huang等人，2011)和RAD51增强剂RS-1(Song等人，2016)对精确基因组编辑效率的效应。此外，我们包括了已被认为增强修复蛋白激酶ATM的小分子。白藜芦醇已被认为在体外对纯化ATM的催化效率具有直接刺激效应(Lee等人，2014)。组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A活化ATM-依赖性DNA损害信号传导通路，并且已经被认为增加HR(Lee 2007)(Jimeno等人，2015)。最后，我们在筛选中包括了β3-肾上腺素能受体激动剂L755507。
[0128] 结果
[0129] 小分子对精确基因组编辑的效应
[0130] 首先我们测试了不同浓度的小分子以检验它们对利用iCRISPRCas9D10A对CALD1、KATNA1和SLITRK1的精确编辑的影响(图3)。因此，我们选择了得到最高频率的精确基因组编辑的各个浓度。当不同浓度对编辑具有相似效应时，我们选择较低的浓度。来自重复独立试验的所选小分子浓度对利用Cas9D10A和Cas9在CALD1、KATNA1和SLITRK1中的精确基因组编辑效率的效应显示在图4中。
[0131] NU7026处理提高利用Cas9D10A(图4A)和Cas9(图4B)对所有三个基因座的PGE。平均改变为利用Cas9D10A对CALD1是1.5-倍，对KATNA1是2.6-倍和对SLITRK1是2.5-倍，以及利用Cas9对CALD1是1.5-倍，对KATNA1是1.6-倍和对SLITRK1是1.2-倍。除了NU7026以外，我们发现TSA和MLN4924对利用Cas9D10A的PGE效率具有增强效应。TSA使利用Cas9D10A对CALD1的PGE提高1.5-倍，对KATNA1的PGE提高2.2-倍，以及对SLITRK1的PGE提高1.8-倍；有趣的是，利用Cas9没有发现增强效应。MLN4924使利用Cas9D10A对CALD1的PGE提高1.2-倍，对KATNA1的PGE提高1.1-倍以及对SLITRK1的PGE提高1.3-倍。利用Cas9，MLN4924对PGE有轻微的消除效应。用NSC 15520处理，分别使利用Cas9D10A和Cas9的CALD1的PGE提高1.4倍和1.3倍。然而，对KATNA1和SLITRK1的PGE没有效应。NSC 19630、AICAR、RS-1、白藜芦醇、SCR7、L755507和STL127685显示与各自的对照相比，对利用Cas9D10A对三个基因CALD1、KATNA1和SLITRK1的PGE频率没有明显的效应，以及对利用Cas9没有效应或有清除效应。B02使利用Cas9D10A和Cas9在所有三个基因座中的PGE减半。
[0132] 我们下一步测试了小分子的组合是否对利用Cas9D10A或Cas9的PGE有增强效应。我们选择了显示在至少一个基因中利用Cas9D10A的PGE提高或显示没有PGE减少的小分子；
那些小分子是：NU7026、TSA、MLN4924、NSC 19630、NSC 15520、AICAR和RS-1。
那些小分子是：NU7026、TSA、MLN4924、NSC 19630、NSC 15520、AICAR和RS-1。
[0133] 小分子组合对利用Cas9D10A或Cas9编辑三个不同基因座的影响显示在图5中。对于利用Cas9D10A的编辑，用NU7026或PGE处理产生的PGE频率比没有所述分子时高2.3-倍或1.8-倍(Tukey配对事后比较：p<0.001)(图5A)。NU7026和TSA两者的组合产生的PGE频率比单独NU7026或TSA时高1.3倍或1.6倍(p<0.001)。向NU7026和TSA的混合物中添加MLN4924导致PGE的额外1.3-倍提高(p<0.01)。当使用Cas9D10A进行编辑时，进一步添加NSC 15520轻微地提高所有基因座的PGE均值，没有达到统计学显著性。添加NSC 19630、AICAR和RS-1对PGE没有可测量到的效应。
[0134] 我们得出结论，使利用Cas9D10A的PGE频率提高最大的小分子混合物是NU7026(20μM)、TSA(0.01μM)、MLN4924(0.5μM)和NSC 15520(5μM)的组合，我们将其命名为‘CRISPY’切口酶混合物。其在iCRISPR409-B2 iPSC系中对于CALD1，PGE提高2.8-倍(从11至31％)，对于KATNA1提高3.6-倍(从12.8至45.8％)以及对于SLITRK1提高6.7-倍(从4.7至31.6％)。
[0135] 当我们使用Cas9(其引入平末端DSB)时，当加入除NU7026以外的其他小分子时没有显著效应(图5B)。相反，在409-B2 hiPSC中通过电穿孔引入的CRISPY混合物与Cpf1核糖核蛋白(其产生交错的DNA切口)一起对HPRT提高PGE 2.9-倍，对DMNT1提高4.0-倍(图5D)。仅加入NU7026使对HPRT的PGE提高2.1-倍，以及使对DMNT1的PGE提高2.4-倍。
[0136] 为了测试CRISPY混合物是否在其他多能干细胞系中提高PGE，我们使用Cas9n质粒电穿孔编辑了SC102A1 hiPSC和H9 hESC中的基因KATNA1，以及使用Cpf1核糖核蛋白编辑了黑猩猩iPSC中的HPRT。PGE分别提高了2.6-倍、2.8-倍和2.3-倍，并且所述提高比单独使用NU7026时更大(图5C)。
[0137] 在进一步的实验中，在多种非多能性细胞类型中通过Cpf1的电穿孔测试了CRISPY混合物及其组分对靶向核苷酸置换效率的影响，所述非多能性细胞类型包括永生化人胚胎肾细胞系HEK293、永生化白血病细胞系K562、造血CD4+T细胞和CD34+造血祖细胞以及原代人角质形成细胞(HEKα)。结果显示在图6中。发现CRISPY混合物的组分NU7026在除了HEKa细胞以外的测试细胞系中是有效的。在HEK293和K562细胞中，NU7026强烈地提高PGE效率，TSA和NSC15520中度地提高效率，MLN4924在具有癌症特征的那些细胞系中具有明显的破坏效应。MLN4924也对原代细胞中的PGE效率有破坏效应。在造血CD4+T和CD34+祖细胞中，不含MLN4924的CRISPY混合物对PGE效率的效应高于单独的NU7026。在原代人角质形成细胞(HEKα)中，NU7026和NSC15520也对PGE效率具有破坏效应。
[0138] 在又进一步的实验中，测试了CRISPY混合物及其组分的毒性。在利用Cas9n双切口和CRISPY混合物处理编辑KATNA1 24h后，与没有小分子处理相比细胞显示75％的活力，其组分没有累积的毒性效应(图7)。重要地是，当我们模拟5轮编辑时，每轮由用脂质转染试剂和CRISPY混合物传代细胞，接着恢复3天组成，细胞具有健康的核型，没有数值上或大规模的染色体畸变，如胰蛋白酶诱导的吉姆萨染色所示(图13)。
[0139] 在又进一步的实验中，测试了CRISPY混合物及其组分NU7026对人诱导性多能干细胞中的BFP插入(ssODN)效率的影响。结果显示在图8中。我们在AAVS1 iCRISPR基因座中插入了871nt(包含50nt同源臂)序列，所述序列编码2A-自裂解肽和在其后的增强蓝色荧光蛋白(BFP)(Subach等人，2011)。如果插入了该序列，则多西环素将导致输入核中的BFP的表达。与无-CRISPY的对照(3.7％)相比，BFP阳性的细胞核增加了7.1-倍(26.6％)，而单独NU7026引起1.6倍(6％)的增加(图8B和C)，这表明CRISPY混合物提高了在iPSC中插入基因片段的效率。
[0140] 配制的DNA蛋白激酶催化亚基对精确基因组编辑的效应
[0141] 在ATP结合位点附近的K3753R突变消除了DNA-PKcs的激酶活性。在CHOV3细胞中，DNA-PKcs KR细胞中DSB诱导的HDR显示比无DNA-PKcs细胞的升高HDR水平高2至3倍，比表达野生型DNA-PKcs的细胞高～4至7倍(Shrivastav等人，2008和2009)。
[0142] 我们生成了具有多西环素诱导性Cas9切口酶(iCRISPR-D10A)的诱导性多能干细胞(iPSC)系，如Gonzalez等人(2014)所述，以实现具有减少的脱靶的高效率的靶向DSB(Shen等人，2014)。使用整合的Cas9D10A，我们将DNA-PKcs(K3752R)的激酶活性位点附近的赖氨酸交换为精氨酸以使其激酶活性失活(Shrivastav等人，2008和2009),同时保持整体结构完整。为了比较使用野生型DNA-PKcs与DNA-PKcs KR的精确基因组编辑效率，我们选择精确地编辑神经突生长基因CALD1、KATNA1和SLITRK1回复至人和尼安德特人的最近共同祖先的古老状态(Prufer等人，2014)。我们还通过将R3753交换回赖氨酸研究了PRKDC(DNA-PKcs)的反向失活效率。利用表达野生型DNA-PKcs或DNA-PKcs KR的iCRISPR-Cas9D10A对CALD1、KATNA1、SLITRK1和PRKDC的PGE效率显示在图10A中。当使用DNA-PKcs KR时，对CALD1、KATNA1和SLITRK1的PGE效率提高2.5-倍(36％)、4.1-倍(78.5％)和7.8-倍(51.1％)。这对应于PGE/NHEJ的比率分别从0.23、0.29和0.08改变为3.49、25.45和2.60。我们在71.4％的染色体中实现了PRKDC的回复突变。当电穿孔重组Cas9或Cpf1时，对CALD1或HPRT的PGE效率提高4.8倍(72.2％)或8.3倍(43.7％)，PGE/NHEJ的比率从0.45改变至12.8或从0.08改变至7.1。因此，无论DSB是什么类型，KR系均提高PGE。
[0143] 假定利用DNA-PKcs KR具有这样高的PGE效率，我们下一步尝试对三个基因的多重编辑。当使用gRNA和ssDNA供体的多重脂质转染时，我们对一个基因最多实现了3-10％的PGE效率(数据未显示)。当电穿孔三个基因的gRNA和ssODN时，我们实现对CALD1的21.3％的PGE效率，对KATNA1的32.0％的PGE效率，以及对SLITRK1的34.0％的PGE效率(图11A)。与脂质转染相反，将细胞制备成单细胞悬液用于电穿孔。在大多数细胞被铺板用于后续的大量DNA分析的同时，10％作为单细胞稀释液铺板，将得到衍生自一个细胞的集落。对33个克隆的分析显示古老突变和沉默阻断突变不总是被一起掺入在发生靶向核苷酸置换(TNS)的染色体中(图11B)。图11C显示了掺入了插入/缺失和掺入了任意的TNS，无论是阻断突变还是古老突变(左侧图)，或至少掺入了古老突变(右侧图)的染色体的热图。大多数克隆保持野生型或所有三个基因均被精确编辑。引人注目的是，三分之一的克隆具有TNS，对于所有三个基因在两个染色体上都没有任何额外的插入/缺失，12.1％的克隆至少具有古老的TNS，对于所有三个基因在两个染色体上都没有任何额外的插入/缺失。从33.3％降低至12.1％主要归因于CALD1供体的设计，其中正确的阻断突变远离其他两个突变，并且其是在30％的CALD1 TNS阳性染色体中仅有的掺入置换(30个中有9个)(图3A)。基于单一基因TNS效率，对于3个基因在两个染色体上掺入TNS比偶然预期高4倍以上(对任何TNS预期7.1％，对至少古老TNS预期2.9％)。本文提出的MPGE不仅是有效的而且是很快的。在电穿孔后直接使用单细胞稀释液接种允许在少于2周内生成具有所需MPGE的克隆(图11D)。重要的是，在26代后(对应于3个月)，DNA-PKcs KR hiPSC保持了健康的核型，没有数值上或大规模的染色体畸变，如胰蛋白酶诱导的吉姆萨条带所示(图13)。
[0144] 在存在突变的DNA-PKcs的情况下的PGE效率可以进一步利用Cas9D10A通过CRISPY混合物来增强，如我们在进一步实验中所显示的那样。DNA-PKcs突变体对CALD1、KATNA1和SLITRK1分别具有2.8-倍、4.3-倍和12.4-倍的PGE提高(参见图12)。另外，利用CRISPY混合物，与没有小分子处理的DNA-PKcs野生型相比，PGE的效率甚至进一步提高。对于CALD1、KATNA1和SLITRK1，PGE效率分别为48％(提高3.7-倍)、82％(提高4.7-倍)和57.5％(提高19.2-倍)。
[0145] 讨论
[0146] 尽管在测试的所有4个多能干细胞系(三个是人细胞系，一个是黑猩猩细胞系)中CRISPY混合物比组成其的任一单个组分更多地提高PGE(图5A、C和D)，但对测试的其他细胞系不是这样的(图6)。实际上，我们的结果显示小分子及其组合可以在不同的细胞系中对PGE有相反的效应。这可能是因为细胞系依赖于不同的修复蛋白或修复通路的缘故，并且提示有必要对DNA修复的细胞类型特异性机制进行后续研究。依照此解释，进行的研究显示人ESC和iPSC拥有非常高的DNA修复能力，该修复能力在分化后降低(Blanpain等人，2011,Rocha等人，2013)。其还可以解释研究之间的一些不一致，例如，DNA连接酶IV抑制剂SCR7和RAD51增强剂RS-1在一些细胞类型中提高精确基因组编辑，但在其他细胞类型中不提高。因此，可能需要筛选小分子在每个感兴趣细胞类型中对CRISPR编辑的效应。
[0147] 在多能干细胞中对利用Cas9D10A和ssODN供体两者在单独(图4A)以及在混合物中(图5A)的情况提高PGE的小分子是NU7026、TSA、MLN4924和NSC 15520。所述混合物还显示与利用NU7026的单一处理相比，对利用Cpf1的PGE有额外的提高效应，但对利用Cas9则没有。NU7026抑制DNA-PK，其为NHEJ通路中的主要复合物(Shrivastav等人，2008)，并且以前已经显示NU7026提高hiPSC中的PGE效率(Suzuki等人，2016)。TSA可以活化ATM-依赖性DNA损害信号传导通路(Lee 2007)。Nedd8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924已经显示抑制CtIP的类泛素化，这增加了在链断裂处DNA末端切除的程度，由此促进HDR(Jimeno等人，2015)。在经历同源搜索和重组之前，DNA切除留下了被RPA包覆和稳定的ssDNA。NSC15520防止RPA与p53和RAD9的缔合(Glanzer等人，2011)(Glanzer等人，2013)，可能增加了对可以有利于HDR的ssDNA可用的RPA的丰度。从我们的资料看RS-1、SCR7和L755507显示对利用Cas9和利用Cas9D10A的PGE都没有明显的效应，对于RS-1、SCR7和L755507提高PGE的能力有相互矛盾的报道。
[0148] 当与Cas9D10A双切口或Cpf1一起使用时，与利用Cas9观察不到效应相反，TSA和MLN4924对PGE的增强效应提示平末端和交错的DNA切口(5’突出端)通过不同的修复机制被修复。至今利用ssODN的HDR的机制还不清楚，但已经提出了模型(Bothmer等人，2017)。Bothmer等人发现5’突出端结构产生比3’突出端更高水平的HDR，并且提示不同的突出端极性参与不同的修复通路。
[0149] 然而，在利用Cas9编辑的情况下MLN4924的负效应可能是由于与较长的Cas9D10A ssODN相比，使用较短的ssODN引起的。如果发生由MLN4924触发的广泛DNA切除，则使用短供体时没有为ssODN退火留下同源性。由于在Cas9D10A编辑中存在长的5‘突出端，因此甚至在广泛切除后也提供了同源DNA。因此，较长供体的使用可以在使用Cas9时使得MLN4924也有效地增强精确基因组编辑。
[0150] 尽管RAD51显然对于利用dsDNA的经典同源重组很重要(Shrivastav等人，2008)，但我们想检验RAD52(而非RAD51)是否可能是在ssODN的HDR后的驱动力，因为RAD52是ssDNA退火所必需的(Grimme等人，2010)。我们的RAD52抑制剂AICAR、RAD51抑制剂B02和RAD51增强剂RS-1对PGE效率的结果表明RAD51而非RAD52对利用ssODN的精确编辑是重要的，因为B02对RAD51的抑制被减半，并且对RAD52的抑制对PGE效率没有效应。有趣的是，利用RS-1刺激RAD51对PGE没有有益效应。
[0151] 为了提高PGE效率，我们产生了诱导性Cas9D10A iPSC系并优化了ssODN的递送，使得有时在超过90％的细胞中观察到插入/缺失(图3A)。使用CRISPY小分子混合物，我们在hiPSC中实现了几乎50％的PGE(图3A)，这是我们所知的至今记载的人多能干细胞的最高PGE效率。此外，我们首先显示了通过使用Cpf1(20％)在CRISPY混合物的辅助下的有效PGE(图5C)。CRISPY混合物提供了提高PGE效率的简易工具，并且因此可以为许多研究者或医务人员所用，他们使用CRISPR系统来执行精确基因组编辑。
[0152] 通过使用iCRISPR利用有效的DSB诱导并采用激酶失活的DNA-PKcs KR，作为NHEJ和HDR之间的开关，有可能实现对基因组的高度有效的精确编辑(图10)。高PGE效率和PGE与插入/缺失的高比率相配合。我们还显示了当同时操作几个基因时，基于单一基因TNS效率，在所有靶向的染色体中TNS的掺入比偶然预期高得多。DNA-PKcs的HDR抑制特性已经显示绝对依赖于其激酶活性(Neal等人，2011)。与我们的数据类似，在CHOV3 KR细胞中的HDR显示高于表达野生型DNA-PKcs的细胞4-7倍(Shrivastav等人，2008和2009)。令人惊讶地，在CHOV3 KR细胞中的HDR增加高于在CHOV3 DNA-PKcs敲除细胞中的增加，表明蛋白结构是进一步增强HDR所必需的。其ABCDE或JK簇的磷酸化显示分别促进末端加工，或抑制NHEJ(参见图9B)。DNA-PKcs缺陷导致在培养的细胞系和小鼠中重要的修复激酶ATM的水平降低(10)。Shrivastav等人反驳认为DNA-PKcs KR的恢复的ATM-依赖性磷酸化以及可能的ATM促进的RAD51周转，有助于过度重组表型(Neal等人,2016)。通过使用无催化活性但结构完整的DNA-PKcs，阻断了下游c-NHEJ蛋白的磷酸化，以及磷酸化诱导的对ATM激酶活性的抑制(Zhou等人,2017),同时以不依赖激酶的方式维持ATM水平，因此导致增强的HDR。鉴于DNA-PKcs在c-NHEJ中的中心地位以及由Shrivastav等人在中国仓鼠卵巢细胞中关于HDR增加的相似发现，我们猜想KR突变会在细胞类型和物种之间具有一致的效应。因为DNA-PKcs及其在K3753周围的序列在脊椎动物中是保守的(图9C)，KR突变在几个动物模型中可以是有价值的基因修饰工具。DNA-PKcs直系同源物也已经在蚊子、蜜蜂和阿米巴粘菌中发现，表明了该酶的古老祖先(Dore等人，2004,Douglas等人，2007)。
[0153] 在培养DNA-PKcs KR hiPSC 3个月后我们没有检测到任何数值上或大规模的染色体畸变(图13)。除了靶向基因组裂解以外，由于活性氧种类和导致复制叉垮塌的物理性应力，以及在V(D)J重组期间，定期地发生内源性DSB。通过使DNA-PKcs的激酶活性失活对易错c-NHEJ的减弱，迫使细胞利用姊妹染色体通过可靠的和增强的HDR修复DSB，伴有缓慢的易错a-NHEJ修复DSB，或死亡。因此推测由于HDR的高保真修复,与野生型相比，基因组稳定性在KR细胞中甚至更好，代价是杂合性丢失。
[0154] 我们还显示了通过将R3753突变回赖氨酸实现了对DNA-PKcs的有效反向失活(图10A)。在实施靶向突变后再活化DNA-PKcs在细胞分化成T细胞前是需要的，因为V(D)J重组取决于c-NHEJ。在细胞分化成非增殖细胞如神经元之前回复突变的DNA-PKcs KR也可能是有益的。HDR限于分裂细胞，并且因此在有丝分裂后细胞中NHEJ对于DNA修复是最重要的。然而，c-NHEJ因子Ku70/80、XRCC4和LIG4与XLF一起足以修复低水平的损害(Gu等人，2000)，并且a-NHEJ无论如何也不依赖于DNA-PKcs。
[0155] 将CRISPY小分子混合物与无催化活性的DNA-PKcs一起使用，这个发现具有革新CRISPR辅助研究和定制基因组的潜力，因为有可能一次编辑多个基因座。不仅编辑效率非常高(达到82％)–有限比例的插入/缺失现在允许快速的(多重)精确基因组编辑(图10和11)。
[0156] 得出以下结论：DNA-PKcs KR与CRISPR技术组合的过度重组效应在精确基因组编辑中产生了意想不到的效率，在人多能干细胞中可以通过CRISPY小分子混合物而进一步提高精确基因组编辑效率。在众多基因组研究领域中这可以大大地减少时间和劳力。这些包括一些激动人心的应用，如对医学相关的重要特性的高通量全基因组关联分析(GWAS)验证、疾病建模和药物筛选、物种比较分析、间接体内基因治疗、简化地产生定制的动物模型、灭绝物种复活以及有朝一日可能实施的从头合成的大基因组片段。
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