免疫调节转基因植物及相关方法
阅读：971发布：2021-08-01
专利汇可以提供免疫调节转基因植物及相关方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 描述了一种转基因 植物 ，其表达一种或多种拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域 抗体 以及编码该拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体的基因的，该拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体可以刺激或调节免疫系统并改善饲喂该转基因植物或其组织的动物的胃肠道生理。本发明还描述了掺入所述转基因植物或其组织的动物 饲料 添加剂和动物饲料。本发明提供了通过使用转基因植物或其组织来刺激或调节动物免疫系统、改善动物胃肠道生理、改善动物生产性能以及 治疗 感染有胃肠道病原体的动物的方法。，下面是免疫调节转基因植物及相关方法专利的具体信息内容。
1.一种转基因植物或其组织，其包含编码至少一种拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的合成多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述至少一种拮抗剂IL-10R肽包括包含与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽。
3.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述至少一种拮抗剂IL-10R肽包含连接肽，所述连接肽包含与选自由SEQ ID NO：32-40组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体具有在10kDa至20kDa范围内的分子量。
5.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合。
6.根据权利要求5所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体包含与选自由SEQ ID NO：87-154组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体包含与选自由SEQ ID NO：89、135和146组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述合成多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：16-28和56组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
9.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，所述合成多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：173-178组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
10.根据权利要求1所述的转基因植物或其组织，其中，植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、小麦、水稻、高粱、油菜、棉花和柳枝稷。
11.一种抗IL-10单结构域抗体，其与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合。
12.根据权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体具有在10kDa至
20kDa范围内的分子量。
13.根据权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体在70℃至90℃的温度范围内稳定。
14.根据权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，在细胞ELISA测定中，所述抗体以30nM或更低的EC50与鸡IL-10结合。
15.根据权利要求11所述的抗Il-10单结构域抗体，其中，所述抗体可被胃蛋白酶消化。
16.根据权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体包含与选自由SEQ ID NO：87-154组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体包含与选自由SEQ ID NO：89、135和146组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
18.一种合成多核苷酸，其编码权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体。
19.根据权利要求18所述的合成多核苷酸，其中，所述合成多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：173-178组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
20.一种动物饲料，其包含权利要求1-10中任意一项所述的转基因植物或其组织，或者权利要求11-17中任意一项所述的抗IL-10单结构域抗体。
21.一种动物饲料，其包含至少一种拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。
22.根据权利要求21所述的动物饲料，其中，所述至少一种拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体在植物中表达并暴露在25℃至130℃的温度范围内有活性。
23.根据权利要求21所述的动物饲料，其中，该动物饲料进一步包含饲料补充剂。
24.根据权利要求21所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂为植物材料。
25.根据权利要求24所述的动物饲料，其中，所述植物材料为非转基因植物或转基因植物。
26.根据权利要求24所述的动物饲料，其中，所述植物材料包括选自由以下组成的组的至少一种组分：玉米粉、玉米颗粒、小麦粉、小麦颗粒、小麦籽粒、大麦籽粒、大麦颗粒、大豆粉、大豆油饼、高粱籽粒和高粱颗粒。
27.根据权利要求23所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括一种或多种外源酶。
28.根据权利要求27所述的动物饲料，其中，所述一种或多种外源酶包括选自由以下组成的组的水解酶：木聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶和甘露聚糖酶。
29.根据权利要求23所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括选自由以下组成的组的至少一种组分：可溶性固体、脂肪和蛭石、石灰石、原盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、 维生素预混料、磷酸二钙、硒预混料、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混料。
30.一种治疗或预防动物胃肠道感染的方法，其包括向动物给药权利要求1所述的转基因植物或其组织、权利要求11所述的抗IL-10单结构域抗体、或者权利要求21所述的动物饲料。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述给药步骤通过饲喂或注射进行。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述胃肠道感染是由胃肠道病原体引起的，所述胃肠道病原体选自由以下组成的组：细菌、酵母、真菌、古细菌、病毒和原生动物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述胃肠道病原体属于艾美球虫属(Eimeria)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述胃肠道病原体选自由以下组成的组：柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)和巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)。
35.根据权利要求30所述的方法，其中，治疗刺激免疫系统并增强动物生长。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述动物选自由以下组成的组：鸡、火鸡或鸭。
免疫调节转基因植物及相关方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年5月30日提交的美国临时申请号62/512,444的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本公开内容涉及拮抗剂IL-10受体(IL-10R)肽和抗IL-10抗体(包括抗IL-10单结构域抗体)。本公开内容涉及表达和积累拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体的转基因植物，该拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体可刺激或调节免疫系统并改善用转基因植物或其组织饲喂的动物的胃肠道生理。本公开内容还涉及编码这些肽和抗体的基因。
[0005] 本公开内容涉及动物饲料添加剂和动物饲料，其包含包括肽和抗体的转基因植物或其组织。本公开内容还涉及包含肽和抗体的动物饲料添加剂和动物饲料。
[0006] 本公开内容涉及通过向其给予拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体、表达本文所公开的肽和抗体的转基因植物或用包括这些转基因植物、肽或抗体的动物饲料饲喂动物来治疗感染有胃肠道病原体的动物的方法。本公开内容还涉及通过使用所公开的转基因植物或其组织、拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体来刺激或调节动物的免疫系统的方法、改善动物的胃肠道生理的方法、改善动物生产性能的方法。
[0007] 本公开内容涉及制备拮抗剂IL-10R肽和抗IL-10单结构域抗体的方法，以及制备表达本文所公开的肽和抗体的转基因植物的方法。
[0008] 通过引用将与本申请一起电子提交的名称为“序列表(Sequence Listing)”的序列表(其于2017年5月30日创建，文件大小为210,215字节)的全部内容并入本文。
背景技术
[0010] 该疾病通过接触被感染的粪便或摄入被感染的组织而从一种动物传播到另一种动物。鸡球虫病是由艾美球虫属(Eimeria)的原生动物寄生虫感染(通常是由柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)感染)肠壁细胞引起的。用于治疗球虫感染的最常用药物是抗球虫药、抗生素和疫苗。
[0011] 抗球虫药和抗球虫剂(Coccidiostat)用于家禽生产中以控制球虫病并保持动物的生产力，当动物被艾美球虫感染时，其生产力通常会降低且发展为亚临床或临床球虫病。临床球虫病会导致消化道破裂，症状包括体重减轻、生长受到抑制、腹泻、流血便血(bloody dropping)和死亡率增加。即使采用当前抗球虫剂或疫苗时，亚临床球虫病也在家禽生产中很常见，并且不会表现出许多与临床球虫病相同的症状，但仍会降低动物的生产力。球虫病导致的动物生产力下降给家禽业造成了估计每年超过十亿美元的巨大损失。
[0012] 抗球虫药、抗生素和疫苗对于有效的家禽生产非常重要，但由于消费者对其使用和安全性的担忧，许多国家正在逐步淘汰它们。鸡群内部免疫力不足会给疫苗使用带来挑战，抗球虫药价格昂贵，需要在正确的时间和剂量下给予，并可能导致耐艾美球虫菌株的产生。工业界已经发现耐药菌株数量的增加，这降低了这些产品的价值，并需要开发控制球虫病的其他方法。
[0013] 艾美球虫(Eimeria)刺激抗炎细胞因子白介素10(IL-10)的产生。IL-10在肠壁上与其受体IL-10R相互作用以抑制免疫应答。反过来，这使得艾美球虫感染得以继续进行而不受免疫系统的干扰。IL-10是有助于动物控制炎症应答的有效的抗炎细胞因子。IL-10还控制免疫系统以防止过度免疫应答。阻断IL-10以防止其与IL-10R的相互作用将防止免疫抑制，因此有助于动物的正常免疫应答以减少和清除艾美球虫感染。与控制球虫病的其他预防或治疗方法相反，阻断免疫系统的IL-10抑制不会导致耐艾美球虫菌株的产生，因为这种干预的重点在于刺激宿主的免疫应答，而不是减弱或杀死传染原本身。
[0014] 如前所述，该方法当前具有严重的局限性，从而限制了其广泛的商业采用和工业使用。首先，到目前为止所用的抗体是已通过用靶标肽接种母鸡或鸡蛋而产生的。在前者的情况下，只能使用接种过的母鸡的雏鸡，需要接种许多用于生产雏鸡的母鸡，并且由于免疫力不足、肽(刺激性抗原)无效或应答时间过长而不能确保全面保护。肽的有效性也可能会受到挑战，因为众所周知小肽通常不会调动有效的免疫应答，并且由于IL-10(或IL-10同源物)由宿主产生，在不使用佐剂或共轭物下，可能很难产生足够的抗体，这进一步增加了该方法的成本和复杂性。此外，由于已知IL-10在体内二聚，所以选择的肽可能产生针对通常不被IL-10二聚体暴露的表位的抗体，因此在宿主动物中结合IL-10可能无效。同样，接种鸡蛋(或收集来自接种的母鸡的鸡蛋)很麻烦且成本增加，具有许多挑战母鸡接种的相同问题，并且当必须从蛋黄中收获抗体时又增加了额外的成本。在从卵中收获抗体的情况下，必须将材料干燥、稳定化，然后混合到饲料中以输送给雏鸡。尽管增加加工步骤(包括收获鸡蛋、干燥、配制和包装以用于饲料添加)增加了额外成本，但尚不清楚这种生产方法的一致性如何，它是否容易受到其他传染源(infectious agent)的污染，或者以这种方式产生的抗体是否足够热稳定以在制备动物饲料所用的制粒工艺中保持活性。当与动物饲料结合并通过制粒机加工时，许多全长抗体不具备保持其溶解度、结构和对IL-10的亲和力所需的热稳定性。颗粒饲料中所输送的抗体将暴露于65℃、70℃、75℃、80℃、82℃、85℃、90℃、95℃或更高的制粒温度下。由于这些原因，使用鸡蛋生产用于动物饲料的抗体是一项非常具有挑战性的高成本实践，并且由于从未对抗体进行完全测序或表征，因此，这种生产方法无法使用生物技术来改善抗体特性和生产成本、效率以及效果。因此，如果IL-10信号传导途径的调节要在动物生产工业中获得任何市场相关性，则非常需要新型技术。为了解决这些缺点，需要一种新型的低成本的饲料添加剂，该添加剂理想地以现有饮食成分被输送，具有耐受饲料制粒过程的提高的热稳定性，并且可以更有效地抑制IL-10信号传导过程。发明内容
[0015] 在一方面中，本发明涉及一种包含编码至少一种拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的合成多核苷酸的转基因植物或其组织。
[0016] 在一方面中，本发明涉及至少一种拮抗剂IL-10R肽。所述至少一种拮抗剂IL-10R肽是一种包含与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽。所述至少一种拮抗剂IL-10R肽包含连接肽(concatenated peptide)，所述连接肽包含与选自由SEQ ID NO：32-40组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0017] 在一方面中，本发明涉及一种编码本文所述的至少一种IL-10R拮抗剂肽的合成多核苷酸。
[0018] 在一方面中，本发明涉及一种与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合的抗IL-10单结构域抗体。
[0019] 在一方面中，本发明涉及一种编码本文所述的抗IL-10单结构域抗体中的任意一种的合成多核苷酸。
[0020] 在一方面中，本发明涉及一种包含本文所述的转基因植物或其组织中的任意一种的动物饲料。
[0021] 在一方面中，本发明涉及一种包含本文所述的任意拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的动物饲料。
[0022] 在一方面中，本发明涉及一种治疗或预防动物胃肠道感染的方法，其包括向动物饲喂本文所述的转基因植物或其组织、拮抗剂IL-10R肽、抗IL-10单结构域抗体或动物饲料中的任意一种。
[0023] 在一方面中，本发明涉及一种刺激或调节免疫系统并改善动物的胃肠道生理的方法，其包括向动物饲喂本文所述的转基因植物或其组织、拮抗剂IL-10R肽、抗IL-10单结构域抗体或动物饲料中的任意一种。
[0024] 在一方面中，本发明涉及一种改善动物生产性能的方法，其包括向动物饲喂本文所述的转基因植物或其组织、拮抗剂IL-10R肽、抗IL-10单结构域抗体或动物饲料中的任意一种。
[0025] 在一方面中，本发明涉及一种制备动物饲料的方法，其包括将本文所述的转基因植物或其组织中的任意一种与植物材料混合以形成混合物。
[0026] 在一方面中，本发明涉及一种制备动物饲料的方法，其包括将本文所述的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种与植物材料混合以形成混合物。
[0028] 结合附图阅读，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中示出了特定的实施方式。然而，应当理解的是本发明不限于所示的精确布置和手段。在附图中：
[0029] 图1A-1G是载体pAG4305(图1A)、pAG4306(图1B)、pAG4308(图1C)、pAG4310(图1D)、pAG4311(图1E)、pAG4312(图1F)和pAG4313(图1G)的示意图。
[0030] 图2A-2D是载体pAG4981(图2A)、pAG4982(图2B)、pAG4983(图2C)和pAG4984(图2D)的示意图。
[0031] 图3示出了由注射有全长鸡IL-10的美洲驼(llama)产生的抗体应答。这证明了相对于动物的免疫前(即注射前)状态，注射后提高与鸡IL-10结合的动物产生了特异性抗体。
[0032] 图4示出了来自抗IL-10抗体的产生以及所鉴定的序列之间的相互关系的测序结果。
[0033] 图5示出了抗IL-10抗体对鸡IL-10的表观结合亲和力。
[0034] 图6示出了在模拟胃液(SGF)测试中抗IL-10抗体消化的结果。
[0035] 图7示出了在抗IL10抗体chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)和chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146)存在下IL-10与IL-10受体结合的表观抑制。
[0036] 图8示出了原代鸡脾细胞中IL-10抑制伴刀豆球蛋白A诱导的IFN-γ分泌。
[0037] 图9示出了还用抗IL-10抗体(chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)、chIL10sdAB1B9(SEQ ID NO：111)和chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146))处理时，用伴刀豆球蛋白A和鸡IL-10处理的原代鸡脾细胞中IFN-γ分泌的恢复。
[0038] 图10A是载体pAG4314的示意图。
[0039] 图10B是载体pAG4988的示意图。
[0040] 图11示出了单结构域抗体在单个玉米粒中高水平表达。在两个转基因事件中，对单个粒进行基因分型并提取蛋白。凝胶图像中sdAB带的存在与sdAB基因的存在完全相关，如上图所示，如果存在sdAB基因，则以“+”表示，如果不存在sdAB基因，则以“-”表示。
[0041] 图12是pLH1A1lint表达盒的示意图。
[0042] 图13是pLH1A11表达盒的示意图。
[0043] 图14示出了烟草(N.benthamiana)叶中瞬时表达的Nb1A11的终点RT-PCR分析。泳道1-5含有以下样品：泳道1-GV3101+pLH9000(阴性对照)；泳道2-GV3101+pLH1A11int；泳道3-GV3101+pLH1A11；泳道4-质粒pLH1A11int；泳道5-质粒pLH1A11。
[0044] 图15示出了农杆菌(Agrobacterium)浸润的烟草叶中的sdAB1A11表达。Western印迹示出了样品5和6中sdAB1A11的检测。
具体实施方式
[0045] 以下描述中使用的某些术语只是为了方便，而不是限制性的。
[0046] 如本文所用的“合成核酸序列”、“合成多核苷酸”、“合成寡核苷酸”、“合成DNA”或“合成RNA”是指通过具有与自然界中发现序列不同的序列或自然界中未发现的化学修饰而不同于自然界中发现的核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、DNA或RNA。合成核酸的定义包括但不限于使用生物技术工具创建的DNA序列。此类工具包括但不限于重组DNA技术、化学合成或核酸酶的定向使用(所谓的“基因组编辑”或“基因优化”技术)。
[0047] 如本文所用的“合成蛋白”、“合成多肽”、“合成寡肽”或“合成肽”是指通过合成工艺制得的蛋白、多肽、寡肽或肽。合成工艺包括但不限于化学合成或重组技术。
[0048] 如本文所用，术语“白介素10”、“IL10”和“IL-10”可互换使用，且是指细胞因子合成抑制因子，即抗炎细胞因子。术语“cIL-10”，“cIL10”，“chIL10”和“chIL-10”是指鸡白介素10。
[0049] 如本文所用，术语“拮抗剂IL-10R肽”、“拮抗剂IL10R”、“IL10R拮抗剂肽”和“IL-10R拮抗剂肽”可互换使用，且是指作为IL-10受体(IL-10R)抑制剂的肽。IL-10R拮抗剂肽可以是IL-10的片段，或者可以不同于IL-10的片段。IL-10R拮抗剂肽可以是源自IL-10R的拮抗剂。IL-10R拮抗剂肽可以是肽的融合体、肽的连接体或能够阻断或拮抗IL-10受体的任意其他肽。IL-10R拮抗剂肽可以以任意方式阻断或拮抗受体，例如通过阻断IL-10受体的IL-
10结合口袋、阻止IL-10与受体结合、阻断IL-10二聚化或IL-10受体装配或允许IL-10与受体结合但阻断随后的信号转导。IL-10R拮抗剂肽可以通过任意机制或作用模式阻断或拮抗IL-10受体。
10结合口袋、阻止IL-10与受体结合、阻断IL-10二聚化或IL-10受体装配或允许IL-10与受体结合但阻断随后的信号转导。IL-10R拮抗剂肽可以通过任意机制或作用模式阻断或拮抗IL-10受体。
[0050] 如本文所用的“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。
[0051] 如本文所用的“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由工程化以产生抗体的宿主(例如本文所述的哺乳动物细胞、微生物细胞或植物)表达的抗体。该术语还应被解释为意指通过合成编码该抗体的DNA分子产生的并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列的抗体，其中，该DNA或氨基酸序列已使用本领域众所周知且可获得的合成DNA或氨基酸序列技术获得。本文所述的“合成抗体”可以包括抗体的片段和杂种。本文所述的“合成抗体”可以由给与特异性抗原的生物体产生，并且由该生物体产生的抗体被分离并在第二生物体中繁殖。
[0052] “单结构域抗体”或sdAB是指合成抗体，其是抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区。sdAB可以源自天然存在的抗体或在骆驼科动物(例如骆驼和美洲驼)中产生的抗体，并可以通过用靶标抗原免疫骆驼、分离外周血单个核细胞、分离其核酸并从特异性核酸片段克隆sdAB编码区而产生。sdAB也可以在细胞培养中，通过发酵工艺中的微生物宿主或通过植物产生。本文所述的抗体可以是包含基本上如本文所述的VHH结构域的sdAB。单结构域抗体是合成抗体。
[0053] 本文所用的“抗原”被定义为触发免疫应答的分子。该免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。该抗原可以指能够刺激免疫应答的任意分子，包括大分子(例如蛋白或肽)。该抗原可以在哺乳动物、昆虫、微生物或植物细胞中合成、重组产生，或者可以源自生物样品(包括但不限于组织样品、细胞或生物流体)。
[0054] “结合亲和力”是指结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的总非共价相互作用的总和。抗体的结合亲和力可以基于表观结合EC50值来确定。如本文所用，术语“EC50”或“EC50”是指最大有效浓度的一半，其包括在指定的暴露时间后诱导基线和最大值之间一半应答的抗体的浓度。EC50本质上表示观察到其最大作用50％的抗体浓度。在某些实施方式中，EC50值等于通过例如ELISA测定确定的使与表达鸡IL-10的细胞的结合达到最大一半的本发明抗体的浓度。因此，随着EC50或最大有效浓度值的一半增加，观察到结合降低或减弱。
[0055] 如本文所用，“变体”是指具有与原始序列不同的氨基酸或核酸序列，但是保留了与原始序列相同或基本上类似的生物学活性的蛋白或DNA分子。变体可以来自相同或不同物种，或者是基于天然或先前分子的合成序列。
[0056] 除非另外特别说明，否则权利要求书和说明书的相应部分中所用的词语“一个(a)”和“一个(one)”被定义为包括一个或多个所引用的项。该术语包括上面特别提到的词语，其派生词以及类似含义的词语。短语“至少一种”后跟两个或多个项的列表，例如“A、B或C”，意指A、B或C中的任意一个个体及其任意组合。
[0057] 在一个实施方式中，提供了一种或多种拮抗剂IL-10R肽。拮抗剂IL-10R肽可以单独表达为一种拮抗剂IL-10R肽。拮抗剂IL-10R肽可以包括与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，该参考序列选自以下组成的组：SEQ ID NO：1[P21]、SEQ ID NO：2[P22]、SEQ ID NO：3[P23]、SEQ ID NO：4[P24]、SEQ ID NO：5[P25]、SEQ ID NO：6[P26]、SEQ ID NO：7[P27]、SEQ ID NO：8[P28]、SEQ ID NO：9[P29]、SEQ ID NO：10[P11]、SEQ ID NO：11[P30]、SEQ ID NO：12[P31]和SEQ ID NO：13[P32]。
[0058] 拮抗剂IL-10R肽可以以连接的拮抗剂IL-10R肽的形式表达。连接的拮抗剂IL-10R肽可以包含融合至第二拮抗剂IL-10R肽的第一拮抗剂IL-10R肽，所述第一拮抗剂IL-10R肽具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述第二拮抗剂IL-10R肽具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。所述第一拮抗剂IL-10R肽可以不同于第二拮抗剂IL-10R肽。所述第一拮抗剂IL-10R肽可以类似于第二拮抗剂IL-10R肽。连接的拮抗剂IL-
10R肽可以具有两种以上的拮抗剂IL-10R肽。连接的拮抗剂IL-10R肽中包括的每个第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽可以具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。随后的拮抗剂IL-10R肽可以不同于第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽并且彼此不同。随后的拮抗剂IL-10R肽可以与第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽类似并且彼此类似。连接的拮抗剂IL-10R肽可以包含与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，该参考序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：32[P2501]、SEQ ID NO：33[P2502]、SEQ ID NO：34[P2503]、SEQ ID NO：35[P2504]、SEQ ID NO：36[P2505]、SEQ ID NO：37[P2506]、SEQ ID NO：38[P2507]、SEQ ID NO：39[P2508]和SEQ ID NO：40[P2509]。第一拮抗剂IL-10R肽可以通过接头将连接至第二拮抗剂IL-10R肽。第一拮抗剂IL-10R肽、第二拮抗剂IL-10R肽和随后的拮抗剂IL-10R肽中的每个可以通过一个或多个接头彼此连接。一个或多个接头可以选自由SEQ ID NO：41-44和65组成的组。拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以包含信号肽。该信号肽可以是但不限于淀粉样蛋白靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽或液泡靶向肽。该信号肽可以是N末端信号肽或C末端信号肽。N末端信号肽可以是但不限于OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白(zein)27(xGZm27ss)信号肽。C末端信号肽可以是但不限于KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。IL-10R拮抗剂肽或连接的IL-10R拮抗剂肽可以与N末端信号肽或C末端信号肽或两者融合。
96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。所述第一拮抗剂IL-10R肽可以不同于第二拮抗剂IL-10R肽。所述第一拮抗剂IL-10R肽可以类似于第二拮抗剂IL-10R肽。连接的拮抗剂IL-
10R肽可以具有两种以上的拮抗剂IL-10R肽。连接的拮抗剂IL-10R肽中包括的每个第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽可以具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。随后的拮抗剂IL-10R肽可以不同于第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽并且彼此不同。随后的拮抗剂IL-10R肽可以与第一拮抗剂IL-10R肽和第二拮抗剂IL-10R肽类似并且彼此类似。连接的拮抗剂IL-10R肽可以包含与参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，该参考序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：32[P2501]、SEQ ID NO：33[P2502]、SEQ ID NO：34[P2503]、SEQ ID NO：35[P2504]、SEQ ID NO：36[P2505]、SEQ ID NO：37[P2506]、SEQ ID NO：38[P2507]、SEQ ID NO：39[P2508]和SEQ ID NO：40[P2509]。第一拮抗剂IL-10R肽可以通过接头将连接至第二拮抗剂IL-10R肽。第一拮抗剂IL-10R肽、第二拮抗剂IL-10R肽和随后的拮抗剂IL-10R肽中的每个可以通过一个或多个接头彼此连接。一个或多个接头可以选自由SEQ ID NO：41-44和65组成的组。拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以包含信号肽。该信号肽可以是但不限于淀粉样蛋白靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽或液泡靶向肽。该信号肽可以是N末端信号肽或C末端信号肽。N末端信号肽可以是但不限于OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白(zein)27(xGZm27ss)信号肽。C末端信号肽可以是但不限于KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。IL-10R拮抗剂肽或连接的IL-10R拮抗剂肽可以与N末端信号肽或C末端信号肽或两者融合。
[0059] 拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以减少IL-10与IL-10R的结合。当用于包含被IL-10刺激以增加干扰素γ或一氧化氮产生的细胞的细胞分析中时，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R的肽可以降低干扰素γ或一氧化氮的产生。
[0060] 在一个实施方式中，与其对应的氨基酸序列SEQ ID NO：1-13或32-40具有小于100％同一性的拮抗剂IL-10R肽可以是参考肽或氨基酸的变体。在一个实施方式中，提供了沿着具有SEQ ID NO：1-13和32-40中任意一个序列蛋白的7至10个、7至15个、7至30个、7至
40个、7至50个或7至所有氨基酸，具有与具有SEQ ID NO：1-13和32-40中任意一个序列的肽具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列的分离肽。
该序列长度列表涵盖SEQ ID NO：1-13和32-40中的每个全长肽，以及列表中每个较小的长度的肽(即使对于不包括超过50个氨基酸的肽)。例如，7至10个、7至20个、7至30个以及7至所有氨基酸的长度适用于具有50个氨基酸的序列。本文所述的氨基酸序列长度的范围包括该范围内的每个氨基酸序列长度，包括端点在内。所述氨基酸的长度可以在参考序列内的任意单个位置处开始，足够的氨基酸跟随该单个位置以适应所述长度。拮抗剂IL-10R肽的片段可以是本文多肽的子序列，当用于包含被IL-10抑制(在ConA或PHA存在下)以减少干扰素γ或一氧化氮产生的细胞的细胞测定中时，该子序列保留至少40％的拮抗剂IL-10R肽EC50值。该片段可以具有5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。该片段可以包括5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸。实施方式还包括编码所述氨基酸序列的核酸或多核苷酸。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：1-13和32-40的序列中一个的与所述氨基酸长度对应的任意部分。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：1-
13和32-40的任意一个的部分。
40个、7至50个或7至所有氨基酸，具有与具有SEQ ID NO：1-13和32-40中任意一个序列的肽具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列的分离肽。
该序列长度列表涵盖SEQ ID NO：1-13和32-40中的每个全长肽，以及列表中每个较小的长度的肽(即使对于不包括超过50个氨基酸的肽)。例如，7至10个、7至20个、7至30个以及7至所有氨基酸的长度适用于具有50个氨基酸的序列。本文所述的氨基酸序列长度的范围包括该范围内的每个氨基酸序列长度，包括端点在内。所述氨基酸的长度可以在参考序列内的任意单个位置处开始，足够的氨基酸跟随该单个位置以适应所述长度。拮抗剂IL-10R肽的片段可以是本文多肽的子序列，当用于包含被IL-10抑制(在ConA或PHA存在下)以减少干扰素γ或一氧化氮产生的细胞的细胞测定中时，该子序列保留至少40％的拮抗剂IL-10R肽EC50值。该片段可以具有5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。该片段可以包括5、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸。实施方式还包括编码所述氨基酸序列的核酸或多核苷酸。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：1-13和32-40的序列中一个的与所述氨基酸长度对应的任意部分。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：1-
13和32-40的任意一个的部分。
[0061] 在一个实施方式中，相对于饲喂缺少所述肽的相同饲料的家禽，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以保持或改善饲喂所述肽的家禽的体重和/或饲料转化率。拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以以每千克颗粒饲料小于500mg(或更优选每千克颗粒饲料小于50mg、更进一步优选每千克颗粒饲料小于5mg或者更进一步优选每千克颗粒饲料小于1mg)给予。当用于捣碎(非颗粒)饲料时，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽也可以改善家禽的体重或饲料转化率。在小于或等于65℃、或70℃、或75℃、或80℃、或85℃、或90℃、或95℃、或100℃的温度下在液体中温育至少60秒后，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以保持其与IL-10R的亲和力。当加热至70℃至90℃的温度时，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以保持其对IL-10R的亲和力。当加热至70℃、75℃、
80℃、85℃或90℃中的任意两个值之间的温度范围时，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-
10R肽可以保持其对IL-10R的亲和力。
80℃、85℃或90℃中的任意两个值之间的温度范围时，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-
10R肽可以保持其对IL-10R的亲和力。
[0062] 在一个实施方式中，拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以是对胃蛋白酶消化稳定的肽或连接肽，在动物消化道中可以具有提高的稳定性，并且可以由微生物宿主产生。拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽可以是易于被胃蛋白酶降解的肽或连接的肽。易降解的肽或连接肽可以在胃蛋白酶处理45分钟至40分钟、40分钟至35分钟、35分钟至30分钟、30分钟至25分钟、25分钟至20分钟、20分钟至15分钟、15分钟至10分钟、10分钟至8分钟、8分钟至6分钟、6分钟至4分钟、4分钟至2分钟的时间段内完全降解。降解的时间段可以在2分钟至45分钟之间的任意两个整数值之间的范围内。由胃蛋白酶完全降解肽或连接肽可以在10分钟内发生。
[0063] 一个实施方式提供了与IL-10结合的抗体，并且在本文中被称为抗IL-10抗体。抗IL-10抗体可以与红原鸡(Gallus gallus，鸡)IL-10结合，并且在本文中被称为抗chIL-10抗体或chIl10AB。抗IL-10抗体可以是单结构域抗IL-10抗体(sdAB)。“单结构域抗IL-10抗体”和“抗IL-10单结构域抗体”均是指相同类型的抗体，并且可以在本文中互换使用。抗IL-10单结构域抗体可以与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合。抗IL-10单结构域抗体可以减少IL-10与IL-10受体(IL-10R)的结合。
[0064] 在一个实施方式中，抗IL-10单结构域抗体对鸡Il-10的结合EC50可以为30nM或更小。抗IL-10单结构域抗体对鸡IL-10的结合EC50可以为约30nM或更小、约25nM或更小、约20nM或更小、约15nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小或约1nM或更小。抗IL-10单结构域抗体对鸡Il-10的结合EC50可以在以下任意两个EC50值之间的范围内：30、20、10、5或1nM。在一个实施方式中，本文提供的抗IL-10单结构域抗体的EC50可以通过ELISA或本领域已知的任意其他测定来测量。抗IL-10单结构域抗体值的EC50可以通过本文实施例9中所述的ELISA测定来测量。
[0065] 不受限制地，抗IL-10单结构域抗体可以是能够减少IL-10与IL-10受体(IL-10R)的结合的任意长度和任意分子量的单结构域抗体。抗IL-10单结构域抗体可以具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kDa的分子量。抗IL-10单结构域抗体可以具有14、15、16、
17、18、19或20kDa的分子量。抗IL-10单结构域抗体可以具有以下任意两个分子量之间范围内的分子量：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kDa。抗Il-10单结构域抗体可以具有以下任意两个分子量之间范围内的分子量：14、15、16、17、18、19或20kDa。
17、18、19或20kDa的分子量。抗IL-10单结构域抗体可以具有以下任意两个分子量之间范围内的分子量：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kDa。抗Il-10单结构域抗体可以具有以下任意两个分子量之间范围内的分子量：14、15、16、17、18、19或20kDa。
[0066] 抗IL-10单结构域抗体可以包括与选自由以下组成的组的参考序列的具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：87[chIL10sdAB1H5]、SEQ ID NO：88[chIL10sdAB1E9]、SEQ ID NO：89[chIL10sdAB1H1]、SEQ ID NO：90[chIL10sdAB1G6]、SEQ ID NO：91[chIL10sdAB1C10]、SEQ ID NO：92
[chIL10sdAB1B6]、SEQ ID NO：93[chIL10sdAB1D12]、SEQ ID NO：94[chIL10sdAB1C2]、SEQ ID NO：95[chIL10sdAB1B5]、SEQ ID NO：96[chIL10sdAB1E2]、SEQ ID NO：97
[chIL10sdAB1G7]、SEQ ID NO：98[chIL10sdAB1G9]、SEQ ID NO：99[chIL10sdAB1H12]、SEQ ID NO：100[chIL10sdAB2A9]、SEQ ID NO：101[chIL10sdAB1E12]、SEQ ID NO：102
[chIL10sdAB1E10]、SEQ ID NO：103[chIL10sdAB1F12]、SEQ ID NO：104[chIL10sdAB1A8]、SEQ ID NO：105[chIL10sdAB1C8]、SEQ ID NO：106[chIL10sdAB1C12]、SEQ ID NO：107[chIL10sdAB1B1]、SEQ ID NO：108[chIL10sdAB1F1]、SEQ ID NO：109[chIL10sdAB1D11]、SEQ ID NO：110[chIL10sdAB1E6]、SEQ ID NO：111[chIL10sdAB1B9]、SEQ ID NO：112[chIL10sdAB1B10]、SEQ ID NO：113[chIL10sdAB1F5]、SEQ ID NO：114[chIL10sdAB1A6]、SEQ ID NO：115[chIL10sdAB1D5]、SEQ ID NO：116[chIL10sdAB1D8]、SEQ ID NO：117[chIL10sdAB1B4]、SEQ ID NO：118[chIL10sdAB1C7]、SEQ ID NO：119[chIL10sdAB1B3]、SEQ ID NO：120[chIL10sdAB1D7]、SEQ ID NO：121[chIL10sdAB1F7]、SEQ ID NO：122
[chIL10sdAB1F10]、SEQ ID NO：123[chIL10sdAB1F2]、SEQ ID NO：124[chIL10sdAB1F3]、SEQ ID NO：125[chIL10sdAB1F8]、SEQ ID NO：126[chIL10sdAB1C9]、SEQ ID NO：127[chIL10sdAB1A12]、SEQ ID NO：128[chIL10sdAB1C3]、SEQ ID NO：129[chIL10sdAB1E7]、SEQ ID NO：130[chIL10sdAB1D9]、SEQ ID NO：131[chIL10sdAB1A9]、SEQ ID NO：132[chIL10sdAB1H10]、SEQ ID NO：133[chIL10sdAB1C1]、SEQ ID NO：134[chIL10sdAB1D1]、SEQ ID NO：135[chIL10sdAB1A11]、SEQ ID NO：136[chIL10sdAB1G8]、SEQ ID NO：137[chIL10sdAB1A5]、SEQ ID NO：138[chIL10sdAB1C5]、SEQ ID NO：139[chIL10sdAB1H6]、SEQ ID NO：140[chIL10sdAB2A8]、SEQ ID NO：141[chIL10sdAB1F9]、SEQ ID NO：142
[chIL10sdAB1E11]、SEQ ID NO：143[chIL10sdAB1D6]、SEQ ID NO：144[chIL10sdAB1C4]、SEQ ID NO：145[chIL10sdAB1H4]、SEQ ID NO：146[chIL10sdAB1F11]、SEQ ID NO：147[chIL10sdAB1D3]、SEQ ID NO：148[chIL10sdAB1A7]、SEQ ID NO：149[chIL10sdAB1H8]、SEQ ID NO：150[chIL10sdAB1H3]、SEQ ID NO：151[chIL10sdAB1B8]，SEQ ID NO：152
[chIL10sdAB1B2]，SEQ ID NO：153[chIL10sdAB1D2]和SEQ ID NO：154[chIL10sdAB1D10]。
抗IL-10单结构域抗体可以与信号肽融合。该信号肽可以是但不限于淀粉样蛋白靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽、内质网保留信号或液泡靶向肽。该信号肽可以是N末端信号肽或C末端信号肽。N末端信号肽可以是但不限于OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白(zein)27(xGZm27ss)信号肽。C末端信号肽可以是但不限于KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。抗IL-10单结构域抗体可以与N末端信号肽或C末端信号肽或两者融合。
[chIL10sdAB1B6]、SEQ ID NO：93[chIL10sdAB1D12]、SEQ ID NO：94[chIL10sdAB1C2]、SEQ ID NO：95[chIL10sdAB1B5]、SEQ ID NO：96[chIL10sdAB1E2]、SEQ ID NO：97
[chIL10sdAB1G7]、SEQ ID NO：98[chIL10sdAB1G9]、SEQ ID NO：99[chIL10sdAB1H12]、SEQ ID NO：100[chIL10sdAB2A9]、SEQ ID NO：101[chIL10sdAB1E12]、SEQ ID NO：102
[chIL10sdAB1E10]、SEQ ID NO：103[chIL10sdAB1F12]、SEQ ID NO：104[chIL10sdAB1A8]、SEQ ID NO：105[chIL10sdAB1C8]、SEQ ID NO：106[chIL10sdAB1C12]、SEQ ID NO：107[chIL10sdAB1B1]、SEQ ID NO：108[chIL10sdAB1F1]、SEQ ID NO：109[chIL10sdAB1D11]、SEQ ID NO：110[chIL10sdAB1E6]、SEQ ID NO：111[chIL10sdAB1B9]、SEQ ID NO：112[chIL10sdAB1B10]、SEQ ID NO：113[chIL10sdAB1F5]、SEQ ID NO：114[chIL10sdAB1A6]、SEQ ID NO：115[chIL10sdAB1D5]、SEQ ID NO：116[chIL10sdAB1D8]、SEQ ID NO：117[chIL10sdAB1B4]、SEQ ID NO：118[chIL10sdAB1C7]、SEQ ID NO：119[chIL10sdAB1B3]、SEQ ID NO：120[chIL10sdAB1D7]、SEQ ID NO：121[chIL10sdAB1F7]、SEQ ID NO：122
[chIL10sdAB1F10]、SEQ ID NO：123[chIL10sdAB1F2]、SEQ ID NO：124[chIL10sdAB1F3]、SEQ ID NO：125[chIL10sdAB1F8]、SEQ ID NO：126[chIL10sdAB1C9]、SEQ ID NO：127[chIL10sdAB1A12]、SEQ ID NO：128[chIL10sdAB1C3]、SEQ ID NO：129[chIL10sdAB1E7]、SEQ ID NO：130[chIL10sdAB1D9]、SEQ ID NO：131[chIL10sdAB1A9]、SEQ ID NO：132[chIL10sdAB1H10]、SEQ ID NO：133[chIL10sdAB1C1]、SEQ ID NO：134[chIL10sdAB1D1]、SEQ ID NO：135[chIL10sdAB1A11]、SEQ ID NO：136[chIL10sdAB1G8]、SEQ ID NO：137[chIL10sdAB1A5]、SEQ ID NO：138[chIL10sdAB1C5]、SEQ ID NO：139[chIL10sdAB1H6]、SEQ ID NO：140[chIL10sdAB2A8]、SEQ ID NO：141[chIL10sdAB1F9]、SEQ ID NO：142
[chIL10sdAB1E11]、SEQ ID NO：143[chIL10sdAB1D6]、SEQ ID NO：144[chIL10sdAB1C4]、SEQ ID NO：145[chIL10sdAB1H4]、SEQ ID NO：146[chIL10sdAB1F11]、SEQ ID NO：147[chIL10sdAB1D3]、SEQ ID NO：148[chIL10sdAB1A7]、SEQ ID NO：149[chIL10sdAB1H8]、SEQ ID NO：150[chIL10sdAB1H3]、SEQ ID NO：151[chIL10sdAB1B8]，SEQ ID NO：152
[chIL10sdAB1B2]，SEQ ID NO：153[chIL10sdAB1D2]和SEQ ID NO：154[chIL10sdAB1D10]。
抗IL-10单结构域抗体可以与信号肽融合。该信号肽可以是但不限于淀粉样蛋白靶向信号、细胞壁靶向肽、线粒体靶向肽、胞质定位信号、叶绿体靶向信号、核靶向肽、内质网保留信号或液泡靶向肽。该信号肽可以是N末端信号肽或C末端信号肽。N末端信号肽可以是但不限于OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白(zein)27(xGZm27ss)信号肽。C末端信号肽可以是但不限于KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。抗IL-10单结构域抗体可以与N末端信号肽或C末端信号肽或两者融合。
[0067] 在一个实施方式中，与SEQ ID NO：87-154之一的相应氨基酸序列具有小于100％同一性的抗IL-10单结构域抗体可以是所引用的肽或氨基酸的变体。在一个实施方式中，提供了沿着具有SEQ ID NO：87-154中任意一个序列的蛋白的10至20个、10至25个、10至30个、10至40个、10至50个、10至60个、10至70个、10至80个、10至90个、10至100个、10至110个、10至115个、10至116个、10至117个、10至118个、10至119个、10至120个、10至121个、10至122个、10至123个、10至124个、10至125个、10至126个或10至所有氨基酸，具有与具有SEQ ID NO：87-154中任意一个序列的肽具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列的分离肽。该序列长度列表涵盖SEQ ID NO：87-154中的每个全长肽，以及列表中每个较小的长度的肽(即使对于不包括超过126个氨基酸的肽)。例如，10至20个、10至25个、10至30个、10至40个、10至50个、10至60个、10至70个、10至80个、10至90个、10至100个、10至110个、10至115个、10至116个、10至117个、10至118个、10至119个、10至120个、10至121个、10至122个、10至123个、10至124个、10至125个、10至126个或10至所有氨基酸的长度适用于具有126个氨基酸的序列。本文所述的氨基酸序列长度的范围包括该范围内的每个氨基酸序列长度，包括端点在内。所述氨基酸的长度可以在参考序列内的任意单个位置处开始，足够的氨基酸跟随该单个位置以适应所述长度。抗IL-10单结构域抗体的片段可以是本文多肽的子序列，如本文实施例9所述的，当用于包含被IL-10抑制(在ConA存在下)以减少干扰素γ产生的细胞的细胞测定中时，该子序列保留了至少40％的抗IL-10单结构域抗体EC50值。该片段可以具有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、115、116、117、118、19、120、121、122、123、124、124或126个氨基酸。该片段可以包括10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、115、116、117、
118、19、120、121、122、123、124、124或126个连续氨基酸。实施方式还包括编码所述氨基酸序列的核酸或多核苷酸。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：87-154的序列中一个的与所述氨基酸长度对应的任意部分。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：87-154的任意一个的部分。
90、95、100、115、116、117、118、19、120、121、122、123、124、124或126个氨基酸。该片段可以包括10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、115、116、117、
118、19、120、121、122、123、124、124或126个连续氨基酸。实施方式还包括编码所述氨基酸序列的核酸或多核苷酸。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：87-154的序列中一个的与所述氨基酸长度对应的任意部分。小于全长氨基酸序列可以选自SEQ ID NO：87-154的任意一个的部分。
[0068] 当用于包含被IL-10抑制以减少干扰素γ或一氧化氮产生的细胞的细胞测定中时，抗IL-10单结构域抗体可以增加干扰素γ或一氧化氮的产生。
[0069] 相对于饲喂缺少所述抗体的相同饲料的家禽，抗IL-10单结构域抗体可以保持或改善饲喂所述抗体的家禽的体重和/或饲料转化率。抗IL-10单结构域抗体可以以每千克颗粒饲料小于500mg(或更优选每千克颗粒饲料小于50mg、更进一步优选每千克颗粒饲料小于5mg或者更进一步优选每千克颗粒饲料小于1mg)给予。当用于捣碎(非颗粒)饲料时，抗IL-
10单结构域抗体也可以改善家禽的体重或饲料转化率。在暴露于小于或等于65℃、或70℃、或75℃、或80℃、或85℃、或90℃、或95℃、或100℃的制粒过程的温度后，抗IL-10单结构域抗体可以保持其与IL-10的亲和力。在小于或等于65℃、或70℃、或75℃、或80℃、或85℃、或
90℃、或95℃、或100℃的温度下在液体中温育至少60秒后，抗IL-10单结构域抗体可以保持其与IL-10的亲和力。当加热至70℃至90℃的温度时，抗IL-10单结构域抗体可以具有活性。
当加热至70℃、75℃、80℃、85℃或90℃中的任意两个值之间的温度范围时，抗IL-10单结构域抗体可以具有活性。在暴露于70℃至90℃或前述值之间的任意值的温度后，抗IL-10单结构域抗体可以是活性的。抗IL-10单结构域抗体可以是对胃蛋白酶消化稳定的抗体，在动物消化道中可以具有提高的稳定性，并且可以由微生物宿主产生。抗IL-10单结构域抗体可以是易于被胃蛋白酶降解的抗体。易降解的抗体可以在胃蛋白酶处理45分钟至40分钟、40分钟至35分钟、35分钟至30分钟、30分钟至25分钟、25分钟至20分钟、20分钟至15分钟、15分钟至10分钟、10分钟至8分钟、8分钟至6分钟、6分钟至4分钟、4分钟至2分钟的时间段内完全降解。降解的时间段可以在2分钟至45分钟之间的任意两个整数值之间的范围内。由胃蛋白酶完全降解抗体可以在10分钟内发生。
10单结构域抗体也可以改善家禽的体重或饲料转化率。在暴露于小于或等于65℃、或70℃、或75℃、或80℃、或85℃、或90℃、或95℃、或100℃的制粒过程的温度后，抗IL-10单结构域抗体可以保持其与IL-10的亲和力。在小于或等于65℃、或70℃、或75℃、或80℃、或85℃、或
90℃、或95℃、或100℃的温度下在液体中温育至少60秒后，抗IL-10单结构域抗体可以保持其与IL-10的亲和力。当加热至70℃至90℃的温度时，抗IL-10单结构域抗体可以具有活性。
当加热至70℃、75℃、80℃、85℃或90℃中的任意两个值之间的温度范围时，抗IL-10单结构域抗体可以具有活性。在暴露于70℃至90℃或前述值之间的任意值的温度后，抗IL-10单结构域抗体可以是活性的。抗IL-10单结构域抗体可以是对胃蛋白酶消化稳定的抗体，在动物消化道中可以具有提高的稳定性，并且可以由微生物宿主产生。抗IL-10单结构域抗体可以是易于被胃蛋白酶降解的抗体。易降解的抗体可以在胃蛋白酶处理45分钟至40分钟、40分钟至35分钟、35分钟至30分钟、30分钟至25分钟、25分钟至20分钟、20分钟至15分钟、15分钟至10分钟、10分钟至8分钟、8分钟至6分钟、6分钟至4分钟、4分钟至2分钟的时间段内完全降解。降解的时间段可以在2分钟至45分钟之间的任意两个整数值之间的范围内。由胃蛋白酶完全降解抗体可以在10分钟内发生。
[0070] 一个实施方式提供了一种或多种编码本文所述的抗IL-10单结构域抗体或其变体的合成多核苷酸。一种或多种合成多核苷酸可以包含、基本上由或由与以下参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列组成：SEQ ID NO：173[chIL101A11编码序列]、SEQ ID NO：174[chIL101A11B编码序列]、SEQ ID NO：175[chIL101F11A编码序列]、SEQ ID NO：176[chIL101F11B编码序列]、SEQ ID NO：177[chIL101H1A编码序列]或SEQ ID NO：178[chIL101H1B编码序列]。一种或多种合成多核苷酸可以包含在表达盒中以在宿主中表达。该宿主可以是但不限于微生物、植物细胞、噬菌体、病毒、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
[0071] 一个实施方式提供了一种表达盒。该表达盒可以包含一种或多种编码本文所述的拮抗剂IL-10R肽、连接的IL-10R拮抗剂肽、抗IL-10单结构域抗体或其变体的合成多核苷酸。
[0072] 可以将本文的表达盒、分离的核酸、载体或任意其他DNA构建体中的或在本文的方法中所利用的多核苷酸序列可操作地连接至一个或多个调节元件。包括的调节元件可以是启动子。该启动子可以是组成型启动子，其在大多数细胞、组织和器官中以及在许多但不一定是所有发育阶段期间提供了遍及整个植物的多核苷酸序列的转录。该启动子可以是诱导型启动子，仅当暴露于特定的化学或环境刺激时其才启动多核苷酸序列的转录。该启动子可以是对宿主特异性的。该启动子可以适合于在植物、细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达多核苷酸。该启动子可以是植物特异性的启动子。该启动子可以对特定发育阶段、器官或组织是特异性的。组织特异性的启动子能够在特定植物组织中启动转录。可以被组织特异性的启动子靶向的植物组织可以是但不限于茎、叶、毛状体、花药、种子、胚或胚乳。本文的组成型启动子可以是玉米泛素启动子、水稻泛素3启动子(OsUbi3P)、柳枝稷
(switchgrass)泛素启动子、PEPC启动子、玉米肌动蛋白启动子或水稻肌动蛋白1启动子。可以使用其他已知的组成型启动子，包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、夜香树黄叶卷曲病毒启动子(Cestrum Yellow Leaf Curling Virus promoter，CMP)或CMP短型(CMPS)和Rubisco小亚基启动子。
(switchgrass)泛素启动子、PEPC启动子、玉米肌动蛋白启动子或水稻肌动蛋白1启动子。可以使用其他已知的组成型启动子，包括但不限于花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、夜香树黄叶卷曲病毒启动子(Cestrum Yellow Leaf Curling Virus promoter，CMP)或CMP短型(CMPS)和Rubisco小亚基启动子。
[0073] 组织特异性的启动子可以包括种子特异性的启动子。种子特异性的启动子可以是但不限于玉米醇溶蛋白启动子、水稻谷蛋白(GluB4)启动子、玉米油质蛋白启动子或玉米球蛋白启动子。
[0074] 该启动子可以是与先前所列的源自其他物种的任意一个启动子同源的启动子，或者与先前所列的启动子具有大于80％同一性的启动子变体。
[0075] 该启动子可以适合于在细菌中表达一种或多种多核苷酸。该启动子可以是T7RNA聚合酶启动子、LAC启动子或阿拉伯糖启动子。该启动子可以适合于在酵母中表达多核苷酸。该启动子可以是GAL启动子或葡萄糖启动子。该启动子可以是任意原核启动子。该原核启动子可以是细菌启动子或在细菌中有活性的噬菌体启动子。该原核启动子可以是在细菌中有活性的任意诱导型启动子，或者在细菌中有活性的任意其他启动子。
[0076] 可以提供的另一个调控元件是终止转录的终止子序列。该终止子序列可以包含在表达盒转录单元的3'末端。该终止子可以源自多种基因。该终止子可以来自真核生物(例如植物或哺乳动物细胞)或原核生物。该终止子可以是来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因的终止子序列。该终止子可以是玉米γ玉米醇溶蛋白27终止子。该终止子可以是任意其他终止子序列。
[0077] 一种或多种合成多核苷酸可以进一步包括编码本文所述的任意一种信号肽的一种或多种信号多核苷酸序列。表达盒可以包含、基本上由或由与以下参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的合成多核苷酸序列组成：
SEQ ID NO：84[xGZein27ss：chIL10sdAB1A11：KDEL]、SEQ ID NO：85[xGZein27ss：
chIL10sdAB1B9：KDEL]、SEQ ID NO：86[xGZein27ss：chIL10sdAB1F11：KDEL]或SEQ ID NO：
179[xGZein27ss：chIL10sdAB1H1：KDEL]。
SEQ ID NO：84[xGZein27ss：chIL10sdAB1A11：KDEL]、SEQ ID NO：85[xGZein27ss：
chIL10sdAB1B9：KDEL]、SEQ ID NO：86[xGZein27ss：chIL10sdAB1F11：KDEL]或SEQ ID NO：
179[xGZein27ss：chIL10sdAB1H1：KDEL]。
[0078] 包括一种或多种合成多核苷酸的表达盒可以包含在载体中。
[0079] 一个实施方式包含含有表达盒的载体，所述表达盒包括一个或多个编码上述任意实施方式的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的合成多核苷酸。该载体可以含有本文任意实施方式中所述的表达盒中的任意一种。该载体可以是用于植物转化的载体，并且能够将其DNA递送到植物细胞的基因组中。该载体可以是用于酵母和真菌表达的载体。该载体可以是在细菌表达中用于表达所用的本文所述的肽、连接肽或抗体的载体。该载体可以是用于哺乳动物或昆虫细胞表达的载体。
[0080] 该载体可以包含表达盒，该表达盒包括编码拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽的合成多核苷酸。该载体可以包含与参考序列SEQ ID NO：69[pAG4305]、SEQ ID NO：
70[pAG4306]、SEQ ID NO：71[pAG4308]、SEQ IS NO：72[pAG4310]、SEQ ID NO：73
[pAG4311]、SEQ ID NO：74[pAG4312]、SEQ ID NO：75[pAG4313]、SEQ ID NO：76[pAG4981]、SEQ ID NO：77[pAG4982]、SEQ ID NO：78[pAG4983]和SEQ ID NO：79[pAG4984]具有至少70、
72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。
70[pAG4306]、SEQ ID NO：71[pAG4308]、SEQ IS NO：72[pAG4310]、SEQ ID NO：73
[pAG4311]、SEQ ID NO：74[pAG4312]、SEQ ID NO：75[pAG4313]、SEQ ID NO：76[pAG4981]、SEQ ID NO：77[pAG4982]、SEQ ID NO：78[pAG4983]和SEQ ID NO：79[pAG4984]具有至少70、
72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。
[0081] 该载体可以包含表达盒，该表达盒包括编码抗IL-10单结构域抗体的合成多核苷酸。该载体可以包含与参考序列SEQ ID NO：155[pAG4314]、SEQ ID NO：156[pAG4315]、SEQ ID NO：157[pAG4316]、SEQ ID NO：158[pAG4317]、SEQ ID NO：159[pAG4985]、SEQ ID NO：160[pAG4986]、SEQ ID NO：161[pAG4987]、SEQ ID NO：162[pAG4988]、SEQ ID NO：163[pAG4989]、SEQ ID NO：164[pAG4990]、SEQ ID NO：165[pAG4991]、SEQ ID NO：166[pAG4992]、SEQ ID NO：167[pAG4993]、SEQ ID NO：168[pAG4994]、SEQ ID NO：169[pAG4995]、SEQ ID NO：170[pAG4996]、SEQ ID NO：171[pAG4997]或SEQ ID NO：172[pAG4998]具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。
[0082] 一个实施方式包含、基本上由或由沿其长度与本文所列的任意一种序列或其互补序列的多核苷酸的连续部分具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列组成的多核苷酸。该连续部分可以是直至本文所列的序列或其互补序列的全长的任意长度。
[0083] 确定两个氨基酸序列或两个核酸序列同一性百分比可以包括比对和比较两个序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸。如果两个序列中的所有位置都被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则该序列被称为100％相同。同一性百分比通过Smith Waterman算法测量((Smith TF,Waterman MS 1981"Identification of Common Molecular Subsequences,"J Mol Biol 147:195-197,通过引用将其全部内容并入本文)。
[0084] 在一个实施方式中，提供了一种转基因植物，其包含本文所述合成多核苷酸中的任意一种并表达本文所述的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。如本文所用的，术语“转基因植物”描述了用DNA转化的植物，该DNA使得含有转化DNA的植物能够执行新型功能；通常，DNA的转录水平可能与野生型植物的水平不同，并可能将转录物翻译成蛋白，该蛋白可能是一种新型植物蛋白。该转基因植物可以指完整的转基因植物或其组织。该转基因植物的组织可以是转基因植物的任意部分，包括但不限于叶、茎、花、芽、花瓣、籽粒、种子、胚、胚乳、叶、叶柄、根、花粉或花药。该组织还可以指通过将转基因植物的任意部分在有机或水性液体中分馏(例如，从转基因种子中提取蛋白并将提取物用作转基因蛋白的来源)并使用分离的液体饲喂动物或者在动物饲料或动物饲料添加剂中使用分离的液体而制得的液体提取物。该组织可以是来自转基因植物的愈伤组织。该组织可以是来自积累本文所述的肽、拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的转基因植物的种子。该转基因植物可以从转基因植物的组织再生。该转基因植物可以是第一转基因植物与第二转基因植物或非转基因植物有性杂交的产物，其中，该产物植物保留了引入到第一转基因植物的合成核酸。转基因植物可以是第一转基因植物与其自身的自花授粉的产物。
[0085] 一个实施方式提供本文所述转基因植物中任意一种的后代。该转基因植物可以表达本文所述抗体中的任意一种。该抗体可以靶向由摄取转基因植物或其组织的宿主动物产生的内源性分子。靶向的内源性分子可以是但不限于白介素、细胞因子、激素、肽、细胞受体、分化簇或相关分子。本公开内容的转基因植物可以表达影响饲喂该转基因植物或其组织的动物的免疫应答的其他肽或蛋白。该转基因植物可以含有本文所述表达盒中的至少一个。该转基因植物可以使用本文所述的载体产生。该转基因植物可以产生本文所述的肽、拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。表达本文所述的肽、拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的转基因植物可以是但不限于烟草、玉米、大豆或通常被动物食用的其他植物。
[0086] 该转基因植物可以表达调节、刺激或增强饲喂转基因植物或其组织的动物的免疫系统或免疫应答的肽和蛋白。该转基因植物可以表达靶向由摄取转基因植物或其组织的宿主动物产生的内源性分子的抗体。该转基因植物表达的抗体可以结合例如白介素、细胞因子、激素、肽、细胞受体、分化簇或类似分子的分子。该转基因植物可以表达调节各种内源性免疫系统途径、内分泌途径或其他生理系统的其他肽或蛋白。更具体地，该转基因植物可以表达与白介素10(IL-10)结合的一种或多种抗体、或干扰或阻断IL-10受体复合物(IL-10R)的一种或多种肽或蛋白拮抗剂、或以其他方式抑制IL-10信号途径的一种或多种肽或蛋白分子。
[0087] 该转基因植物或其组织可以调节、刺激或增强饲喂转基因植物或其组织的动物的免疫系统或免疫应答。该转基因植物或其组织可以改善食用该植物的动物的胃肠道生理。饲喂家禽时，转基因植物或其组织可以降低IL-10与IL-10受体(IL-10R)的结合。相对于饲喂缺乏转基因植物或其组织的相同饲料的家禽，该转基因植物或其组织可以保持或改善饲喂转基因植物或其组织的家禽的体重和/或饲料转化率。转基因植物或其组织可以以每吨颗粒饲料小于700kg(或更优选每吨颗粒饲料小于5kg、或更优选每吨颗粒饲料小于1kg、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于500g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于50g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于5g)给予。当用于捣碎(非颗粒)饲料时，该转基因植物及其组织也可以改善家禽的体重或饲料转化率。
[0088] 在一个实施方式中，提供制备本文所述转基因植物中任意一种的方法。该方法可以包括培养来自靶标植物的外植体，并使它们与含有至少一个本文所述的表达盒的载体接触。该靶标植物可以是玉米或大豆，或者可以是小麦、水稻、高粱、烟草、油菜、棉花、柳枝稷或其他植物。该方法可以包括使载体与植物外植体接触，例如通过使用生物射弹转化或通过农杆菌(Agrobacterium)转化。一旦外植体已经与载体接触，就可以使用本领域已知的选择和再生整个植物的方法。
[0089] 在一个实施方式中，可以从转基因植物或植物组织中分离拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。
[0090] 在一个实施方式中，本文所述的特异性的重组、工程化或合成分子可以由其他宿主表达并且可以从宿主中分离。
[0091] 在一个实施方式中，转基因植物或其组织或分离的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以包含在动物饲料中。
[0092] 在一个实施方式中，提供了包括本文所述转基因植物或其组织中任意一种的动物饲料。术语“动物饲料”是指适合并旨在为动物的营养和生长而摄取的任意食物、饲料、饲料组合物、制剂、添加剂、补充剂或混合物。饲喂家禽时，包含转基因植物或植物组织的动物饲料可以降低IL-10与IL-10R的结合。相对于饲喂缺乏转基因植物或其组织的相同饲料的家禽，包含转基因植物或植物组织的动物饲料可以保持或改善饲喂转基因植物或其组织的家禽的体重和/或饲料转化率。所述动物饲料可以以每吨颗粒饲料小于700kg(或更优选每吨颗粒饲料小于5kg、或更优选每吨颗粒饲料小于1kg、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于500g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于50g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于5g)包含转基因植物或其组织。当用于捣碎(非颗粒)饲料时，包含转基因植物及其组织的动物饲料或动物饲料添加剂还可以改善家禽的体重或饲料转化率。该动物饲料可以包括分离的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。包括动物饲料中的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体在动物胃肠道环境中可以是有活性的。包含在动物饲料中的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以是对胃蛋白酶消化稳定的肽或抗体。包含在动物饲料中的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以是被胃蛋白酶消化的肽或抗体。该动物可以是单胃动物。该单胃动物可以是但不限于鸡、火鸡或鸭。制备动物饲料后，拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以是有活性的。制备期间饲料所暴露的温度可以在20℃至70℃的范围内，包括端点在内。该温度可以是20℃、25℃、30℃、35℃、
40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、20℃至25℃、20℃至30℃、2℃至35℃、20℃至40℃、20℃至45℃、20℃至50℃、20℃至55℃、20℃至60℃、20℃至65℃、20℃至70℃、30℃至70℃、40℃至70℃、50℃至70℃、60℃至60℃或低于70℃。制粒期间饲料所暴露的温度可以在
70℃至130℃的范围内，包括端点在内。该温度可以是70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、
100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、0℃至75℃、70℃至80℃、70℃至85℃、70℃至90℃、70℃至95℃、70℃至100℃、70℃至105℃、70℃至110℃、70℃至115℃、70℃至120℃、70℃至125℃、70℃至130℃、80℃至130℃、90℃至130℃、100℃至130℃、110℃至130℃、
120℃至130℃或低于130℃。
40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、20℃至25℃、20℃至30℃、2℃至35℃、20℃至40℃、20℃至45℃、20℃至50℃、20℃至55℃、20℃至60℃、20℃至65℃、20℃至70℃、30℃至70℃、40℃至70℃、50℃至70℃、60℃至60℃或低于70℃。制粒期间饲料所暴露的温度可以在
70℃至130℃的范围内，包括端点在内。该温度可以是70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、
100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、0℃至75℃、70℃至80℃、70℃至85℃、70℃至90℃、70℃至95℃、70℃至100℃、70℃至105℃、70℃至110℃、70℃至115℃、70℃至120℃、70℃至125℃、70℃至130℃、80℃至130℃、90℃至130℃、100℃至130℃、110℃至130℃、
120℃至130℃或低于130℃。
[0093] 在饲料制粒期间暴露于高温后，拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以具有改善的热稳定性并可以保留活性。
[0094] 在一个实施方式中，该动物饲料可以进一步包括饲料补充剂。该饲料补充剂可以是任意植物材料。该植物材料可以是非转基因植物或转基因植物。该植物材料可以包括转基因植物或突变植物。该植物材料可以是含有淀粉的籽粒。该植物材料可以是含有纤维的籽粒。该植物材料可以是经化学处理的草料(forage)。该植物材料可以是非转基因植物或其部分。该植物材料可以包括选自由以下组成的组的至少一种组分：大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、黑小麦、甜菜、糖料甜菜、菠菜、卷心菜、藜麦、玉米粉、玉米颗粒、玉米油、酒糟(distillers grain)、草料、小麦粉、小麦颗粒、小麦籽粒、大麦籽粒、大麦颗粒、大豆粉、大豆油饼、羽扇豆粉、油菜籽粉、高粱籽粒、高粱颗粒、油菜籽、葵花种子和棉花种子。
[0095] 该饲料补充剂可以是矿物质。该矿物质可以是微量矿物质。该矿物质可以是大量矿物。该矿物质可以是磷酸岩或磷酸盐。该矿物质可以是磷酸钙。饲料补充剂可以是至少一种维生素。至少一种维生素可以是脂溶性维生素。该饲料补充剂可以是氨基酸。该饲料补充剂可以包括一种或多种外源酶。一种或多种外源酶可以包括植酸酶。一种或多种外源酶可以包括水解酶(hydrolytic enzyme)。该水解酶可以是根据EC3.4归类为水解酶(hydrolase)的酶。该水解酶可以是但不限于木聚糖酶、甘露聚糖酶、糖酶、蛋白酶、肽酶、葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶、果胶酶、半乳糖苷酶、漆酶、淀粉酶、半纤维素酶或纤维二糖水解酶。该酶可以在包含在饲料补充剂中的转基因植物或其部分中表达。该饲料补充剂可以包括纯化的酶。该饲料补充剂可以是但不限于生长改善添加剂、着色剂、调味剂、稳定剂、石灰石、硬脂精(stearine)、淀粉、糖、脂肪酸或树胶。该着色剂可以是类胡萝卜素。该类胡萝卜素可以是但不限于鸡油菌素、β胡萝卜素、虾青素或叶黄素。该脂肪酸可以是多不饱和脂肪酸。该多不饱和脂肪酸可以包括但不限于花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或γ-亚油酸。
[0096] 该饲料补充剂可以包括选自由以下组成的组的至少一种组分：可溶性固体、脂肪和蛭石、石灰石、原盐(plain salt)、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、 维生素预混料、磷酸二钙、硒预混料、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混料。该饲料补充剂可以包括鱼粉、鱼油、骨粉、羽毛粉和动物脂肪。该饲料补充剂可以包括酵母或酵母提取物。
[0097] 在一个实施方式中，提供一种制备动物饲料的方法。该方法可以包括通过本文所述的任意一种方法生产本文所述的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂L-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。
[0098] 一个实施方式提供一种生产动物饲料的方法。该方法可以包括将本文所述转基因植物或其组织或其后代中的任意一种与植物材料混合。该转基因植物可以是包括一种或多种编码本文所述肽和抗体的合成多核苷酸的转基因植物的后代。一种或多种多核苷酸可以包含在遗传构建体或表达盒中。该方法可以包括制备本文的任意转基因植物。该转基因植物或其后代可以是表达通过本文的方法生产的肽或蛋白的植物。该方法可以进一步包括将混合物制粒。该方法可以进一步包括将饲料补充剂添加到混合物中。该饲料补充剂可以包括至少一种外源酶。至少一种外源酶可以选自由以下组成的组：植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶、葡聚糖酶和纤维素酶。制备动物饲料可以包括将本文所述一种或多种转基因植物与任意其他饲料补充剂混合。
[0099] 在将植物混合的步骤之前或在将植物制粒的步骤之前，可以在植物中表达具有一种或多种编码拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的多核苷酸的表达盒。该表达可以是组成型的，也可以是诱导型的。在表达核酸后，与具有相同遗传背景但缺乏一个或多个表达盒的非转基因植物中的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体水平相比，转基因植物可以具有提高的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体水平。
[0100] 可以将拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体分离、纯化并添加到动物饲料中作为纯拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。可以从完整的宿主生物体中分离拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体，并添加到动物饲料中作为拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体组合物。拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以与其他饲料补充剂混合添加到动物饲料中。包括拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体，或纯化的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的转基因植物可以与其他饲料补充剂组合以形成预混料。
[0101] 动物饲料可以生产为捣碎饲料。动物饲料可以生产为颗粒饲料。研磨的饲料可以与包括任意一种转基因植物的预混料混合，所述转基因植物包括拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以是对胃蛋白酶消化稳定的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以是可被胃蛋白酶消化的拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体。研磨的饲料原料可以包括本文所述的植物材料和饲料补充剂。该饲料补充剂可以包括一种或多种本文所述的外源酶。该酶可以以液体或固体制剂添加。对于饲料，可以在混合步骤之前或期间添加固体或液体肽制剂。对于制粒的饲料，可以在制粒步骤之前或之后添加肽制剂。拮抗剂IL-10R肽、连接的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体可以包含在预混料中。预混料还可以包括维生素和微量矿物质。大量矿物质可以单独添加到动物饲料原料中。
[0102] 一个实施方式包含治疗或预防动物胃肠道感染的方法。胃肠道感染可能是由胃肠道病原体引起的。如本文所用的，胃肠道病原体可以包括细菌、酵母、真菌、古细菌、病毒、原生动物或能够在感染宿主动物内部或外部复制并在感染宿主动物内引起刺激、坏死、细胞破坏或细胞损伤或以其他方式刺激或调节感染宿主动物的免疫系统的其他传染原。胃肠道病原体可能属于艾美球虫属(Eimeria)。胃肠道病原体可以是但不限于柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)或巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)。该方法可以包括向动物给药本文所述的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。给药可以通过任意已知途径(例如通过注射)来进行。给药可以通过用表达一种或多种与IL-10结合的抗体或一种或多种与IL-10R结合的肽或蛋白拮抗剂的转基因植物或其植物组织，或含有转基因植物及其组织的动物饲料或饲料组合物饲喂感染动物来进行。该方法包含以治疗有效量给药本文所述的拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体中的任意一种。如本文所用的，拮抗剂IL-10肽、连接的拮抗剂IL-10肽或抗IL-10单结构域抗体的治疗有效量是当持续一周至两个月每天给药时有效减少动物胃肠道疾病症状的量。拮抗剂IL-10R肽或连接的拮抗剂IL-10R肽的治疗有效量可以是每千克颗粒饲料小于500mg(或更优选每千克颗粒饲料小于50mg、或更进一步优选每千克颗粒饲料小于5mg或更进一步优选每千克颗粒饲料小于1mg)的剂量。
[0103] 抗IL-10单结构域抗体的治疗有效量可以是每千克颗粒饲料小于500mg的剂量(或更优选每千克颗粒饲料小于50mg的剂量、或更进一步优选每千克颗粒饲料小于5mg的剂量或更进一步优选每千克颗粒饲料小于1mg的剂量)。
[0104] 转基因植物或其组织的治疗有效量可以是每吨颗粒饲料小于700kg的剂量、或更优选每吨颗粒饲料小于5kg的剂量、或更优选每吨颗粒饲料小于1kg的剂量、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于500g的剂量、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于50g的剂量、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于5g的剂量。
[0105] 动物饲料的治疗有效量可以以每吨颗粒饲料小于700kg、或更优选每吨颗粒饲料小于5kg、或更优选每吨颗粒饲料小于1kg、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于500g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于50g、或更进一步优选每吨颗粒饲料小于5g包含转基因植物或其组织。
[0106] 一个实施方式包含刺激或调节免疫系统并改善动物胃肠道生理的方法，该方法包括用转基因植物或其组织饲喂动物。如本文所用的，术语“调节”意指改变或对刺激应答。在这种情况下，“调节”可能意指增加应答或减少应答。关于调节免疫应答，其意指刺激或减少免疫应答。在涉及应答调节时，与减少同义使用的词语包括阻断、干扰、阻抗、降低、减轻、关闭或除去。术语胃肠道生理描述了动物胃肠道(包括前肠、中肠和后肠)的生物学状态。胃肠道的实际解剖特征可能因动物物种而变化，但在家禽中包括食道、嗉囊(crop)、前胃(proventriculus)、胃(ventriculous)、肌胃(gizzard)、十二指肠、空肠、回肠、小肠、大肠、泄殖腔和盲肠。胃肠道的生物学状态可以描述为健康或正常、无任何异常的视觉或病理观察、或异常的组织学评估。胃肠道的生物学状态可以描述为发炎、感染或坏死，所有这些都描述了受损的生理状态并能够改善为正常或健康状态。
[0107] 在一个实施方式中，提供一种改善动物胃肠道生理的方法。该方法可以包括向动物饲喂本文所述的任意转基因植物或植物部分。在一个实施方式中，该方法可以包括向动物饲喂本文所述的任意抗IL-10单结构域抗体、肽或拮抗剂IL-10R。
[0108] 在一个实施方式中，提供一种改善动物生产性能或动物胃肠生理的方法。该方法可以包括向动物饲喂任意表达一种或多种与IL-10结合的抗体或一种或多种IL-10R的肽或蛋白拮抗剂的转基因植物或其植物组织，或含有转基因植物或其组织或抗IL-10单结构域抗体或IL-10R拮抗剂的饲料或饲料组合物。该方法可以包括向动物饲喂本文所述转基因植物或植物部分中的任意一种。如本文所用的，动物生产性能是动物生长或动物生产力的同义词，并且每个术语可以互换使用。动物生产性能涉及动物的体重随时间增加，并且涉及动物的饲料转化率，饲料转化率被定义为动物食用的饲料质量除以动物的体重增加。这些术语可以用于描述体重增加和饲料转化率或两者，因此，动物生产性能的改善可能表明相对于对照动物，增重的增加和或饲料转化率的减少(每质量动物生长所食用的饲料减少)。在一个实施方式中，该方法可以包括向动物饲喂包含本文所述的任意动物饲料或动物饲料添加剂，该动物饲料或动物饲料添加剂包含本文所述的任意抗IL-10单结构域抗体、肽、IL-10R拮抗剂或其转基因植物或组织。
[0109] 以下列表包括本发明的特定实施方式。但是该列表不是限制性的，并且不排除替代实施方式或本文另外所述的实施方式。在以下实施方式列表中所述的同一性百分比是指所引用序列沿参考序列的整个长度的同一性。
[0110] 实施方式
[0111] 1、至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，(i)所述至少一种拮抗剂IL-10R肽是包含与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽，或(ii)所述至少一种拮抗剂IL-10R肽含有包含与选自由SEQ ID NO：32-40组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的连接肽。
[0112] 2、根据实施方式1所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，每个连接肽通过一个或多个接头彼此连接。
[0113] 3、根据实施方式1和2中任意一项或两项所述的至少一种拮抗剂肽，其中，所述一个或多个接头包含选自由SEQ ID NO：41-44和65组成的组的序列。
[0114] 4、根据实施方式1-3中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，所述至少一种肽或每个连接肽包含N末端信号肽或C末端信号肽或两者。
[0115] 5、根据实施方式1-4中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，N末端信号肽选自由以下组成的组：OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白(zein)27(xGZm27ss)信号肽。
[0116] 6、根据实施方式1-5中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，所述肽在70℃至90℃的温度下稳定。
[0117] 7、根据实施方式1-6中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，所述肽可被胃蛋白酶消化。
[0118] 8、根据实施方式1-6中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，所述肽对胃蛋白酶消化稳定。
[0119] 9、根据实施方式1-8中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽，其中，C末端信号肽选自由以下组成的组：KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。
[0120] 10、一种编码实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽的合成多核苷酸。
[0121] 11、根据实施方式10所述的合成多核苷酸，其中，所述合成多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：16-28和56组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
[0122] 12、一种与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合的抗IL-10单结构域抗体。
[0123] 13、根据实施方式12所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体具有在10kDa至20kDa范围内的分子量。
[0124] 14、根据实施方式12和13中任意一项或两项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体在70℃至90℃的温度下稳定。
[0125] 15、根据实施方式12-14中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，在细胞ELISA测定中，所述抗体以30nM或更低的EC50与鸡Il-10结合。
[0126] 16、根据实施方式12-15中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体包含与选自由SEQ ID NO：87-154组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0127] 17、根据实施方式12-16中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体包含与选自由SEQ ID NO：89、135和146组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0128] 18、根据实施方式12-17中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗体与N末端信号肽或C末端信号肽或两者融合。
[0129] 19、根据实施方式12-18中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，N末端信号肽选自由以下组成的组：OsGluB4sp(水稻Glu-B4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)、PR1(致病相关蛋白)或玉米醇溶蛋白27(xGZm27ss)信号肽。
[0130] 20、根据实施方式12-19中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，C末端信号肽选自由以下组成的组：KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、来自大麦多胺氧化酶的HvVSD或来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)。
[0131] 21、根据实施方式12-20中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗IL-10单结构域抗体可被胃蛋白酶消化。
[0132] 22、根据实施方式12-20中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗IL-10单结构域抗体对胃蛋白酶消化稳定。
[0133] 23、根据实施方式12-22中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体，其中，所述抗IL-10单结构域抗体暴露在大于70℃且小于100℃的温度下稳定。
[0134] 24、一种编码实施方式12-23中任意一项或多项的抗IL-10单结构域抗体的合成多核苷酸。
[0135] 25、根据实施方式24所述的合成多核苷酸，其中，所述合成多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：173-178组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
[0136] 26、一种转基因植物或其组织，其包含一种或多种编码实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽或实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体的多核苷酸。
[0137] 27、一种包含一种或多种编码至少一种拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体的多核苷酸的转基因植物或其组织。
[0138] 28、根据实施方式27所述的转基因植物或其组织，其中，所述拮抗剂IL-10R肽是与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽。
[0139] 29、根据实施方式27和28中任意一项或两项所述的转基因植物或其组织，其中，所述拮抗剂IL-10R肽含有包含与选自由SEQ ID NO：32-40组成的组的参考序列具有至少90％同一性的氨基酸的连接的拮抗剂IL-10R肽。
[0140] 30、根据实施方式27-29中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体与包含氨基酸序列SEQ ID NO：80的多肽结合。
[0141] 31、根据实施方式27-30中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体具有在10kDa至20kDa范围内的分子量。
[0142] 32、根据实施方式27-31中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体在70℃至90℃的温度范围内稳定。
[0143] 33、根据实施方式27-32中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，在细胞ELISA测定中，所述抗IL-10单结构域抗体以30nM或更低的EC50与鸡Il-10结合。
[0144] 34、根据实施方式27-33中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体包含与选自由SEQ ID NO：87-154组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0145] 35、根据实施方式27-34中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体包含与选自由SEQ ID NO：89、135和146组成的组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0146] 36、根据实施方式27-35中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述一个或多个多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：16-28和56组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
[0147] 37、根据实施方式27-36中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述一个或多个多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO：173-178组成的组的参考序列具有至少90％同一性的序列。
[0148] 38、根据实施方式27-37中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体可被胃蛋白酶消化。
[0149] 39、根据实施方式27-37中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，所述抗IL-10单结构域抗体对胃蛋白酶消化稳定。
[0150] 40、根据实施方式27-39中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织，其中，植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、小麦、水稻、高粱、油菜、棉花和柳枝稷。
[0151] 41、一种包含实施方式26-40中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织的动物饲料。
[0152] 42、一种包含实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽或实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体的动物饲料。
[0153] 43、根据实施方式42所述的动物饲料，其中，至少一种IL-10R拮抗剂IL-10R肽或抗IL-10单结构域抗体在植物中表达并暴露在25℃至130℃的温度范围内有活性。
[0154] 44、根据实施方式41或42-43中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，该动物饲料进一步包含饲料补充剂。
[0155] 45、根据实施方式41或42-44中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂为植物材料。
[0156] 46、根据实施方式41或42-45中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述植物材料为非转基因植物或转基因植物。
[0157] 47、根据实施方式41或42-46中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述植物材料包括选自由以下组成的组的至少一种组分：玉米粉、玉米颗粒、小麦粉、小麦颗粒、小麦籽粒、大麦籽粒、大麦颗粒、大豆粉、大豆油饼、高粱籽粒和高粱颗粒。
[0158] 48、根据实施方式41或42-47中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括一种或多种外源酶。
[0159] 49、根据实施方式41或42-48中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述一种或多种外源酶包括选自由以下组成的组的水解酶：木聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶和甘露聚糖酶。
[0160] 50、根据实施方式41或42-49中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括选自由以下组成的组的至少一种组分：可溶性固体、脂肪和蛭石、石灰石、原盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、 维生素预混料、磷酸二钙、硒预混料、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混料。
[0161] 51、一种治疗或预防动物胃肠道感染的方法，其包括向动物饲喂实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽、实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体、实施方式26-40中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织、或实施方式41-50中任意一项或多项所述的动物饲料。
[0162] 52、根据实施方式51所述的方法，其中，所述胃肠道感染是由胃肠道病原体引起的，所述胃肠道病原体选自由以下组成的组：细菌、酵母、真菌、古细菌、病毒和原生动物。
[0163] 53、根据实施方式51和52中任意一项或两项所述的方法，其中，所述胃肠道病原体属于艾美球虫属(Eimeria)。
[0164] 54、根据实施方式51-53中任意一项或多项所述的方法，其中，所述胃肠道病原体选自由以下组成的组：柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)和巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)。
[0165] 55、一种刺激或调节免疫系统并改善动物胃肠道生理的方法，其包括向动物饲喂实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽、实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体、实施方式26-40中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织、或实施方式41-50中任意一项或多项所述的动物饲料。
[0166] 56、一种改善动物生产性能的方法，其包括向动物饲喂实施方式1-9中任意一项或多项所述的至少一种拮抗剂IL-10R肽、实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体、实施方式26-40中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织、或实施方式41-50中任意一项或多项所述的动物饲料。
[0167] 57、一种制备动物饲料的方法，其包括将实施方式1-9中任意一项或多项所述的拮抗剂IL-10R肽、实施方式12-23中任意一项或多项所述的抗IL-10单结构域抗体、或实施方式26-40中任意一项或多项所述的转基因植物或其组织与植物材料混合以形成混合物。
[0168] 58、根据实施方式57所述的方法，其中，该方法进一步包含将所述混合物制粒。
[0169] 59、根据实施方式57和58中任意一项或两项所述的方法，其中，该方法进一步包含将所述饲料补充剂添加到所述混合物中。
[0170] 60、根据实施方式57-59中任意一项或多项所述的方法，其中，所述植物材料为非转基因植物或转基因植物。
[0171] 61、根据实施方式57-60中任意一项或多项所述的方法，其中，所述植物材料包括选自由以下组成的组的至少一种组分：玉米粉、玉米颗粒、小麦粉、小麦颗粒、小麦籽粒、大麦籽粒、大麦颗粒、大豆粉、大豆油饼、高粱籽粒和高粱颗粒。
[0172] 62、根据实施方式57-61中任意一项或多项所述的方法，其中，所述饲料补充剂包括一种或多种外源酶。
[0173] 63、根据实施方式57-62中任意一项或多项所述的方法，其中，所述一种或多种外源酶包括选自由以下组成的组的水解酶：木聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶和甘露聚糖酶。
[0174] 64、根据实施方式57-63中任意一项或多项所述的方法，其中，所述饲料补充剂包括选自由以下组成的组的至少一种组分：可溶性固体、脂肪和蛭石、石灰石、原盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、 维生素预混料、磷酸二钙、硒预混料、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混料。
[0175] 通过在一个实施方式中补充来自本文任意一个或多个其他实施方式的一个或多个元素，和/或用来自一个或多个其他实施方式的一个或多个元素替换来自一个实施方式的一个或多个元素可以形成本文其他实施方式。
[0176] 实施例
[0177] 提供以下非限制性实施例以说明特定的实施方式。可以在整个实施方式中补充来自以下一个或多个实施例的一个或多个细节，和/或用来自以下一个或多个实施例的一个或多个细节替换来自实施方式的一个或多个元素。
[0178] 实施例1.工程化肽和抗体的策略
[0179] 尽管在艾美球虫(Eimeria)感染之前和期间降低IL-10水平可以帮助控制球虫病的负面影响，但已经用于降低IL-10水平的本领域已知机制价格昂贵，并且在工业上广泛采用具有不可靠的稳健性。使用生物技术设计靶向IL-10信号途径的新型产品，可以通过几种重要方式解决控制球虫病的已知技术(使用分离的或部分纯化的肽或抗体)的缺点。首先，通过将抗体的发现和开发范围扩大到普通靶标鸡生产系统之外，就像当前通过用连接的IL-10肽接种母鸡或鸡蛋来完成的那样，可以开发专门针对控制球虫病的新型抗体和肽。将本文开发的肽和合成抗体工程化以具有高亲和力(因此降低了剂量水平)、改善的热稳定性(当混合到动物饲料中时要在制粒中保持活性)和低分子量以促进高水平表达(以最大化生产效益)、天然存在的肽和抗体中未发现以及不能简单地从自然界中选择出来的性质，在不进行过度实验的情况下这些性质也无法在母鸡或鸡蛋生产系统中有效地被复制。第二，通过将编码本文开发的肽和抗体的基因工程化到植物中，可以通过在饮食中将植物或植物组织直接饲喂而无需额外的分离、纯化或配制。这极大地有利于生产和动物管理经济学。这种技术的组合有效地控制了球虫病是出乎预料的。预计全籽粒或全粉中输送的未分离的抗体和多肽当与饲料混合时将无法在制粒过程中保持活性(当使用较大抗体(例如IgG或IgY)和肽时通常是这种情况)，不能从植物基质充分扩散，并且不容易被动物以足够的浓度获得以调节IL-10信号途径，或将在消化道中迅速降解。而出乎预料的是，用于制备本文所述产品的技术的组合能够克服这些挑战并解决本领域中用于控制球虫病的当前方法所面临的挑战。
[0180] 异源肽和蛋白的植物表达是地球上最便宜的重组蛋白生产系统之一。通过玉米或大豆工程化以生产抗IL-10抗体、IL-10R肽拮抗剂或其他抑制IL-10信号传导的分子，可以以高浓度制得这些分子，例如浓度范围从每克研磨籽粒0.01mg异源蛋白(抗IL-10抗体、IL-10R肽拮抗剂或其他抑制IL-10信号传导的蛋白或肽)到每克研磨籽粒多达20mg异源蛋白。
随着种子发育后经历了脱水过程，种子组织中生产的异源蛋白和肽天然稳定在种子中。玉米或大豆中生产的抗体和肽拮抗剂可以通过简单地将籽粒研磨并将其与其他成分混合而直接用于家禽饮食中。尽管可以使用其他加工和配制步骤，但是如果这些产品是通过发酵或接种鸡蛋生产的，则不需要额外的加工步骤，这两种方法都是更昂贵的过程。进而，由于这些分子由稳定整合到植物基因组中的DNA编码，因此有机会进一步将这些分子工程化并赋予它们在母鸡中产生抗体或通过接种鸡蛋时无法实现的有益的性质。
随着种子发育后经历了脱水过程，种子组织中生产的异源蛋白和肽天然稳定在种子中。玉米或大豆中生产的抗体和肽拮抗剂可以通过简单地将籽粒研磨并将其与其他成分混合而直接用于家禽饮食中。尽管可以使用其他加工和配制步骤，但是如果这些产品是通过发酵或接种鸡蛋生产的，则不需要额外的加工步骤，这两种方法都是更昂贵的过程。进而，由于这些分子由稳定整合到植物基因组中的DNA编码，因此有机会进一步将这些分子工程化并赋予它们在母鸡中产生抗体或通过接种鸡蛋时无法实现的有益的性质。
[0181] 抗体、蛋白和肽的工程化为满足调节IL-10信号途径的工业需求提供了额外机会。抗IL-10抗体可以由多种宿主产生，其包括骆驼、牛犊、鸡、山羊、马、人、美洲驼、小鼠、兔子、大鼠、鲨鱼和许多其他物种。产生抗体的宿主的特定选择可能取决于多种考虑因素，包括抗原的选择(抗原会被宿主识别为自身还是被识别为外源并产生适当的免疫应答)、抗体的选择(IgG、IgY、多克隆、单克隆等)、与宿主合作的容易度、所需抗体的数量、所用该抗体的预期物种以及所需抗体的类型(全长(约120-160kDa)、抗体片段(可能约为50kDa的Fab或可能约为25kDa的scFv)或单结构域抗体(可能约为10-20kDa))。单结构域抗体是由缩写为sdAb、sdAB、VHH或VNAR的小合成抗体且具有使其通过饲料输送到动物消化道时适合靶向IL-10的特定特征。特别地，sdAb通常被认为相对于全长和其他抗体片段具有改善的热稳定性，并且非常容易受到分子工程化的影响，这提供了进一步改善其热稳定性和亲和力的可能性，这两者都可以帮助减少调节IL-10信号途径所需动物饲料的必需剂量(E.R.Goldman,
G.P.Anderson,J.L.Liu,J.B.Delehanty,L.J.Sherwood,L.E.Osborn,L.B.Cummins,and A.Hayhurst,2006,Facile Generation of Heat-Stable Antiviral and Antitoxin
Single Domain Antibodies from a Semisynthetic Llama Library,Annal.Chem.,78:
8245-8255，通过引用将其全部内容并入本文)。将鸡IL-10(SEQ ID NO：80中第2-151位置的氨基酸残基)与美洲驼IL-10(SEQ ID NO：207)进行比较。序列比对分析显示了序列仅48％相同。基于该分析，选择了全长红原鸡(Gallus gallus)IL-10(鸡IL-10或cIL-10)作为在骆驼或美洲驼中产生sdAb的靶标抗原。由于美洲驼没有暴露于内源性鸡白介素cIL-10，并且只有通过生物技术过程才能够制备、分离cIL-10并将其给予到美洲驼中，因此，美洲驼对cIL-10是naive的，结果发现如图3所示可能产生显著的免疫应答。进而，鉴于已知IL-10会在体内二聚化(K.Asadullah,W.Sterry,H.D.Volk,"Interleukin-10Theraphy-Review of a New Approach",Pharmacological Reviews,55(2):241-269,2003)，使用IL-10肽作为靶标抗原是具有挑战性的，因为可以选择通常在体内IL-10二聚体中不暴露的肽表位。因此，使用全长cIL-10可以更容易地优化文库的建立和抗体筛选，并开发合成抗体。开发用于表达的单个分子的另一个优势是，它可以从接种宿主制得的多种分子中选择，允许筛选和选择高度优化的sdAb，该sdAb可以高效地在玉米或其他宿主中复制。以这种方式，可以解决当前家禽中调节IL-10途径的许多挑战以将这项创新推向市场。
G.P.Anderson,J.L.Liu,J.B.Delehanty,L.J.Sherwood,L.E.Osborn,L.B.Cummins,and A.Hayhurst,2006,Facile Generation of Heat-Stable Antiviral and Antitoxin
Single Domain Antibodies from a Semisynthetic Llama Library,Annal.Chem.,78:
8245-8255，通过引用将其全部内容并入本文)。将鸡IL-10(SEQ ID NO：80中第2-151位置的氨基酸残基)与美洲驼IL-10(SEQ ID NO：207)进行比较。序列比对分析显示了序列仅48％相同。基于该分析，选择了全长红原鸡(Gallus gallus)IL-10(鸡IL-10或cIL-10)作为在骆驼或美洲驼中产生sdAb的靶标抗原。由于美洲驼没有暴露于内源性鸡白介素cIL-10，并且只有通过生物技术过程才能够制备、分离cIL-10并将其给予到美洲驼中，因此，美洲驼对cIL-10是naive的，结果发现如图3所示可能产生显著的免疫应答。进而，鉴于已知IL-10会在体内二聚化(K.Asadullah,W.Sterry,H.D.Volk,"Interleukin-10Theraphy-Review of a New Approach",Pharmacological Reviews,55(2):241-269,2003)，使用IL-10肽作为靶标抗原是具有挑战性的，因为可以选择通常在体内IL-10二聚体中不暴露的肽表位。因此，使用全长cIL-10可以更容易地优化文库的建立和抗体筛选，并开发合成抗体。开发用于表达的单个分子的另一个优势是，它可以从接种宿主制得的多种分子中选择，允许筛选和选择高度优化的sdAb，该sdAb可以高效地在玉米或其他宿主中复制。以这种方式，可以解决当前家禽中调节IL-10途径的许多挑战以将这项创新推向市场。
[0182] 实施例2.肽的选择
[0183] 通过分析人IL-10/IL-10R1复合物的晶体结构、确定有助于结合的人蛋白序列的部分并通过将人和鸡IL-10和IL-10R1的序列分别与Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/；Diaz-Valdez等，2011，Josephson等，2001，Naiyer等，2013，Ni等，2016，Reineke等，1998，Yoon等，2005，Zdanov等，1996)进行比对从而在鸡蛋白中找到类似序列来设计合成肽。从Pub Med(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)获得氨基酸序列，并从比对中除去推测的信号肽序列、跨膜序列和细胞内序列。使用过敏原在线数据库(Allergen Online Database，http://www.allergenonline.org/
databasefasta.shtml)检查所有肽序列的已知过敏原表位。
databasefasta.shtml)检查所有肽序列的已知过敏原表位。
[0184] 通过肽作图确定的参与结合其受体的人IL-10残基如下：
[0185]
[0186] 如上所述获得人(AAA63207.1；SEQ ID NO：81)和鸡(NP_001004414.2；SEQ ID NO：80)序列并进行编辑。参与结合人IL-10R1的人IL-10残基为粗体和灰色(Reineke等，1998)。
并显示了鸡IL-10序列与人IL-10序列的比对。
并显示了鸡IL-10序列与人IL-10序列的比对。
[0187] 在具有受体的复合物中掩埋了＞ 表面积的人IL-10残基(Yoon等，2005)。
[0188]
[0189] 显示了鸡IL-10序列(SEQ ID NO：80)与人IL-10序列(SEQ ID NO：81)的比对，其中作为大部分结合表面的人IL-10序列的两个区段(Diaz-Valdez等，2011；Josephson等，2001；Naiyer等，2013；Ni等，2016；Reineke等，1998；Yoon等，2005和Zdanov等，1996)以粗体和灰色表示。螺旋区加下划线。
[0190] 基于与结合相互作用的预测序列区进行比对的肽设计实施例：
[0191]
[0192] 如前所述标示人IL-10的结合热点和螺旋区。涵盖肽P25(SEQ ID NO：5)和P26(SEQ ID NO：6)的鸡IL-10序列中的序列用粗斜体和灰色标示。肽P21(SEQ ID NO：1)由P25、P26和序列中它们之间的所有鸡IL-10残基组成：
[0193] 基于与结合热点进行比对的肽设计实施例：
[0194]
[0195] 如前所述标示人IL-10的结合热点和螺旋区。肽P27(SEQ ID NO：7)用粗斜体和灰色标示。肽P22(SEQ ID NO：2)用粗体标示并包括在框中。肽27是P22序列内的区域。
[0196] 人(SEQ ID NO：83)和鸡(SEQ ID NO：82)IL-10R1可溶性结构域序列的比对：
[0197]
[0198] 如上所述获得人(NP_001549.2)和鸡(NP_001034686.1)序列并进行编辑。参与结合人IL-10的人IL-10R1残基(Reineke等，1998的图5)用粗体表示。并显示了鸡IL-10R1序列与人IL-10R1序列的比对；为了清楚起见，省略了细胞内和跨膜结构域。
[0199] 实施例3.肽的筛选
[0200] 通过Watsonbio,Inc.,Houston TX对肽进行化学合成、脱盐并纯化至>98％的纯度。在DMSO中以10mM制备肽原液并在测定缓冲液中稀释至0.05mM。通过确定其在阻断鸡IL-10对鸡脾细胞中伴刀豆球蛋白A(ConA)(或者可替换地使用植物血凝素(PHA))诱导的干扰素γ(IFN-γ)诱导中的抑制作用的有效性，在加利福尼亚州诺瓦托市的Marin Biologic Laboratories,Inc.筛选肽(Wu等(2016)和Rothwell等(2004))。简而言之，通过在Ficoll-Hypaque上进行差速离心从鸡脾中分离淋巴细胞和单个核细胞。在有cIL-10和无cIL-10下，在存在肽、1.2μg/mL ConA(或者可替换地12.5μg/mL PHA)下将细胞以5×106个细胞/mL在
96孔平板的孔中培养72小时。并将脾细胞在没有肽和/或没有ConA(或PHA)下作为对照进行温育。通过ELISA确定上清液中的IFN-γ水平。
96孔平板的孔中培养72小时。并将脾细胞在没有肽和/或没有ConA(或PHA)下作为对照进行温育。通过ELISA确定上清液中的IFN-γ水平。
[0201] 使用源自几种物种IL-10的肽添加到饲料中以减少这些动物的呼吸道和肠道疾病在本领域中是已知的。参见美国专利号8,652,457B2和美国专利申请公开号US2016/0280778A1，通过引用将其全部内容并入本文。将这些肽设计为在动物中引发免疫应答，这将导致抗IL-10抗体的产生。相反地，设计本文所述肽的目的是直接干扰鸡IL-10与其受体(即作为IL-10R拮抗剂)的结合。结果，与以前专利中设计为掺入IL-10抗原特征的肽相反，将本文所述的肽部分设计为模拟cIL-10或cIL-10受体的R1亚基的部分，并与cIL-10或cIL-
10R竞争与其他种类的结合。
10R竞争与其他种类的结合。
[0202] 表1：肽的氨基酸序列
[0203]
[0204] *P9和P6是对照肽(Ni等)。
[0205] 实施例4.用于在玉米中生产IL-10R拮抗剂肽的基本植物表达构建体
[0206] 已将IL-10R拮抗剂肽的氨基酸序列和本文件中的所有其他序列反向翻译并为在所需宿主生物体中表达而优化了密码子。例如，对于植物表达，将玉米密码子的使用用于证明密码子优化、表达盒组装、载体组装和植物转化，但是也可以使用其他宿主生物体。使用计算机程序Vector NTI(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)将所有IL-10R拮抗剂肽和抗体反向翻译并为在玉米中表达而优化了密码子。所得的DNA序列列于表2和本文件的末尾。
[0207] 表2.IL-10R拮抗剂肽及其经玉米密码子优化的DNA编码序列
[0208]
[0209] 在表3中给出了含有用于P24IL-10R拮抗剂肽的单个表达盒的基本克隆载体的例子。通过用不同的肽或抗体序列替代P24肽转基因可以制得表2中所列的任意其他IL-10R拮抗剂肽或抗体的类似载体。
[0210] 表3.P24基本表达载体
[0211]
[0212] 图1A-1G示出了载体pAG4305(图1A)、pAG4306(图1B)、pAG4308(图1C)、pAG4310(图1D)、pAG4311(图1E)、pAG4312(图1F)和pAG4313(图1G)的示意图。
[0213] 图2A-2D示出了载体pAG4981(图2A)、pAG4982(图2B)、pAG4983(图2C)和pAG4984(图2D)的示意图。
[0214] 可以将任意编码表2中所列的IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体的DNA片段克隆在基本P24肽表达载体(表3)中所需的启动子和Nos终止子序列之间以产生所需的表达盒。另外，可以用其他信号序列代替氨基末端(N)信号序列(例如玉米表达载体中的xGZein27ss)以将IL-10R拮抗剂肽或抗体的特异性表达和积累调节至所需水平。N末端信号序列包括但不限于例如OsGluB4sp(水稻GluB-4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)或PR1(致病相关蛋白)。可以使用羧基末端(C)保留信号序列(例如KDEL(SEQ ID NO：
29)、HDEL(SEQ ID NO：30)或SEKDEL)将IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体表达至内质网(ER)以改善积累和糖基化。此外，借助于连接到序列N末端或C末端部分的信号序列，可以表达IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体并将其定向至蛋白质贮存液泡。这些贮存液泡信号序列包括来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)或来自大麦多胺氧化酶的HvVSD。如有需要，还可以由无需信号序列的基本P24载体表达IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体以用于在质外体或细胞质中积累表达产物。可以将上述所有那些以及具有类似功能的其他信号序列添加至基本植物表达载体或从中除去。上述信号序列可以在本文档末尾的“序列表”中找到。
29)、HDEL(SEQ ID NO：30)或SEKDEL)将IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体表达至内质网(ER)以改善积累和糖基化。此外，借助于连接到序列N末端或C末端部分的信号序列，可以表达IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体并将其定向至蛋白质贮存液泡。这些贮存液泡信号序列包括来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)或来自大麦多胺氧化酶的HvVSD。如有需要，还可以由无需信号序列的基本P24载体表达IL-10R拮抗剂肽或抗IL-10单结构域抗体以用于在质外体或细胞质中积累表达产物。可以将上述所有那些以及具有类似功能的其他信号序列添加至基本植物表达载体或从中除去。上述信号序列可以在本文档末尾的“序列表”中找到。
[0215] 实施例5.在转基因玉米中表达IL-10R拮抗剂肽的额外策略
[0216] 肽的连接
[0217] 该策略代表了嵌合IL-10R拮抗剂序列的表达，该序列含有编码IL-10R拮抗剂肽的DNA序列的多个连续连接的拷贝。连接体中的肽编码序列可以直接彼此融合，也可以通过中间序列(例如AGPA铰链)分开以稳定表达嵌合分子。表4中提供了8个氨基酸长的肽P25的连接肽序列可能变体的例子。可以将每个P25连接体作为DNA分子合成并克隆到任意P24基本表达载体中，从而有效地替代了P24编码序列以用于随后在玉米中表达。以这种方式，可以开发新型玉米转化载体(例如pAG4306)，其中，由水稻GluB4启动子将P2509连接体表达到ER中，该连接体由三个被AGPA铰链分开的P25单元组成。P2509的核苷酸序列可以在“序列表”部分获得。可以使用类似的方法来表达表2中所列的所有其他短或所有IL-10R拮抗剂肽。
[0218] 表4.用于在玉米中表达的P25IL-10R拮抗剂肽和连接体的例子
[0219]
[0220] 基因融合
[0221] 在植物中表达IL-10R拮抗剂肽的另一种策略可以采用嵌合扩增或基因融合方法。在这种策略中，靶标肽可以表达为例如与玉米γ-玉米醇溶蛋白27kDa部分的嵌合融合体。
该策略用于表达Zeolin和Zera融合蛋白(Mainieri等，2007；美国专利号8802825；Llop-Tous，2010，通过引用将其全部内容并入本文)。作为γ-玉米醇溶蛋白融合体的靶标序列的共表达允许在ER衍生的蛋白体中的高水平蛋白积累。可以借助于接头序列(例如接头
GSGGSG(SEQ ID NO：41))将选择表达的IL-10R拮抗剂肽序列与玉米γ-玉米醇溶蛋白序列融合。也可以利用额外的接头序列，例如与zeolin融合蛋白(GGGGS；SEQ ID NO：42)、Zera融合体(GGGGG；SEQ ID NO：43)类似的那些接头或其他接头(表5)。所有IL-10R拮抗剂肽均可在有或没有C末端序列(例如KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、HvVSD或其他此类序列)下表达。此外，作为嵌合蛋白扩增的融合组分的γ-玉米醇溶蛋白序列可以替代其他蛋白序列，例如用于将人IL-10的弹性蛋白样多肽(ELP)(Urry，
1992)在烟草中表达(Patel等，2007)或用于在烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时蛋白表达的疏水蛋白(Joensuu等，2010；Jacquet等，2014)。当使用后两种方法中的任意一种时，所表达的蛋白融合体形成蛋白体。用载体pAG4308和pAG4310代表两个用作表达与玉米γ-玉米醇溶蛋白组分融合的P2509连接体例子的构建体。pAG4311载体是将P2509表达为与28×VPGVG(SEQ ID NO：44)弹性样多肽的融合体的例子(Conley等，2009)。ELP融合伴侣中可变数量的重复和序列(例如VPGXG)可以用于表达IL-10R拮抗剂肽。可以通过重组蛋白的非色谱生物分离将ELP融合蛋白纯化(Lin等，2006)。pAG4312构建体提供了表达与里氏木霉(Trichoderma reesei)HFBI疏水蛋白的成熟链融合的P2509肽(GenBank登录号P52754.1)的例子。可以通过基于表面活性剂的高效水性两相系统(ATPS)将疏水蛋白融合体纯化
(Joensuu等，2010)。还可以利用IL-10R拮抗剂肽的其他融合伴侣，例如将P2509与存在于载体pAG4313中的热稳定的葡聚糖酶融合。
该策略用于表达Zeolin和Zera融合蛋白(Mainieri等，2007；美国专利号8802825；Llop-Tous，2010，通过引用将其全部内容并入本文)。作为γ-玉米醇溶蛋白融合体的靶标序列的共表达允许在ER衍生的蛋白体中的高水平蛋白积累。可以借助于接头序列(例如接头
GSGGSG(SEQ ID NO：41))将选择表达的IL-10R拮抗剂肽序列与玉米γ-玉米醇溶蛋白序列融合。也可以利用额外的接头序列，例如与zeolin融合蛋白(GGGGS；SEQ ID NO：42)、Zera融合体(GGGGG；SEQ ID NO：43)类似的那些接头或其他接头(表5)。所有IL-10R拮抗剂肽均可在有或没有C末端序列(例如KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)、SEKDEL(SEQ ID NO：31)、HvVSD或其他此类序列)下表达。此外，作为嵌合蛋白扩增的融合组分的γ-玉米醇溶蛋白序列可以替代其他蛋白序列，例如用于将人IL-10的弹性蛋白样多肽(ELP)(Urry，
1992)在烟草中表达(Patel等，2007)或用于在烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时蛋白表达的疏水蛋白(Joensuu等，2010；Jacquet等，2014)。当使用后两种方法中的任意一种时，所表达的蛋白融合体形成蛋白体。用载体pAG4308和pAG4310代表两个用作表达与玉米γ-玉米醇溶蛋白组分融合的P2509连接体例子的构建体。pAG4311载体是将P2509表达为与28×VPGVG(SEQ ID NO：44)弹性样多肽的融合体的例子(Conley等，2009)。ELP融合伴侣中可变数量的重复和序列(例如VPGXG)可以用于表达IL-10R拮抗剂肽。可以通过重组蛋白的非色谱生物分离将ELP融合蛋白纯化(Lin等，2006)。pAG4312构建体提供了表达与里氏木霉(Trichoderma reesei)HFBI疏水蛋白的成熟链融合的P2509肽(GenBank登录号P52754.1)的例子。可以通过基于表面活性剂的高效水性两相系统(ATPS)将疏水蛋白融合体纯化
(Joensuu等，2010)。还可以利用IL-10R拮抗剂肽的其他融合伴侣，例如将P2509与存在于载体pAG4313中的热稳定的葡聚糖酶融合。
[0222] 表5.用于开发蛋白融合体的接头序列
[0223]
[0224] 实施例6.针对IL-10的单结构域抗体的产生
[0225] 通过用全长纯化的重组cIL-10(IBI Scientific，Peosta IA)免疫美洲驼产生对cIL-10具有亲和力的骆驼科动物单结构域抗体(sdAB；也称为VHH抗体)。与单个cIL-10肽相反，选择全长IL-10，因为cIL-10与美洲驼IL-10同源体只有48％相同。此前未知的是cIL-10是否会在美洲驼中产生足够的免疫应答，但是鉴于有限的序列同一性，cIL-10用于测试美洲驼是否 并且全长分子可以用于产生足够的免疫应答。此外，已知IL-10会二聚化，因此使用全长分子会使产生的抗体偏向二聚化分子中存在的表位。除非通过注射分离的或重组的cIL-10，否则美洲驼不会暴露于cIL-10，这提供了一种产生抗cIL-10抗体的新型工艺。在注射cIL-10之前，从单个美洲驼收集免疫前血清。在完全弗氏佐剂(CFA)存在下用200μg cIL-10进行首次免疫。随后在初次免疫后三周、七周和十一周，在不完全弗氏佐剂(IFA)存在下分别用100μg cIL-10进行随后的加强免疫。每次加强免疫后一周，从动物收集血液样品(“血样”)。图3示出了在给予cIL-10之前(免疫前)和之后的美洲驼免疫应答。
[0226] 如图3所示，通过ELISA使用每个血样评估在该免疫过程期间动物中靶向cIL-10抗体的生产，然后将血样用于开发单结构域抗体。鸡和美洲驼IL-10同源物的比对显示48％同一性(68％类似性)。sdAB的制备已在其他地方进行描述(Goldman等，2006；Arbabi Ghahroudi等，1997；Liu等，2013)。简而言之，从免疫方案的第8周和第12周期间收集的血样中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。从PBMC中纯化RNA并用于创建噬菌粒cDNA文库以表达和筛选sdAB。值得注意的是，sdAB仅代表用重组cIL-10注射宿主时来自所产生的美洲驼抗体的重链可变区(VHH)，因此sdAB的源自RNA的DNA编码序列代表通过自然界中不存在的新型过程产生的合成核苷酸。将针对纯化重组cIL-10的两轮淘选用于富集与抗原具有亲和力的sdAB噬菌体展示文库。从经富集的文库中产生、分离和测序单个克隆。图4示出了抗IL-
10sdAB筛选和测序的结果。图4证明了分离的sdAB氨基酸序列位于四个不同的组中，具有第五个杂类组(miscellaneous group)。互补决定区(CDR)标示在图4中。
10sdAB筛选和测序的结果。图4证明了分离的sdAB氨基酸序列位于四个不同的组中，具有第五个杂类组(miscellaneous group)。互补决定区(CDR)标示在图4中。
[0227] 实施例7.抗IL-10sdAbEC50的测定和热稳定性
[0228] 通过ELISA测定，评估了候选sdAB对纯化cIL-10的表观结合亲和力。在cIL-10ELISA平板上温育不同浓度的单个分离的sdAB，信号增加表明sdAB与cIL-10结合水平更高。通过确定观察到最大信号50％的sdAB浓度来估计表观EC50值。图5示出了所选的候选sdAB与鸡IL-10的ELISA测定和表观结合亲和力。在所测试的候选中，chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)、chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146)和chIL10sdAB1B9(SEQ ID NO：111)具有小于100nM的EC50值，其评估值分别为1nM、15nM和35nM。另一种sdAB，chIL10sdAB1D6(SEQ ID NO：143)具有100nM的EC50评估值。以这种方式评估其他sdAB的EC50值，其包括具有20nM的EC50值的chIL10sdAB1H1(SEQ ID NO：89)。由于通过较低的EC50值反映较高的结合亲和力，因此选择具有较低EC50值和更多差异序列的sdAB进行进一步评价和开发。
[0229] 尽管认为sdAB对其抗原靶标具有高特异性，并且不与非特异性肽强烈结合，但通常需要证明对单个表位或肽的结合特异性。使用全长chIL-10蛋白制得sdAB，然而也可以在本文的方法中使用单个肽。同样地，反向筛选与全长chIL-10结合但对特异性肽几乎没有或没有亲和力的sdAB也用于鉴定与所需抗原肽结合而不与其他抗原肽结合的sdAB。可以使用几种不同的方法进行反向筛选，包括ELISA或斑点印迹法，其中，将用于反向筛选的肽固定在表面上，并将抗cIL-10sdAB温育以使其结合，洗涤以除去未结合的sdAB，然后与标记的抗美洲驼抗体温育以检测结合的sdAB。还可以进一步开发不结合用于反向筛选的固定肽但仍结合全长IL-10的sdAB，确信它们拥有所需的结合标准。用于反向筛选的一些肽包括：DDELNIQL[肽1；SEQ ID NO：180]、VLPRAMQT[肽2；SEQ ID NO：181]、EKMDENGI[肽3；SEQ ID NO：182]、EPTCLHFS[肽4；SEQ ID NO：183]、DQMGDLL[肽5；SEQ ID NO：184]、DQLHSLL[肽6；
SEQ ID NO：185]、VMPKAESD[肽7；SEQ ID NO：186]、VMPQAENH[肽8；SEQ ID NO：187]、SKLQERGV[肽9；SEQ ID NO：188]、SELQERGV[肽10；SEQ ID NO：189]、ENSCIHFP[肽11；SEQ ID NO：190]、DSSCIHLP[肽12；SEQ ID NO：191]、DQLNSML[肽13；SEQ ID NO：192]、NMLQERGV[肽
14；SEQ ID NO：193]、DSSCTHFP[肽15；SEQ ID NO：194]、DDLEIGL[肽16；SEQ ID NO：195]、VLPTAIADMTEE[肽17；SEQ ID NO：196]、TQMEGKGP[肽18；SEQ ID NO：197]和NQCCRFV[肽19；
SEQ ID NO：198]。
SEQ ID NO：185]、VMPKAESD[肽7；SEQ ID NO：186]、VMPQAENH[肽8；SEQ ID NO：187]、SKLQERGV[肽9；SEQ ID NO：188]、SELQERGV[肽10；SEQ ID NO：189]、ENSCIHFP[肽11；SEQ ID NO：190]、DSSCIHLP[肽12；SEQ ID NO：191]、DQLNSML[肽13；SEQ ID NO：192]、NMLQERGV[肽
14；SEQ ID NO：193]、DSSCTHFP[肽15；SEQ ID NO：194]、DDLEIGL[肽16；SEQ ID NO：195]、VLPTAIADMTEE[肽17；SEQ ID NO：196]、TQMEGKGP[肽18；SEQ ID NO：197]和NQCCRFV[肽19；
SEQ ID NO：198]。
[0230] 进行内部热稳定性筛选以确定sdAB的耐热性，这对于它们在动物饲料加工中的使用可能重要的。特别地，在动物饲料制粒过程中，热稳定性是非常需要的性质，其中，根据特异性工艺和所用的制粒设备，分子可能会暴露在70℃以上和最高125℃的温度下。为了评估热稳定性，通过在70℃、75℃、80℃、85℃和90℃下温育sdAB 30秒、60秒、90秒、120秒、300秒和600秒，然后使其平衡至室温，从而制得热处理的sdAB。将对照sdAB在37℃或室温下温育与热处理的sdABs相同的时间段，并使其平衡至室温。然后通过ELISA比较对照(37℃或室温处理)和处理(在70℃和90℃之间加热不同时间的那些sdAB)sdAB的EC50值。用热处理的sdAB和对照sdAB的EC50值之比表示的热稳定性介于30％至90％之间，较高的热稳定性值与较低的温度和较短的暴露时间相关。
[0231] 实施例8.抗IL-10sdAb的胃稳定性
[0232] 模拟胃液(SGF)由0.084M HCl、35mM NaCl组成，pH 1.2，每毫升含有2630单位胃蛋白酶。反应终止溶液是200mM的碳酸钠。待测蛋白样品在贮存缓冲液(50mM MES、150mM NaCl、40％(v/v)甘油，pH 6.3)中的浓度达到5mg/mL，该蛋白样品包括牛血清白蛋白(BSA)、chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)、chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146)、chIL10sdAB1H1(SEQ ID NO：89)、chIL10sdAB1B9(SEQ ID NO：111)、chIL10sdAB1D6(SEQ ID NO：143)、chIL10sdAB1E11(SEQ ID NO：142)、chIL10sdAB1F7(SEQ ID NO：121)、chIL10sdAB1F9(SEQ ID NO：141)和chIL10sdAB2A8(SEQ ID NO：140)。
[0233] 将单结构域抗体样品(2.5μL)分配到200μL薄壁PCR管中并在设置为37℃的PCR热循环仪上预热。将SGF等分试样(100μL)放入PCR管中并预热。对于0分钟的消化样品，在添加SGF之前将17.5μL终止溶液添加到蛋白样品中。通过向sdAB样品中添加47.5μL预热的SGF来开始消化。1分钟、2分钟、5分钟、10分钟和30分钟后，通过添加17.5μL终止溶液来终止反应。将SDS-PAGE上样缓冲液(17.5μL；ThermoFisher目录号NP0007，添加二硫苏糖醇至浓度约为
50mM)添加到每个样品中。在70℃加热10分钟后，将15μL的每个上样到蛋白电泳凝胶
(ThermoFisher目录号NP0321或类似产品)上，并按照制造商的指示进行电泳。然后使用标准方法用考马斯蓝染料将凝胶染色。0和10分钟时间点的结果示于图6中。在该图中，泳道1-分子量标准；泳道2-仅胃蛋白酶；泳道3-BSA 0分钟；泳道4-BSA 10分钟；泳道5-1A11 0分钟；泳道6-1A11 10分钟；泳道7-1F11 0分钟；泳道8-1F11 10分钟；泳道9-1H1 0分钟；泳道
10-1H1 10分钟；泳道11-1B9 0分钟；泳道12-1B9 10分钟；泳道13-分子量标准；泳道14-1D6
0分钟；泳道15-1D6 10分钟；泳道16-1E11 0分钟；泳道17-1E1110分钟；泳道18-1F7 0分钟；
泳道19-1F7 10分钟；泳道20-1F9 0分钟；泳道21-1F9 10分钟；泳道22-2A8 0分钟；泳道23-
2A8 10分钟和泳道24-仅胃蛋白酶。图6示出正如所有测试的sdAB一样，BSA在10分钟内的SGF消化中会显著降解。鉴于sdAB的内在快速消化能力，出乎预料的是，当给予到饲料中时，sdAB在控制球虫病和结合IL-10方面表现良好。可能预计SGF的快速消化将导致sdAB在控制球虫病中表现不佳，因为它们应迅速降解，因此结合IL-10和阻断IL-10信号传导的能力有限。鉴于本文所述的sdAB在控制球虫病中是有效的，这表明胃稳定性不是口服抗体给药的主要因素，而是有益的特性，因为在SGF中快速降解的蛋白比在SGF中稳定的蛋白具有较低的变应原性风险。鉴于sdAB的热稳定性提高(参见上面实施例1的讨论)，开发的sdAB易于被胃蛋白酶消化是不寻常的，因为普遍认为sdAB所证明的高热稳定性与高SGF稳定性相关，这与已开发的抗IL-10sdAB的可测消化能力相反。本文开发的抗IL-10sdAB具有良好的热稳定性，并易于在胃蛋白酶中被消化，这是支持产品性能和安全特征的属性，有助于其法规评估和最终的客户接受度。
50mM)添加到每个样品中。在70℃加热10分钟后，将15μL的每个上样到蛋白电泳凝胶
(ThermoFisher目录号NP0321或类似产品)上，并按照制造商的指示进行电泳。然后使用标准方法用考马斯蓝染料将凝胶染色。0和10分钟时间点的结果示于图6中。在该图中，泳道1-分子量标准；泳道2-仅胃蛋白酶；泳道3-BSA 0分钟；泳道4-BSA 10分钟；泳道5-1A11 0分钟；泳道6-1A11 10分钟；泳道7-1F11 0分钟；泳道8-1F11 10分钟；泳道9-1H1 0分钟；泳道
10-1H1 10分钟；泳道11-1B9 0分钟；泳道12-1B9 10分钟；泳道13-分子量标准；泳道14-1D6
0分钟；泳道15-1D6 10分钟；泳道16-1E11 0分钟；泳道17-1E1110分钟；泳道18-1F7 0分钟；
泳道19-1F7 10分钟；泳道20-1F9 0分钟；泳道21-1F9 10分钟；泳道22-2A8 0分钟；泳道23-
2A8 10分钟和泳道24-仅胃蛋白酶。图6示出正如所有测试的sdAB一样，BSA在10分钟内的SGF消化中会显著降解。鉴于sdAB的内在快速消化能力，出乎预料的是，当给予到饲料中时，sdAB在控制球虫病和结合IL-10方面表现良好。可能预计SGF的快速消化将导致sdAB在控制球虫病中表现不佳，因为它们应迅速降解，因此结合IL-10和阻断IL-10信号传导的能力有限。鉴于本文所述的sdAB在控制球虫病中是有效的，这表明胃稳定性不是口服抗体给药的主要因素，而是有益的特性，因为在SGF中快速降解的蛋白比在SGF中稳定的蛋白具有较低的变应原性风险。鉴于sdAB的热稳定性提高(参见上面实施例1的讨论)，开发的sdAB易于被胃蛋白酶消化是不寻常的，因为普遍认为sdAB所证明的高热稳定性与高SGF稳定性相关，这与已开发的抗IL-10sdAB的可测消化能力相反。本文开发的抗IL-10sdAB具有良好的热稳定性，并易于在胃蛋白酶中被消化，这是支持产品性能和安全特征的属性，有助于其法规评估和最终的客户接受度。
[0234] 实施例9.鸡IL-10配体受体测定和sdAB IC50测量
[0235] 开发测定法以测量sdAB如何结合其靶标cIL-10并防止cIL-10与其受体结合。表达cIL-10受体的可溶性结构域并将其固定在biacore探针的表面上。然后将其与cIL-10以及sdAB和cIL-10的不同混合物温育，并通过表面等离子体共振测量cIL-10与cIL-10受体的可溶性结构域的结合。
[0236] 通过将人IL-10Rα受体亚基的氨基酸序列(UniProtKB/SwissProt登录号Q13651)与类似的鸡IL-10受体亚基1(NCBI参考序列NP_001034686)比对推导出了鸡白介素-10受体亚基1(cIL-10R1)的可溶性结构域的氨基酸序列。
[0237] 对于该测定法，合成了编码鸡受体可溶性结构域(残基22-231)的基因，作为通过与由IEGRMD[SEQ ID NO：199]组成的接头连接的人IgG1Fc结构域(UniProtKB/SwissProt登录号P01857的残基100-330)的上游融合体(包含与融合至Fc残基100-330的IEGRMD[SEQ ID NO：199]融合的cIL-10R1的最终总体表达分子将被称为“cIL-10R1-Fc”)。可以将cIL-10R1-Fc直接固定以促进在biacore仪器上的表面等离子体共振结合测定。为了产生cIL-10R1-Fc，将编码cIL-10R1-Fc的基因通过EcoRI和NotI限制性位点克隆到pGAPZαB(ThermoFisher)中。按照pGAPZαB说明书手册中的指导用质粒转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115。使用分批补料方案在2.5L发酵罐中生长高表达克隆。分批阶段的生长培养基由1.5L的20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、13.4g/L酵母氮基、10g/L酪蛋白氨基酸、10g/L甘油和
100mM磷酸二氢钠组成。将温度保持在28℃，通过添加50％氢氧化铵将pH值保持在6.0，并将溶解氧(pO2)保持在30％。甘油耗尽后，如溶解氧的尖峰所示，将温度降低至25℃，并启动进料750mL的100g/L葡萄糖、50g/L蛋白胨、25g/L酵母提取物、10g/L酪蛋白氨基酸、0.5％(v/v)消泡剂204和100μg/mL zeocin。
100mM磷酸二氢钠组成。将温度保持在28℃，通过添加50％氢氧化铵将pH值保持在6.0，并将溶解氧(pO2)保持在30％。甘油耗尽后，如溶解氧的尖峰所示，将温度降低至25℃，并启动进料750mL的100g/L葡萄糖、50g/L蛋白胨、25g/L酵母提取物、10g/L酪蛋白氨基酸、0.5％(v/v)消泡剂204和100μg/mL zeocin。
[0238] 通过离心分离培养物上清液并通过0.22μm过滤器无菌过滤。通过添加0.5体积的3M硫酸铵、20mM Tris.HCl、1mM EDTA，pH 8使上清液存在于1M硫酸铵中。过滤后，通过疏水相互作用色谱(苯基琼脂糖凝胶，Phenyl Sepharose)、亲和色谱(蛋白G琼脂糖凝胶，
Protein G Sepharose)、阴离子交换色谱(MonoQ)和尺寸排阻色谱纯化受体融合体。
Protein G Sepharose)、阴离子交换色谱(MonoQ)和尺寸排阻色谱纯化受体融合体。
[0239] 鸡IL-10获取自Kingfisher Biotech公司。将融合C末端myc标签和his标签的骆驼科动物VHH结构域在大肠杆菌(E.coli)中表达，其表达通过N末端信号肽定位至周质空间。通过渗透休克从周质中提取蛋白，然后通过金属螯合色谱和尺寸排阻色谱纯化。使用由氨基酸序列计算的消光系数，通过测量在280nm处的吸光度来确定蛋白浓度。
[0240] 使用BIAcore T200表面等离子体共振仪(GE Healthcare)测量亲和力和抑制力。按照制造商的指导使用EDC/NHS化学法将约7000个应答单元的cIL-10R1-Fc融合体共价偶联至CM5传感器芯片。所有实验均在37℃的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％[v/v]Tween-20，pH 7.4)中进行。通过在传感器芯片上以20μL/秒注射五种浓度的cIL-10 120秒来确定cIL-10与固定的cIL-10R1-Fc的结合亲和力(Kd)。解离300秒后，在进行下次注射之前，用10mM乙酸钠、0.5mM EDTA、pH 4的10秒脉冲，随后进行120秒稳定化阶段以再生传感器芯片。使用BIAcore评估软件计算每种cIL-10浓度的最大结合物质
(Rmax)。相对于cIL-10浓度绘制Rmax值并拟合矩形双曲线方程以计算Kd。
(Rmax)。相对于cIL-10浓度绘制Rmax值并拟合矩形双曲线方程以计算Kd。
[0241] 通过将10nM cIL-10与六种浓度的各sdAB在HBS-EP中预温育至少20分钟然后如上所述注射到传感器芯片上来测量sdAB对cIL-10与cIL-10R1-Fc结合的抑制。相对于sdAB浓度绘制每种sdAB浓度的计算Rmax值以确定IC50值。
[0242] 图7示出了测量的chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)和chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146)的抗IL-10sdAb IC50值。
[0243] 实施例10.基于细胞的测定法测量经刺激的原代鸡脾细胞中cIL-10对干扰素γ(IFN-γ)产生的生物学活性和抗IL-10sdAB对cIL-10的抑制
[0244] 已知IL-10是有效的免疫系统调节剂，其可影响许多细胞类型并通常起到减弱炎症和免疫应答的作用(Kevin N.Couper,Daniel G.Blount,Eleanor M.Riley“, IL-10:The Master Regulator of Immunity to Infection”The Journal of Immunology,180:5771-5777,2008)。将原代鸡脾细胞用于评估sdAB在相关靶标细胞类型的细胞信号传导中阻断IL-10生物学活性的用途。开发了一种基于细胞的测定法以研究cIL-10对鸡脾细胞中干扰素γ(IFN-γ)产生的伴刀豆球蛋白A(ConA)依赖性诱导(或者植物血凝素(PHA)依赖性诱导，两种刺激物均对这些细胞起作用)的抑制作用(Wu等(2016)和Rothwell等(2004))。简而言之，通过用Ficoll-Hypaque进行差速离心从鸡脾中分离淋巴细胞和单个核细胞。在有cIL-10(浓度为0-25mg/mL)和无cIL-10下，在存在1.2μg/mL ConA(或者12.5μg/mL PHA)下将新鲜分离的细胞以5×106个细胞/mL在96孔平板的孔中培养72小时。通过ELISA确定了经处理的细胞上清液中的IFN-γ水平。图8显示在没有ConA、没有cIL-10的ConA以及0.39或
1.56或6.25或25ng/mL cIL-10的ConA下细胞的IFN-γ应答。如图8所示，IL-10抑制原代鸡脾细胞中ConA诱导的IFN-γ分泌。图8还显示脾细胞对chIL-10的IFN-γ产生具有剂量依赖性应答，因为增加cIL-10以剂量依赖性的方式降低了IFN-γ的产生。
1.56或6.25或25ng/mL cIL-10的ConA下细胞的IFN-γ应答。如图8所示，IL-10抑制原代鸡脾细胞中ConA诱导的IFN-γ分泌。图8还显示脾细胞对chIL-10的IFN-γ产生具有剂量依赖性应答，因为增加cIL-10以剂量依赖性的方式降低了IFN-γ的产生。
[0245] 为了测试sdAB在中断cIL-10刺激的IFN-γ产生中的有效性如何，在有或没有不同浓度的sdAB(范围从0.1nM至10μM，有ConA以及有或没有cIL-10)下温育鸡原代脾细胞。通过ELISA确定培养上清液中IFN-γ的水平。作为对照处理，这些研究包括仅用5μg/mL ConA处理的脾细胞(IFN-γ产生的阳性对照)、用5μg/mL ConA和1.5ng/mL cIL-10处理的细胞(cIL-10抑制ConA依赖性IFN-g产生的阳性对照)以及用5μg/mL的ConA、1.5μg/mL的cIL-10和抗IL-10多克隆抗体(“aIL10pAb”，阳性对照抗体)或不结合cIL-10的非特异性sdAB(“aMOP pAb(NC)”，用于证明非特异性结合不能提供与特异性结合cIL-10的抗体所观察到的相同效果的阴性对照抗体)处理的细胞。实验处理含有5μg/mL ConA、1.5ng/mL cIL-10和不同浓度的抗IL-10sdAB。在这些实验中，分别以1nM、30nM和1000nM给予sdAB。
[0246] 图9示出了抗IL-10抗体(chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)、chIL10sdAB1B9(SEQ ID NO：111)、chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146))对原代鸡脾细胞中IFN-γ分泌的影响。根据这些结果，测得的chIL10sdAB1A11(SEQ ID NO：135)、chIL10sdAB1B9(SEQ ID NO：111)、chIL10sdAB1F11(SEQ ID NO：146)的表观EC50值分别为25nM、40nM和60nM，尽管高于测得的抗IL-10sdAB与cIL-10结合的EC50和IC50值，但它们仍与这些值相对一致，进一步证明了抗IL-10sdAB在阻断IL-10信号传导和降低免疫系统抑制中的生物学功效。
[0247] 实施例11.抗IL-10单结构域抗体的植物表达
[0248] 在使用烟草的瞬时表达和转基因玉米事件中证明抗体表达。其他可以用于表达抗IL-10sdAB的植物物种包括水稻、高粱、大豆和油菜。根据最终产品和预期用途，特定的植物物种可能比其他物种更适合生产。
[0249] 含有用于在玉米中表达的抗IL-10sdAb序列的表达盒包括在表6中。在表6中，一些载体含有单个表达盒，而其他载体含有多个表达盒，这通常有助于增加sdAB的表达。表6所列的表达盒中含有的各个鸡抗IL-10sdAB的DNA序列已针对玉米基因表达进行了密码子优化，然而，当需要不同的表达宿主时，可以对其他植物(或微生物)物种进行基因优化以改善其表达。
[0250] 表6.用于表达鸡抗IL-10sdAB的植物表达载体：
[0251]
[0252] 图10A是载体pAG4314的示意图，该载体包括抗IL-10sdAB单个表达盒(OsGluB4P：xGZein27ss：chIL10sdAB1A11A：KDEL)和用于在植物中筛选的PMI表达盒。图10B是载体pAG4988的示意图，该载体通过包括两个相同的抗IL-10sdAB表达盒(ZmZ27P：xGZein27ss：
chIL10sdAb1A11A：KDEL+OsGluB4P：xGZein27ss：chIL10sdAB1A11A：KDEL)来增加转基因剂量。载体pAG4988也包括用于在植物组织中筛选的PMI表达盒。下面以每个序列均以右边界重复开始且以左边界重复结束的方式提供表中所列载体的T-DNA序列。
chIL10sdAb1A11A：KDEL+OsGluB4P：xGZein27ss：chIL10sdAB1A11A：KDEL)来增加转基因剂量。载体pAG4988也包括用于在植物组织中筛选的PMI表达盒。下面以每个序列均以右边界重复开始且以左边界重复结束的方式提供表中所列载体的T-DNA序列。
[0253] 用于所选鸡IL10sdAb的推导的蛋白序列具有玉米γ玉米醇溶蛋白27信号序列和KDEL信号序列，这两个序列分别位于该蛋白的N末端和C末端并加下划线。
[0254] 由植物表达盒编码的chIL10sdAB蛋白序列
[0255]
[0256] 将载体和核苷酸序列中编码chIL10sdAB1A11、chIL10sdAB1F11和chIL10sdAB1H1抗体的核苷酸序列分别命名为1A11A(chIL101A11A)、1F11A(chIL101F11A)和1H1A(chIL101H1A)以反映随使用密码子改变的不同编码序列。进行这种修饰是为了避免将来由于用于玉米表达的玉米密码子优化序列的不同变体(例如“变体A”和“变体B”)的可用性而可能造成的混淆。由变体“A”和“B”编码的推导蛋白序列是相同的。
[0257] 所选chIL10sdAB的玉米密码子优化变体“A”和“B”的核苷酸序列比对：
[0258]
[0259]
[0260] 表7.“A”和“B”变体之间核苷酸序列同一性的百分比
[0261]
[0262] 可以将编码抗IL10抗体的任意多核苷酸克隆在本文所述的植物表达载体(表6)中的所需启动子和终止子序列之间以便产生表达盒。另外，可以用其他信号序列代替氨基末端(N)信号序列(例如玉米表达载体中的xGZein27ss)以便将抗IL-10抗体的特异性表达和积累调节至所需水平。N末端信号序列包括但不限于例如OsGluB4sp(水稻GluB-4谷蛋白信号肽)、BAASS(大麦α淀粉酶信号序列)或PR1(致病相关蛋白)。可以使用羧基末端(C)保留信号序列(例如KDEL(SEQ ID NO：29)、HDEL(SEQ ID NO：30)或SEKDEL(SEQ ID NO：31))将抗IL-10抗体表达至内质网(ER)以改善积累和潜在糖基化。此外，可以表达抗IL10抗体并借助于连接到序列N末端或C末端部分的信号序列定向至蛋白质贮存液泡。这些贮存液泡信号序列包括来自大麦糊粉的HvAle(硫醇蛋白酶)或来自大麦多胺氧化酶的HvVSD。如有需要，还可以用无信号序列的表达载体表达抗IL-10抗体以用于在质外体、叶绿体或细胞质中积聚表达产物。可以将上述所有遗传元件(包括具有类似功能的其他信号序列)添加至基本植物表达载体或从中除去以定制抗IL-10sdAB的表达性质。图11示出了使用本文所述的遗传元件可以在玉米籽粒中高水平表达sdAB。在图11中，从半合子亲本的单个种子中提取玉米中表达的sdAB，其中，50％的种子含有表达盒，而50％的种子不含表达盒。在图11中，对来自两个不同转基因事件的单个种子进行基因分型并通过SDS-PAGE电泳和考马斯染色分析表达的sdAB的存在。如图11所示，sdAB的存在与基因分型结果完全相关，即仅通过PCR对基因测试为阳性的种子产生了正确大小的sdAB蛋白带。此外，事件1中sdAB的表达水平估计为每克玉米籽粒3mg，而完全纯合事件将导致每克玉米9mg sdAB的表达水平。使用本文所述的表达盒和遗传元件观察到重组蛋白(包括sdAB)的表达水平高达每克玉米籽粒21mg。
[0263] 实施例12.鸡IL10sdAb 1A11在烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的瞬时表达
[0264] 植物中的瞬时蛋白表达已被多个研究小组用于生产治疗性蛋白和疫苗抗原。在各种植物物种中，烟草Nicotiana benthamiana是最合适的生产宿主之一，因为它可以通过使用叶浸润程序在短时间内实现高水平的蛋白表达。这种生产属性是经济地生产异源蛋白所需的。
[0265] 遗传元件和载体的构建
[0266] 为了在烟草(N.benthamiana)中表达，将鸡IL-10sdAb 1A11(在本文中称为Nb1A11；SEQ ID NO：202)序列进行密码子优化以用于烟草(Nicotiana)密码子使用，并用GenScript合成为868bp的NcoI-AvrII DNA片段(在5'末端含有编码转运肽的90bp烟草PR1a基因序列[SEQ ID NO：205]、在Nb1a11编码区中含有304bp拟南芥(Arabidopsis)泛素10基因(AtUBQ10i)的第一内含子，在3'末端含有myc标签、6xHis和KDEL序列[SEQ ID NO：206])或不具有AtUBQ10i内含子的564bp NcoI-AvrII片段。Nb1A11：AtUBQ10i序列如下显示为SEQ ID NO：203，内含子序列用粗体表示并加下划线。
[0267]
[0268] 将AtUBQ10i插入到核苷酸124和125之间的Nb1A11编码区中以用于双重目的：1)监测来自植物细胞而非来自农杆菌的Nb1A11的表达；2)潜在地增强烟草中Nb1A11的表达，因为异源内含子对植物和其他物种的基因转录的积极影响已在文献中充分记载("Introns increase gene expression in cultured maize cells,"J.Callis,M.Fromm,V.Walbot,Genes Dev.,1:1183-1200,1987；doi:10.1101/gad.1.10.1183；"Increased Gene Expression by the First Intron of Maize Shrunken-1Locus in Grass Species,"
V.Vasil,M.Clancy,R.J.Ferl,I.K.Vasil,L.C.Hannah,Plant Physiol.91:1575-1579,
1989；"Intron-mediated enhancement as a method for increasing transgene
expression levels in barley,"J.G.Bartlett,J.W.Snape,W.A.Harwood,Plant
Biotechnology Journal,7:856-866,2009，通过引用将其全部内容并入本文)。包括myc标签和6xHis的序列以促进Nb1A11sdAB的检测和纯化。添加KDEL序列以将表达的1A11sdAb保留在内质网(ER)中而提高蛋白的积累水平。为了在烟草中瞬时表达Nb1A11sdAB，使用新型和以前未表征的组成型泛素1基因启动子(prNbUbi1)。prNbUbi1序列在下面显示为SEQ ID NO：204，其中内含子序列的序列用粗体表示并加下划线。
V.Vasil,M.Clancy,R.J.Ferl,I.K.Vasil,L.C.Hannah,Plant Physiol.91:1575-1579,
1989；"Intron-mediated enhancement as a method for increasing transgene
expression levels in barley,"J.G.Bartlett,J.W.Snape,W.A.Harwood,Plant
Biotechnology Journal,7:856-866,2009，通过引用将其全部内容并入本文)。包括myc标签和6xHis的序列以促进Nb1A11sdAB的检测和纯化。添加KDEL序列以将表达的1A11sdAb保留在内质网(ER)中而提高蛋白的积累水平。为了在烟草中瞬时表达Nb1A11sdAB，使用新型和以前未表征的组成型泛素1基因启动子(prNbUbi1)。prNbUbi1序列在下面显示为SEQ ID NO：204，其中内含子序列的序列用粗体表示并加下划线。
[0269]
[0270] 通过筛选叶组织泛素基因转录物最丰富的烟草表达序列标签(EST)数据库来鉴定该启动子。该数据库由烟草(Nicotiana benthamiana)基因组和转录组测序联盟维护(http://benthgenome.qut.edu.au/；Nakasugi K,Crowhurst RN,Bally J,Wood CC,
Hellens RP,Waterhouse PM(2013)De Novo Transcriptome Sequence Assembly and
Analysis of RNA Silencing Genes oi Nicotiana benthamiana.PLoS ONE 8(3):
e59534.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059534，通过引用将其全部内容并入本文)。与其他泛素相关的转录物相比，被标注为推定泛素1的转录物Nbv6.1trP26199似乎含有显著更多的EST(1196)。已在烟草基因组序列草图(v1.0.1)中鉴定了Nbv6.1trP26199特异性1466bp上游基因组序列(包括位于3'UTR的128bp内含子)，该序列草图可从博伊斯·汤普森植物研究所(Boyce Thompson Institute for Plant Research)的Sol Genomics Network获得(https://solgenomics.net/organism/Nicotianajbenthamiana/genome；
Bombarely,A.,H.G.Eosli,J.Vrebalov,P.Moffett,L.A.Mueller,and G.B.Martin(2012).A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research.Molecular Plant-Microbe Interactions 25:1523-1530，通过引用将其全部内容并入本文)。
Hellens RP,Waterhouse PM(2013)De Novo Transcriptome Sequence Assembly and
Analysis of RNA Silencing Genes oi Nicotiana benthamiana.PLoS ONE 8(3):
e59534.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059534，通过引用将其全部内容并入本文)。与其他泛素相关的转录物相比，被标注为推定泛素1的转录物Nbv6.1trP26199似乎含有显著更多的EST(1196)。已在烟草基因组序列草图(v1.0.1)中鉴定了Nbv6.1trP26199特异性1466bp上游基因组序列(包括位于3'UTR的128bp内含子)，该序列草图可从博伊斯·汤普森植物研究所(Boyce Thompson Institute for Plant Research)的Sol Genomics Network获得(https://solgenomics.net/organism/Nicotianajbenthamiana/genome；
Bombarely,A.,H.G.Eosli,J.Vrebalov,P.Moffett,L.A.Mueller,and G.B.Martin(2012).A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research.Molecular Plant-Microbe Interactions 25:1523-1530，通过引用将其全部内容并入本文)。
[0271] 烟草基因组中的这个1466bp序列在Scaffold No：5041中具有核苷酸坐标74703-76169，并与推定的泛素基因的编码区融合，该泛素基因编码5个76个氨基酸长的相同泛素单体。1466bp prNbUbi1由GenScript合成为NotI-NcoI片段。将整个Nb1A11+AtUBQ10i或Nb1A11表达盒克隆到pLH9000载体的NotI-KpnI位点，该载体由I.Lernomtova博士(德国IPK Gatersleben)提供，最终构建体分别命名为pLH1A11int或pLH1A11。图12示出了pLH1A11int表达盒。图13示出了pLH1A11表达盒。随后，将pLH9000、pLH1A11int和pLH11A11电穿孔到农杆菌菌株GV3101的电感受态细胞中。通过PCR验证携带pLH9000、pLH1A11int和pLH11A11构建体的农杆菌菌落。
[0272] 烟草(N.benthamiana)植株生长并接种农杆菌(Agrobacterium)
[0273] 烟草种子获取自美国烟草种质收藏中心(NC State University)。将种子播种到含有ProMix土壤的4”×4'盆中。发芽后，将幼苗和植株保持在白天16小时和晚上8小时的光照方案下。将五周龄健康的烟草植株用于具有pLH9000作为阴性对照的农杆菌菌株GV3101，或者具有携带表达Nb1A11(如上所述，用于烟草表达的鸡IL-10sdAb1A11)的pLH1A11int或pLH1A11或者具有上述两种农杆菌菌株的混合物(例如具有pLH1A111int的GV3101和具有p19的C58C1)的注射浸润。如本文所用的，1A11sdAB与抗鸡IL-10sdAB和鸡IL-10sdAb1A11是同义的。p19是一种番茄丛矮病毒蛋白(tomato bushy stunt virus protein)，它参与RNA依赖性基因沉默的抑制，从而改善异源蛋白的表达。农杆菌菌株GV3101和具有p19的C58C1由I.Lernomtova博士(德国IPK Gatersleben)友情提供。含有质粒的农杆菌菌株在补充有相应抗生素的LB培养基中由单个菌落生长过夜，通过离心收获细胞并将其重悬于的10mM MgCl2、10mM MES-K(pH 5.6)中至OD600＝0.4。在注射浸润烟草叶之前，将100μM乙酰丁香酮添加到各个农杆菌菌株中。在浸润后第4天收获用于Nb1A11表达分析的叶组织。
[0274] Nb1A11表达的RNA分析
[0275] 根据制造商的方案，用NucleoSpin RNA植物试剂盒(Takara)分离农杆菌浸润的烟草叶组织的总植物RNA。随后，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将1μg的总RNA转化为cDNA，并在使用以下引物的PCR反应中将1.5μl的每种cDNA用作模板：
[0276] 正向引物3661(5'-CGTGCCCAAGTTCAGTTACA-3'[SEQ ID NO：200])，
[0277] 反向引物3662(5'-TTGCAACAAGTTCTCTTTGCTT-3'[SEQ ID NO：201])。将引物定位至Nb1A11编码区内的侧翼内含子AtUBQ10i，并允许用完全剪接的内含子明确鉴定植物细胞表达的1A11转录物。Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)用于在制造商推荐的条件下扩增PCR产物，扩增36个循环，引物退火温度为55℃。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离。图14示出了烟草叶中瞬时表达Nb1A11的终点RT-PCR分析。在该图中，泳道1-5：泳道1-GV3101+pLH9000(阴性对照)；泳道2-GV3101+pLH1A11int；泳道3-GV3101+pLH1A11；泳道4-质粒pLH1A11int；泳道5-质粒pLH1A11。
[0278] 在用阴性对照质粒pLH9000浸润的烟草叶组织中，未扩增得到1A11转录物(泳道1)。从用pLH1A11int或pLH1A11(分别为泳道2和3)浸润的烟草叶组织中扩增得到预期的
1A11转录物大小的不同PCR产物。
1A11转录物大小的不同PCR产物。
[0279] 将来自质粒pLH1A11int和pLH1A11的扩增PCR产物用作阳性对照，并在泳道4和5中进行电泳。观察到泳道4和5中所得产物与泳道2和3中的产物大小相同。在泳道2中也检测到了较低强度的PCR条带，大小对应于预期的含有AtUBQ10i的458bp片段。该片段可能是从烟草基因组DNA扩增的，尽管按照制造商的说明书建议通过DNase消化将其除去，但仍残留在样品的总RNA制剂中，或者可选地扩增产物指示分离的总RNA的一部分，其中含有仍未剪接的AtUBQ10i的Nb1A11转录物。
[0280] 1A11sdAb瞬时蛋白表达分析
[0281] 基于烟草叶中Nb1A11RNA转录物分析的结果，选择用pLH1A11int和pLH1A111int+p19浸润的叶组织样品用于蛋白分离和蛋白印迹(Western blot)分析。将农杆菌浸润的叶组织在液氮中研磨，并使用由1M NaCl、50mM磷酸钠pH8.0、10mM咪唑组成的提取缓冲液分离总蛋白。提取缓冲液补充有1X Halt蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher)和2mMβ-巯基乙醇。蛋白提取通过在4℃搅拌1h进行，将样品离心两次以除去植物碎片。根据生产商的原始条件的方案，使用Ni-NTA纯化柱(Ni-NTA spin column，QIAGEN)从烟草总叶蛋白的澄清上清液中分离出在其C末端含有6xHis标签的1A11sdAB。使用Amicon Ultra-2离心过滤器(Millipore-Sigma)进一步浓缩1A11sdAB，并通过NanoDrop分光光度计测定蛋白浓度。随后，使用1X MOPS SDS凝胶电泳缓冲液在4-12％梯度的NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶
(ThermoFisher)上分离15μg含有浓缩蛋白级分的1A11。将生物素化蛋白分子量标准
(Biotynylated Protein Ladder，Cell Signaling Technologies)和Precision Plus Protein Kaleidoscope(Bio-Rad)作为分子量标准。在聚丙烯酰胺凝胶中将蛋白分离并使用半干蛋白印迹程序转移到PVDF膜上。使用1：2500稀释度的兔抗VHH HRP(Invitrogen)作为一抗，然后使用1：5000稀释度的山羊抗兔IgG过氧化物酶(Sigma)作为二抗检测与PVDF膜结合的1A11蛋白。蛋白分子量标准中生物素化蛋白的检测由1：15000稀释度的抗生物素HRP样抗体Ab(Cell Signalling Technologies)完成。使用Super Signal West Pico Plus化学发光底物(ThermoFisher)实现信号检测。图15示出了农杆菌浸润烟草叶中的1A11蛋白表达。蛋白印迹显示在样品5、6中检测到1A11sdAb。已证明了泳道5和6含有预期分子量为
17.4kDa的蛋白，该蛋白与抗VHH一抗交叉反应，表明该蛋白的确是1A11sdAB。
(ThermoFisher)上分离15μg含有浓缩蛋白级分的1A11。将生物素化蛋白分子量标准
(Biotynylated Protein Ladder，Cell Signaling Technologies)和Precision Plus Protein Kaleidoscope(Bio-Rad)作为分子量标准。在聚丙烯酰胺凝胶中将蛋白分离并使用半干蛋白印迹程序转移到PVDF膜上。使用1：2500稀释度的兔抗VHH HRP(Invitrogen)作为一抗，然后使用1：5000稀释度的山羊抗兔IgG过氧化物酶(Sigma)作为二抗检测与PVDF膜结合的1A11蛋白。蛋白分子量标准中生物素化蛋白的检测由1：15000稀释度的抗生物素HRP样抗体Ab(Cell Signalling Technologies)完成。使用Super Signal West Pico Plus化学发光底物(ThermoFisher)实现信号检测。图15示出了农杆菌浸润烟草叶中的1A11蛋白表达。蛋白印迹显示在样品5、6中检测到1A11sdAb。已证明了泳道5和6含有预期分子量为
17.4kDa的蛋白，该蛋白与抗VHH一抗交叉反应，表明该蛋白的确是1A11sdAB。
[0282] 实施例13.IL-10R肽拮抗剂和sdAB在感染有堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)田间分离株混合物的商品肉鸡中的抗球虫功效
[0283] 使用相同的研究设计测量抗IL10抗体或IL-10R拮抗剂对堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)混合物的抗球虫功效/敏感性。在这些试验中，将鸡分为多个对照组和处理组，这些对照组分别暴露于艾美球虫(Eimeria)(已感染，I)或不暴露于艾美球虫(Eimeria)(未感染，NI)，这些处理组暴露于艾美球虫(Eimeria)并用各种饮食进行处理。对照组包括：阴性对照组、接受有和没有抗IL-10sdAB(或者有和没有IL-10R拮抗剂)的正常饲料的阴性对照组以及接受标准化学抗球虫药的阳性对照组。给处理组饲喂饮食，该饮食含有50g至4kg表达抗IL-10sdAB的研磨籽粒/kg饲料(或IL-10R拮抗剂肽剂量范围为1mg多肽/kg饲料至40mg IL-10R拮抗剂肽/kg饲料)。以这种方式测试抗IL-10sdAB，其包括SEQ ID NO：87(chIL10sdAB1H5)、SEQ ID NO：88(chIL10sdAB1E9)、SEQ ID NO：89(chIL10sdAB1H1)、SEQ ID NO：90(chIL10sdAB1G6)、SEQ ID NO：91(chIL10sdAB1C10)、SEQ ID NO：92(chIL10sdAB1B6)、SEQ ID NO：93
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(chIL10sdAB1D2)或SEQ ID NO：154(chIL10sdAB1D10)，或肽SEQ ID NO：1[P21]、SEQ ID NO：2[P22]、SEQ ID NO：3[P23]、SEQ ID NO：4[P24]、SEQ ID NO：5[P25]、SEQ ID NO：6[P26]、SEQ ID NO：7[P27]、SEQ ID NO：8[P28]、SEQ ID NO：9[P29]、SEQ ID NO：10[P11]、SEQ ID NO：11[P30]、SEQ ID NO：12[P31]、SEQ ID NO：13[P32]，或连接肽SEQ ID NO：32[P2501]、SEQ ID NO：33[P2502]、SEQ ID NO：34[P2503]、SEQ ID NO：35[P2504]、SEQ ID NO：36[P2505]、SEQ ID NO：37[P2506]、SEQ ID NO：38[P2507]、SEQ ID NO：39[P2508]或SEQ ID NO：40[P2509]。
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(chIL10sdAB1D6)、SEQ ID NO：144(chIL10sdAB1C4)、SEQ ID NO：145(chIL10sdAB1H4)、SEQ ID NO：146(chIL10sdAB1F11)、SEQ ID NO：147(chIL10sdAB1D3)、SEQ ID NO：148
(chIL10sdAB1A7)、SEQ ID NO：149(chIL10sdAB1H8)、SEQ ID NO：150(chIL10sdAB1H3)、SEQ ID NO：151(chIL10sdAB1B8)、SEQ ID NO：152(chIL10sdAB1B2)、SEQ ID NO：153
(chIL10sdAB1D2)或SEQ ID NO：154(chIL10sdAB1D10)，或肽SEQ ID NO：1[P21]、SEQ ID NO：2[P22]、SEQ ID NO：3[P23]、SEQ ID NO：4[P24]、SEQ ID NO：5[P25]、SEQ ID NO：6[P26]、SEQ ID NO：7[P27]、SEQ ID NO：8[P28]、SEQ ID NO：9[P29]、SEQ ID NO：10[P11]、SEQ ID NO：11[P30]、SEQ ID NO：12[P31]、SEQ ID NO：13[P32]，或连接肽SEQ ID NO：32[P2501]、SEQ ID NO：33[P2502]、SEQ ID NO：34[P2503]、SEQ ID NO：35[P2504]、SEQ ID NO：36[P2505]、SEQ ID NO：37[P2506]、SEQ ID NO：38[P2507]、SEQ ID NO：39[P2508]或SEQ ID NO：40[P2509]。
[0284] 饲喂试验为期八天，由96笼组成，每笼以8只雄性雏鸡开始。处理将分为8个区，每个区随机分成8笼。签约设施使用了用于处理和区的围栏分配的随机过程。
[0285] 表8.用于测试表达chIL10sdAB的玉米籽粒的处理
[0286]
[0287] 使用相同的试验设计、相同的籽粒装载量，但不同的表达chIL10sdAB的玉米籽粒测试了其他sdAB。如表9所示，以类似的方式将相同的试验设计用于测试IL-10R肽拮抗剂。
[0288] 表9.用于测试IL-10R拮抗剂肽的处理设计
[0289]
[0290] 在每次试验开始时，对设施进行检查以确保所有笼中都有可用的水和饲料无限制地提供给动物。将建筑物温度保持为适合禽类的年龄。通过沿墙壁垂直悬挂的荧光灯提供均匀连续的照明。每天检查笼两次，并记录观察结果(包括饲料、水的可用性，温度和任何异常状况)。从笼中取出死亡禽类，并记录笼数量、日期、禽类重量、性别和可能的死亡原因。
[0291] 作为试验的一部分，配制与基础饲料复合的不给药商品起始日粮。该日粮用于配制研究的阴性和阳性对照日粮以及实验性饮食，从雏鸡到达之日起直至研究完成全部无限制地饲喂这些日粮和实验性饮食。记录用于准备处理批次的所有基础饲料和测试物品的数量，并作为试验质量控制程序的一部分进行测试。将处理饮食混合成测试物品的均匀分布。在对照饮食和处理饮食之间以及在每种处理饮食之间冲洗混合器。然后将每种处理饲料分配到相应处理的笼中。
[0292] 本研究中使用孵化当天的雄性雏鸡(Cobb 500)。达到后，将雏鸡群体饲养在无球虫的层架式笼中。在12日龄(试验第0天)时，将雏鸡分组成8组，称重并放入指定的笼中。在试验第0和8天，将禽笼称重。
[0293] 在试验第2天，所有未感染的禽类都通过口服吸管接受1ml蒸馏水。所有其他禽类都接受稀释至1ml体积并通过口服吸管给予的球虫接种物。接种物是堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)田间分离株的混合物，其会对所有物种产生轻度感染。
[0294] 在开始研究后第0、2、7和8天收集数据。在第0天，将鸡称重并分配到笼中进行研究。在第2天，用球虫接种指定的禽类。在第7天，清洗粪便盘以准备在第8天收集粪便并进行后续分析。在第8天，将禽笼以及剩余饲料和粪便称重。将每笼收集的粪便充分混合并准备进行粪便漂浮，然后检查每个样品以确定每克粪便中的卵囊数量。使用Johnson and Reid(1970)的方法在第8天对所有禽类的球虫病进行评分。在试验期间，记录死亡体重，在整个研究过程中每天记录两次临床观察结果。
[0295] 测量每组的饲料摄入、体重增加、饲料转化率、opgs、球虫病评分和死亡率并通过标准统计方法进行分析。比较了用艾美球虫(Eimeria)处理和未用艾美球虫处理的组之间，用艾美球虫和抗体(或肽)处理的处理组与用和未用艾美球虫处理的对照组、用艾美球虫和无抗体(或肽)或抗球虫药处理的对照组、用艾美球虫处理以及抗球虫药处理的对照组之间sdAB(或肽)补充的作用。
[0296] 另外，通过观察相对于已感染但未用抗体(或肽)或抗球虫药处理的对照禽类，哪种抗体(或肽)的剂量降低了粪便卵囊计数或病变评分来确定最小有效剂量。使用该设计确定卵囊和病变评分降低程度为剂量的函数。
[0297] 参考文献
[0298] Arbabi Ghahroudi，M.et al.，1997.Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.FEBS Letters，414(3)，pp.521-526.Available at：http：//dx.doi.org/10.1016/S0014-5793(97)01062-4.[0299] Cervantes，H.，2002.Incidence of pathological conditions in clinically stnormal broilers from different regions of the USA.51 Western Poultry Disease Conference，May 1-4，Casa Magna Marriott Resort，Puerto Vallart，Jalisco，Mexico，
220-223.
220-223.
[0300] Cervantes，H.，2006.Incidence of subclinical diseases and pathological conditions in clinically normal broilers from 3 production complexes sorted by sex and age.143rd Annual Convention of the American Veterinary Medical Association and 50th Annual Meeting of the American Association of Avian
Pathologists，July 15-19，Hawaii Convention Center，Honolulu，Hawaii.
Pathologists，July 15-19，Hawaii Convention Center，Honolulu，Hawaii.
[0301] Cook，M.E.，Sand，J.M.，McGuirk，S.M.，Rieman，J.E.，and Raabis，S.M.(2015)，U.S.patent application No.US2016/0280778 A1
[0302] Diaz-Valdes，N.，Manterola，L.，Belsue，V.，Riezu-Boj，J.I.，Larrea，E.，Echeverria，I.，LLopiz，D.，Lopez-Sagaseta，J.，Lerat，H.，Pawlotsky，J.-M.，Prieto，J.，Lasarte，J.J.，Borras-Cuesta，F.，and Sarobe，P.(2011)，Hepatology 53，23-31.[0303] Goldman，E.R.et al.，2006.Facile Generation of Heat Stable Antiviral and Antitoxin Single Domain Antibodies from a Semi-synthetic Llama Library.，78(24)，pp.8245-8255.
[0304] Josephson，K.，Logsdon，N.J.，and Walter，M.W.(2001)，Immunity 14，35-46.[0305] Liu，J.L.et al.，2013.Selection and evaluation of single domain antibodies toward MS2 phage and coat protein.Molecular Immunology，53(1-2)，pp.118-125.Available at：http：//dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2012.07.010.
[0306] Naiyer，M.M.，Saha，S.，Hemke，V.，Roy，S.，Singh，S.，Musti，K.V.，and Saha，B.(2013)，Human Immunology 74，28-31.
[0307] Ni，G.，Chen，S.，Yang，Y.，Cummins，S.F.，Zhan，J.，Li，Z.，Zhu，B.，Mounsey，K.，Walton，S.，Wei，M.Q.，Wang，Y.，Zhou，Y.，Wang，T.，and Liu，X.(2016)，PLOSOne，April 21，2016.
[0308] Reineke，U.，Sabat，R.，Volk，H.-D.，and Schneider-Mergener，J.(1998)，Protein Sci.7，951-960.
[0309] Rothwell，L.，Young，J.R.，Zoorob，R.，Whittaker，C.A.，Hesketh，P.，Archer，A.，Smith，A.L.，and Kaiser，P.(2004)，J.Immunol.173，2675-2682.
[0310] Sand，J.M，and Cook，M.E.(2014)，U.S.patent No.8,652,457 B2.
[0311] Wu，Z.，Hu，T.，Rothwell，L.，Vervelde，L.，Kaiser，P.，Boulton，K.，Nolan，M.J.，Tomley，F.M.，Blake，D.P.，and Hume，D.A.(2016)，Devel.Comp.Immunol.63，206-212.[0312] Yoon，I.L.，Jones，B.C.，Logsdon，N.J.，and Walter，M.R.(2005)，Structure 13，551-564.
[0313] Zdanov，A.，Schalk-Hihi，C.，and Wlodawer，A.(1996)，Protein Sci.5，1955-1962.
[0314] 贯穿本申请所引用的参考文献出于在本文中以及在参考文献本身中显而易见的所有目的而被并入，如同每个参考文献被完全阐述一样。为了呈现的目的，在本文的特定位置引用了这些参考文献中的具体参考文献。在特定位置对参考文献的引用指示了所并入参考文献教导的一种或多种方式。然而，在特定位置引用参考文献并不限制出于所有目的并入所引用参考文献的所有教导方式。
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