高莱鲍迪苷M甜菊植物栽培品种及其产生方法
阅读：229发布：2020-05-12
专利汇可以提供高莱鲍迪苷M甜菊植物栽培品种及其产生方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了具有高RebM含量的甜菊品种。还提供了通过负调节选择所得 植物 的某些基因来产生具有高RebM含量的甜菊植物、以及用这样的植物进行育种以赋予植物后代这样的期望Reb M表型的方法。，下面是高莱鲍迪苷M甜菊植物栽培品种及其产生方法专利的具体信息内容。
1.甜菊(Stevia rebaudiana)植物，其包含在莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的至少一种被破坏的负调节基因。
2.通过诱导甜菊植物中至少一种负调节基因功能的破坏来提高所述植物中莱鲍迪苷M含量的方法，其中所述负调节基因选自影响代谢、信号转导和基因调节的基因，以及新的未分类基因。
3.权利要求2所述方法的代谢基因，其中所述基因包含影响糖代谢、单加氧酶含量、萜代谢、氨基转移酶代谢、多抗微生物挤出蛋白代谢和甲硫氨酸代谢的基因。
4.权利要求3所述的代谢基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。
5.权利要求2所述甜菊植物的植物或其植物部分，其由叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、胚珠、种子、细胞、根、根尖、雌蕊、花药、花和茎组成。
6.权利要求2所述方法的信号转导和基因调节基因，其中所述基因包含非生物胁迫基因和生物胁迫基因。
7.权利要求6所述的信号转导和基因调节基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
8.权利要求2所述方法的新的未分类基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。
9.用于产生高莱鲍迪苷M甜菊植物的方法，其包括：(a)筛选甜菊植物种群在以下序列的至少一个中的突变：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：
5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：
18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；(b)选择具有所述至少一个突变的第一甜菊植物；(c)将具有至少一个突变的第一所选甜菊植物与第二甜菊植物杂交；(d)筛选甜菊后代的具有高莱鲍迪苷M的植物；以及(e)选择具有高莱鲍迪苷M的甜菊植物。
10.通过权利要求9所述方法产生的甜菊植物。
高莱鲍迪苷M甜菊植物栽培品种及其产生方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0005] 背景
[0006] 甜菊(stevia)是用于生产甜味剂、糖替代品和其他可消费成分(consumable ingredient)的重要且有价值的大田作物(field crop)。因此，甜菊植物育种者(breeder)的持续目标是开发稳定、高产的农学上健康的甜菊物种的甜菊栽培品种(cultivar)。实现该目标的原因是为了使甜味剂、糖替代品和其他可消费成分的量和品质最大化。为了实现这一目标，甜菊育种者必须选择和开发具有产生优良栽培品种之性状的植物。本文中引用的所有参考文献均通过引用整体并入。
[0007] 新甜菊栽培品种的开发需要评价和选择亲本以及使这些亲本进行杂交。由于给定杂交缺乏可预见的成功，因此需要育种者在任何给定年份中进行具有相同或不同育种目标的数次杂交。
[0008] 相关领域的前述实例和与其相关的限制旨在是举例说明性的而非排他性的。在阅读说明书之后，相关领域的其他限制对本领域技术人员而言将变得明显。
[0009] 概述
[0010] 以下实施方案及其方面结合产品和方法进行描述和举例说明，其旨在是示例性的和举例说明性的，而不是在范围上的限制。在多种实施方案中，上述问题中的一个或更多个已被减小或消除，而另一些实施方案针对另一些改进。
[0011] 据信，植物中莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M的转换需要最少的步骤来完成。然而，与莱鲍迪苷A相比，已知的甜菊物种包含非常少的莱鲍迪苷M，这表明转换途径受到这些植物中某些调节元件的负效应。通过鉴定这些负调节因子并破坏其功能，据信从莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M的转换途径可更容易地发生，导致甜菊叶中莱鲍迪苷M的产率更高。
[0012] 本公开内容的一个实施方案涉及产生与天然或商业上已知的甜菊植物(例如Stevia rebaudiana Bertoni和Stevia rebaudiana Morita)相比产生高水平莱鲍迪苷M的甜菊植物栽培品种。
[0013] 另一个实施方案公开了破坏莱鲍迪苷M生物合成的负调节物。通过破坏甜菊中这些负调节物的功能，可产生与不同的甜菊品种相比能够产生更高水平莱鲍迪苷M的甜菊植物。
[0014] 另一个实施方案公开了包含在莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的至少一种被破坏的负调节基因的甜菊植物。
[0016] 另一个实施方案公开了代谢基因，其中所述基因包含影响糖代谢、单加氧酶含量、萜代谢、氨基转移酶代谢、多抗微生物挤出蛋白(multi-antimicrobial extrusion protein)代谢和甲硫氨酸代谢的基因。
[0017] 另一个实施方案公开了代谢基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。
[0020] 另一个实施方案公开了信号转导和基因调节基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
[0021] 另一个实施方案公开了新的未分类基因，其中所述基因选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20。
[0022] 另一个实施方案公开了用于产生高莱鲍迪苷M甜菊植物的方法，其包括：(a)筛选甜菊植物种群在以下序列的至少一个中的突变：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；(b)选择具有所述至少一个突变的第一甜菊植物；(c)将具有至少一个突变的第一所选甜菊植物与第二甜菊植物杂交；(d)筛选甜菊后代的具有高莱鲍迪苷M的植物；以及(e)选择具有高莱鲍迪苷M的甜菊植物。
[0023] 序列表简述
[0024] SEQ ID NO：1公开了内-1，3；1，4-β-D-葡聚糖酶基因(STKS#1)。
[0026] SEQ ID NO：3公开了细胞色素P450 716B1样基因(STKS#3)。
[0027] SEQ ID NO：4公开了推定的类黄酮3’-羟化酶细胞色素P450基因(STKS#4)。
[0028] SEQ ID NO：5公开了KAH样细胞色素P450基因(STKS#5)。
[0029] SEQ ID NO：6公开了类异戊二烯生物合成C1超家族基因(STKS#6)。
[0030] SEQ ID NO：7公开了瑞斯蒂酮(vestitone)还原酶样基因(STKS#7)。
[0031] SEQ ID NO：8公开了氨基转移酶基因(STKS#8)。
[0032] SEQ ID NO：9公开了MATE流出家族蛋白基因(STKS#9)。
[0033] SEQ ID NO：10公开了甲硫氨酸腺苷转移酶2亚基β样基因(STKS#10)。
[0034] SEQ ID NO：11公开了SAL1磷酸酶样同种型基因(STKS#11)。
[0035] SEQ ID NO：12公开了硝酸盐依赖性转录调节基因(STKS#12)。
[0036] SEQ ID NO：13公开了包含LURP1样结构域之蛋白的基因(STKS#13)。
[0037] SEQ ID NO：14公开了RGC2抗性蛋白基因(STKS#14)。
[0038] SEQ ID NO：15公开了LRR受体激酶基因(STKS#15)。
[0039] SEQ ID NO：16公开了壁相关受体激酶基因(STKS#16)。
[0040] SEQ ID NO：17公开了未知功能的DNA序列(2672)(STKS#17)。
[0041] SEQ ID NO：18公开了未知功能的DNA序列(5237)(STKS#18)。
[0042] SEQ ID NO：19公开了未知功能的DNA序列(10666)(STKS#19)。
[0043] SEQ ID NO：20公开了未知功能的DNA序列(13209)(STKS#20)。
[0045] 并入本文中并构成说明书一部分的附图示出了一些但不是唯一或排他的示例性实施例和/或特征。本文中公开的实施例和附图旨在被认为是举例说明性的而不是限制性的。
[0046] 图1示出了不同甜菊植物类型中细胞色素P450 716B1样基因(STKS#3)的表达模式。
[0047] 定义
[0049] 高莱鲍迪苷A：本文中使用的被描述为具有高莱鲍迪苷A的植物的莱鲍迪苷A含量大于或等于9％、莱鲍迪苷D含量小于或等于0.3％，并且莱鲍迪苷M含量小于或等于0.2％。
[0050] 高莱鲍迪苷D：本文中使用的被描述为具有高莱鲍迪苷D的植物的莱鲍迪苷D含量大于或等于0.6％并且莱鲍迪苷D/总甜菊醇糖苷(steviol glycoside)大于或等于8％。
[0051] 高莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M：本文中使用的被描述为具有莱鲍迪苷D和高莱鲍迪苷M含量的植物的莱鲍迪苷D含量大于或等于0.6％并且莱鲍迪苷D/总甜菊醇糖苷大于或等于8％，并且莱鲍迪苷M含量大于或等于0.5％。
[0052] 高莱鲍迪苷M：本文中使用的被描述为具有高莱鲍迪苷M的植物的莱鲍迪苷M含量大于或等于0.5％。
[0053] 高甜菊苷：本文中使用的被描述为具有高甜菊苷的植物的甜菊苷含量大于或等于7％、莱鲍迪苷D含量小于或等于0.3％，并且莱鲍迪苷M含量小于或等于0.2％。
[0054] 高甜菊苷(stevioside)和高莱鲍迪苷A：本文中使用的被描述为具有高甜菊苷和高莱鲍迪苷A的植物的莱鲍迪苷D/总甜菊醇糖苷小于或等于7.60％并且莱鲍迪苷M/总甜菊醇糖苷小于或等于1.9％。
[0055] 标记：本文中使用的“标记”是存在至少一种多态性的指示物，因此标记可以是例如核苷酸序列本身或探针。
[0056] 植物：本文中使用的术语“植物”包括提及未成熟或成熟的整个植物，包括已被加工用于甜菊醇糖苷的植物。会产生植物的种子或植物部分也被认为是植物。
[0057] 植物部分：本文中使用的术语“植物部分”包括叶、茎、根、种子、胚、花粉、胚珠、花、根尖、花药、组织、细胞等。
[0058] 莱鲍迪苷A(RebA)：本文中使用的“莱鲍迪苷A”或“RebA”是仅包含葡萄糖作为其单糖部分(moiety)的甜菊醇糖苷。其总共包含四个葡萄糖分子，其中三联体的中心葡萄糖与主要的甜菊醇结构在其羟基处连接，并且其余葡萄糖在其羧基处连接形成酯键。
[0059] 莱鲍迪苷D(RebD)：本文中使用的“莱鲍迪苷D”或“RebD”是从甜菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷(ent-kaurane diterpene glycoside)。
[0060] 莱鲍迪苷M(RebM)：本文中使用的“莱鲍迪苷M”或“RebM”是从甜菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷。
[0061] SNP：本文中使用的术语“SNP”应是指单核苷酸多态性。
[0062] 甜菊苷含量：本文中使用的甜菊苷是来源于甜菊植物的糖苷百分比。
[0063] 发明详述
[0064] 甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)是菊科(Asteraceae)的多年生草本植物，其由约230种草本植物、灌木和亚灌木植物组成。已知甜菊产生比蔗糖甜约300倍的二萜类甜菊醇糖苷(steviol glycoside，SG)。已在甜菊的叶组织中鉴定出二十一种二萜糖苷(US2011/0183056)。其中，在甜菊叶中合成的四种主要甜菊醇糖苷是甜菊苷(stevioside，STEV)、RebA、莱鲍迪苷C(RebC)和莱鲍迪苷F(RebF)。STEV占叶干重的5％至10％，而RebA占2％至4％(Pande和Priyanka 2013)。
[0065] 在全世界种植的所有甜菊在遗传上与估计的2GB基因组97％至99％相同。遗传差异仅包含不同甜菊植物中该2GB基因组的2％至3％，并且其是对于甜菊适应性、生长性能、叶片大小、抗病性、甜菊醇糖苷组成变异等的关键属性。
[0066] 已采用深度短读测序方法对具有不同莱鲍迪苷M累积的样品中的基因表达水平进行量化。为了鉴定莱鲍迪苷M生物合成的潜在负调节物，根据与高莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷D甜菊植物中的表达水平相比，高莱鲍迪苷M甜菊植物中的较低表达水平来选择候选基因。优选选择具有单拷贝蛋白编码序列的候选基因。所选候选基因的表达模式在独立的短读测序数据集中得到验证。
[0067] 本文中描述的一些实施方案通常涉及这样的甜菊品种，其中莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的至少一个负调节基因已被破坏。
[0068] 下表1中示出了被认为参与莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径的负调节的候选基因的列表。据信，甜菊中一种或更多种这些负调节基因的破坏将导致甜菊植物中莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M的转换提高。所有候选基因对于甜菊植物是天然的。
[0069] 表1：用于莱鲍迪苷M过度产生的负调节候选基因
[0070]
[0071] 本文中描述的一些实施方案还提供破坏莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的至少一种负调节基因的方法。这样的方法可包括但不限于：甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)诱变、定点诱变、直接基因靶向(敲除)、RNA干扰和CRISPR(基因编辑)。
[0072] 本文中描述的实施方案还提供了将突变引入到莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的一个或更多个负调节基因中的方法，所述方法包括应用诱变剂，其中所述诱变剂选自包含以下的组：电离辐射、化学诱变剂、靶向基因组中诱导的局部损伤、锌指核酸酶介导的诱变和大范围核酸酶，并且提供了选择在莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中具有一个或更多个负调节基因突变的植物的方法。
[0073] 本文中提供的另一个实施方案公开了通过以上方法产生的甜菊植物，其中叶的莱鲍迪苷M含量为干重的至少0.5％。
[0074] 本文中描述的一些实施方案还提供了用于筛选包含莱鲍迪苷M的至少一种负调节物的破坏的甜菊植物的方法。这些方法可包括但不限于：基因测序、SNP分析、RNA测序和基因表达分析。
[0075] 本文中描述的一些实施方案还提供了通过选择具有至少一种负调节基因的破坏的甜菊植物并应用植物育种技术(例如轮回选择(recurrent selection)、回交、谱系育种、标记增强选择、或单倍体/双单倍体生产)在植物育种程序中将高莱鲍迪苷M表型渐渗(introgressing)到其他甜菊品种中以产生具有高莱鲍迪苷M的新甜菊栽培品种的方法。
[0076] 另一个实施方案公开了甜菊植物，其中所述甜菊植物的叶的莱鲍迪苷M含量为干重的约0.1％至2.0％、或约0.5％至1.54％(例如约1.15％)。本发明考虑了更高的莱鲍迪苷M含量，例如3.0％、4.0％或5.0％。
[0077] 另一个实施方案公开了用于产生高莱鲍迪苷M甜菊植物的方法，其包括：(a)筛选甜菊植物种群在以下序列的至少一个中的突变：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；(b)选择具有所述至少一个突变的第一甜菊植物；(c)将具有至少一个突变的第一所选甜菊植物与第二甜菊植物杂交；(d)筛选甜菊后代的具有高莱鲍迪苷M的植物；以及(e)选择具有高莱鲍迪苷M的甜菊植物。
[0078] 本文中提供的另一个实施方案公开了通过以上的育种方法产生的甜菊植物，其中叶的莱鲍迪苷M含量为干重的至少0.5％。实施例
[0079] 提供以下实施例以进一步举例说明多种应用，并且不旨在将本发明限制在所附权利要求书中所述限制之外。
[0080] 为了鉴定莱鲍迪苷M累积的顶部负调节物，使用PacBio Iso-seq和Illumina HiSeq测序方法进行转录组学分析。进行PacBio Iso-seq测序以确定全长基因模型和转录后修饰，以有助于进行基因组注释和基因预测。Illumina HiSeq测序是为了将在不同条件下特定组织中每种转录物的表达水平进行量化。顶部负调节物的选择标准是：1)在高莱鲍迪苷M甜菊品系中具有较低表达的蛋白质编码序列；2)在不同条件下(健康和胁迫)高莱鲍迪苷M甜菊品系中的一致更低表达；3)与表达网络中的莱鲍迪苷M性状呈负相关。作为一个实例，候选基因细胞色素P450 716B1样蛋白基因的表达模式示于图1中。细胞色素P450 716B1样蛋白基因在高莱鲍迪苷M甜菊品系中的表达水平显著低于在高甜菊苷甜菊品系、高莱鲍迪苷A甜菊品系和高莱鲍迪苷D甜菊品系中的表达水平。该细胞色素P450酶可修饰SG或SG前体以降低朝向SG生物合成的代谢流(metabolic flow)。该基因中的突变可降低不期望的分支反应，并且可将代谢流重定向到更多的Reb M生物合成。
[0081] 用于破坏莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的一种或更多种负调节基因的分子技术
[0082] 用于基因沉默的许多技术是本领域技术人员公知的，包括但不限于敲除(例如通过插入转座因子(例如Mu(Vicki Chandler，The Maize Handbook，Ch.118(Springer-Verlag 1994))或其他遗传元件(例如FRT、Lox或其他位点特异性整合位点))；反义技术(参见例如Sheehy等，PNAS USA，85：8805-8809(1988)和美国专利No.5,107,065、5,453,566和5,759,829)；共抑制(例如，Taylor，Plant Cell，9：1245(1997)；Jorgensen，Trends Biotech.，8(12)：340-344(1990))；Flavell，PNAS USA，91：3490-3496(1994)；Finnegan等，Bio/Technology，12：883-888(1994)；Neuhuber等，Mol.Gen.Genet.，244：230-241(1994))；
RNA干扰(Napoli等，Plant Cell，2：279-289(1990)；美国专利No.5,034,323；Sharp，Genes Dev.，13：139-141(1999))；Zamore等，Cell，101：25-33(2000)；Montgomery等，PNAS USA，
95：15502-15507(1998))、病毒诱导的基因沉默(Burton等，Plant Cell，12：691-705(2000)；Baulcombe，Curr.Op.Plant Bio.，2：109-113(1999))；靶RNA特异性核酶(Haseloff等，Nature，334：585-591(1988))；发夹结构(Smith等，Nature，407：319-320(2000)；美国专利No.6,423,885、7,138,565、6,753,139和7,713,715)；MicroRNA(Aukerman&Sakai，Plant Cell，15：2730-2741(2003))；核酶(Steinecke等，EMBO J.，11：1525(1992)；Perriman等，Antisense Res.Dev.，3：253(1993))；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如，美国专利No.6,528,
700和6,911,575)；Zn指靶向分子(例如，美国专利No.7,151,201、6,453,242、6,785,613、7,
177,766和7,788,044)；以及本领域技术人员已知的其他方法或上述方法的组合。
RNA干扰(Napoli等，Plant Cell，2：279-289(1990)；美国专利No.5,034,323；Sharp，Genes Dev.，13：139-141(1999))；Zamore等，Cell，101：25-33(2000)；Montgomery等，PNAS USA，
95：15502-15507(1998))、病毒诱导的基因沉默(Burton等，Plant Cell，12：691-705(2000)；Baulcombe，Curr.Op.Plant Bio.，2：109-113(1999))；靶RNA特异性核酶(Haseloff等，Nature，334：585-591(1988))；发夹结构(Smith等，Nature，407：319-320(2000)；美国专利No.6,423,885、7,138,565、6,753,139和7,713,715)；MicroRNA(Aukerman&Sakai，Plant Cell，15：2730-2741(2003))；核酶(Steinecke等，EMBO J.，11：1525(1992)；Perriman等，Antisense Res.Dev.，3：253(1993))；寡核苷酸介导的靶向修饰(例如，美国专利No.6,528,
700和6,911,575)；Zn指靶向分子(例如，美国专利No.7,151,201、6,453,242、6,785,613、7,
177,766和7,788,044)；以及本领域技术人员已知的其他方法或上述方法的组合。
[0083] 突变育种是破坏莱鲍迪苷A向莱鲍迪苷M转换途径中的一种或更多种负调节基因的另一种方法。自发发生或人工诱导的突变对于植物育种者来说可以是可用的变异来源。人工诱变的目标是提高所期望特征的突变率。突变率可通过许多不同的手段来提高，其包括温度、长期种子储存、组织培养条件、电离辐射(例如X射线、γ射线(例如钴60或铯137))、中子(铀235在原子反应堆中的核裂变产物)、β辐射(发射自放射性同位素(例如磷32或碳
14))、或紫外辐射(优选2500至2900纳米)；化学诱变剂(例如碱基类似物(5-溴-尿嘧啶))、相关化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(链黑菌素)、烷化剂(硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯胺、硫酸盐、磺酸盐(例如甲磺酸乙酯)、砜、内酯)、叠氮化钠、羟胺、亚硝酸、甲基亚硝基脲(methylnitrilsourea)或吖啶；TILLING(靶向诱导的基因组中局部损伤(targeting induced local lesion in genome))，其中突变由化学诱变剂诱导，并且诱变伴随着从每个突变的植物品系或种子分离染色体DNA并使用先进的分子技术在DNA水平上进行种子或植物种群的筛选；锌指核酸酶。一旦通过诱变观察到期望的性状，则可通过传统育种技术将该性状并入到现有种质(germplasm)中。突变育种的细节可见于：Sikora，Per等，″Mutagenesis as a Tool in Plant Genetics，Functional Genomics，and Breeding"International Journal of Plant Genomics.2011(2011)；13页；Petilino，Joseph F.″Genome editing in plants via designed zinc finger nucleases″In Vitro Cell Dev Biol Plant.51(1)：第1至8页(2015)；以及Daboussi，Fayza等."Engineering
Meganuclease for Precise Plant Genome Modification"in Advances in New
Technology for Targeted Modification of Plant Genomes.Springer Science+Business.第21至38页(2015)。
14))、或紫外辐射(优选2500至2900纳米)；化学诱变剂(例如碱基类似物(5-溴-尿嘧啶))、相关化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(链黑菌素)、烷化剂(硫芥、氮芥、环氧化物、乙烯胺、硫酸盐、磺酸盐(例如甲磺酸乙酯)、砜、内酯)、叠氮化钠、羟胺、亚硝酸、甲基亚硝基脲(methylnitrilsourea)或吖啶；TILLING(靶向诱导的基因组中局部损伤(targeting induced local lesion in genome))，其中突变由化学诱变剂诱导，并且诱变伴随着从每个突变的植物品系或种子分离染色体DNA并使用先进的分子技术在DNA水平上进行种子或植物种群的筛选；锌指核酸酶。一旦通过诱变观察到期望的性状，则可通过传统育种技术将该性状并入到现有种质(germplasm)中。突变育种的细节可见于：Sikora，Per等，″Mutagenesis as a Tool in Plant Genetics，Functional Genomics，and Breeding"International Journal of Plant Genomics.2011(2011)；13页；Petilino，Joseph F.″Genome editing in plants via designed zinc finger nucleases″In Vitro Cell Dev Biol Plant.51(1)：第1至8页(2015)；以及Daboussi，Fayza等."Engineering
Meganuclease for Precise Plant Genome Modification"in Advances in New
Technology for Targeted Modification of Plant Genomes.Springer Science+Business.第21至38页(2015)。
[0084] 另外的方法包括但不限于使用直接基因转移方法(例如微粒(microprojectile)介导的递送、DNA注射、电穿孔等)将表达载体引入到植物组织中。更优选地，通过使用具有生物射弹装置(biolistic device)的微粒介导的递送或通过使用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将表达载体引入到植物组织中。用实施方案的原生质获得的转化体植物旨在在实施方案的范围内。
[0085] 使用CRISPR进行基因编辑
[0086] 可使用CRISPR/Cas9技术(Saunders&Joung，Nature Biotechnology，32，347-355，2014)进行靶向基因编辑。CRISPR是代表规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)的一类基因组编辑系统。该系统和CRISPR相关(Cas)基因能够使生物体(例如选择的细菌和古细菌)响应于并消除入侵的遗传物质。Ishino，Y.等.J.Bacteriol.169，5429-5433(1987)。这些重复序列早在20世纪80年代就在大肠杆菌中得知，但Barrangou及其同事们示出，嗜热链球菌(S.thermophilus)可通过将感染性病毒基因组的片段整合到其CRISPR基因座中来获得对噬菌体的抗性。Barrangou，R.等.Science 315，1709-1712(2007)。许多植物已使用CRISPR系统进行了修饰。参见例如Zhang，B等，″Exploiting the CRISPR/Cas9 System for Targeted Genome Mutagenesis in Petunia"Science Reports，第6卷，2016年2月。
[0087] 还可使用用于基因编辑的crRNA引导的监测系统进行基因编辑。关于用于基因编辑的crRNA引导的监测复合系统的另外的信息可见于通过引用整体并入的以下文件：美国申请公开No.2010/0076057(Sontheimer等，Target DNA Interference with crRNA)；美国申请公开No.2014/0179006(Feng，CRISPR-CAS Component Systems，Methods，and Compositions for Sequence Manipulation)；美国申请公开No.2014/0294773(Brouns等，Modified Cascade Ribonucleoproteins and Uses Thereof)；Sorek等，Annu.Rev.Biochem.82：273-266，2013；以及Wang，S等，Plant Cell Rep(2015)34：1473-
1476。
1476。
[0088] 分子标记育种
[0089] 在育种过程期间也可使用分子标记来选择定性性状。例如，与等位基因密切相关的标记或包含实际感兴趣等位基因内的序列的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣等位基因的植物。标记还可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的基因组进行选择。使用该操作可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除某些种质来源作为植物的祖先或亲本品种。包括通过使用例如以下的技术鉴定的标记的分子标记可用于利用本申请的植物的植物育种方法：同工酶电泳、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、任意引发聚合酶链反应(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR)、DNA扩增指纹技术(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)、序列特征扩增区(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide
Polymorphism，SNP)。参见Vainstein，″Breeding for Ornamentals：Classical and Molecular Approaches，″Kluwer Academic Publishers(2002)。
Polymorphism，SNP)。参见Vainstein，″Breeding for Ornamentals：Classical and Molecular Approaches，″Kluwer Academic Publishers(2002)。
[0090] 分子标记的一种用途是数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)映射。QTL映射是使用标记，已知所述标记与对于数量性状具有可测量影响的等位基因密切相关。
育种过程中的选择是基于与正效应等位基因相关的标记的累积和/或与来自植物基因组的负效应等位基因相关的标记的消除。参见例如Fletcher，Richard S等，″QTL analysis of root morphology，flowering time，and yield reveals trade-offs in response to drought in Brassica napus"Journal of Experimental Biology.66(1)：245-256(2014)。在育种过程期间也可使用QTL标记来选择定性性状。例如，与等位基因密切相关的标记或包含实际感兴趣等位基因内的序列的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣等位基因的植物。标记还可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的基因组进行选择。使用该操作可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除作为植物的祖先或亲本品种的某些种质来源。
育种过程中的选择是基于与正效应等位基因相关的标记的累积和/或与来自植物基因组的负效应等位基因相关的标记的消除。参见例如Fletcher，Richard S等，″QTL analysis of root morphology，flowering time，and yield reveals trade-offs in response to drought in Brassica napus"Journal of Experimental Biology.66(1)：245-256(2014)。在育种过程期间也可使用QTL标记来选择定性性状。例如，与等位基因密切相关的标记或包含实际感兴趣等位基因内的序列的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣等位基因的植物。标记还可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的基因组进行选择。使用该操作可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除作为植物的祖先或亲本品种的某些种质来源。
[0091] 用于检测用于标记辅助育种的SNP的方法
[0092] 除了位点的直接或间接测序之外，SNP还可通过本领域中公知的多种有效方法来检测，其包括在美国专利No.5,468,613和5,217,863；5,210,015；5,876,930；6,030,787；6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；5,945,283；5,468,613；6,090,558；5,800,944和5,616,464中公开的那些。特别地，DNA序列中的多态性可通过如美国专利No.5,468,613和5,217,863中所公开的与等位基因特异性寡核苷酸(allele-specific
oligonucleotide，ASO)探针的杂交来检测。设计ASO探针的核苷酸序列以形成完美匹配的杂合体或在可变核苷酸残基的位点处包含错配的碱基对。匹配和错配杂合体之间的区别是基于在杂交或洗涤过程中所使用条件下的杂合体的热稳定性差异，通过变性梯度电泳或在错配位点处的化学切割分析的杂合体的稳定性差异。
oligonucleotide，ASO)探针的杂交来检测。设计ASO探针的核苷酸序列以形成完美匹配的杂合体或在可变核苷酸残基的位点处包含错配的碱基对。匹配和错配杂合体之间的区别是基于在杂交或洗涤过程中所使用条件下的杂合体的热稳定性差异，通过变性梯度电泳或在错配位点处的化学切割分析的杂合体的稳定性差异。
[0093] 如果SNP产生或破坏限制性内切核酸酶切割位点，其将改变通过用该限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段的大小或特征。因此，通过限制性片段分析，可将具有变体序列的植物与具有原始序列的那些区分开来。可以以这种方式鉴定的SNP被称为“限制性片段长度多态性”(“restriction fragment length polymorphism，RFLP”)。RFLP已广泛用于人和植物遗传分析(Glassberg，英国专利申请2135774；Skolnick等，Cytogen.Cell Genet.32：58-67(1982)；Botstein等，Ann.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；Fischer等，PCT申请WO
90/13668；Uhlen，PCT申请WO 90/11369。
90/13668；Uhlen，PCT申请WO 90/11369。
[0094] 确定SNP的替代方法是基于切割的扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS)(Konieczny，A.和F.M.Ausubel，Plant J.4：403-410(1993)；
Lyamichev等，Science 260：778-783(1993)。被称为dCAP的CAP的修饰形式是用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。dCAPS技术通过使用包含与模板DNA具有一个或更多个错配的引物引入或破坏限制酶识别位点。然后对以这种方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所得的限制性模式确定SNP的存在或不存在。该技术可用于对分离的DNA的已知突变和遗传映射进行基因分型(Neff MM，Neff JD，Chory J，Pepper AE.dCAPS，a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms：experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J.1998May；14(3)：387-92)。
Lyamichev等，Science 260：778-783(1993)。被称为dCAP的CAP的修饰形式是用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。dCAPS技术通过使用包含与模板DNA具有一个或更多个错配的引物引入或破坏限制酶识别位点。然后对以这种方式修饰的PCR产物进行限制酶消化，并通过所得的限制性模式确定SNP的存在或不存在。该技术可用于对分离的DNA的已知突变和遗传映射进行基因分型(Neff MM，Neff JD，Chory J，Pepper AE.dCAPS，a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms：experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J.1998May；14(3)：387-92)。
[0095] SNP还可通过单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)分析来鉴定。SSCP技术是能够识别单链DNA中大多数序列变异(通常为150到250个核苷酸长)的方法(Elles，Methods in Molecular Medicine：Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，Humana Press(1996)；Orita等，Genomics 5：874-879(1989)。在变性条件下，单链DNA将采用独特地依赖于其序列的构象。即使只改变单个碱基，这种构象通常也将会不同。已报道大多数构象充分地改变物理结构或大小以可通过电泳检测。已描述了许多SSCP方案，其包括但不限于Lee等，Anal.Biochem.205：289-293(1992)；Suzuki等，Anal.Biochem.192：82-84(1991)；Lo等，Nucleic Acids Research 20：1005-1009(1992)；Sarkar等，Genomics 13：441-443(1992)。
[0096] SNP还可使用被称为扩增片段长度多态性(AFLP)的DNA指纹技术来检测，其基于来自基因组DNA总消化物的限制性片段的选择性PCR扩增以描述该DNA。Vos等，Nucleic Acids Res.23：4407-4414(1995)。该方法允许许多限制性片段的特异性共扩增，其可在不知道核酸序列的情况下进行分析。AFLP基本上采用了三个步骤。最初，用限制酶切割基因组DNA样品，并将寡核苷酸衔接子连接至DNA的限制性片段。然后通过使用衔接子和限制性序列作为引物退火的靶位点使用PCR扩增限制性片段。通过使用延伸到限制性片段中的引物实现选择性扩增，仅扩增其中引物延伸与限制性位点两侧的核苷酸匹配的那些片段。然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上使这些扩增的片段可视化(Beismann等，Mol.Ecol.6：989-993(1997)；Janssen等，Int.J.Syst.Bacteriol 47：1179-1187(1997)；Huys等，
Int.J.Syst.Bacteriol.47：1165-1171(1997)；McCouch等，Plant Mol.Biol.35：89-99(1997)；Nandi等，Mol.Gen.Genet.255：1-8(1997)；Cho等，Genome 39：373-378(1996)；
Simons等，Genomics 44：61-70(1997)；Cnops等，Mol.Gen.Genet.253：32-41(1996)；Thomas等，Plant J.8：785-794(1995)。
Int.J.Syst.Bacteriol.47：1165-1171(1997)；McCouch等，Plant Mol.Biol.35：89-99(1997)；Nandi等，Mol.Gen.Genet.255：1-8(1997)；Cho等，Genome 39：373-378(1996)；
Simons等，Genomics 44：61-70(1997)；Cnops等，Mol.Gen.Genet.253：32-41(1996)；Thomas等，Plant J.8：785-794(1995)。
[0097] SNP还可使用随机扩增多态性DNA(RAPD)来检测(Williams等，Nucl.Acids Res.18：6531-6535(1990))。
[0098] SNP可通过如美国专利No.5,210,015；5,876,930和6,030,787中所公开的方法来检测，其中具有报道分子和猝灭剂分子的寡核苷酸探针与靶多核苷酸杂交。该探针被核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所降解。
[0099] SNP还可通过如美国专利No.6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；以及5,945,283中所公开的标记的碱基延伸方法来检测。这些方法基于引物延伸和可检测的核苷三磷酸的并入。引物被设计成退火至与可变核苷酸紧邻的序列，该序列可在并入少至一个经标记的核苷三磷酸之后被检测到。美国专利No.5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可在核酸中通过以下过程检测：其中包含核苷酸变异的序列被扩增、点在膜上并用经标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。
[0100] 除了上述那些方法之外，用于鉴定和检测SNP的其他方法包括使用限制酶(Botstein等，Am.J.Hum.Genet.32：314-331(1980)；以及Konieczny和Ausubel，Plant J.4：
403-410(1993))、酶和化学错配测定(Myers等，Nature 313：495-498(1985))、等位基因特异性PCR(Newton等，Nucl.Acids Res.17：2503-2516(1989)；以及Wu等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2757-2760(1989))、连接酶链反应(Barany，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))、单链构象多态性分析(Labrune等，Am.J.Hum.Genet.48：1115-1120(1991))、单碱基引物延伸(Kuppuswamy等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1143-1147(1991)；以及Goelet，美国专利No.6,004,744和5,
888,819，基于固相ELISA的寡核苷酸连接测定(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.22：4167-
4175(1994))、双脱氧指纹技术(Sarkar等，Genomics13：441-443(1992))、寡核苷酸荧光猝灭测定(Livak等，PCR Methods Appl.4：357-362(1995))、5’-核酸酶等位基因特异性杂交TAQMAN测定(Livak等，Nature Genet.9：341-342(1995))、模板指导的染料-终止子并入(dye-terminator incorporation，TDI)测定(Chen和Kwok，Nucl.Acids Res.25：347-353(1997))、等位基因特异性分子信标测定(Tyagi等，Nature Biotech.16：49-53(1998))、PinPoint测定(Haff和Smimov，Genome Res.7：378-388(1997))、dCAPS分析(Neffetal.，Plant J.14：387-392(1998))、焦磷酸测序(Ronaghi等，Analytical Biochemistry 267：
65-71(1999))；Ronaghi等，PCT申请WO 98/13523；以及Nyren等，PCT申请WO 98/28440)、使用质谱法例如MASSCODE系统(Howbert等WO 99/05319；Howber等WO 97/27331)、质谱(美国专利No.5,965,363，寡核苷酸探针的侵入性切割(Lyamichev等，Nature Biotechnology
17：292-296)，以及使用高密度寡核苷酸阵列(Hacia等，Nature Genetics 22：164-167)。
403-410(1993))、酶和化学错配测定(Myers等，Nature 313：495-498(1985))、等位基因特异性PCR(Newton等，Nucl.Acids Res.17：2503-2516(1989)；以及Wu等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2757-2760(1989))、连接酶链反应(Barany，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))、单链构象多态性分析(Labrune等，Am.J.Hum.Genet.48：1115-1120(1991))、单碱基引物延伸(Kuppuswamy等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1143-1147(1991)；以及Goelet，美国专利No.6,004,744和5,
888,819，基于固相ELISA的寡核苷酸连接测定(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.22：4167-
4175(1994))、双脱氧指纹技术(Sarkar等，Genomics13：441-443(1992))、寡核苷酸荧光猝灭测定(Livak等，PCR Methods Appl.4：357-362(1995))、5’-核酸酶等位基因特异性杂交TAQMAN测定(Livak等，Nature Genet.9：341-342(1995))、模板指导的染料-终止子并入(dye-terminator incorporation，TDI)测定(Chen和Kwok，Nucl.Acids Res.25：347-353(1997))、等位基因特异性分子信标测定(Tyagi等，Nature Biotech.16：49-53(1998))、PinPoint测定(Haff和Smimov，Genome Res.7：378-388(1997))、dCAPS分析(Neffetal.，Plant J.14：387-392(1998))、焦磷酸测序(Ronaghi等，Analytical Biochemistry 267：
65-71(1999))；Ronaghi等，PCT申请WO 98/13523；以及Nyren等，PCT申请WO 98/28440)、使用质谱法例如MASSCODE系统(Howbert等WO 99/05319；Howber等WO 97/27331)、质谱(美国专利No.5,965,363，寡核苷酸探针的侵入性切割(Lyamichev等，Nature Biotechnology
17：292-296)，以及使用高密度寡核苷酸阵列(Hacia等，Nature Genetics 22：164-167)。
[0101] 虽然本文中描述了用于检测SNP的某些方法，但是也可使用其他检测方法。例如，在以下文献中已知并进行陈述的另外的方法：Birren等，Genome Analysis，4：135-186，A Laboratory Manual.Mapping Genomes，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1999)；Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology.A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1995)；Paterson，Biotechnology Intelligence Unit：Genome Mapping in Plants，R.G.Landes Co.，Georgetown，Tex.和Academic Press，San Diego，Calif.(1996)；The Maize Handbook，Freeling和Walbot eds.，Springer-Verlag，New York，N.Y.(1994)；
Methods in Molecular Medicine：Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，Elles ed.，Humana Press，Totowa，N.J.(1996)；Clark ed.，Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark ed.，Springer-Verlag，Berlin，Germany(1997)。
Methods in Molecular Medicine：Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，Elles ed.，Humana Press，Totowa，N.J.(1996)；Clark ed.，Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark ed.，Springer-Verlag，Berlin，Germany(1997)。
[0102] 用于检测和测量甜菊醇糖苷的方法
[0103] 可使用HPLC检测和测量甜菊醇糖苷。下述方案是一个实例。
[0104] 对于HPLC分析，将甜菊叶样品风干/烘干，然后使用研杵和研钵将其研磨成细粉。对于每个样品，用15ml 60℃蒸馏水提取叶粉末(100mg)18小时。离心混合物并过滤上清液并收集用于通过HPLC(Agilent，USA)的甜菊醇糖苷组成分析。甜菊醇糖苷的分析使用配备Agilent Poroshell 120SB-C18 2.7μm，4.6×150mm的Agilent Technologies 1200系列(USA)HPLC进行。设置在210nm的二极管阵列用作检测器。用于所有糖苷(包括莱鲍迪苷E、RebD、RebM、莱鲍迪苷N和莱鲍迪苷O)的参考标准购自ChromaDex Inc.(USA)。以下方法用于分析莱鲍迪苷E(RebE)、RebD、RebM、莱鲍迪苷N(RebN)和莱鲍迪苷O(RebO)：柱温：40℃，流动相：溶剂A10mM磷酸二氢钠pH 2.6：乙腈，75％：25％(v/v)，溶剂B水∶乙腈，50％∶50％(v/v)，梯度程序％v/v：在0.0和14.0分钟时100％A和0％B，在14.5和25.0分钟时，100％B和0％A，流量：0.5mL/分钟，进样：5μL，自动进样器温度：环境温度。除了流动相由等度10mM磷酸二氢钠pH 2.6：乙腈，68％∶32％(v/v)，流量为1.0mL/分钟，运行时间为20分钟以外，使用上述相同的方法分析莱鲍迪苷A(RebA)、甜菊苷(Stev)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷C(RebC)、杜克苷A(Dulcoside A，DulA)、覆盆子苷(Rubusoside，Rub)、莱鲍迪苷B(RebB)和甜菊醇双苷(Stev)。
[0105] 除了HPLC之外，可通过本领域中公知的许多方法检测和测量甜菊醇糖苷。
[0106] 另外的育种方法
[0107] 在任何期望的植物种质的开发中存在许多步骤。植物育种始于对当前种质问题和劣势的分析和定义、计划目标的制定以及对特定育种目标的定义。下一步是选择具有满足计划目标的性状的种质。目标是在单个栽培品种中组合来自亲本种质的期望性状的改进组合。在甜菊中，重要性状为叶产率，早熟，改善的叶片品质、莱鲍迪苷含量、甜菊苷含量，对病虫害的抗性，对旱热的抗性和改善的农学性状。育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改善性状的遗传力，以及商业上使用的栽培品种类型(例如F1杂交栽培品种、纯系栽培品种等)。对于高度可遗传的性状，在单个位置处评价优质个体植物的选择将是有效的，而对于具有低遗传力的性状，选择应基于从相关植物家族的重复评价获得的平均值。流行的选择方法通常包括谱系选择、改进的谱系选择、重量选择(mass selection)和轮回选择。
[0108] 遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种用于将高度可遗传性状的一个或一些有利基因转移到期望的栽培品种中。该方法已广泛用于对于抗病栽培品种进行育种。多种轮回选择技术用于改善由许多基因控制的定量遗传性状。在自花授粉作物中轮回选择的使用取决于授粉的容易程度、每次授粉成功杂交的频率、以及每个成功杂交的杂交后代的数量。
[0109] 每个育种程序应包括对育种操作效率的定期、客观评价。评价标准根据目标和目的而不同，但应包括基于与适当标准的比较、先进育种品系的总体价值、以及每单位投入(例如，每年、每消费的美元数等)产生的成功栽培品种的数量的每年来自选择的收益。
[0110] 有前途的先进育种品系经过全面测试，并与代表商业目标区域的环境中的流行栽培品种进行了三年或更多年的比较。比流行的栽培品种优良的品系是成为新的商业栽培品种的候选者。那些仍然缺乏一些性状的品系被丢弃或用作亲本以产生新的种群用于进一步选择。
[0111] 导致营销和分销的最后步骤的这些过程通常需要从进行第一次杂交开始起7到12年。因此，开发新栽培品种是一个耗时的过程，需要精确的前瞻性规划、资源的高效利用以及方向的最小变化。
[0112] 最困难的任务是鉴定遗传上优良的个体，因为对于大多数性状，真实的基因型值被其他混杂的植物性状或环境因素所掩盖。鉴定优良植物的一种方法是观察其相对于其他实验品系和广泛培养的标准栽培品种的性能。对于许多性状，单个观察结果是不确定的，并且需要在时间和空间上重复观察以提供对品系的遗传价值的良好估计。
[0113] 商业甜菊育种程序的目标是开发新的、独特的和优良的甜菊栽培品种。育种者最初选择两个或更多个亲本品系并使其杂交，然后进行世代进化和选择，从而产生许多新的遗传组合。通过这种操作，育种者理论上可产生数十亿种不同的遗传组合。育种者无法直接控制在其培养的有限种群规模中将会出现哪种遗传组合。因此，两个育种者将永远不会开发出具有相同性状的相同品系。
[0114] 每年，植物育种者选择种质以推进至下一代。该种质在独特且不同的地理、气候和土壤条件下生长，并随后在生长季节期间和结束时进行进一步选择。所开发的品系是不可预测的。这种不可预测性是因为育种者的选择发生在独特的环境中，在DNA水平上没有控制(使用常规育种操作)，并且产生了数百万种不同的可能的遗传组合。本领域普通技术育种人员不能预测他开发的最终所得品系，除了可能以非常粗略和一般的方式。通过使用完全相同的原始亲本和相同的选择技术，同一育种者不能以任何合理的可能性产生相同的栽培品种两次。这种不可预测性导致大量研究资金的开支用于开发优良的新的甜菊栽培品种。
[0115] 甜菊的纯系栽培品种通常通过使两个或更多个亲本杂交然后进行选择来繁殖。遗传的复杂性、育种目标和可利用的资源均影响育种方法。谱系育种、轮回选择育种和回交育种是通常用于自花授粉作物(例如甜菊)的育种方法。这些方法涉及其中制备育种池或种群以组合来自两个或更多个栽培品种或多种广泛来源的期望性状的方式。通常用于选择期望个体或个体种群的操作被称为重量选择、株行选择(plant-to-row selection)和单粒传法(single seed descent)或改进的单粒传法。这些选择方法中的一种或其组合可用于从育种种群开发栽培品种。
[0116] 谱系育种主要用于将有利基因组合成全新栽培品种，其在许多性状上与用于原始杂交的任一亲本不同。其通常用于改良自花授粉作物。将具有有利的互补性状的两个亲本杂交以产生F1(子一代)。通过使F2植物自交产生F2群体。期望个体植物的选择可早在其中发生最大基因分离的F2代开始。个体植物选择可发生一代或更多代。接下来，来自每个所选植物的种子可种植在被称为后代行(progeny row)或后代山(progeny hill)的单独的、识别的行或山中以评价该品系并提高种子数量，或进一步选择个体植物。一旦选择具有期望性状的后代行或后代山，其就变成所谓的育种品系，其可从源自相同原始种群的其他育种品系中特异性地鉴定。在高世代(advanced generation)(即F5或更高)中，在重复测试中评价个体品系的种子。在高级阶段，测试来自相同原始杂交的最佳品系或表型相似品系的混合物作为新栽培品种的潜在释放。
[0117] 严格意义上的单粒传法操作是指种植分离种群，从每柱植物中收获一粒种子，并将这些种子组合成批(bulk)，其作为下一代种植。当群体已经进展至期望的近交水平时，从其来源的品系的植物将分别追踪至不同的F2个体。单粒传法操作的主要优点是延迟选择，直至在单个植物中实现高水平的纯合性(例如，缺乏基因分离)，并且通常通过使用冬季苗圃快速通过这些早期世代。
[0118] 改进的单粒传法操作涉及从种群中的每个植物收获多个种子(即单个锁(single lock)或简单铃(simple boll))并将它们组合以形成批。该批的一部分用于种植下一代，且一部分用于储备。该操作已被用于在收获时节省劳动力并保持足够的种群种子数量。
[0119] 期望性状的选择可在任何分离的世代(F2及更高)发生。通过在最大程度地表达期望性状的环境中培养种群并且可鉴定具有该性状的个体或品系而对种群施加选择压力。例如，当植物或品系在天然或人工诱导的疾病环境中培养时，可进行对抗病性的选择，并且育种者仅选择几乎没有或没有疾病并因此被认为具有抗性的那些个体。
[0120] 确定甜菊基因型的方法
[0121] 除了表型观察之外，还可检测植物的基因型。存在许多基于实验室的技术可用于植物基因型的分析、比较和表征。其中包括同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹技术(DAF)、序列特征扩增区(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR-也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。
[0122] 同工酶电泳和RFLP已广泛用于确定遗传组成。Shoemaker和Olsen，(Molecular Linkage Map of Soybean(Glycine max L.Merr.)，第6.131至6.138页，SJ O′Brien(编辑)Genetic Maps：Locus Maps of Complex Genomes，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，(1993))开发了分子遗传连锁图谱，其由25个具有约365个RFLP、11个RAPD、3个经典标记和4个同工酶基因座的连锁群组成。还参见Shoemaker，R.C.，RFLP Map of Soybean，第299至309页，in Phillips，R.L.和Vasil，I.K.(Eds.)，DNA-Based Markers in Plants，Kluwer Academic Press，Dordrecht，the Netherlands(1994)。
[0123] SSR技术是目前最高效且实用的标记技术；与RFLP相比，可常规使用更多的标记基因座，并且可使用SSR找到每个标记基因座的更多等位基因。例如，Diwan和Cregan描述了在大豆中具有多达26个等位基因的高度多态微卫星基因座。Diwan，N.和Cregan，P.B.，Theor.Appl.Genet.，95：22-225(1997)。本文中描述的那些的另外的SNP也可用于鉴定本发明的独特遗传组成和保留该独特遗传组成的后代品种。可组合使用多种分子标记技术以增强总体分辨率。
[0124] 包括通过使用例如同工酶电泳、RFLP、RAPD、AP-PCR、DAF、SCAR、AFLP、SSR和SNP的技术鉴定的标记的分子标记可用于植物育种。分子标记的一种用途是数量性状基因座(QTL)映射。QTL映射是使用已知与对于数量性状具有可测量的影响的等位基因密切相关的标记。育种过程中的选择基于与正效应等位基因相关的标记的积累和/或与来自植物基因组的负效应等位基因相关的标记的消除。
[0125] 在育种过程期间也可使用分子标记来选择定性性状。例如，与包含实际感兴趣等位基因内的序列的等位基因或标记密切相关的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣的等位基因的植物。例如，分子标记用于大豆育种以选择对大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode)具有抗性的性状，参见美国专利No.6,162,967。标记也可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的标记进行选择。使用该操作可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除作为植物的祖先或亲本品种的某些种质来源，如下文中更全面地讨论的。
[0126] 另外的实施方案
[0127] 随着允许分离和表征编码特定蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家们对设计植物基因组以包含和表达外源基因或者另外的或经修饰形式的天然或内源基因(可能由不同的启动子驱动)以便以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。这样的外源的另外的和/或经修饰的基因在本文中被统称为“转基因”。在过去的十五至二十年中，已经开发了数种用于产生转基因植物的方法，在一些特定的实施方案中，还涉及要求保护的栽培品种的转化形式。
[0128] 植物转化涉及构建将在植物细胞中发挥作用的表达载体。这样的载体包含含有受调节元件(例如，启动子)控制或与其可操作地连接的基因的DNA。表达载体可包含一个或更多个这样的可操作地连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒的形式，并且可单独使用或与其他质粒组合使用，以提供经转化的甜菊植物，使用如下所述的转化方法将转基因并入到甜菊植物的遗传物质中。
[0129] 用于甜菊转化的表达载体：标记基因
[0130] 表达载体包括至少一个可操作地连接至调节元件(例如，启动子)的遗传标记，其允许通过阴性选择(即，抑制不包含选择标记基因的细胞的生长)或通过阳性选择(即，筛选由遗传标记编码的产物)来回收包含标记的转化细胞。用于植物转化的许多常用的选择标记基因在转化领域中是已知的，并且包括例如编码代谢解毒选择性化学试剂的酶的基因，所述选择性化学试剂可以是抗生素或除草剂，或者编码对抑制剂不敏感的经改变靶标的基因。一些正选择方法也是本领域中已知的。
[0131] 用于植物转化的一种常用的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)，其在植物调节信号的控制下赋予对卡那霉素的抗性。Fraley等，PNAS，80：4803(1983)。另一种常用的选择标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。Vanden Elzen等，Plant Mol.Biol.，5：299(1985)。
[0132] 赋予对抗生素之抗性的细菌来源的另外的选择标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3’-腺苷转移酶，即博来霉素抗性决定子。Hayford等，Plant Physiol.，86：1216(1988)；Jones等，Mol.Gen.Genet.，210：86(1987)；Svab等，Plant Mol.Biol.，14：197(1990)；Hille等，Plant Mol.Biol.，7：171(1986)。其他选择标记基因赋予对除草剂(例如草甘膦、草铵膦或溴苯腈)的抗性。Comai等，Nature，317：741-744(1985)；Gordon-Kamm等，Plant Cell，2：603-618(1990)；以及Stalker等，Science，242：419-423(1988)。
[0133] 用于非细菌来源的植物转化的其他选择标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholtz等，Somatic Cell Mol.Genet.，13：67(1987)；Shah等，Science，233：478(1986)；Charest等，Plant Cell Rep.，8：643(1990)。
[0134] 用于植物转化的另一类标记基因需要筛选推定转化的植物细胞，而不是直接遗传选择经转化细胞对毒性物质(例如抗生素)的抗性。这些基因特别可用于量化或可视化特定组织中基因表达的空间模式，并且通常被称为报道基因，因为其可与基因或基因调控序列融合以研究基因表达。用于筛选推定转化细胞的常用基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase，GUS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson，R.A.，Plant Mol.Biol.Rep.，5：387(1987)；Teeri等，EMBO J.，8：343(1989)；Koncz等，PNAS，84：131(1987)；DeBlock等，EMBO J.3：1681(1984)。
[0135] 可获得用于不需要破坏植物组织的可视化GUS活性的体内方法。Molecular Probes Publication 2908，IMAGENE GREEN，第1至4页(1993)和Naleway等，J.Cell Biol.，115：151a(1991)。然而，由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择标记相关的限制，这些用于可视化GUS活性的体内方法未被证明可用于回收经转化细胞。编码绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的基因在原核和真核细胞中已被用作用于基因表达的标记。Chalfie等，Science，263：802(1994)。GFP和GFP突变体可用作可筛选标记。
[0136] 用于甜菊转化的表达载体：启动子
[0137] 包含在表达载体中的基因必须由包含调节元件(例如，启动子)的核苷酸序列驱动。目前，数种类型的启动子在转化领域中是公知的，可单独使用或与启动子组合使用的其他调节元件也是如此。
[0138] 本文中使用的，“启动子”包括提及来自转录起始上游的DNA区域，并参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子。发育控制下的启动子的实例包括在某些组织(例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞(tracheid)或厚壁组织(sclerenchyma))中优先启动转录的启动子。这样的启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一个或更多个器官中某些细胞类型的表达，例如，根或叶中的维管细胞。“诱导型”启动子是受环境控制的启动子。可能通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下具有活性的启动子。
[0139] A.诱导型启动子：
[0140] 诱导型启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。任选地，诱导型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。对于诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而提高。
[0141] 任何诱导型启动子均可用于本发明。参见Ward等，Plant Mol.Biol.，22：361-366(1993)。示例性诱导型启动子包括但不限于来自响应于铜的ACEI系统的启动子(Mett等，PNAS，90：4567-4571(1993))；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等，Mol.Gen.Genet.，227：229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genet.，243：32-38(1994))；或来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz等，Mol.Gen.Genet.，227：229-237(1991))。诱导型启动子的一个实例是响应于植物通常不响应之诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性由糖皮质激素诱导(Schena等，PNAS，88：0421(1991))。
[0142] B.组成型启动子：
[0143] 组成型启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因，或者组成型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。
[0144] 许多不同的组成型启动子可用于本发明。示例性的组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，例如来自CaMV的35S启动子(Odell等，Nature，313：810-812(1985))和来自例如稻肌动蛋白(rice actin)的基因的启动子。(McElroy等，Plant Cell，2：163-171(1990))；泛素(Christensen等，Plant Mol.Biol.，12：619-632(1989)和Christensen等，Plant Mol.Biol.，18：675-689(1992))；pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.，81：581-588(1991))；MAS(Velten等，EMBO J.，3：2723-2730(1984))；以及玉米H3组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genet.，231：276-285(1992)和Atanassova等，Plant Journal，2(3)：291-300(1992))。
[0145] ALS启动子，即甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的XbaI/NcoI片段(或与所述XbaI/NcoI片段相似的核苷酸序列)代表特别地可用的组成型启动子。参见PCT申请No.WO 96/30530。
[0146] C.组织特异性或组织优选的启动子：
[0147] 组织特异性启动子可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。任选地，组织特异性启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊中表达的基因。用可操作地连接至组织特异性启动子的感兴趣基因转化的植物仅在或优先在特定组织中产生转基因的蛋白质产物。
[0148] 任何组织特异性或组织优选的启动子都可用于本发明。示例性的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于：根优选的启动子，例如来自菜豆蛋白(phaseolin)基因的启动子(Murai等，Science，23：476-482(1983)和Sengupta-Gopalan等，PNAS，82：3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab或rubisco的启动子(Simpson等，EMBO J.，4(11)：2723-2729(1985)和Timko等，Nature，318：579-582(1985))；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子(Twell等，Mol.Gen.Genet.，217：240-245(1989))；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子(Guerrero等，Mol.Gen.Genet.，244：161-168(1993))；或小孢子优选的启动子，例如来自apg的启动子(Twell等，Sex.Plant Reprod.，6：217-224(1993))。
[0149] 用于将蛋白质靶向到亚细胞区室的信号序列
[0150] 通过将编码信号序列的核苷酸序列与编码感兴趣蛋白的基因的5’和/或3’区可操作地连接来实现将转基因产生的蛋白质转运至亚细胞区室，例如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体(glyoxysome)、细胞壁或线粒体，或用于分泌到质外体(apoplast)中。在蛋白质合成和加工期间，结构基因的5’和/或3’末端的靶向序列可确定所编码蛋白质最终被区室化的位置。
[0151] 信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室或用于分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等，Plant Mol.Biol，20：49(1992)；Close，P.S.，Master′s Thesis，Iowa State University(1993)；Knox，C.等，Plant Mol.Biol，9：3-17(1987)；Lerner等，Plant Physiol.，91：124-129(1989)；Fontes等，Plant Cell，3：
483-496(1991)；Matsuoka等，PNAS，88：834(1991)；Gould等，J.Cell.Biol.，108：1657(1989)；Creissen等，Plant J.，2：129(1991)；Kalderon等，Cell，39：499-509(1984)；
Steifel等，Plant Cell，2：785-793(1990)。
483-496(1991)；Matsuoka等，PNAS，88：834(1991)；Gould等，J.Cell.Biol.，108：1657(1989)；Creissen等，Plant J.，2：129(1991)；Kalderon等，Cell，39：499-509(1984)；
Steifel等，Plant Cell，2：785-793(1990)。
[0152] 用于甜菊转化的方法
[0153] 已开发了许多用于植物转化的方法，其包括生物和物理植物转化方案。参见例如Mild等，″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants″in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67至88页(1993)。另外，可获得用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如Gruber等，″Vectors for Plant Transformation"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第89至119页(1993)。
[0154] A.农杆菌介导的转化：
[0155] 用于将表达载体引入到植物中的一种方法基于农杆菌的天然转化系统。参见例如Horsch等，Science，227：1229(1985)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其遗传地转化植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见例如Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant Sci.，10：1(1991)。农杆菌载体系统的描述和用于农杆菌介导的基因转移方法由Gruber等，同上，Miki等，同上，和Moloney等，Plant Cell Rep.，8：238(1989)提供。还参见1996年10月8日发布的美国专利No.5,563,055(Townsend和Thomas)。
[0156] B.直接基因转移：
[0157] 已开发了被统称为直接基因转移的数种植物转化方法作为农杆菌介导的转化的替代方法。通常可应用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中DNA被携带在1μm至4μm的微粒表面上。使用生物射弹装置将表达载体引入到植物组织中，所述生物射弹装置将微粒加速至300m/s至600m/s的速度，其足以穿透植物细胞壁和膜。Sanford等，Part.Sci.Technol.，5：27(1987)；Sanford，J.C.，Trends Biotech.，6：299(1988)；Klein等，Bio/technology，6：559-563(1988)；Sanford，J.C.，Physiol Plant，7：206(1990)；
Klein等，Bio/technology，10：268(1992)。还参见1991年5月14日发布的美国专利No.5,
015,580(Christou等)；1994年6月21日发布的美国专利No.5,322,783(Tomes等)。
Klein等，Bio/technology，10：268(1992)。还参见1991年5月14日发布的美国专利No.5,
015,580(Christou等)；1994年6月21日发布的美国专利No.5,322,783(Tomes等)。
[0158] 用于将DNA物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理。Zhang等，Bio/technology，9：996(1991)。或者，脂质体和原生质球融合已用于将表达载体引入到植物中。Deshayes等，EMBO J.，4：2731(1985)；Christou等，PNAS，84：3962(1987)。还报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA吸收到原生质体中。Hain等，
Mol.Gen.Genet.，199：161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。还描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn等，In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53(1990)；D’Halluin等，Plant Cell，4：1495-1505(1992)；以及Spencer等，Plant Mol.Biol.，24：51-61(1994)。
Mol.Gen.Genet.，199：161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。还描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn等，In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53(1990)；D’Halluin等，Plant Cell，4：1495-1505(1992)；以及Spencer等，Plant Mol.Biol.，24：51-61(1994)。
[0159] 转化甜菊靶组织之后，上述选择标记基因的表达允许使用本领域中目前公知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物。
[0160] 用于转化的前述方法将通常用于产生转基因品种。然后可将转基因品种与另一种(未经转化的或经转化的)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，可使用在植物育种领域中公知的传统回交技术将使用前述转化技术已工程化到特定甜菊栽培品种中的遗传性状转移到另一个栽培品种中。例如，回交方法可用于将工程化性状从公共、非优良品种转变为优良品种，或从其基因组中包含外源基因的品种转变为不含该基因的品种。本文中使用的“杂交”可指简单的X×Y杂交，或回交的过程，这取决于上下文。
[0161] C.单基因转换
[0162] 当本文中使用术语“甜菊植物”时，这也包括该品种的任何单基因转换。本文中使用的术语“单基因转换植物”是指通过被称为回交的植物育种技术开发的那些甜菊植物，其中除了通过回交技术转移到品种中的单个基因之外，基本上恢复了品种的所有所期望形态和生理特征。本文中可使用回交方法来改进或引入到该品种中的特征。本文中使用的术语“回交”是指将杂交后代重复杂交回轮回亲本，即回交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次至轮回亲本。为期望特征贡献基因的亲本甜菊植物被称为“非轮回”或“供体亲本”。该术语是指非轮回亲本在回交方案中使用一次并因此不再出现的事实。转移来自非轮回亲本的基因的亲本甜菊植物被称为轮回亲本，因为其被用于数轮回交方案中(Poehlman&Sleper(1994)；Fehr(1987))。在典型的回交方案中，将感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的单个感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次杂交至轮回亲本，并重复该过程，直至获得这样的甜菊植物，其中除了来自非轮回亲本的单个转移基因之外，在经转换植物中基本上恢复了轮回亲本的所有所期望形态和生理特征，如在相同环境条件下培养时在5％显著性水平下确定的。
[0163] 合适的轮回亲本的选择是成功回交操作的重要步骤。回交方案的目标是改变或替代原始品种中的单个性状或特征。为了实现这一点，轮回品种的单个基因被来自非轮回亲本的期望基因修饰或替代，同时基本保留所有剩余的期望遗传基因，并因此保留原始品种的期望生理和形态构成。特定非轮回亲本的选择将取决于回交的目的。其中一个主要目的是为植物添加一些商业上期望的、农学上重要的性状。确切的回交方案将取决于被改变的特征或性状以确定适当的测试方案。虽然当被转移的特征是显性等位基因时简化了回交方法，但也可转移隐性等位基因。在这种情况下，可必需引入后代测试以确定是否已成功转移所期望特征。
[0164] 已鉴定了许多单基因性状，其在新品种的开发中没有被定期选择，但是可通过回交技术来改善。单基因性状可以是或可以不是转基因的。这些性状的实例包括但不限于雄性不育，蜡质淀粉，除草剂抗性，对细菌、真菌或病毒疾病的抗性，昆虫抗性，雄性能育性，增强的营养品质，工业用途，产率稳定性和产率提高。这些基因通常通过胞核遗传。这些单基因性状中的一些描述于美国专利No.5,959,185；5,973,234；以及5,977,445中，其公开内容特别地通过引用在此并入。
[0165] 通过组织培养和再生可进一步繁殖该品种。甜菊多种组织的组织培养和植物从其再生是公知且广泛发表的。例如，可参考Komatsuda，T.等，Crop Sci.，31：333-337(1991)；Stephens，P.A.等，Theor.Appl.Genet.，82：633-635(1991)；Komatsuda，T.等，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，28：103-113(1992)；Dhir，S.等.Plant Cell Rep.，11：285-
289(1992)；Pandey，P等，Japan J.Breed.，42：1-5(1992)；以及Shetty，K.等，Plant Science，81：245-251(1992)；以及1991年6月18日授予Collins等的美国专利No.5,024,944和1991年4月16日授予Ranch等的美国专利No.5,008,200。因此，本发明的另一方面是提供在生长和分化时产生具有高RebD和RebM的甜菊植物以及本文中公开的标记SNP的细胞。
289(1992)；Pandey，P等，Japan J.Breed.，42：1-5(1992)；以及Shetty，K.等，Plant Science，81：245-251(1992)；以及1991年6月18日授予Collins等的美国专利No.5,024,944和1991年4月16日授予Ranch等的美国专利No.5,008,200。因此，本发明的另一方面是提供在生长和分化时产生具有高RebD和RebM的甜菊植物以及本文中公开的标记SNP的细胞。
[0166] 本文中使用的术语“组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或组织成植物部分的这样的细胞的集合。示例性类型的组织培养物是原生质体、愈伤组织、植物团块(plant clump)和植物细胞，其可产生在植物或植物部分(例如胚、花粉、花、种子、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊等)中的完整的组织培养物。用于制备和维持植物组织培养物的方法是本领域中公知的。举例来说，包含器官的组织培养物已用于产生再生植物。美国专利No.5,959,185；5,973,234；以及5,977,445描述了某些技术。
[0167] 用于提取和纯化糖苷的方法
[0168] 使用水或有机溶剂从甜菊植物提取和纯化甜糖苷的方法描述于例如美国专利No.4,361,697；4,082,858；4,892,938；5,972,120；5,962,678；7,838,044和7,862,845中。提取RebD的方法描述于美国专利No.9,029,426中，并且RebM的提取在美国申请No.14/254,
653中提供。
653中提供。
[0169] 该组合物可用作多种食品和饮料产品中的甜味增强剂、风味增强剂和甜味剂。食物和饮料产品的实例包括但不限于：碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等张饮料、低卡路里饮料、零卡路里饮料、运动饮料、茶、水果和蔬菜汁、果蔬汁饮料、乳制品饮料、酸奶饮料、酒精饮料(alcohol beverage)、粉状饮料、烘焙产品、曲奇饼干(cookies)、饼干(biscuit)、烘焙混合物、谷物、糕点(confectionery)、糖果(candy)、太妃糖、口香糖、乳制品、调味牛奶、酸奶、调味酸奶、发酵乳(cultured milk)、酱油(soy sauce)和其他大豆基产品(soy base product)、沙拉酱(salad dressing)、蛋黄酱、醋、冷冻甜食(frozen-dessert)、肉制品、鱼肉制品、瓶装和罐头食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜。另外，该组合物可用于药物或药物制剂和化妆品，其包括但不限于牙膏、漱口水、咳嗽糖浆、咀嚼片、锭剂(lozenge)，维生素制剂等。该组合物可“原样”使用或与其他甜味剂、矫味剂和食品成分组合使用。
[0170] 尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换(permutation)、添加和子组合。因此，所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。
[0171] 在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，一个或更多个方面可以以其他具体形式实施。所描述的实施方式在所有方面被认为仅是举例说明性的而不是限制性的。因此，本实施方案的范围由所附权利要求而不是前面的描述来指明。落入权利要求书的等同意义和等同范围内的所有变化都包含在其范围内。
[0172] 为了举例说明和描述的目的呈现了对实施方案的前述讨论。前述内容并非旨在将实施方案限制为本文中公开的形式。在前述实施例的详细描述中，为了简化本公开内容，在一个或更多个实施方案中将实施方案的多种特征组合在一起。本公开内容的方法不应被解释为反映所要求保护的实施方案需要比每个权利要求中明确记载的更多特征的意图。相反，如所附权利要求书所反映的，创造性方面在于少于单个前述公开的实施方案的所有特征。因此，以下权利要求由此并入到该详细描述中，每项权利要求独立作为单独的优选实施方案。
[0173] 此外，尽管对实施方案的描述已包括对一个或更多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但是其他变化和修改也在实施方案的范围内(例如，可在理解本公开之后，在本领域技术人员的技术和知识范围内)。其旨在获得在允许的程度内包括替代实施方案的权利，所述权利包括对所要求保护的那些的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或作用，无论本文中是否公开了这样的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或作用，并且不打算公开贡献任何可专利的主题。
[0174] 除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述实施方案的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另有记载，否则本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的数值被合并到说明书中，如同其在本文中单独记载。例如，如果公开了范围10至15，则也公开了11、12、13和14。除非本文中另外指明或者与上下文明显相矛盾，否则可以以任何合适的顺序进行本文中所描述的所有方法。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅旨在更好地举例说明实施方案并且不对实施方案的范围构成限制，除非另有说明。说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的要素指示为对于实施一个或更多个实施方案所必需的。
[0175] 尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。
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