一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器
专利汇可以提供一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及电化学 传感器 技术领域，特别是涉及一种基于中空多孔 二 氧 化 硅 聚合物 纳米球构建对 农药 残留啶虫脒检测的电化学适配体传感器制备方法，包括啶虫脒电化学适配体传感器的制备步骤，和使用该传感器测定啶虫脒的操作方法等，这种基于中空多孔 二氧化硅 聚合物纳米球构建的具有双 信号 放大的啶虫脒电化学适配体传感器，材料合成简单方便，传感器制作较简便，材料价格低廉，传感器易于更新，重现性好，无毒，不污染环境，并且本测定方法选择性好，灵敏度高。，下面是一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器专利的具体信息内容。
1.一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器，其特征在于，以中空多孔SiO2纳米球复合物Fc-HPNs标记啶虫脒适配体的互补链cDNA作为信号标签放大信号；以抗坏血酸AA循环催化二茂铁还原进一步放大信号，得到双重放大信号的电化学适配体传感器，并用于高灵敏检测啶虫脒。
2.根据权利要求1所述的啶虫脒电化学适配体传感器信号标签，其特征在于，具体步骤为：
（1）聚乙烯亚胺-二茂铁复合物PEI-Fc的制备：称取0.36g甲酸二茂铁Fc-COOH与25mL超纯水混合，加入2.5mL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液，搅拌2h；再加入60μL的氨基封端的聚乙烯亚胺PEI过夜，在 8000rpm下离心15min，然后用超纯水洗涤两次；最后用6g水分散，放在冰箱内保存，制得浓度为1%的PEI-Fc；
（2）中空多孔SiO2纳米球复合物Fc-HPNs的制备：取125μL 1mg/mL实心SiO2纳米球于
100mL烧杯中，加入50mL无水乙醇，再加入0.5mL 1%的 PEI-Fc，快速搅拌30min；将混合物转移到离心管中，8000rpm下离心5min，得到的沉淀震荡超声分散均匀后，转移到烧杯中；加
1mL 0.05g/mL的聚丙烯酸PAA，继续搅拌30min, 再将所得的溶液转移到离心管中，8000rpm下离心5min；重复上述二茂铁包覆过程两次，加入250μL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液搅拌两个小时后，用无水乙醇洗2次，超纯水洗1次，得到实心纳米球SiO2@PEI-Fc-PAA，用
5mL水分散；然后用1%的HF腐蚀15min；腐蚀完毕，8000rpm下离心5min，用水洗一次，制得中空多孔SiO2纳米球复合物Fc-HPNs，分散在500μL的超纯水中；
（3）信号标签Fc-HPNs-cDNA的制备；取5μL 1.0μM啶虫脒适配体的互补链cDNA与所得的Fc-HPNs混合，加入10μL戊二醛交联剂，搅拌1 h，在8000rpm下离心5min，用无水乙醇洗涤后冰箱冷冻存储。
3.根据权利要求1所述的基于中空多孔纳米球啶虫脒电化学适配体传感器，其特征在于，制备步骤为：
（1）将8μL 1.0μM啶虫脒适配体Apt滴涂在AuNPs/GCE表面，在4℃下孵化12h，用5μL 2 mM的MCH封闭非特异性结合位点，得到电极MCH/Apt/AuNP/GCE；
（2）取7μL信号标签Fc-HPNs-cDNA滴涂到电极表面，37℃孵化1h，得到电极Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GCE；上述电极修饰过程各步骤都需要用PBS洗涤以除去未键合的生物材料。
4.根据权利要求1所述的双放大信号电化学适配体传感器应用于啶虫脒检测，其特征在于，检测步骤如下：
（1）以Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GCE电极为工作电极，在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流，记为~
0
Ip；
（2）分别将8μL 10nM 1.0fM啶虫脒标准溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GCE~
电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；
（3）将步骤（2）孵化好的电极做工作电极，按步骤（1）的方法分别测定不同浓度啶虫脒时峰电流Ip；随着啶虫脒浓度增大，电化学响应信号减小，峰电流差值ΔIp增大，ΔIp =Ip0-Ip；在10nM 1.0fM之间，ΔIp与啶虫脒浓度的对数呈良好的线性关系，回归方程为ΔIp ~
= 5.72+0.842lgc，ΔIp为峰电流差值，单位μA；c为浓度，单位为nM，相关系数为0.998，检测限为0.33fM；
（4）结合上述线性方程，对未知浓度的啶虫脒溶液样品进行测定，计算出啶虫脒的浓度；将8μL未知浓度的啶虫脒溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GCE电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流Ip；计算峰电流差值ΔIp ~
=Ip0-Ip，将ΔIp值代入上述所得的线性方程中，计算得啶虫脒浓度。
一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体
技术领域
背景技术
色谱法：色谱法的检测原理是利用被检测物中各组分被流动相携带洗脱的过程中分散系数不同以及被检测物在固定相和流动相的保留时间不同实现分离，色谱法以下几种：
气相色谱法检测原理是气体作为固定相，根据检测物质的沸点以及各物质与色谱住的作用力不同而进行分离的一种检测方法。其特点是可以同时对多种组分进行检测，气相色谱法广泛应用于有机磷的检测。但是不适用于现场检测以及易分解或者沸点较高的物质的检测；
高效液相色谱法分离原理是将分子极性有差别的一种溶剂或者按百分比混合的不同溶剂在高压系统下泵入色谱固定相中，被检测的组分在柱子里被分离，最后进入检测器定性分析。特点是高效快速，易于自动化，缺点是易受紫外检测器灵敏度的影响，在检测之前需要经过一定的预处理来提高灵敏度；
毛细管色谱柱内不填充固定相，直接在毛细管内壁涂固定相，降低了传质组分在气相与液相中的传质阻力。特点是分离线率、检测速度、灵敏度均比填充柱有优势。薄层色谱法的准确性不高，现在已经被更多高灵敏的方法取代；
酶抑制法：酶抑制法是利用特定农药对酶有抑制作用来检测农药的一种方法，胆碱酯酶和羧酸酯酶等是常用于检测农残的酶,检测的农药种类有有机磷、氨基甲酸酯类农药。酶抑制法检测农药的特点是样品预处理简单、检测成本低、检测速度快，适合小规模、现场快速检测；
免疫分析法：利用抗体抗原的特异性结合来检测药物等物质的检测技术；
分子印迹技术：该技术的基本原理是印迹分子和高分子聚合物的单体连接形成多重作用点，这种作用在聚合过程会被记录下来，印迹分子去除后会在聚合物中形成与印迹分子的空间构型相匹配的具有多重作用点并对印迹分子和它的相似物特异性辨别的孔洞。该技术的特点有预定性、识别性、实用性。该技术实际应用于有机磷农药残留的检测中，灵敏度高，检出限低。但是需要大量的有机溶剂，容易造成坏境的污染。
发明内容
（1）聚乙烯亚胺-二茂铁复合物（PEI-Fc）的制备：称取0.36g甲酸二茂铁与25mL超纯水混合，加入2.5mL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液，搅拌2h；再加入60μL的氨基封端的聚乙烯亚胺（PEI）过夜，在 8000rpm下离心15min，然后用超纯水洗涤两次；最后用6g水分散，放在冰箱内保存，制得浓度为1%的PEI-Fc；
（2）实心 SiO2纳米球的制备：将10mL氨水、16.5mL无水乙醇和25mL超纯水在三口烧瓶里混合均匀，作为A液；将4.5mL的硅酸四乙酯与45mL的无水乙醇混合，作为B液；将B液与A 液混合在干净的三口烧瓶中，静置30s后，用封口膜封口，将磁力搅拌器的转速调整到
400rpm，溶液搅拌2h后，调节离心机的转速为8500rpm，离心时间5min，离心结束后倒出表层清液，先用乙醇洗涤得到的沉淀物2次，再用超纯水洗涤1次，制得SiO2实心球；
（3）中空多孔SiO2纳米球复合物（Fc-HPNs）的制备：取125μL 1mg/mL实心SiO2于100mL烧杯中，加入50mL无水乙醇，再加入0.5mL 1%的 PEI-Fc，快速搅拌30min；将混合物转移到离心管中，8000rpm下离心5min，得到的沉淀震荡超声分散均匀后，转移到烧杯中；加1mL
0.05g/mL的聚丙烯酸（PAA），继续搅拌30min, 再将所得的溶液转移到离心管中，8000rpm下离心5min；重复上述二茂铁包覆过程两次，加入250μL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液，搅拌2h后，用无水乙醇洗涤2次，超纯水洗涤1次，得到实心纳米球复合物（SiO2@PEI-Fc-PAA），用5mL水分散；然后用1%的HF腐蚀15 min；腐蚀完毕，8000rpm下离心5min，用水洗一次，制得中空多孔SiO2纳米球复合物（Fc-HPNs），分散在500μL的超纯水中；
上述PEI-Fc包覆层数及实验条件是通过优化实验得到，具体为：在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，根据电~
信号的大小与峰形进行条件优化；
（4）信号标签Fc-HPNs-cDNA的制备：取5μL 1.0μM的啶虫脒适配体的互补链（cDNA）与所得的Fc-HPNs混合，加入10μL戊二醛交联剂，搅拌1h，在8000rpm下离心5min，用无水乙醇洗涤后冰箱冷冻存储；
所述啶虫脒电化学适配体传感器所用的AuNPs修饰玻碳电极（AuNPs/GCE），其具体制备步骤为：
（1）AuNPs的制备：将600μL 0.1M的NaBH4（0℃）注入到含 0.25mM柠檬酸三钠和0.25mM HAuCl4的混合溶液中，并大力搅拌。继续不间断地搅拌6h，得到金纳米粒子（AuNPs）；
（2）AuNPs/GCE修饰电极的制备：玻碳电极（GCE）在加有0.05μm的α-Al2O3的湿润的麂皮上抛光、打磨，用超纯水超声洗涤；将8μL AuNPs滴涂到GCE表面，常温下晾干，得到AuNPs/GCE修饰电极。
（2）取7μL信号标签Fc-HPNs-cDNA滴涂到该电极表面，37℃孵化1h，得到电极Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC；上述电极修饰过程各步骤都需要用PBS洗涤以除去未键合的生物材料；
所述的双放大信号的电化学适配体传感器应用于啶虫脒检测，检测步骤如下：
（1）以Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC电极为工作电极，在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流，记为~
Ip0；
（2）分别将8μL 10nM 1.0fM啶虫脒标准溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC~
电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；
（3）将步骤（2）孵化好的电极做工作电极，按步骤（1）的方法分别测定不同浓度啶虫脒时峰电流Ip；随着啶虫脒浓度增大，电化学响应信号减小，峰电流差值ΔIp（ΔIp =Ip0-Ip）增大；在10nM 1.0fM之间，ΔIp与啶虫脒浓度的对数呈良好的线性关系，回归方程为ΔIp = ~
5.72+0.842lgc，ΔIp为峰电流差值，单位μA；c为浓度，单位为nM，相关系数为0.998，检测限为0.33fM；
（4）结合上述线性方程，对未知浓度的啶虫脒溶液样品进行测定，计算出啶虫脒的浓度；将8μL未知浓度的啶虫脒溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流Ip；计算峰电流差值ΔIp ~
，将ΔIp值代入上述所得的线性方程中，计算得啶虫脒浓度。
其中啶虫脒浓度分别为：1-0，2-1.0fM，3-10fM，4-0.1pM，5-1.0pM，6-10pM，7-0.1nM，8-
10nM
图2所示为峰电流差值与啶虫脒浓度对数的线性关系图
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
（1）聚乙烯亚胺-二茂铁复合物（PEI-Fc）的制备：称取0.36g甲酸二茂铁与25mL超纯水混合，加入2.5mL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液，搅拌2h；再加入60μL的氨基封端的聚乙烯亚胺（PEI）过夜，在 8000rpm下离心15min，然后用超纯水洗涤两次；最后用6g水分散，放在冰箱内保存，制得浓度为1%的PEI-Fc；
（2）实心 SiO2纳米球的制备：将10mL氨水、16.5mL无水乙醇和25mL超纯水在三口烧瓶里混合均匀，作为A液；将4.5mL的硅酸四乙酯与45mL的无水乙醇混合，作为B液；将B液与A 液混合在干净的三口烧瓶中，静置30s后，用封口膜封口，将磁力搅拌器的转速调整到
400rpm，溶液搅拌2h后，调节离心机的转速为8500rpm，离心时间5min，离心结束后倒出表层清液，先用乙醇洗涤得到的沉淀物2次，再用超纯水洗涤1次，制得SiO2实心球；
（3）中空多孔SiO2纳米球复合物（Fc-HPNs）的制备：取125μL 1mg/mL实心SiO2于100mL烧杯中，加入50mL无水乙醇，再加入0.5mL 1%的 PEI-Fc，快速搅拌30min；将混合物转移到离心管中，8000rpm下离心5min，得到的沉淀震荡超声分散均匀后，转移到烧杯中；加1mL
0.05g/mL的聚丙烯酸（PAA），继续搅拌30min, 再将所得的溶液转移到离心管中，8000rpm下离心5min；重复上述二茂铁包覆过程两次，加入250μL浓度为4mM:1mM的交联剂EDC/NHS溶液，搅拌2h后，用无水乙醇洗涤2次，超纯水洗涤1次，得到实心纳米球复合物（SiO2@PEI-Fc-PAA），用5mL水分散；然后用1%的HF腐蚀15 min；腐蚀完毕，8000rpm下离心5min，用水洗一次，制得中空多孔SiO2纳米球复合物（Fc-HPNs），分散在500μL的超纯水中；
上述PEI-Fc包覆层数及实验条件是通过优化实验得到，具体为：在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，根据电~
信号的大小与峰形进行条件优化；
（4）信号标签Fc-HPNs-cDNA的制备：取5μL 1.0μM啶虫脒适配体的互补链（cDNA）与所得的Fc-HPNs混合，加入10μL戊二醛交联剂，搅拌1h，在8000rpm下离心5min，用无水乙醇洗涤后冰箱冷冻存储；
2.啶虫脒电化学适配体传感器所用AuNPs修饰玻碳电极（AuNPs/GCE）的制备（1）AuNPs的制备：将600μL 0.1M的NaBH（4 0℃）注入到含 0.25mM柠檬酸三钠和0.25mM HAuCl4的混合溶液中，并大力搅拌。继续不间断地搅拌 6h，得到金纳米粒子（AuNPs）；
（2）AuNPs/GCE修饰电极的制备：玻碳电极（GCE）在加有0.05μm的α-Al2O3的湿润的麂皮上抛光、打磨，用超纯水超声洗涤；将8μL AuNPs滴涂到GCE表面，常温下晾干，得到AuNPs/GCE修饰电极；
3. 一种基于中空多孔纳米球双放大信号的啶虫脒电化学适配体传感器的制备（1）将8μL 1.0μM啶虫脒适配体（Apt）滴涂在AuNPs/GCE表面，在4℃下孵化12h，用5μL
2mM的MCH封闭非特异性结合位点，得到电极MCH/Apt/AuNP/GCE；
（2）将7μL信号标签Fc-HPNs-cDNA滴涂到该电极表面，37℃孵化1h，得到电极Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC；上述电极修饰过程各步骤都需要用PBS洗涤以除去未键合的生物材料；
4. 双放大信号的电化学适配体传感器应用于啶虫脒的检测方法
（1）以Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC电极为工作电极，在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流，记为~
Ip0；
（2）分别将8μL 10nM 1.0fM啶虫脒标准溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC~
电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；
（3）将步骤（2）孵化好的电极做工作电极，按步骤（1）的方法分别测定不同浓度啶虫脒时峰电流Ip；随着啶虫脒浓度增大，电化学响应信号减小，峰电流差值ΔIp（ΔIp =Ip0-Ip）增大；在10nM 1.0fM之间，ΔIp与啶虫脒浓度的对数呈良好的线性关系，回归方程为ΔIp = ~
5.72+0.842lgc，ΔIp为峰电流差值，单位μA；c为浓度，单位为nM，相关系数为0.998，检测限为0.33fM；
（4）结合上述线性方程，对未知浓度的啶虫脒溶液样品进行测定，计算出啶虫脒的浓度；将8μL未知浓度的啶虫脒溶液滴涂在Fc-HPNs-cDNA/MCH/Apt/AuNPs/GC电极表面，在37℃孵化1h，然后用PBS冲洗未反应的啶虫脒；在pH 7.4 含1.0mM抗坏血酸的0.1M PBS底液中，在-0.2 0.6V电位区间，进行差分脉冲伏安扫描，记录峰电流Ip；计算峰电流差值ΔIp ~
，将ΔIp值代入上述所得的线性方程中，计算得啶虫脒浓度。
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