提高植物的非生物胁迫抗性的方法
阅读：1026发布：2020-07-15
专利汇可以提供提高植物的非生物胁迫抗性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及增加 土壤 养分来提高 植物 的非 生物 胁迫抗性的方法，该方法包含将含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或其突变体的组合物施用于所述植物、所述植物的一部分和/或该植物或植物部分周围的区域。本发明还涉及增加土壤养分的方法，其包含将含有枯草芽孢杆菌或其突变体的组合物施用于土壤。，下面是提高植物的非生物胁迫抗性的方法专利的具体信息内容。
1.一种提高植物的非生物胁迫抗性的方法，该方法包含将包含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的组合物施用于所述植物、所述植物的一部分和/或该植物或植物部分周围的区域。
2.如权利要求1所述的方法，其中该非生物胁迫抗性为盐胁迫抗性或对养分缺乏的抗性。
3.如权利要求2所述的方法，其中该盐胁迫抗性为盐耐受性或干旱抗性之一。
4.如权利要求2所述的方法，其中对养分缺乏的抗性是通过养分增溶或是通过刺激植物在该植物或植物部分周围区域的土壤中铁载体(siderophore)的产生得到提高。
5.如权利要求4所述的方法，其中该养分增溶可改善养分的生物利用度至少约5％。
6.如权利要求4所述的方法，其中该养分增溶选自由以下组成的组：由铁载体结合作用引起的钾增溶、磷酸盐增溶或铁增溶及其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中在该施用之前先鉴定该土壤具有低浓度的选自由以下组成的组的一种或多种土壤养分：钾、磷酸盐及铁。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌QST 2808，或所述枯草芽孢杆菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌QST30002、枯草芽孢杆菌QST30004、短小芽孢杆菌QST 2808的突变体、枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌QST30002的突变体、枯草芽孢杆菌QST30004的突变体及其组合。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该组合物包含在swrA基因中具有突变的枯草芽孢杆菌QST713细胞且该具有突变的细胞占该组合物中总细菌细胞的至少3.5％。
10.如权利要求9所述的方法，其中该具有突变的细胞在起始密码子中包含至少一个核酸碱基对变化和/或在该swrA基因中包含至少一个核酸碱基对插入或缺失。
11.如权利要求10所述的方法，其中在该swrA基因中的插入或缺失是发生在SEQ ID NO.1的位置26-34中的一个或多个碱基对处。
12.如权利要求9所述的方法，其中该具有突变的细胞选自由以下组成的组：分别被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏的菌株QST30002及菌株QST30004。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含至少一种载体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含对该组合物施用至少一种其它活性成分。
15.如权利要求14所述的方法，其中该活性成分为化学品或其它细菌菌株。
16.如权利要求14所述的方法，其中该活性成分选自由以下组成的组：植物生长调节剂、植物生长刺激剂、肥料及其组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物部分选自由以下组成的组：
种子、果实、根、球茎、块茎、鳞茎及根茎。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包含将所述组合物施用于土壤。
19.如权利要求18所述的方法，其中该组合物在植物或植物部分与土壤接触之前、期间或之后施用。
20.如权利要求19所述的方法，其中该组合物在种植前至少约五天施用。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物为一种选自由以下组成的组的组合物：液体、可湿性粉末、颗粒、可流动性组合物及微囊包封组合物。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物选自由以下组成的组：树、草本植物、灌木、草、藤本之舞、蕨类、苔藓类和绿藻类、单子叶植物及双子叶植物。
6
22.如权利要求17所述的方法，其中该组合物以每一种子至少约1×10 cfu的比率施用。
7 14
23.如权利要求18所述的方法，其中该组合物以每英亩约4×10 至约8×10 cfu的比率施用。
1.一种提高植物的非生物胁迫抗性的方法，该方法包含将包含短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的组合物施用于所述植物、所述植物的一部分和/或该植物或植物部分周围的区域，其中该短小芽孢杆菌选自由以下组成的组：短小芽孢杆菌QST2808、短小芽孢杆菌QST 2808的突变体及其组合，并且该枯草芽孢杆菌选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌QST30002、枯草芽孢杆菌QST30004、枯草芽孢杆菌QST713的突变体、枯草芽孢杆菌QST30002的突变体、枯草芽孢杆菌QST30004的突变体及其组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中该非生物胁迫抗性为盐胁迫抗性或对养分缺乏的抗性。
3.如权利要求2所述的方法，其中该盐胁迫抗性为盐耐受性或干旱抗性。
4.如权利要求2所述的方法，其中对养分缺乏的抗性是通过养分增溶或是通过刺激植物在该植物或植物部分周围区域的土壤中的铁载体(siderophore)产生得到提高。
5.如权利要求4所述的方法，其中该养分增溶可改善养分的生物利用度至少约5％。
6.如权利要求4所述的方法，其中该养分增溶选自由以下组成的组：由铁载体结合作用引起的钾增溶、磷酸盐增溶或铁增溶及其组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中在该施用之前先鉴定该土壤具有低浓度的选自由以下组成的组的一种或多种土壤养分：钾、磷酸盐及铁。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该组合物包含在swrA基因中具有突变的枯草芽孢杆菌QST713细胞且该具有突变的细胞占该组合物中总细菌细胞的至少3.5％。
9.如权利要求8所述的方法，其中该具有突变的细胞在起始密码子中包含至少一个核酸碱基对变化和/或在该swrA基因中包含至少一个核酸碱基对插入或缺失。
10.如权利要求9所述的方法，其中在该swrA基因中的插入或缺失是发生在SEQ ID NO.1的位置26-34中的一个或多个碱基对处。
11.如权利要求8所述的方法，其中该具有突变的细胞选自由以下组成的组：分别被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏的菌株QST30002及菌株QST30004。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含至少一种载体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含对该组合物施用至少一种其它活性成分。
14.如权利要求13所述的方法，其中该活性成分为化学品或其它细菌菌株。
15.如权利要求13所述的方法，其中该活性成分选自由以下组成的组：植物生长调节剂、植物生长刺激剂、肥料及其组合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物部分选自由以下组成的组：
种子、果实、根、球茎、块茎、鳞茎及根茎。
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17.如权利要求16所述的方法，其中该组合物以每一种子至少约1×10 cfu的比率施用。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法包含将组合物施用于土壤。
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19.如权利要求18所述的方法，其中该组合物以每英亩约4×10 至约8×10 cfu的比率施用。
20.如权利要求18所述的方法，其中该组合物在植物或植物部分与土壤接触之前、期
提高植物的非生物胁迫抗性的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年8月31日提交的美国临时专利申请号61/696,046、2012年10月18日提交的美国临时专利申请号61/715,780、2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/792,355的优先权。前述各申请的全部内容在此以引用方式并入本文。发明领域
[0004] 发明背景
[0005] 为了促进植物生长、发育和产量，全世界使用基于无机和有机物质二者的肥料。另一限制植物生长和生产力的主要因素为非生物性胁迫(abiotic stress)，诸如干旱胁迫、盐胁迫、养分缺乏、重金属污染、极端温度或洪水。例如暴露于盐胁迫、干旱条件或养分缺乏通常会导致植物材料、种子、果实及其他可食用产品的产量降低。由这些胁迫造成的主要农作物(诸如水稻、玉米(maize)(玉米(corn))和小麦)以及林木的作物损失和作物产量损失代表着重大的经济和政治因素，并导致了许多发展中国家粮食短缺。例如，研发使植物具有盐胁迫耐受性和/或盐胁迫抗性的方法成为可能解决或调解至少一些这样的问题的策略。此外，增加土壤养分及从有机物质释出植物养分的方法可增加植物生长并减轻对植物的环境胁迫。
[0006] 因此，提供使植物对非生物胁迫具有耐受性和/或抗性，及增加植物可利用的土壤养分的需求持续存在。本发明的目的在于提供一种赋予或增进植物的非生物性胁迫耐受性和/或抗性及增加土壤中植物养分的可用性的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供一种提高植物的非生物胁迫抗性的方法。该方法包括在植物、植物的一部分、该植物周围的区域及该植物部分周围的区域施用组合物。通常，该方法包括提供组合物。该组合物包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在一些实施方案中，包含在组合物中的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的已知菌株的突变体。
[0009] 在某些实施方案中，本发明提供提高植物的非生物胁迫抗性的方法，该方法包含将含有枯草芽孢杆菌的组合物以足以提高植物的非生物胁迫抗性的量施用于所述植物、所述植物的一部分和/或该植物或植物部分周围的区域。
[0010] 根据一些特殊实施方案，该枯草芽孢杆菌为以NRRL登录号B-21661保藏的枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌株QST30002或枯草芽胞杆菌株QST30004(其分别被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)，或其突变体。在其它实施方案中，该短小芽孢杆菌株为短小芽孢杆菌2808，其被以登录号NRRL B-0087保藏且描述于国际专利出版物WO 2000/058442中。根据一些其他特殊实施方案，该非生物胁迫可能为盐胁迫或养分缺乏。盐胁迫可包括增加的盐浓度或干旱。养分缺乏可能是植物周围的土壤区域中缺乏土壤养分，诸如钾、磷酸盐或铁。经由改善土壤中所缺乏的养分的溶解度可增进对抗(土壤)养分缺乏(诸如磷酸盐)的胁迫抗性。植物或植物部分周围区域(其亦可能在果实周围)可能为，或包括植物生长的所在地，或该所在地的一部分。例如，植物或植物部分周围的各自区域可为或包括位于该植物或植物部分附近的物质(诸如土壤)。例如，果实周围的相应区域可为或包括长出果实的植物部分，或可为或包括位于带有该果实的植物或植物部分附近的物质(诸如土壤)。在一些实施方案中，该方法包括将组合物施用于土壤。该组合物和土壤可独立地与植物接触。在一些实施方案中，该土壤在施用组合物前与植物或植物部分接触。在一些实施方案中，该组合物在植物或植物部分与土壤接触之前施用。在一些实施方案中，该组合物在植物或植物部分与土壤接触的同 时施用。
[0011] 在暴露于组合物后，非生物胁迫抗性(诸如盐胁迫抗性或抗养分缺乏性)可被有效提高至少约2周。在一些实施方案中，该盐胁迫抗性被提高至少约一个月。在一些实施方案中，暴露于组和物的植物的盐胁迫抗性被提高至少约2个月，包括至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、或至少约11个月。在一些实施方案中，各自植物的盐胁迫抗性系被提高至少约1
一年，包括在施用后至少约1/2年或更长的时间。
一年，包括在施用后至少约1/2年或更长的时间。
[0012] 本发明的方法包括在植物的生命周期期间的任何时间、在植物的生命周期期间的一个或多个阶段、或在植物的生命周期的固定间隔、或在植物的整个生命中连续地施用组合物。因此，可依需要施用该组合物。例如，可在植物生长期间、开花之前和/或期间、和/或种子发生之前和/或期间施用该组合物。一种说明性实例为在将植物从一个位置移植到另一个位置(诸如从温室或温床移至田野)之前，期间和/或之后不久施用组合物。在另一实例中，可在幼苗从土壤或其它生长介质(例如蛭石(vermiculite))冒出后不久施用该组合物。另一实例为组合物可在水栽(hydroponically)植物生长的任何时间施用该组合物。根据本发明的方法可包括在所需的时间段内将组合物施用于植物、植物的一部分、植物周围区域(包括植物附近)、果实上和/或果实周围的区域(包括果实附近)数次，例如预先选定的次数。在一些实施方案中，可将各自组合物在所需的间隔施用于植物数次。
[0013] 在根据本发明的方法中，组合物系被施用于植物、植物的一部分、植物或植物部分周围的区域、带有果实的植物和/或果实周围的区域。例如，果实、植物或植物部分周围的区域可为在该植物、植物部分、或果实周围的约2米、约1米、约70厘米、约50厘米、约25厘米、约10厘米或约5厘米内的区域。
[0014] 在相关的方面，本发明涉及枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌在提高植物的盐胁迫抗性中的用途。该用途包括将组合物施用于植物、植物的一部分、植物周围的区域及植物部分周围的区域的其中至少一个。在一些 实施方案中，将枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌包含于组合物中。
[0015] 根据另一实施方案，本发明涉及增加土壤养分的方法，其包含将包含枯草芽孢杆菌的组合物施用于土壤。该组合物可促进以选自由以下组成的组的水解酶来生物降解有机物质：蛋白酶、纤维素酶及木聚糖酶。在一实施方案中，本发明提供增加土壤养分的方法，其包含将包含枯草芽孢杆菌的组合物以足以增加土壤养分的量施用于土壤，以增加土壤养分。
[0016] 在相关的方面，本发明涉及促进有机物质生物降解的方法，该方法包含将枯草芽孢杆菌以足以促进水解酶生物降解有机物质的量施用于有机物质。
[0018] 图1描绘以水或SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天的水稻植株。
[0019] 图2描绘以水或SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天(64盎司/英亩等于0.448克/平方米)的水稻植株的根部。
[0020] 图3描绘以水或 处理并以60mM的盐灌溉14周的水稻植株。
[0021] 图4描绘以水或SERENADE 或 处理并以60mM的盐灌溉14天(64盎司/英亩等于0.448克/平方米)的水稻植株的根部。
[0023] 图6描绘从生长在NBRIY培养基中的枯草芽孢杆菌株AQ30002(第6A图)及AQ713(第6B图)培养产生的可溶性磷酸盐水平与空白培养基的比较。
[0024] 图7显示包含预测的swrA转录物(transcript)的各种swrA基因组DNA的比对。Bsub_168＝枯草芽孢杆菌株168；Bsub_3610＝枯草芽孢杆菌株3610；QST713＝QST713野生型；AQ30002及AQ30004＝本发明的代表菌株；Bamy_FZB42＝解淀粉芽孢杆菌株FZB42(B.amyloliquefaciens FZB42)；Bpum_SAFR-032＝短小芽孢杆菌株SAFR -032；且Blic_14580＝地衣芽孢杆菌株14580(B.licheniformis 14580)。
[0025] 图8显示包含预测的swrA转录物的各种swrA基因组DNA的比对。缩写具有与图7中相同的swrA含义，且Batr_1942＝萎缩芽孢杆菌株1942(B.atrophaeus 1942)，Bpum_2808＝短小芽孢杆菌株2808。
[0026] 图9显示从其预测的swrA转录物取得的各种蛋白质的比对。缩写具有与图7和8中的含义相同的含义，且Bpum_7061＝短小芽孢杆菌7061。发明详述
[0027] 除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员所通常理解的相同含义。
[0028] 本文所使用的术语“植物”是指属于植物界的任何生物体(即，植物界中的任何属/种)。这包括熟悉的生物体，诸如但不限于树木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨类植物、苔藓类及绿藻。此术语是指单子叶植物(monocotyledonous plants亦称为monocots)和双子叶植物(dicotyledonous plants亦称为dicots)两者。在一些实施方案中，植物具有经济重要性。在一些实施方案中，该植物为人工种植的植物，例如栽培植物，其可以为农业、造林或园艺用植物。举些例子，特殊植物的实例包括但不限于玉米、马铃薯、玫瑰、苹果树、向日葵、小麦、水稻、香蕉、西红柿、opo、南瓜、西葫芦、生菜(lettuce)、白菜、橡树、擎天菠萝(guzmania)、天竺葵、扶桑(hibiscus)、威灵仙(clematis)、一品红(poinsettias)、甘蔗、芋头、鸭杂草(duck weed)、松树、肯塔基蓝草、结缕草、椰子树、芸苔属叶菜类蔬菜(例如西兰花、球花甘蓝(broccoli raab)、布鲁塞尔豆芽、白菜、中国白菜(Bok Choy和Napa)、菜花、cavalo、芥兰菜(collards)、羽衣甘蓝(kale)、大头菜、芥菜、油菜及其它芸苔属叶菜类蔬菜作物)、鳞茎类蔬菜(例如大蒜、韭菜、洋葱(洋葱干鳞茎、大葱、长葱)、葱及其它鳞茎蔬菜作物)、柑橘类果实(例如葡萄柚、柠檬、莱姆、柳橙、桔子、柑桔杂交种、柚子及其它柑橘类果实作物)、瓜类蔬菜(例如小黄瓜、枸橼西瓜、食用葫芦、西印度黄瓜、甜瓜(包括黄瓜瓜类的杂交种和/或栽培变种)、西瓜、哈密瓜及其它瓜类蔬菜作物)、果类蔬菜(包括茄子、鹅莓、人参果、辣椒、西红 柿、树蕃茄及其它果类蔬菜作物)、葡萄、叶菜类蔬菜(例如莴苣(romaine))、根/块茎和球茎蔬菜(例如马铃薯)、及树坚果(杏仁、胡桃、开心果及核桃)、浆果(例如西红柿、伏牛花、葡萄干(currants)、接骨木果、醋栗、金银花、鬼臼根、荚迷、俄勒冈葡萄、沙棘、朴树果、熊果、越橘、草莓、海葡萄、lackberries、黄梅、杨莓(loganberries)、覆盆子、美莓、糙莓及酒莓)、禾谷类作物(例如玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、非洲小米(fonio)及藜麦)、梨果类果实(例如苹果、梨)、核果(例如咖啡、枣、芒果、橄榄、椰子、油棕、开心果、杏仁、杏、樱桃、西洋李子、油桃、桃子及李子)、藤(例如食用葡萄、酿酒葡萄)、麻类作物(例如麻、棉)、观赏植物。在一些实施方案中，该植物可以为住宅/家内植物、温室植物、农业植物或园艺植物。如上文所指出的，在一些实施方案中，该植物可以为硬木，诸如合欢、桉树、角树、榉木、红木、胡桃木、橡木、梣树、柳、胡桃木、桦木、板栗、杨树、桤木、枫树、梧桐、银杏、棕榈树和枫香。在一些实施方案中，该植物可以为针叶树，诸如柏树、道格拉斯冷杉、枞、红杉、铁杉、雪松、刺柏、落叶松、松树、红木、云杉及红豆杉。在一些实施方案中，该植物可以为产果实的木本植物，诸如苹果、李子、梨、香蕉、橙、猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄、木瓜、花生及无花果。在一些实施方案中，该植物可以为木本植物，诸如棉、竹及橡胶植物。在一些实施方案中，该植物可以为农业、造林和/或观赏用植物，即，常用于园艺(例如在公园、花园中和在阳台上)的植物。在大量观赏植物中可举出的一些例子有草皮、天竺葵(geranium)、天竺葵(pelargonia)、矮牵牛、秋海棠及灯笼海棠。术语“植物”亦意欲包括任何植物繁殖体。
[0029] 术语“植物”一般包括已由一次或多次育种、诱变和基因工程修改的植物。基因工程是指使用重组DNA技术。重组DNA技术允许不能很容易地经由在自然环境下交叉育种、基因突变或自然重组获得的修改。在一些实施方案中，由基因工程获得的植物可以为转基因植物。
[0030] 如本文所使用的术语“植物部分”是指植物的任何部分，包括但不限于幼苗、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞、枝条、叶 柄、节间、树皮、木材、块茎、软毛、分蘗、根茎、藻体、叶片、花粉、雄蕊、小孢子、果实和种子。生长在本领域所使用的典型介质(诸如土壤)中的植物的两种主要部分通常被称为“地上”部分(亦常被称为“新枝”)及“地下”部分(亦常被称为“根”)。
[0031] 在根据本发明的方法中，该组合物可被施用于长在生长植物所使用的任何类型的介质(例如土壤、蛭石、碎纸板及水)中的任何植物或任何植物的任何部分，或施用于架空种植的植物或植物部分，诸如兰花或鹿角蕨上。例如，该组合物可通过喷洒、喷雾、蒸发、撒、掸、浇水、喷、洒或浇注进行施用。如上文已经指出，施用程序可在感兴趣的植物放置的任何所需地点进行，诸如农业、园艺、森林、农园、果园、苗圃、有机种植的作物、草皮及城市环境。
[0032] 本发明提供使用包含枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌的发酵产物、或枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌的无细胞提取物的组合物来提高植物的盐胁迫抗性的方法。枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌为革兰氏阳性土壤细菌，其经常在植物根围中被找到。如同许多细菌菌种，枯草芽孢杆菌可以表现出两种不同的增长模式，自由游动、浮游增长模式及无梗生物膜模式(其中细胞聚集体分泌一种细胞外基质以彼此黏附和/或黏附在表面上)。细菌(诸如枯草芽孢杆菌)用来建立生物膜的途径极其多样，在不同物种之内和之间及在不同的环境条件下变化颇大。最近，由枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及相关菌种的特定菌株形成的生物膜已被确认可能有助于控制由植物病原体引起的感染。
[0033] 包含枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌的组合物可为液体、浆液、可湿性粉末、颗粒，可流动性形式，无论是干燥或含水的，或在合适介质中的微囊包封形式。
[0034] 枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌可以孢子(其为休眠状态)形式、营养细胞(其为生长状态)形式、过渡态细胞(其为从生长阶段到孢子形成阶段的过渡期)、或所有这些细胞类型的组合存在于本发明所使用的组合物中。在一些实施方案中，各自组合物主要包括孢子(包括基本上由 孢子组成及由孢子组成)。在其它实施方案中，该组合物包括孢子及在形成孢子前于发酵期间细胞所产生的代谢物。
[0035] 在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌株QST713。枯草芽孢杆菌株QST713为可用于控制植物疾病(包括枯病、黑星病、灰霉病及数种类型的霉病)的天然产生的广布细菌。美国和欧洲监管部门已将枯草芽孢杆菌QST713归类为对人体或环境无不良影响。该细菌(枯草杆菌)普遍存在于土壤中，并已在全世界的各种栖息地中被发现。已知枯草芽孢杆的QST713菌株可拮抗许多植物真菌病原。
[0036] 野生型枯草芽孢杆菌QST713、其突变体、其上清液和其脂肽代谢物，以及使用它们来控制植物病原体和昆虫的方法被充分描述于美国专利号6,060,051；6,103,228；6,291,426；6,417,163；及6,638,910中；各篇的全部教导内容以引用方式被具体且全部纳入本文中。在这些美国专利中，该菌株被称为AQ713(其与QST713同义)。本专利说明书中当提及存在于 产品中、被以NRRL登录号B21661保藏、或在仿真
制造 产品的条件下的生物反应器中制备QST713时是指枯草芽孢杆菌
QST713(又名AQ713)。
制造 产品的条件下的生物反应器中制备QST713时是指枯草芽孢杆菌
QST713(又名AQ713)。
[0037] 在1998年提交美国专利申请号09/074,870(其对应于上述专利)时，该菌株根据典型、生理、生化及形态学方法被命名为枯草芽孢杆菌。芽孢杆菌种的分类学从那时起已逐步发展，尤其是鉴于遗传学和测序技术的进步，因而物种的命名很大程度上是基于DNA序列，而非1998年所使用的方法。在比对来自解淀粉芽孢杆菌FZB42、枯草芽孢杆菌168和QST713的蛋白质序列后，在解淀粉芽孢杆菌FZB42中发现的蛋白质中约有95％与QST713中发现的蛋白质具有85％或更高的同一性；而在枯草芽孢杆菌168中只有35％与QST713中的蛋白质具有85％或更高的同一性。然而，即使是较大程度地依赖遗传学，在反映过去15年对芽孢杆菌分类学的演化理解的相关科学文献和规范性文件中仍然有分类模糊性。例如，以枯草芽孢杆菌株FZB24(其如同FZB42般与QST713密切相关)为基础的农药产品在美国环保局的文件中被归类为枯草杆菌解淀粉变种。由于命名学中的这些复杂性，此特殊芽孢杆菌种根据该文件被 不同地命名为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌解淀粉变种。因此，我们保留枯草芽孢杆菌QST713的命名，而非将其改变成目前仅根据序列比较及推断的分类学所预期的解淀粉芽孢杆菌。
[0038] 枯草芽孢杆菌株QST713已根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定在1997年3月7日保藏在NRRL，登录号为B21661。NRRL为农业研究服务培养物保藏中心的缩写，为用于保藏为国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约下的微生物菌株的国际保存单位，地址为61604美国伊利诺伊州皮奥里亚市北大学街1815号，美国农业部农业研究服务，全国农业利用研究中心。枯草芽孢杆菌株QST713的合适配方(formulation)可从美国北卡罗莱纳州Bayer CropScience LP的市售商品 ASO、 SOIL及
MAX取得。
MAX取得。
[0039] 产品(美国EPA登记编号69592-12)包含专利枯草芽孢杆菌株(菌株QST713)及许多协同工作以破坏疾病病原体并提供优越的抗菌活性的不同脂肽。 产品用于保护植物(诸如蔬菜、果实、坚果和藤蔓作物)以对
抗诸如火疫病(Fire Blight)、灰霉病(Botrytis)、酸腐病(Sour Rot)、锈病(Rust)、菌核病(Sclerotinia)、白粉病(Powdery Mildew)、细菌性斑点(Bacterial Spot)和白霉(White Mold)等疾病。 产品可以液体或干燥配方的形式取得，其可以
叶面和/或土壤处理剂施用。 产品的美国EPA主标签的复印件(包括
ASO、 MAX及 SOIL)可透过全国农
药信息检索系统(NPIRSv)的USEPA/OPP农药产品标签系统(PPLS)公开取得。
抗诸如火疫病(Fire Blight)、灰霉病(Botrytis)、酸腐病(Sour Rot)、锈病(Rust)、菌核病(Sclerotinia)、白粉病(Powdery Mildew)、细菌性斑点(Bacterial Spot)和白霉(White Mold)等疾病。 产品可以液体或干燥配方的形式取得，其可以
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[0040] ASO(水性悬浮液-有机)含有1.34％作为活性成分的干燥9
QST713及98.66％其它成分。 ASO经配制以含有最少1×10cfu/克
10
的QST713，而QST713的最大量已经测定为3.3×10 cfu/克。 ASO
的替代商品名包括 BIOFUNGICIDE、SERENADE 及SERENADE
DISEASE。进一步信息请参阅2010年1月4日的 ASO及
SERENADE 的美国EPA主标签，各篇的全部内容以引用方式被并入本文。
QST713及98.66％其它成分。 ASO经配制以含有最少1×10cfu/克
10
的QST713，而QST713的最大量已经测定为3.3×10 cfu/克。 ASO
的替代商品名包括 BIOFUNGICIDE、SERENADE 及SERENADE
DISEASE。进一步信息请参阅2010年1月4日的 ASO及
SERENADE 的美国EPA主标签，各篇的全部内容以引用方式被并入本文。
[0041] MAX含有14.6％作为活性成分的干燥QST713及85.4％的其它9
成分。 MAX经配制以含有最少7.3×10cfu/克的QST713，而QST713的
最大量已经测定为7.9×1010cfu/克。进一步信息请参阅 MAX的美国EPA
主标签，其全部内容以引用方式被并入本文。
成分。 MAX经配制以含有最少7.3×10cfu/克的QST713，而QST713的
最大量已经测定为7.9×1010cfu/克。进一步信息请参阅 MAX的美国EPA
主标签，其全部内容以引用方式被并入本文。
[0042] 如国际专利申请号WO2012/087980中的详细说明，枯草芽孢杆菌QST713的培养实际上为野生型细胞与非常低比例的被命名为“砂纸细胞”(根据其菌落形态)的变异细胞类型的混合物。因此，在 产品中发现的QST713或在生长在生物反应器中的QST713细胞中发现的QST713系由野生型细胞及这些砂纸细胞以相同于或类似于 产品中所发现的比率混合群组成。这些砂纸细胞在营养琼脂上形成形态
及生理上看来高度压实、疏水、平坦、干燥且非常“易碎”并且很难从琼脂去除的菌落。细胞黏附性可以定性方式观察或可由结晶紫染色测量。除了在营养琼脂上的这种独特菌落形态外，砂纸细胞在表面(诸如根)上形成致密、紧实的生物膜(或更强健的生物膜)。根据上述公开内容，描述于国际专利出版物WO2012/087980中的枯草芽孢杆菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)(被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)或具有枯草芽孢杆菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)的所有生理和形态特征的这些枯草芽孢杆菌株的突变体亦可用于本发明的方法中，无论是单独或与其他枯草芽孢杆菌株(诸如枯草芽孢杆菌QST713)的混合物。
及生理上看来高度压实、疏水、平坦、干燥且非常“易碎”并且很难从琼脂去除的菌落。细胞黏附性可以定性方式观察或可由结晶紫染色测量。除了在营养琼脂上的这种独特菌落形态外，砂纸细胞在表面(诸如根)上形成致密、紧实的生物膜(或更强健的生物膜)。根据上述公开内容，描述于国际专利出版物WO2012/087980中的枯草芽孢杆菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)(被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)或具有枯草芽孢杆菌株AQ30002(又名QST30002)或AQ30004(又名QST30004)的所有生理和形态特征的这些枯草芽孢杆菌株的突变体亦可用于本发明的方法中，无论是单独或与其他枯草芽孢杆菌株(诸如枯草芽孢杆菌QST713)的混合物。
[0043] “野生型”是指物种天然发生时和/或物种以先前已被命名为“野生型”的已知分离形式发生时的典型形式的表型。本文所承认的“野生型(wild type)”的同义词包括“野+生型(wildtype)”、野生型(wild-type)”、“”及“wt”。相对于由非标准、“突变体”或“变异体”等位基因所产生的产物，野生型通常被概念化为在一或多个基因位点的特定基因的标 准、“正常”等位基因的产物。一般而言，以及本文所使用的，特殊芽孢杆菌株或分离物的最普遍的等位基因(即，具有最高的基因频率者)为该被视为野生型的等位基因。本文+ +
所使用的“QST713野生型”或“QST713野生型swrA”及其同义词(例如“QST713swrA”、“QST713野生型”、“QST713wt”，等)是指具有能表现经编码的swrA蛋白质的功能性swrA基+ +
因(即，swrA)的枯草芽孢杆菌QST713。因此，这些术语是指为100％swrA的克隆的野生型QST713细胞。
所使用的“QST713野生型”或“QST713野生型swrA”及其同义词(例如“QST713swrA”、“QST713野生型”、“QST713wt”，等)是指具有能表现经编码的swrA蛋白质的功能性swrA基+ +
因(即，swrA)的枯草芽孢杆菌QST713。因此，这些术语是指为100％swrA的克隆的野生型QST713细胞。
[0044] 如上述所指出，在一些实施方案中，该枯草芽孢杆菌株为枯草芽孢杆菌AQ30002或枯草芽孢杆菌AQ30004。在其它实施方案中，该枯草芽孢杆菌株为枯草芽孢杆菌3610。在一些实施方案中，该短小芽孢杆菌株为短小芽孢杆菌SAFR-032。在一些实施方案中，该短小芽孢杆菌株为短小芽孢杆菌2808，其被以登录号NRRL B-30087保藏且描述于美国专利号6,245,551和6,586,231中，以及国际专利出版物W02000/058442中。合适的短小芽孢杆菌株2808的配方可从美国北卡罗莱纳州Bayer CropScience LP的商品 取得。
[0045] 一般来说，本发明所使用的组合物可为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或其突变体的任何发酵肉汤。本文所使用的术语“发酵肉汤”(亦可称为“全肉汤培养物”或“全肉汤”)是指将微生物发酵后所产生的培养基且包含本文所使用的微生物(即，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或其突变体)及其组成部分、未使用的原料基质和发酵过程中由微生物产生的代谢物等。枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均为孢子形成细菌。因此，在一方面，这些发酵肉汤包括形成孢子的细菌细胞、它们的代谢物和残余的发酵肉汤。在其它方面，该发酵肉汤的形成孢子的细菌细胞主要为孢子。在另一方面，该包含发酵肉汤的组合物进一步包含配方惰性物质及配方成分。在一些实施方案中，例如，该发酵肉汤系经由渗滤过程洗涤，以除去残留的发酵肉汤和代谢物，从而使发酵产物主要为孢子。从发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可直接使用或由常规工业方法，诸如离心、切向流过滤、深度过滤及蒸发浓缩。在另一实施方案中，该发酵肉汤或浓缩的发酵肉汤系使用常规干燥过程或方法，诸如喷雾干 燥、冷冻干燥、盘架干燥、流化床干燥、滚筒干燥、或蒸发进行干燥来创建发酵固体。本文所使用的术语“发酵产物”是指全肉汤、肉汤浓缩物和/或发酵固体。
[0046] 在一些实施方案中，该组合物包含枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的特定菌株(诸如枯草芽孢杆菌QST713或短小芽孢杆菌QST2808)的突变体。术语“突变体”是指衍生自QST713或QST2808的遗传变种。在一实施方案中，该突变体具有一种或多种或所有亲本株(诸如QST713或QST2808)的识别(功能性)特性。在另一实施方案中，至少该突变体或其发酵产物及亲本株提高植物的非生物胁迫抗性(为一种鉴别功能特性)。这类突变体可能为其基因组序列与亲本株的基因组序列具有大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约98％、或大于约99％的序列同一性的遗传变异体。突变体可经由以化学品或辐射处理亲本株细胞，或经由选择来自亲本株细胞群的自发突变体(诸如具噬菌体抗性或抗生素抗性的突变体)或经由本领域技术人员熟知的其它方式取得。
[0047] 在一些实施方案中，该组合物包含在swrA基因(即，swrA-细胞)中具有突变的芽孢杆菌细胞，诸如国际专利出版物WO2012/087980中所描述的细胞。国际专利出版物-WO2012/087980亦描述数种在芽孢杆菌细胞中产生swrA细胞的方法。在一实施方案中，在swrA基因中的突变是位于对应于如SEQ ID NO.1中所列出的swrA基因的位置26-34中的一个或多个位置的位置处，或位于对应于如SEQ ID NO.1中所列出的swrA基因的位置1-3中的一个或多个位置的位置处。在一种变化中，该突变为插入或缺失。
[0048] 本申请案提供的序列表提供来自不同芽孢杆菌种和菌株的swrA基因的序列，如亦显示于图7、8和9中。下列表1将SEQ ID NOS与菌株相关联。除SEQ ID NO.2之外(其为氨基酸序列)，所有序列均为核苷酸序列。
[0049] 表1
[0050]序列 菌株
1,11,12及13 枯草芽孢杆菌QST713
2 枯草芽孢杆菌QST713
3 枯草芽孢杆菌AQ30002
4 枯草芽孢杆菌AQ30004
5 解淀粉芽孢杆菌FZB42
6 短小芽孢杆菌SAFR-032
7 枯草芽孢杆菌3610
8 短小芽孢杆菌2808
9 萎缩芽孢杆菌1942
10 地衣芽孢杆菌14580
1,11,12及13 枯草芽孢杆菌QST713
2 枯草芽孢杆菌QST713
3 枯草芽孢杆菌AQ30002
4 枯草芽孢杆菌AQ30004
5 解淀粉芽孢杆菌FZB42
6 短小芽孢杆菌SAFR-032
7 枯草芽孢杆菌3610
8 短小芽孢杆菌2808
9 萎缩芽孢杆菌1942
10 地衣芽孢杆菌14580
[0051] 在一些实施方案中，swrA活性已由除了swrA基因突变以外的方式降低。swrA活性可由各种作用剂(agent)降低，包括小分子、药物、化学品、化合物、siRNA、核酶、反义寡核苷酸、swrA抑制抗体、swrA抑制肽、适配体(aptamer)或镜像适配体。在一实施方案中，在-swrA细胞中的swrA基因中的突变是位于对应于如SEQ ID NO.1中所列出的swrA基因的位置26-34中的一个或多个位置的位置处，或位于对应于如SEQ ID NO.1中所列出的swrA基因的位置1-3中的一个或多个位置的位置处。在一种变化中，该突变为插入或缺失。在-
另一观点中，该swrA细胞为敲除swrA基因的结果。
另一观点中，该swrA细胞为敲除swrA基因的结果。
[0052] 在一实施方案中，本发明的形成孢子的细菌细胞为在swrA基因中具有突变的枯草芽孢杆菌QST713细菌细胞及其组合物。在一方面，该枯草芽孢杆菌QST713细菌细胞在起始密码子中包含至少一种核酸碱基对变化和/或在swrA基因中包含至少一种核酸碱基对插入或删除。在其它方面，该swrA基因中的插入或缺失系发生在SEQ ID NO.1的位置-26-34处的一或个多个碱基对。再在另一方面，该枯草芽孢杆菌QST713的swrA细胞系选自由以下组成的组：菌株AQ30002(又名QST30002)和菌株 AQ30004(又名QST30004)(其分别被以登录号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏)。再在本发明的另一方面，swrA基因中具有突变的枯草芽孢杆菌QST713为epsC、sfp及degQ的野生型。在另一方面，具有突变的枯草芽孢杆菌QST713在其它方面与枯草芽孢杆菌QST713为等基因(isogenic)。
[0053] 在某些实施方案中，该swrA-细胞占组合物中的全部细胞的至少约3.5％，且至少- -70％的swrA细胞为孢子。本发明进一步提供其中该swrA 细胞占该组合物中的全部细胞的至少10％、或占该组合物中的全部细胞的至少50％、或占该组合物中的全部细胞的至少
100％的这类组合物。本发明进一步提供其中至少约80％、至少约85％、或至少约90％的-
swrA细胞和/或组合物中的全部细胞为孢子的这类组合物。
100％的这类组合物。本发明进一步提供其中至少约80％、至少约85％、或至少约90％的-
swrA细胞和/或组合物中的全部细胞为孢子的这类组合物。
[0054] 在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法中，swrA-细胞在全部细胞中的百分比将为至少3.5％、或至少3.6％、或至少3.7％、或至少3.8％、或至少3.9％、或至少4％、或至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％。在本发明的一些实-
施方案中，所有存在于特殊组合物中或用于特殊方法中的细胞均为swrA细胞(即，100％-
swrA细胞)。
施方案中，所有存在于特殊组合物中或用于特殊方法中的细胞均为swrA细胞(即，100％-
swrA细胞)。
[0055] 在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法中，swrA-细胞在全部细胞中的百分比将为约3.5％至约99.9％。在另一实施方案中，该百分比将为约5％至约99％。在另一实施方案中，该百分比将为约10％至约99％。
[0056] 在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法中，每克(“g”)swrA-细胞的菌落7 8 9
形成单位(“cfu”)数将为至少1×10cfu/g或至少1×10cfu/g、或至少1×10cfu/g、
9 9 9 9
或至少2×10cfu/g、或至少3×10cfu/g、或至少4×10cfu/g、或至少5×10cfu/g、或至
9 9 10 10
少6×10cfu/g、或至少 7×10cfu/g、或者至少8×10 cfu/g、或至少8.5×10 cfu/g、或
10 10 11 11
至少9×10 cfu/g、或至少9.5×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g、或至少2×10 cfu/g、或
11 11 11 11
至少3×10 cfu/g、或至少4×10 cfu/g、或至少5×10 cfu/g、或至少6×10 cfu/g、或至
11 11 11 12
少7×10 cfu/g、或至少8×10 cfu/g、或至少9×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g、或至少
13 14
1×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g。
形成单位(“cfu”)数将为至少1×10cfu/g或至少1×10cfu/g、或至少1×10cfu/g、
9 9 9 9
或至少2×10cfu/g、或至少3×10cfu/g、或至少4×10cfu/g、或至少5×10cfu/g、或至
9 9 10 10
少6×10cfu/g、或至少 7×10cfu/g、或者至少8×10 cfu/g、或至少8.5×10 cfu/g、或
10 10 11 11
至少9×10 cfu/g、或至少9.5×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g、或至少2×10 cfu/g、或
11 11 11 11
至少3×10 cfu/g、或至少4×10 cfu/g、或至少5×10 cfu/g、或至少6×10 cfu/g、或至
11 11 11 12
少7×10 cfu/g、或至少8×10 cfu/g、或至少9×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g、或至少
13 14
1×10 cfu/g、或至少1×10 cfu/g。
[0057] 在其它实施方案中，在本发明的组合物和方法中，该swrA-细胞的总量以swrA-细胞在全部组合物中的相对或实际干重为基础。在一些实施方案中，在本发明的组合物和方- -法中，该swrA细胞的总量以该组合物中该swrA 细胞的cfu/克为基础。
[0058] 在一些实施方案中，经由以包含枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或其突变体的组合物处理植物所提高的非生物胁迫抗性为营养缺乏。营养缺乏的一种实例为缺乏土壤养分，诸如钾、磷酸盐和铁。
[0059] 本文所使用的术语“非生物胁迫”的常规意义为非存活因素对特定环境中的存活生物体的负面影响，因此，关于植物方面是指非存活因素在特定环境中对植物的负面影响。非存活因素(变量)以明显的方式影响环境偏离其正常的变化范围以不利地影响植物群的性能或植物的个别生理。虽然生物胁迫包括存活干扰，诸如真菌或害虫，非生物胁迫因素可为自然发生或是人为的，且包括温度、干燥土壤、渗透胁迫、干旱、盐或营养缺乏，所有这些均可能对受影响区域的植物造成伤害(参照，例如Bianco Carmen and Defez Roberto(2011)的表2。Soil Bacteria Support and Protect Plants Against Abiotic Stresses、Abiotic Stress in Plants-Mechanisms and Adaptations，Prof.Arun Shanker(Ed.)、ISBN:978-953-307-394-1，InTech，其可从http://www.intechopen.com/books/abiotic-stress-in-plants-mechanisms-andadaptations/soil-bacteria-support-and-protect-plants-against-abiotic-stresses取得)。在此背景下，在一些实施方案中，重金属毒性被排除在引起非生物胁迫的胁迫因素之外。
[0060] 本文所使用的术语“养分缺乏”是指当植物生长在养分缺乏的条件 下时造成营养匮乏的营养缺乏。因此，术语“提高对养分缺乏的抗性”是指本文所考虑的细菌(或含有这些细菌的组合物)提供植物营养，以减少或消除养分缺乏，从而减少或消除非生物胁迫的能力(参见Lunde et al,Climate Change:Global Risks,Challenges and Decisions,IOP Conf.Series:Earth and Environmental Science 6(2009)372029,doi:10.1088/1755-1307/6/7/372029,IOP Publishing)。该对由养分缺乏所造成的胁迫的抗性的提高是由细菌溶解土壤养分(诸如钾、磷酸盐或铁)，使它们可被植物吸收的能力造成的。在经改善的铁可利用性的情况下，据信其可利用性的改善是由本发明中所使用的细菌制造铁载体(siderophore)所造成的，该铁载体可转而与铁复合，从而使其可被植物吸收。这类供植物吸收的可利用性在本文中亦称为“生物可利用性”。根据本发明，“改善的生物可利用性”意指所提高或改善一种或多种土壤养分的吸收量是以可测量或显著的量超越在相同条件下，但不施用本发明的组合物时被植物吸收的相同养分的量。吸收可经由收获及分析植物组织来测量。根据本发明，当与适当的对照组相比较时，较佳地，该生物可利用性被提高至少
0.5％、或至少1％、或至少2％、或至少4％、或至少5％、或至少10％。
0.5％、或至少1％、或至少2％、或至少4％、或至少5％、或至少10％。
[0061] 在一些实施方案中，本发明中所使用的菌株和组合物在种植前施用并可被称为土壤接种剂。种植前施用可改善土壤养分的生物可利用性和/或增加种植在预处理过的土壤中的植物的产量和/或生长和/或活力。在特定实施方案中，在种植前至少约一天、或在种植前至少约二天、或在种植前至少约三天、或在种植前至少约四天、或在种植前至少约五天、或在种植前至少约六天、或在种植前至少约七天、或在种植前至少约八天、或在种植前至少约九天、或在种植前至少约十天、或在种植前至少约11天、或在种植前至少约12天、或在种植前至少约13天、或在种植前至少约14天、或在种植前至少约2.5周、或在种植前至少约三周将菌株及组合物施用于土壤或盆栽培养基。
[0062] 在一些实施方案中，本发明所使用的菌株和组合物可增加土壤养分。本文所使用的术语“土壤养分”是指就土壤所包含的可用的植物养分水 平而言的土壤条件。经由增加土壤养分，本发明可提高这些植物养分的可利用性。植物养分包括氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、硫(S)、镁(Mg)、硅(Si)、硼(B)、氯(Cl)、锰(Mn)、铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、镍(Ni)、硒(Se)和钠(Na)。
[0063] 当返回土壤时有机物质可提供土壤养分和有机碳。此有机碳改善土壤和作物植物的健康。为了利用存在于有机物质中的植物养分必须进行生物降解以将其分解成较简单的化合物。在一实施方案中，当本发明的菌株和组合物被施用于土壤时可促进生物降解的过程。此有机物质的生物降解过程和土壤中有机碳的富集亦提供土壤保水稳定性。
[0064] 在一实施方案中，本发明的菌株和组合物促进以水解酶生物降解有机物质。该水解酶可为能分别催化蛋白质、纤维素、木聚糖的水解作用的蛋白酶、纤维素酶或木聚糖酶。在一些实施方案中，该纤维素酶为内切葡聚糖酶，而木聚糖酶为内切木聚糖酶。内切葡聚糖酶及内切木聚糖酶分别将纤维素及木聚糖多糖内的内部键裂解，而外切葡聚糖酶及外切木聚糖酶将多糖暴露端附近(例如离端点2至4个单位)的键裂解。
[0065] 在某些实施方案中，该增加土壤养分的方法进一步包含在土壤中施用有机物质。有机物质可为堆肥、动物废物或任何其他有机碳来源的形式。
[0066] 在一些其它实施方案中，经由以包含枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或其突变体的组合物处理植物来提高非生物胁迫抗性为盐胁迫抗性。盐胁迫抗性的实例为盐耐受性或干旱抗性。
[0067] 本文所使用的术语“盐耐受性”的一般含义是指植物对盐浓度的抗性。因此，“提高植物的盐耐受抗性”一词意指当植物暴露于较植物平常的生理上可接受的盐浓度更高的盐浓度时，植物承受或耐受盐浓度(在其环境中，诸如在土壤或水中)的能力提高/改善。
[0068] 术语“耐旱性”在本文中亦以其一般含义使用，其是指植物即使暴露在干旱条件下仍能维持良好的水平衡和膨胀度，从而避免胁迫及其后果的能力。因此，“提高植物的干旱抗性”是指当植物暴露于其中植物无法接受其保持水平衡和膨胀度一般所需的水量的条件下时，植物保持良 好的水平衡和膨胀度的能力被提高/改善。
[0069] 术语“盐胁迫”是指植物暴露于偏离各自植物的最佳离子强度的离子强度。通常，该离子强度偏离各自植物的最佳离子强度在于其为各自植物的最佳离子强度的约1.2倍或更高，或低于最佳离子强度。在一些实施方案中，该离子强度偏离各自植物的最佳离子强度在于其为各自植物的最佳离子强度的约1.5倍或更高，或低于最佳离子强度。在一些实施方案中，该离子强度偏离各自植物的最佳离子强度2倍，包括2.5倍。在一些实施方案中，该离子强度为各自植物的最佳离子强度的约3倍或更高，或低于最佳离子强度。在一些实施方案中，该离子强度偏离最佳离子强度3.5倍，包括4倍。在一些实施方案中，该离子强度为各自植物的最佳离子强度的约5倍或更高，或低于最佳离子强度。盐胁迫可以由氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁及氯化钙的一种或多种的浓度引起，其偏离各自盐的最佳浓度约1.5倍或更多。
[0070] 在一些实施方案中，该氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁和/或氯化钙的浓度偏离各自植物的各自盐的最佳浓度约1.5倍或更多。在一些实施方案中，该氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁和/或氯化钙的浓度偏离各自植物的各自盐的最佳浓度约2倍或更多，包括2.5倍或3倍。在一些实施方案中，该氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁和/或氯化钙的浓度偏离各自植物的各自盐的最佳浓度约4倍或更多。
[0071] 在一些实施方案中，最佳离子强度是由已知的离子强度范围界定的，其中指定植物显示出最佳的活力、生长、生物量的制造或任何其它如以下说明的合适参数。同样地，该氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化镁及氯化钙的一种或多种的最佳浓度可以已知由一定的范围界定，其中指定植物显示出最佳的活力、生长、生物量的制造或任何其它如以下说明的合适参数。在这类实施方案中，盐胁迫可以由超过这类范围的上限值或低于各自范围的下限值约1.2倍或更多的离子强度界定。上述关于最佳离子强度或盐浓度的说明，比照适用于其它方面。在一些实施方案中，抗盐性可以经由将感兴趣的植物暴露于具有提高的盐浓度的水中来验证(亦参见实施例部分)。灌溉土壤的水的盐浓度可有效地以水中溶解的盐(重 量/重量)的百万分率表示。淡水通常具有低于1,000ppm的盐；微咸水通常为1,000ppm至3,000ppm；适度含盐水通常为3,000ppm至10,000ppm；高度含盐水通常为10,000ppm至35,000ppm；而海水通常具有35,000ppm的盐。
[0072] 植物提高的盐胁迫抗性(即，盐耐受性或干旱抗性)可由本领域中可使用的任何所需方法来分析。通常，将感兴趣的植物的特性与参考物相比较。这类参考物可为被保持在相同或可比拟的条件下的对应植物，除了该植物未被暴露在包含枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的组合物外。在一些实施方案中，可使用进一步的参考物以考虑盐胁迫的效果。这类进一步的参考物可为对应于感兴趣的植物的植物，其被保持在相同或可比拟的条件下，除了该植物未被暴露在诱导盐胁迫的条件下。因此，作为这类进一步的参考物的植物通常被保持在其中该植物被暴露于已知可被各自植物品种良好地耐受的盐水平之下。
[0073] 盐胁迫本身通常以渗透胁迫表现，导致植物细胞中体内平衡和离子分布受到干扰。这类盐度或干旱胁迫可引起功能性和结构性蛋白质变性。结果，可将细胞胁迫信号传导途径及细胞胁迫反应活化，诸如制造胁迫蛋白、上调抗氧化剂、累积相容性溶质及遏止生长。
[0074] 植物的盐胁迫抗性或其他非生物胁迫抗性(诸如养分缺乏抗性)指标(indicator)的实例为植物的生长速度。例如，植物的生长速度可通过监测在一段时间内植株高度、植物的根长度或幼苗长度来评估。植物的非生物胁迫抗性指标的另一实例为植物的发育。在这方面，例如，可以经由评估植物达到不同的发育阶段需要多长时间来进行。
一般而言，在这方面，植物的非生物胁迫抗性指标的实例为植物生命力。植物生命力亦在几个方面中表现，其中有些为可视外观，举几个实例，例如：叶子颜色、果实颜色及外观、死亡基生叶的量和/或叶片范围、植株重量、植株高度、植株(倒伏)范围、分蘗数目、强度及生产力、穗的长度、根系范围、根的强度、结瘤范围(尤其是根瘤菌结瘤)、发芽时间点、出苗、开花、籽粒成熟和/或老化、蛋白质含量、糖含量、千粒重、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度或根和幼苗生物量 (亦参见实施例部分，其中使用根或幼苗的大小和重量来评估水稻植株的盐胁迫抗性)。本文所使用的术语“生物量”是指植物的总重量。在生物量的定义内，可将植物的一个或多个部分的生物量加以区分，其量可包括下列的任何一项或多项：地上部分，诸如但不限于幼苗生物量、种子生物量及叶生物量；地上可收获部分，诸如但不限于幼苗生物量、种子生物量及叶生物量；地下部分，诸如但不限于根生物量；
植被生物量，诸如根生物量或幼苗生物量；生殖器官；及繁殖体(propagule)，诸如种子。
一般而言，在这方面，植物的非生物胁迫抗性指标的实例为植物生命力。植物生命力亦在几个方面中表现，其中有些为可视外观，举几个实例，例如：叶子颜色、果实颜色及外观、死亡基生叶的量和/或叶片范围、植株重量、植株高度、植株(倒伏)范围、分蘗数目、强度及生产力、穗的长度、根系范围、根的强度、结瘤范围(尤其是根瘤菌结瘤)、发芽时间点、出苗、开花、籽粒成熟和/或老化、蛋白质含量、糖含量、千粒重、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度或根和幼苗生物量 (亦参见实施例部分，其中使用根或幼苗的大小和重量来评估水稻植株的盐胁迫抗性)。本文所使用的术语“生物量”是指植物的总重量。在生物量的定义内，可将植物的一个或多个部分的生物量加以区分，其量可包括下列的任何一项或多项：地上部分，诸如但不限于幼苗生物量、种子生物量及叶生物量；地上可收获部分，诸如但不限于幼苗生物量、种子生物量及叶生物量；地下部分，诸如但不限于根生物量；
植被生物量，诸如根生物量或幼苗生物量；生殖器官；及繁殖体(propagule)，诸如种子。
[0075] 另一植物的非生物胁迫抗性指标的实例为作物产量。“作物”及“果实”被理解为是在收获后被进一步利用的任何植物产品，例如适当意义的果实、蔬菜、坚果、谷物、种子、木材(例如在造林植物的情况中)或花(例如在园艺植物、观赏植物的情况中)。在一般基础上，作物和果实可为植物所产生的具经济价值的任何物。而植物的另一非生物胁迫抗性指标的实例为该植物对生物胁迫因素的耐受性或抗性。在一些实施方案中，幼苗存活可作为植物的非生物胁迫抗性性指标的另一实例。当需要时可分析植物的非生物胁迫抗性的任一这类指标，不论是单独或数种指标彼此组合。
[0076] 在这方面，植物(诸如农业、造林和/或观赏植物)的“提高的产量”是指各自植物所增加的产物产量系以可测量的量超越该植物同样暴露于非生物胁迫(包括干旱或缺乏养分)，但不施用本发明的组合物时所制造的相同产物的产量。在一些实施方案中，与在类似或相同的非生物胁迫条件下的未经处理的对应植物相比较时，具有增强的非生物胁迫抗性的植物产量被提高约0.5％或更多。在一些实施方案中，具有增强的非生物胁迫抗性的植物的产量在非生物胁迫条件下被提高至少约1％。在一些实施方案中，在非生物胁迫条件下产量被提高至少约2％，诸如至少约4％。在一些实施方案中，在非生物性胁迫条件下产量被提高至少约5％。在一些实施方案中，与在非生物胁迫条件下的合适对照组相比较，该产量被提高至少约10％。
[0077] 感兴趣的植物的干旱抗性(因此，相对于培养在同等条件下的对照 植物，其干旱抗性提高)亦可经由以枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌的组合物处理该植物一段合适的时间，然后停止或减少浇水，再确定何种植物(以枯草芽孢杆菌、或短小芽孢杆菌的组合物处理的植物、或对照组)最后瓦解。另外，干旱抗性可经由让植物循环通过重复的水胁迫(即不灌溉所述植物)和足量水的循环，并评估何种植物最后瓦解(collapse)来确定。
[0078] 如上文所说明的，在本发明的方法中，包含枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌的组合物可施用于很多种农业和/或园艺作物，包括那些长成以用于种子、制造、景观美化者及那些长成以用于生产种子者。可施用该组合物的代表性植物包括但不限于下列者：芸苔属蔬菜、鳞茎类蔬菜、谷物(cereal grain)、柑橘、棉花、瓜类、果菜类、叶菜类、豆类、油籽作物、花生、仁果类果实、根类蔬菜、块根类蔬菜、球茎类蔬菜、核果类果实、烟草、草莓和其它浆果，及各种观赏植物。
[0079] 在本发明的背景中所使用的组合物可以分别将枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌维持在至少为实质上可存活形式的任何形式使用和/或提供。该组合物可施用于植物的表面、植物部分的表面、果实、植物附近、果实附近、包含该植物或果实的区域、或包含该植物部分的区域。
[0080] 该组合物可以叶面喷洒剂、种子/根/块根/块茎/鳞茎/球茎/短枝处理剂和/或土壤处理剂的形式进行施用。该组合物可在种植前、种植期间或种植后被施用于种子/根/根茎/块茎/鳞茎/球茎/短枝。当作为种子处理剂时，本发明的组合物根据该种2 10
子的大小以约1×10至约1×10 菌落形成单位(“cfu”)/种子的速率施用。在一些实
2 9
施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约1×10 cfu/种子的速率施
2 8
用。在一些实施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约1×10 cfu/
2
种子的速率施用。在一些实施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约
7 3
1×10cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为约1×10
8 3
至约1×10cfu/种子。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为约1×10至
7
约1×10cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为 约
3 6
1×10至约1×10 cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速
4 7
率为约1×10至约1×10 cfu/种子的速率施用。当作为土壤处理剂时，本发明的组合物可以土壤表面浸液的形式、戳入(shanked-in)、注射和/或施用在犁沟，或与灌溉水混合施用。土壤浸液处理剂(其可在种植时、播种期间或播种后、或移栽后，以及植物生长的
7 14 9
任何阶段施用)的施用速率为每英亩约4×10至约8×10 cfu、或每英亩约4×10至约
13 11 12 12 13
8×10 cfu、或每英亩约4×10 至约8×10 cfu、或每英亩约2×10 至约6×10 cfu、或每
12 13 12
英亩约2×10 至约3×10 cfu。在一些实施方案中，该施用速率为每英亩约1×10 至约
12 13 13
6×10 cfu、或每英亩约1×10 至约6×10 cfu。在一些实施方案中，土壤浸液处理剂(其可在种植时、播种期间或播种后、或移栽后、及植物生长的任何阶段施用)的施用速率通常
11 12 12
为每英亩约4×10 至约8×10 cfu。在其它实施方案中，该施用速率为每英亩约1×10
12 12 12
至约6×10 cfu。再在其它实施方案中，该施用速率为每英亩约6×10 至约8×10 cfu。
8 9
在其它实施方案中，该施用速率为每英亩至少约1×10、每英亩至少约1×10、每英亩至少
10 11 12 13
约1×10 、每英亩至少约1×10 、每英亩至少约1×10 、或每英亩至少约1×10 。在种植
10 11
时，犁沟处理剂的施用速率为每1000列英尺约2.5×10 至约5×10 cfu。在一些实施方
10 11
案中，该施用速率为每1000列英尺约6×10 至约4×10 cfu。在其他实施方案中，该施用
11 11
速率为每1000列英尺约3.5×10 至每1000列英尺约5×10 cfu。再在其它实施方案中，
9
在种植时，犁沟处理剂的施用速率为每1000列英尺至少约1×10cfu、每1000列英尺至少
10 11 12
约1×10 cfu、每1000列英尺至少约1×10 cfu、或每1000列英尺至少约1×10 cfu。
子的大小以约1×10至约1×10 菌落形成单位(“cfu”)/种子的速率施用。在一些实
2 9
施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约1×10 cfu/种子的速率施
2 8
用。在一些实施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约1×10 cfu/
2
种子的速率施用。在一些实施方案中，本发明的组合物根据该种子的大小以约1×10至约
7 3
1×10cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为约1×10
8 3
至约1×10cfu/种子。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为约1×10至
7
约1×10cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速率为 约
3 6
1×10至约1×10 cfu/种子的速率施用。在一些实施方案中，根据种子的大小，该施用速
4 7
率为约1×10至约1×10 cfu/种子的速率施用。当作为土壤处理剂时，本发明的组合物可以土壤表面浸液的形式、戳入(shanked-in)、注射和/或施用在犁沟，或与灌溉水混合施用。土壤浸液处理剂(其可在种植时、播种期间或播种后、或移栽后，以及植物生长的
7 14 9
任何阶段施用)的施用速率为每英亩约4×10至约8×10 cfu、或每英亩约4×10至约
13 11 12 12 13
8×10 cfu、或每英亩约4×10 至约8×10 cfu、或每英亩约2×10 至约6×10 cfu、或每
12 13 12
英亩约2×10 至约3×10 cfu。在一些实施方案中，该施用速率为每英亩约1×10 至约
12 13 13
6×10 cfu、或每英亩约1×10 至约6×10 cfu。在一些实施方案中，土壤浸液处理剂(其可在种植时、播种期间或播种后、或移栽后、及植物生长的任何阶段施用)的施用速率通常
11 12 12
为每英亩约4×10 至约8×10 cfu。在其它实施方案中，该施用速率为每英亩约1×10
12 12 12
至约6×10 cfu。再在其它实施方案中，该施用速率为每英亩约6×10 至约8×10 cfu。
8 9
在其它实施方案中，该施用速率为每英亩至少约1×10、每英亩至少约1×10、每英亩至少
10 11 12 13
约1×10 、每英亩至少约1×10 、每英亩至少约1×10 、或每英亩至少约1×10 。在种植
10 11
时，犁沟处理剂的施用速率为每1000列英尺约2.5×10 至约5×10 cfu。在一些实施方
10 11
案中，该施用速率为每1000列英尺约6×10 至约4×10 cfu。在其他实施方案中，该施用
11 11
速率为每1000列英尺约3.5×10 至每1000列英尺约5×10 cfu。再在其它实施方案中，
9
在种植时，犁沟处理剂的施用速率为每1000列英尺至少约1×10cfu、每1000列英尺至少
10 11 12
约1×10 cfu、每1000列英尺至少约1×10 cfu、或每1000列英尺至少约1×10 cfu。
[0081] 该组合物亦可经制备以用于以熏蒸剂的形式在户外以及室内两处施用，例如在封闭的环境中，诸如温室、动物谷仓或棚屋、人类住所及其它建筑物。本领域技术人员将知晓用于制备这类熏蒸剂(例如成雾浓缩剂及烟雾产生剂)的各种方法。成雾浓缩剂一般为用于透过成雾机施用以创建可分布在整个封闭和/或开放环境的细水雾的液体配方。这类成雾浓缩剂可使用已知技术制备以使其能通过成雾机施用。烟雾产生剂(其 一般为粉末配方)是经燃烧来创建烟雾熏蒸剂。这类烟雾产生剂亦可使用已知技术制备。
[0082] 在根据本发明的方法中，该组合物可以多种不同的方式施用。在小规模施用方面，可使用背负式槽、手持杖、喷雾瓶或气溶胶罐。在稍大规模施用方面，可使用具有吊杆的拖拉机牵引设备、拖拉机牵引水雾送风机、配备用于喷雾(spraying)或成雾喷雾机的飞机或直升机。小规模施用固体配方可以多种不同的方式完成，其实例有：直接从容器摇动产品或由人力驱动的肥料撒布机以重力施用。大规模施固体配方可由重力给料拖拉机牵引施用器或类似设备完成。
[0083] 在一些实施方案中，该含有枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌的组合物可在将植物从一个位置移植到另一个位置(诸如从温室或温床移至田野)之前、期间和/或之后不久施用。在另一实例中，该组合物可在苗从土壤或其它生长介质(诸如蛭石)冒出后不久施用。再在另一实例中，该组合物可在水栽培植物生长的任何时间施用。因此，根据本发明的方法，该组合物可在植物的生命周期期间的任何所需时间施用。在一些其它实施方案中，本发明的组合物在任何所需的发育阶段期间，每隔约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约两周、约三周、约1个月或更长的时间施用于植物和/或植物部分两次。在一些实施方案中，本发明的组合物在任何所需的发育阶段期间，每隔约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约两周、约三周、约1个月或更长的时间施用于植物和/或植物部分两次以上，例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。若需要时可改变每次施用之间的间隔时间。
[0084] 本发明进一步提供进一步包含至少一种除了swrA-细胞外的其它活性成分或作用剂的任何本发明的组合物。这类其它活性成分或作用剂可为化学品或其他细菌菌株。合适的活性成分或作用剂的实例包括但不限于除草剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、植物生长调节剂、植物生长刺激剂、肥料及其组合。
[0085] 本发明进一步提供孢子形成细菌(诸如枯草芽孢杆菌)或进一步包含配方惰性物质或其它配方成分的本发明组合物的任一个，该配方惰性物质或其它配方成分为诸如多糖(淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素、蛋白质、诸如乳清蛋白、肽、树胶(gum))、糖类(乳糖、海藻糖、蔗糖)、脂类(卵磷脂、植物油、矿物油)、盐类(氯化钠、碳酸钙、柠檬酸钠)及硅酸盐(黏土、无定形二氧化硅、气相/沉淀的二氧化硅、硅酸盐)。在一些实施方案(诸如其中该组合物施用于土壤中的那些)中，本发明的组合物包含载体，诸如水或矿物质或有机物质，诸如促进该组合物并入土壤中的泥炭。在一些实施方案(诸如其中该组合物用于处理种子或作为根浸液的那些)中，该载体为促进该组合物黏附于种子或根的结合剂或黏附剂。在另一其中该组合物作为种子处理剂的实施方案中，该配方成分为着色剂。在其它组合物中，该配方成分为防腐剂。
[0086] 本发明的组合物可包含添加在包含细胞、不含细胞的制剂(preparation)或代谢物的组合物中的配方惰性物质，以改善效力、稳定性及易用性和/或促进加工、包装和最终应用(end-use application)。这类配方惰性物质和成分可包括载体、稳定剂、养分或物理性能改性剂，其可单独添加或组合添加。在一些实施方案中，该载体可包括液体物质，诸如水、油及其他有机或无机溶剂和固体物质，诸如经由生物衍生或化学合成的矿物质、聚合物或聚合复合物。在一些实施方案中，该载体为促进该组合物黏附于植物部分(诸如种子或根)的结合剂或黏附剂。参见，例如Taylor,A.G.,et al.,"Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments"Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339(1990)。该稳定剂可包括防结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。该养分可包括碳、氮和磷来源，诸如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸及磷酸盐。该物理性能改性剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、pH调节剂、流变改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、抗冻剂或着色剂。在一些实施方案中，该包含细胞、无细胞制剂或经由发酵产生的代谢物的组合物可在无任何其他配方制剂，加有或不加有作为稀释剂的水下直接使用。在一些实施方案中，该配方惰性物质在将发酵液浓缩后及干燥期间和/或干燥 后添加。
[0087] 本专利说明书中对于先前发表的文件的列举或讨论不应被视为承认该文件为现有技术的一部分，或为公知常识。
[0088] 说明性地描述于本文中的本发明可在缺乏未具体公开于本文中的任何元素、限制下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩大解读，而无限制。除非上下文另外清楚指明，否则单数型，诸如“一(a)”、“一(an)”或“该”包括复数指称。除非另外指明，否则在一系列元素之前的术语“至少”被理解为指该系列中的每个元素。例如，术语“至少一”及“…中的至少一”包括例如一、两、三、四、五或更多个元素。高于和低于所述范围的轻微变化可用于实质上取得与在该范围内的数值的相同结果。此外，除非另外指明，否则所公开的范围打算为一连续范围，包括在最小值和最大值之间的每个数值。
[0089] 此外，本文已经使用的术语及表述是用作描述而非限制，且这类术语及表述并不打算排除所显示及描述的特性或其部分的任何同等项，但在本发明所要求保护的专利范围内可能进行各种修改是被公认的。因此，应理解，虽然本发明已由示例性的实施方案及可选择的特性被具体公开，本文所公开的内容中体现本发明的修改和变化可为本领域技术人员所采用，且这类修改和变化被认为在本发明的范围内。
[0090] 本文中已广泛且概略地描述本发明。每一落在概括的公开内容内的较狭小形式及亚属分组亦形成本发明的部分。这包括从该类型除去任何主题的限制性条款或消极限制的本发明概括描述，无论该被删除的材料是否被具体列举于本文中。
[0092] 为了使本发明可被容易地理解并投入实际效果，现将通过下列非限制性实例说明特殊实施方案，这些非限制性实例纯粹用于说明的目的来给出。实施例
[0093] 实施例1：由枯草芽孢杆菌提高盐胁迫抗性
[0094] 进行第一项研究以分析以 浸湿的水稻幼苗被灌溉盐时是否可见到植物生长促进。
[0095] 步骤：
[0096] 将三个水稻种子(品种RM401)播种在充满Profile Greens Grade的2.5”盆子中。每个种子接受(为本文所使用的示例性发酵产品/组合物形式)2毫升的64盎司/英亩的市售 (总体积100毫升，占11.2％)或水。将盆子依浸湿处理组放置在无孔单位中，并在温室中生长。在实验持续期间以浓度100ppm N的20-20-20肥料灌溉植物并将灌溉水平维持在约为盆子高度的一半。播种14天后，每一浸湿处理组(水或
64盎司/英亩)取10盆接受60mM盐的灌溉。每周更换单位中的水两
次并在盐处理开始后14天内为植物评级。收获植物，并使其干燥。收集根和幼苗重量。
64盎司/英亩)取10盆接受60mM盐的灌溉。每周更换单位中的水两
次并在盐处理开始后14天内为植物评级。收获植物，并使其干燥。收集根和幼苗重量。
[0097] 结果：
[0098] 以SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天的水稻植物看起来高于在盐胁迫下、以水处理的植物(图1)。以SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天的
水稻植株的根看起来长于在盐胁迫下、以水处理的植物(图2)。在依上述相同的方式进行的另一实验中，以SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天的植物的根和幼苗的重
量显著高于以水处理的植物的重量。参见图5。因此，此结果显示枯草芽孢杆菌QST713的组合物/发酵产物可提高植物的盐胁迫抗性(盐胁迫耐受性)。
水稻植株的根看起来长于在盐胁迫下、以水处理的植物(图2)。在依上述相同的方式进行的另一实验中，以SERENADE 处理并以60mM的盐灌溉14天的植物的根和幼苗的重
量显著高于以水处理的植物的重量。参见图5。因此，此结果显示枯草芽孢杆菌QST713的组合物/发酵产物可提高植物的盐胁迫抗性(盐胁迫耐受性)。
[0099] 实施例2：由短小芽孢杆菌提高盐胁迫抗性
[0100] 进行第二项研究以分析以 浸湿的水稻幼苗被灌溉盐时是否可见到植物生长提升。在这项研究中，亦比较以 处理及以 处理植
物的效力。
物的效力。
[0101] 步骤：
[0102] 将三个水稻种子(品种RM401)播种在充满Profile Greens Grade的2.5”盆子中。每个种子接受(为本文所使用的示例性发酵产品/组合 物形式)2毫升的64盎司/英亩的市售 或 (总体积为100毫升，占11.2％，以cfus/植株标准化)或水。将盆子依浸湿处理组放置在无孔单位中，并在温室中生长。在实验持续期间以浓度100ppm N的20-20-20肥料灌溉植物并将灌溉水平维持在约为陶盆高度的一半。
播种14天后，每一浸湿处理组(水或 64盎司/英亩)取10盆接受盐浓
度为60mM盐的灌溉。每周更换单位中的水两次并在盐处理开始后14天内为植物评级。收获植物，并使其干燥。收集根和幼苗重量。
播种14天后，每一浸湿处理组(水或 64盎司/英亩)取10盆接受盐浓
度为60mM盐的灌溉。每周更换单位中的水两次并在盐处理开始后14天内为植物评级。收获植物，并使其干燥。收集根和幼苗重量。
[0103] 结果：
[0104] 以 处理并以浓度为60mM的盐灌溉14天的水稻植物看起来高于在盐胁迫下、以水处理的植物(图3)。分别以 和SERENADE 处理并以浓
度为60mM的盐灌溉14天的水稻植株的根看起来长于在盐胁迫下、以水处理的植物(图4)。
图5显示出以SERENADE 处理的植物及以水处理的植物以毫克计的根和幼苗的干
燥重量。以SERENADE 处理的植物的幼苗和根二者的干燥重量均显著高于以水处
理的植物。因此，此结果显示短小芽孢杆菌ST2808的组合物/发酵产物可提高植物的盐胁迫抗性(盐胁迫耐受性)。
度为60mM的盐灌溉14天的水稻植株的根看起来长于在盐胁迫下、以水处理的植物(图4)。
图5显示出以SERENADE 处理的植物及以水处理的植物以毫克计的根和幼苗的干
燥重量。以SERENADE 处理的植物的幼苗和根二者的干燥重量均显著高于以水处
理的植物。因此，此结果显示短小芽孢杆菌ST2808的组合物/发酵产物可提高植物的盐胁迫抗性(盐胁迫耐受性)。
[0105] 实施例3：提高旱胁迫抗性
[0106] 盐耐受性被普遍接受用来模拟耐旱性，因此可归结出显示盐耐受性的植物亦将具耐旱性。因此，上述实验亦指出枯草芽胞杆菌QST713及短小芽孢杆菌ST2808亦提高植物的干旱抗性。
[0107] 干旱抗性亦可依下述进行确定。
[0108] 将植物，诸如水稻种子(品种RM401)播种在充满Profile Greens Grade的2.5”陶盆中。每个种子接受2毫升的64盎司/英亩的市售 或 (总体积100毫升，占11.2％)或水。将盆子依浸湿处理组放置在无孔单位中，并在温室中生长。
在实验持续期间以100ppm N的20-20-20肥料灌溉植物并将灌溉水平维持在约为盆子高度的一半。播种14天后，每一浸湿处理组(水或 64盎司/英亩)取10盆
停止或减少浇水，并确定最后瓦解的植株是哪个。根据 上述结果，预期以 或
处理的植物将在仅接受水的植物后瓦解。
在实验持续期间以100ppm N的20-20-20肥料灌溉植物并将灌溉水平维持在约为盆子高度的一半。播种14天后，每一浸湿处理组(水或 64盎司/英亩)取10盆
停止或减少浇水，并确定最后瓦解的植株是哪个。根据 上述结果，预期以 或
处理的植物将在仅接受水的植物后瓦解。
[0109] 另一可用于确定耐旱性的典型操作方案(protocol)为使植物循环通过反复的水胁迫(即不灌溉所述植物)和足量水的循环周期并评估最后瓦解的植株为哪些。例如，停止浇水直到经 或 处理的植物于再次浇水的时间点显示出危难的迹象。在实验结束后将评估哪些植株最后瓦解或看起来更健康。根据上述结果，亦预期在实验结束后当与仅以水处理的植物相比较时，以 或
处理的植物将在仅接受水的植物之后瓦解，或看起来较健康。
处理的植物将在仅接受水的植物之后瓦解，或看起来较健康。
[0110] 实施例4：用于确定枯草芽孢杆菌增溶磷酸盐的养分增溶性能的测定
[0111] 将细菌菌株(AQ30002和AQ713)的新鲜培养物生长于含有NBRIY培养基(葡萄糖10克/升、Ca3(PO4)2 5克/升、(NH4)2SO4 0.1克/升、NaCl 0.2克/升、MgSO4×7H2O 0.25克/升、KCl 0.2克/升、MgC12×6H2O 5克/升、FeSO4×7H2O 0.002克/升)的摇瓶中。将烧瓶培育在30℃下，并在200rpm下一边摇动至多14天。培养7和14天后，使用分光光度计，通过比色法，在660nm处测量并使用空白培养基作为对照组以测量培养肉汤的上清液中的可溶性钾的浓度。从图6可以看出，两种菌株在NBRIY培养基中提供较在空白培养基中显著更高的可溶性磷酸盐水平(图6A由AQ713增溶磷酸盐，图6B由AQ30002增溶磷酸盐)。
[0112] 实施例5：用于确定枯草芽孢杆菌A的养分增溶性能的测定-制造铁载体以改善铁的可利用性
[0113] 根 据 Pérez-Miranda et al.O-CAS,a fast and universal method for siderophore detection.J.Microbiol.Methods 70:127-131,2007，使用覆盖CAS琼脂法将细菌菌株(AQ30002和AQ713)的新鲜培养物接种在铬天青S(CAS)琼脂盘上。将该琼脂盘在30℃下培育至多7天。目视检查琼脂盘的颜色从蓝色变成橙色，这指示铁载体的制造。AQ30002和AQ713菌落造成颜色变化，表明该两种菌株具有作为土壤接种物，提供足够的铁载体制造以改善铁的可利用性的效用。
[0114] 实施例6：用于确定增加土壤养分水平的内切葡聚糖酶、内切木聚糖 酶及蛋白酶活性的测定
[0115] 分别使用辅以1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、1％木聚糖及1％AZO-酪蛋白的营养琼脂来测量内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶及蛋白水解活性。首先将AQ30002及AQ713细菌菌株生长在来自Hardy诊断公司的营养琼脂盘上并在30℃下培育一整夜。然后，将单一菌落转移到辅以基质(CMC-Na、木聚糖、AZO-酪蛋白)的培养盘中间。然后，将培养盘在30℃下培育2-7天。若培育期结束时可见到一个透明区，则将酶活性记录为阳性。
[0116] 将AQ30002和AQ713菌落在辅以基质的培养盘上培育可以在各自基质上产生一透明区。内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶分别水解纤维素和木聚糖(此两者均为存在于植物细胞壁中的多糖)。这些水解活性加上蛋白酶活性可允许AQ713和AQ30002促进存在于土壤中的有机物质转化成可被生长中的植物利用的养分。
[0117] 植物的根亦挤出许多有机物质至根的表面上。不希望受限于任何理论，如AQ713及AQ30002的定殖于根者可使用该挤出物作为沿根部生长的能量来源，并同时通过酶的作用从有机物质释出矿物质以供植物吸收。
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