비생물학적 스트레스에 대한 식물 저항성을 증가시키는 ＢｒＣＰＩ 유전자 및 이의 용도{BrCPI gene enhancing plant tolerance to abiotic stress and uses thereof}

본 발명은 비생물학적 스트레스에 대한 식물 저항성을 증가시키는 BrCPI 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 순무 유래의 BrCPI ( Brassica rapa cysteine protease inhibitor) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 벡터를 이용한 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

순무 ( Brassica rapa L.)는 십자화과에 속하는 온대성 식물로 13세기경 우리나라에 전래되어 재배되고 있다. 세계적으로 십자화과 식물은 배추, 양배추, 브로콜리, 겨자 및 유채 등 350속 3,000종으로 분화되어 게놈 진화 이론의 확립을 통한 유전학적, 육종학적 연구에 많은 성과를 보이고 있다.

주요 십자화과 식물의 게놈은 순무 ( B. rapa 2n=20 AA), 무 ( Raphanus sativus , 2n=18), 양배추 ( B. oleracea , n=9, CC), 배추와 양배추가 교잡된 유채 ( B. napus , 2n=4×=38, AACC), 배추와 흑겨자가 교잡된 갓 ( B. juncea , 2n=4×=36, AABB) 등으로 구성되어 있으며, 이를 통해 다양한 품종으로 육성되어 시판하고 있다. 국내에서 배추는 4대 채소작물 중의 하나이며, 총 야채 재배면적의 1/4 정도를 차지하여 약 4만 ha에서 연간 240만 톤을 생산한다.

오래전부터 국내의 많은 배추 연구자들은 고온다습한 환경 조건에서 재배 가능한 품종으로 수량, 결구형, 숙기 및 내병성 등을 개선하려고 노력하고 있으며, 각 작형에 맞는 생태형 품종 및 품종 개선에 중점을 두고 육성하고 있다. 그럼에도 불구하고 해마다 배추의 여러 가지 병해로 인한 경제적인 피해가 막대하다.

국내의 배추 재배에서 문제시되고 있는 주요 질병은 노균병, 무름병, 무사마귀병, 밑둥썩음병, 흰녹가루병, 모자이크병 등으로 이들 병해의 방제를 위해 다량의 약제 살포가 요구되고 있다. 특히 무름병의 경우, 그 피해가 심각하여 여름철 배추 생산의 가장 큰 장해요인으로 우리나라 뿐 만아니라 일본 및 중국에서도 많이 발생하는 병으로 약제 살포 효과가 낮기 때문에 방제가 어려운 실정이다.

최근 분자생물학의 발달로 병해충에 강한 작물을 개발하고자 하는 노력이 세계 여러 나라에서 중요한 연구 주제로 급부상되어 많은 연구를 수행하고 있으나 그 방어기작에 대해서 정확한 해명이 이루어지지 않은 실정이다. 국내에서 배추의 유전자에 관한 연구가 몇몇 대학 및 연구소를 중심으로 유전자은행 구축, 기능 유전자의 분리 및 분자적 특성, RNAi법에 의한 유전자의 발현 제어, 유전자의 발현 강화, EST 비교 분석, microarray 기법을 이용한 유전자발현 해석 등이 활발하게 진 행되고 있는 실정이다.

동 식물체 내의 생리대사 특히 생체방어와 관련된 다양한 생리반응들은 단백질 분해과정을 통해 특정 단백질이 활성화되는 방식으로 진행된다. 시스테인 프로테아제 저해제(cysteine protease inhibitor)는 세포 내부 또는 외부로부터 시스테인 프로테아제에 의한 비우호적인 단백질 분해 활성으로부터 세포를 보호하며, 침략자에 대한 생물학적 방어 체계로서 중요한 역할을 담당한다.

지금까지 시스테인 프로테아제 저해제는 cathepsin B, H, L, S와 papain 등으로 thiol 기를 갖는 시스테인 계열 단백질분해효소 작용을 저해하는 단백질로 동식물에 널리 분포하고 그 종류와 특성이 다양하다. 식물 유래 시스테인 프로테아제 저해제는 약 30개 정도 알려져 있으며, 12 내지 16kDa의 크기로 QxVxG의 활성 부위 및 이황화 결합이 되지 않은 상태로 존재하며 계란 유래의 동물 시스테인 프로테아제 저해제와 매우 높은 상동성을 갖는다. 염기배열에 따라 식물 유래 시스테인 프로테아제 저해제는 파이토시스타틴의 용어로 새로운 subfamily로 분류되고 있다. 이들 단백질은 식물의 생장과 발육과정에서 상이한 발현 양상을 보이며, 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다. 식물세포내에서 이들 단백질의 역할은 배 발생, 종자발아 및 세포자살(Programed cell death) 과정에서 사용하기 위해 비축한 생물학적 활성을 갖는 시스테인 프로테아제 작용을 억제함으로써 세포를 보호한다. 또한 외부로부터 침입한 딱정벌레, 선충류, 진균 및 바이러스 등으로부터 식물을 보호하기 위한 방어 기작은 시스테인 프로테아제가 세포 복제 및 위(gut)에서 소화효소로서 중요한 역할을 하고 있기 때문에 저해제가 매우 중요한 면역 요인으로 작용한다. 특히 비생물학적 스트레스 반응에서의 시스테인 프로테아제 저해제는 cold shock 및 암흑상태에서 자란 보리의 생체 조직에서 mRNA 축적이 높게 나타났으며, 추위, 염분 및 고온 스트레스 처리한 밤나무의 뿌리 및 잎에서 발현양이 높게 나타났다. 또한 파이토시스타틴은 식품산업의 보조제로 사용하고 있으며, 생물공학기술에 적용하고 있다. 브로컬리, 양배추, 케일 등이 포함된 Brassica 속 식물들은 자가불화합성 연구의 모델식물로 알려져 많은 연구가 되어 있다. 그러나 아시아에서 매우 중요한 체소작물 중 하나인 순무 ( Brasssica rapa L.)에서 방어 기작에 관한 연구는 전무한 상태이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 순무 ( Brassica rapa )의 화아 기관으로부터 파이토시스타틴에 관련된 유전자 (BrCPI1)를 분리하여 유전자의 구조 분석 및 발현 특성을 구명하고, 상기 유전자가 도입된 식물체가 비생물학적 스트레스에 대한 저항성이 증가함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 순무 유래의 BrCPI ( Brassica rapa cysteine protease inhibitor) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용한 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 순무 BrCPI 유전자는 비생물학적 스트레스를 경감시키는 작용을 하는 것으로 생각되므로, 효과적으로 염, 저온 등 각종 스트레스에 대한 저항성이 높은 식물체를 얻을 수 있다. 따라서, 경제작물 등의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 순무 유래의 BrCPI ( Brassica rapa cysteine protease inhibitor) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 BrCPI 단백질의 범위는 순무 ( Brassica rapa )로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 BrCPI 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 비생물학적 스트레스 저항성에 관여하며, BrCPI 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바 람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 BrCPI 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(카나마이신), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(하이그로마이신), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모( Saccharomyce cerevisiae ), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl ₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 BrCPI 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 환경 스트레스는 바람직하게는 비생물학적 스트레스이며, 상기 비생물학적 스트레스는 바람직하게는 염, 저온 또는 ABA(abscisic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러 한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수 수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명은 또한, 환경 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체로부터 얻은 종자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료

순무 ( Brassica rapa L.) 종자를 한경대학교 원예학과의 유리 온실에서 12℃ 이하의 저온을 일정기간 유지하여 꽃눈 분화를 유도하였다. 개화 전에 뿌리, 줄기, 잎, 주두, 꽃잎, 수술, 꽃받침, 화경 등을 분리하여 액체 질소에 넣어 동결한 후, -80℃ 냉동고에 보관하여 RNA 추출 재료로 이용하였다. 또한 발아 초기의 식물 재료를 얻기 위해, 순무 종자를 filter paper 상에서 25℃ 암 상태에서 발아시킨 후, 1, 2, 4, 8, 10일의 유묘를 각각 채취하여 액체 질소에 넣어 동결한 후, -80℃ 냉동고에 보관하여 Total RNA를 분리하였다.

2. Total RNA 분리

식물조직 0.1g을 측정하여 미리 차갑게 준비해 놓은 막자사발과 막대를 이용하여 액체 질소로 마쇄하였다. 갈아진 조직은 계량스푼을 사용하여 1ml의 TRIzol-reagent (1ml TRIzol-reagent/50-100mg 조직)가 담긴 1.5ml 원심분리용 튜브에 넣어 섞어주고, 핵단백질체가 완전히 분리되도록 상온에 15분간 두었다. 1ml TRIzol-reagent에 대해 0.2ml 클로로포름을 넣어 15초 동안 vortex하고, 상온에서 5분간 방치한 후 11,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여 단백질층이 따라 오지 않도록 상층만을 새 튜브로 옮겼다. 상층은 0.5ml의 이소프로판올 (1ml TRIzol-reagent당)과 0.25ml의 고염 침전 용액 (0.8M sodium citrate/1.2M NaCl)을 넣어 잘 섞어주고 상온에서 10분간 방치하여 RNA를 침전시켰다. 이렇게 추출한 산물을 11,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 RNA 침전물에 1ml의 75% 에탄올을 넣고 11,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리했다. 그 다음 상층액을 제거하고 RNA 침전을 진공상태에서 5-10분간 건조시켰다. 마지막으로 50㎕-100 ㎕의 DEPC 처리된 멸균수에 녹이고, spectrophotometer로 RNA 양을 정량하여 사용하였다.

3. cDNA 합성 및 RT - PCR 분석

Total RNA는 RNase H-역방향 Transcriptase (Gibco SuperscriptII) 프로토콜에 따라 수행하였으며, 제1가닥 cDNA는 5㎍ total RNA로부터 합성하였다. RNA 주형 5㎍에 50mM oligo-dT 1㎕, 10mM dNTP 1㎕, DEPC water 10㎕을 첨가하여 17㎕로 맞추고 65℃ 인큐베이터에서 5분간 변성시킨 후, 얼음에 두어 냉각시키고 5× 제1가닥 완충액 4㎕와 0.1M DTT 1㎕, RNase 저해제 (40units/㎕) 1㎕, SuperscriptII RTase (200units/㎕) 1㎕를 첨가하여 최종 부피 20㎕로 제조한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 1시간 반응시키고 72℃에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화하였다. 합성된 cDNA 2㎕를 주형으로 10× PCR 완충액 (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl) 5㎕와 50mM MgCl ₂ 1.5㎕, 10mM dNTP mix 1㎕, Taq DNA 중합효소 (5units/㎕) 0.4㎕, 정방향 프라이머 (10μM), 역방향 프라이머 (10μM)를 각각 1㎕씩 첨가하고 멸균수 38.1㎕로 최종 부피 50㎕를 만든 후 PCR을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 NCBI 데이타베이스로부터 얻어진 정보로부터 (5'-GAACTTGGAAGGTACTG-3'; 서열번호 3), (5'-AGTTTTGCGCTTCAGGCA-3'; 서열번호 4)를 합성하여 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분간 예비변성시킨 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장 과정을 35 사이클로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔상에 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다. 증폭산물은 pGEM T-Easy 벡터 (Promega)에 클로닝하여 염기서열을 조사하였고, 유전자간 상동성 비교는 BLAST 분석에 의하여 실시하였다.

4. 클로닝

cDNA의 3'-말단에 A-tailing이 되는 것을 이용하여 pBig 벡터에 클로닝하였다.

벡터 DNA 의 준비

GUS 유전자를 포함하고 있는 pBig 벡터의 제한효소 처리시 SfII (10units/㎕) 0.5㎕, 10× 완충액 1.5㎕, 벡터 DNA 5㎕ (200ng/㎕)를 넣고 멸균수 7.5㎕로 최종 부피가 15㎕로 하였다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.8% 아가로스 겔상에서 확인했다. 벡터 DNA를 겔로부터 재추출하여 탈인산화 반응을 하였다. BAP 처리는 벡터 DNA 34㎕, 10× 완충액 5㎕, BAP 1.5㎕ 및 멸균수 9.5㎕를 튜브에 모아 55℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

Competent cell 준비

LB agar 배지에 50% 글리세롤 스톡 상태로 -80℃ 초저온 냉동고에 보관중인 E. coli DH5α 균주를 스트리킹하여 37℃에서 16시간 동안 배양했다. 단일 콜로니는 멸균한 LB broth [tryptone 10g/L, yeast extraction 5g/L, sodium chloride (NaCl) 5g/L] 10ml가 담겨진 50ml 튜브에서 37℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양했다. 배양액 2.5ml을 250ml의 LB broth에 넣고 37℃에서 200rpm으로 4시간 동안 OD 600=0.6이 될 때까지 배양한 후, 얼음에 10분 동안 보관하여 차게 한 뒤 배양액을 200ml 원심관에 나누어 담고 5,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리했다. 상등액은 버린 후 침전된 세포에 배양액과 같은 양의 멸균수를 넣고 4℃에서 5,000rpm으로 10분 동안 3회 반복하여 원심분리했다. 마지막으로 침전된 세포에 10% 글리세롤을 400㎕씩 넣고 1.5ml 튜브에 50㎕씩 분주한 후, 즉시 액체 질소에 넣어 냉동시켜 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

플라스미드 벡터와 insert DNA 의 라이게이션

라이게이션을 위해 벡터 (pBig) : insert DNA (CPII gene)의 비율이 1 : 3 이 되도록 준비하고, T4 DNA ligase 10× 완충액 1㎕, T4 DNA ligase (3 Weiss units/㎕) 1㎕, 벡터 DNA (50ng) 1㎕, Insert DNA(20ng) 1㎕를 넣고 멸균수로 최종 부피를 10으로 맞춘 뒤 4℃에서 16시간 이상 반응시켰다.

전기천공법을 이용한 형질전환

-80℃ 초저온 냉동고에 보관해둔 competent cell을 꺼내 얼음에 넣어 녹인 후 라이게이션을 마친 DNA 1-3㎕와 섞어서 electroporation cuvette에 주입한 후 1440V로 전기충격을 가해서 형질전환시켰다. 그리고 SOC 배지 1ml을 첨가하여 혼합한 후 멸균된 시험관에 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 카나마이신 50mg/L을 포함한 LB agar 배지에 839mM IPTG (Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranoside) 10㎕와 50mg/ml X-gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranoside) 40㎕를 배지 위에 떨어뜨리고 밀대로 골고루 펴준 뒤, 37℃에 10분 두었다가 배양액 200㎕를 피펫으로 떨어뜨려서 도말하였다. 37℃ 항온기에서 샤레를 16시간 동안 배양하여 콜로니를 관찰했다. 백색 콜로니는 모두 콜로니 PCR 분석을 수행하여 플라스미드의 크기를 관찰하고 라이게이션 유무를 확인했다. 이를 NCBI 데이타베이스로부터 얻어진 CPI 유전자의 프라이머를 이용하여 도입 여부를 PCR로 확인하였다.

플라스미드 DNA 추출

콜로니 PCR을 통해서 총 12개의 시료를 선별하고 플라스미드 DNA를 추출하였다. 단일 박테리아 콜로니는 카나마이신 50mg/L을 포함한 LB 배지 5ml에 접종한 후 37℃ 인큐베이터에서 200rpm으로 shaking하여 16시간 동안 배양하였다. 배양액 1ml을 1.5ml 튜브에 분주하고 4℃에서 12,000rpm으로 1분간 원심분리하였다. 침전된 세포에 차가운 상태의 GTE 용액 I [glucose 2.25g, 1M Tris-Hcl (pH 8.0) 6.25ml, 0.5M EDTA 5ml per 250ml] 200㎕를 첨가하여 혼합하고 용액 II (0.2N NaOH, 1%SDS) 200㎕를 첨가한 후, tapping하였다. 곧바로 용액 III (3M potassium acetate pH 7.5) 200㎕를 첨가하여 tapping하고 -20℃에 5분 동안 보관한 뒤 4℃에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 다른 튜브에 옮겨, 3㎕의 RNase (10mg/ml)를 첨가하고 37℃ 항온기에서 30분간 방치한 뒤 PCI (페놀/클로로포름/이 소아밀알코올, 25:24:1)를 500㎕ 넣고 실온에서 12,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액에 100% 에탄올 1ml를 첨가해서 30분 동안 -20℃ 냉동고에 보관한 후, 4℃, 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 그 후, 70% 에탄올 500㎕를 넣고 tapping하고 12,000rpm으로 5분간 원심분리 해서 최종 침전물을 건조하여 멸균수 50㎕에 녹여 사용하였다.

5. 비생물학적 스트레스 처리에 따른 유전자 발현 분석

BrCPI1 유전자의 비생물학적 스트레스에서 반응을 알아보기 위해 스트레스 처리 후, 얻어진 조직에서 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 분석에 의해 조사하였다. 스트레스의 종류는 100 mM ABA, 건조, 삼투(15% PEG6000), 250 mM NaCl, 4℃ cold 등으로 하였다. 처리방법은 종자 발아 후, 14일된 육묘을 이용하여 Yosida 양액(Yosida et al. 1976, Philippines: IRRI. 83)에서 온도 25℃, 상대습도 70~75% 조건의 생장상에서 처리하여 시간대별로 식물 조직의 잎과 뿌리를 채취하였다. Total RNA 추출과 RT-PCR 분석은 인트론 바이오사에서 시판하고 있는 식물 RNA 추출 키트와 one-step RT-PCR 키트를 각각 사용하였다. 각각의 유전자 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머들은 유전자의 3'-UTR 부위 중심으로 GC 함량 비율 등을 고려하여 선정하였다. 프라이머 합성은 Takara사에 의뢰하여 제작하였다. RT-PCR의 반응 조건은 45℃에서 30분, 94℃에서 5분간 역전사 반응을 하고, 94℃에서 20초, 58℃에서 40초, 72℃에서 1분의 단계로 40회 반복하여 실시하고, 72℃에서 5분간 최종 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에 전기영동하여 발현 정도를 확인하였다.

6. 형질전환용 아그로박테리움 튜머파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) 균주 작성

식물 발현 벡터 구축

GUS 유전자를 포함하고 있는 pBig 벡터를 SfII 처리하여, 그 위치에 881bp의 CPI1 유전자를 삽입시켰다. 이 재조합된 벡터는 E. coli 에 형질전환시킨 후, 카나마이신 50mg/L을 포함한 LB 배지에서 선발된 단일 콜로니로부터 플라스미드를 추출하여 insert DNA의 유무를 확인하였다.

아그로박테리움 튜머파시엔스에 형질전환

식물 발현의 벡터 구축을 위해 확인된 플라스미드는 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404에 형질전환시켰다. 28℃에서 동일 방법으로 제조된 아그로박테리움 튜머파시엔스 competent cell LBA4404는 얼음에서 녹인 후 플라스미드 DNA 1㎕와 섞어서 electroporation cuvette에 주입하였다. 그 다음 1440V로 전기충격을 가해서 형질전환시킨 후 SOC 배지 1ml을 주입하여 혼합한 후, 멸균된 시험관에 넣고 28℃에서 200rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 배양액은 카나마이신 50mg/L을 포함한 AB agar 배지 (stock I: K ₂ HPO ₄ 3g, stock II: NaH ₂ PO ₄ 1g, NH ₄ Cl 1g, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.3g, KCl 0.15g, CaCl ₂ 0.01g, stock III: FeSO ₄ ·7H ₂ O 2.5mg, glucose 5g/L)에 200㎕를 피펫으로 떨어뜨려서 도말하고, 28℃ 항온기에서 샤레를 2-3일 동안 배양하여 콜로니를 관찰하였다. 백색 콜로니는 모두 콜로니 PCR 방법으로 형질전환여부를 확인하고, 확인된 균주의 배양은 카나마이신 50mg/L이 첨가된 AB 액체 배지에 접종한 후, 2-3일 동안 28℃ 인큐베이터에서 200rpm으로 배양했다. 배양액은 50% 글리세롤을 동량 첨가하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 저장하였다.

7. 도입유전자의 유전분석

Total DNA 분리

유전자의 도입 여부를 위해 total DNA의 분리는 CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) 법을 이용하였다. 형질전환체 및 대조 식물로부터 채취한 0.5g의 잎은 액체 질소를 이용하여 미세하게 분쇄하였고, DNA 추출 완충액 [100mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM EDTA, 500mM NaCl] 400㎕가 담긴 1.5ml 원심분리용 튜브에 갈아진 조직을 넣고 상하로 20회 혼합하였다. 그 후, 2×CTAB 완충액 [2% (w/v) CTAB, 100mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM EDTA, 1.4M NaCl, 1% pvp-40 (polyvinylpyrrolidine)] 200㎕를 첨가하여 같은 방법으로 혼합하고 10% SDS를 넣고 10회 정도 상하로 섞어준 후, 65℃ 항온 수조에 20분간 방치하였다. 5M potassium acetate (pH 7.5) 200㎕를 첨가하고 50회 정도로 상하로 섞어준 후, PCI [페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (25: 24: 1)]를 700㎕ 넣고 30회 정도 상하로 섞 어 실온에서 12,000rpm, 10분간 원심하여 단백질을 분리해냈다. 상층 400㎕정도를 새 1.5ml 튜브로 옮긴 후 동량의 이소프로판올을 첨가하여 -20℃ 냉동고에 20분간 보관하였다가 4℃의 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 1ml를 넣고 세척한 다음 실온에서 완전히 건조시키고 RNase (1mg/ml) 2㎕가 첨가된 TE 완충액 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.4) 50㎕에 충분히 녹인 후 37℃에서 1시간 방치하여 사용하였다.

도입유전자 검정을 위한 PCR 분석

CPI1 유전자의 도입 여부를 확인하기 위한 PCR 반응은 20ng의 주형 DNA를 사용하였고, 아래와 같이 세 종류의 프라이머를 합성하여 각각 이용하였다. 하이그로마이신 저항성 유전자 (HPT) 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트 (정방향 5'-GCGTGACCTATTGCATCTCC-3'; 서열번호 5, 역방향 5'-TTCTACACAGCCATCGGTCC-3'; 서열번호 6)로 96℃에서 5분간 예비변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장 과정을 30 사이클로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 연장을 실시하였다. BrCPI1 유전자 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트 (정방향 5'-ATGGCTTCCAAAGTTCAACTCGTG-3'; 서열번호 7, 역방향 5'-TCAAGTTTCAGAAACCATCTT-3'; 서열번호 8)로 94℃에서 4분간 예비변성시킨 후 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장 과정을 35 사이클로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에 영동한 후 에티디움 브로마이드로 10분간 염색하여 밴드를 확인하였다.

8. RT - PCR 에 의한 BrCPI1 유전자 발현 분석

유전자 도입이 확인된 형질전환체의 BrCPI1 유전자의 발현 정도를 분석하기 위해, 잎 조직 (0.2g)에서 mRNA를 분리하여 RT-PCR 분석을 하였다. 분리한 mRNA는 역전사효소(Promega, USA)를 사용하여 cDNA로 전환하고 spectrophotometer에 의해 일률적으로 조정한 cDNA를 주형으로 사용하였다. RT-PCR에 사용한 BrCPI1 유전자의 프라이머 세트는 정방향 5'-ATGGCTTCCAAAGTTCAACTCGTG-3'(서열번호 9) 및 역방향 5'-TCAAGTTTCAGAAACCATCTT-3'(서열번호 10)로 합성하여 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 4분간 예비변성시킨 후 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 연장 과정을 35 사이클로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장을 실시하였다. RT-PCR의 정량적 기준으로는 액틴 유전자를 이용하였다. β-액틴 유전자의 프라이머 세트는 정방향 5'-ATGGTTGGGATGGGTCAAAAA-3'(서열번호 11), 역방향 5'-TCTTTAATG TCACGGACGATT-3'(서열번호 12)로 합성하여 이용하였다. PCR 반응은 94℃에서 4분간 예비변성시킨 후 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간 연장 과정을 30 사이클로 하였고 72℃에서 5분간 연장을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 10분간 염색하여 각각의 밴드를 확인하였다. RNA의 정량분석은 표준곡선 범위 내에서 BrCPI1 유전자와 reference로 액틴 유전자의 발현을 정량하였다. 각 형질전환 후대 계통의 cDNA stock (5ng/㎕)을 50배 희석하여 튜브마다 5㎕를 넣었다. 정량 PCR에는 SmartCycler II (TaKaRa, Japan)와 SYBR RT-PCR 키트(Perfect Real Time)을 이용하였으며, 증폭된 DNA와 결합한 SYBR Green I을 검출하는 방법을 사용하였다. 검출된 값으로부터 표준곡선을 이용하여 상대 발현량을 계산하였으며, 각 시료에 대해 2 반복으로 측정하였고 평균값을 분석에 이용하였다. 또한, 각 계통마다 액틴 유전자의 발현량을 1로 보정하였고, 그 값에 대한 BrCPI1 유전자의 발현량을 계산하여 그래프로 표시하였다.

실시예 1. BrCPI1 유전자 분리 및 구조 분석

1-1. 유전자 구조 분석

순무 유래 시스테인 프로테아제 저해제 관련 유전자를 분리하기 위해 NCBI 데이타 분석을 통해 프라이머 Br1 (5'-GAACTTGGAAGGTACTG-3'; 서열번호 13)과 Br2 (5'-AGTTTTGCGCTTCAGGCA-3'; 서열번호 14)를 합성하였다. 이들 두 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석한 결과 171bp 단편을 얻었으며, 애기장대 유래 시스테인 프로테아제 저해제와의 염기배열 상동성이 88%로 나타난 것으로 미루어 볼 때 시스테인 프로테아제 저해제라고 생각되었다. 따라서 이 단편의 염기서열을 이용하여 RACE 방법을 통해 Full length을 얻은 결과 3' RACE에서 575bp cDNA 단편을 5' RACE에서 531bp의 단편을 얻었다. 3' RACE에서 얻어진 단편에는 17개 A tail이 존재하며, 209개의 염기가 UTR (untranslated region)으로 존재하며, 처음 분리한 단편과 125개 염기가 중복되었다. 5' RACE에서 얻어진 단편에서 처음 분리한 단편과 62bp가 중복되어 있으며, 개시코돈인 ATG가 존재하였다. 따라서 순무 유래의 시스테인 프 로테아제 저해제 관련 유전자는 881bp 크기로서 BrCPI1으로 명명하였다. BrCPI1 유전자의 구조 분석은 DNA star 프로그램에 의해 분석한 결과 ATG의 개시코돈은 63번째 위치해 있었으며, 종지 코돈인 TGA은 673번째에 존재하였고, 그 후에 poly A가 존재하는 full length cDNA이었다(도 1). 따라서 BrCPI1 유전자는 609개의 염기로 구성하는 ORF 영역으로 202개의 아미노산으로 이루어졌으며, 15.5kDa의 크기로 pI=4.6을 예측할 수 있었다.

BrCPI1 유전자의 아미노산 배열을 이용하여 소수성(Hydrophobicity) 분석 및 von Heijne 방법으로 분석한 결과 signal을 가지는 배열은 A ₂₃ 이었다. 또한 시스테인 프로테아제 수의 비교에서 BrCPI1 유전자의 N 말단 상에 첫 번째로 존재하는 L ₁₀₃ 과 P ₁₀₄ 의 아미노산이 기존에 알려진 단백질과의 높은 상동성을 보인 것으로 미루어 볼 때 L ₁₀₃ 의 아미노산이 BrCPI1 유전자 산물을 구성하는 단백질 구조의 종지 영역으로 생각된다. 보통 시스테인 프로테아제는 활성 효소를 생산하기 위해 아미노산 말단 영역을 제거하는 과정이 필요하다.

아미노산 말단영역은 proregion이라고 불리며 효소활성의 제어뿐만 아니라 새롭게 만들어진 단백질을 올바르게 사슬화하는 역할을 담당한다.

그리고 pH 조건이 갑자기 변할 때 변성효과에 대한 보호 역할을 수행한다. 현재까지 알려진 시스테인 프로테아제의 N 말단 아미노산 배열과 본 연구에서 분리한 BrCPI1 유전자 산물인 파이토시스타틴은 구조면에서 매우 유사하며, 15.5kDa 이다. 따라서 proregion의 영역에 따라 papain 계의 시스테인 프로테아제는 N 말단 영역의 아미노산이 약 60개 정도로 구성되는 cathepsin B와 약 100개의 아미노산으로 구성되는 cathepsin L 의 subfamily로 나눌 수 있다 (도 2).

또한, 아미노산 배열 중에 시스테인 프로테아제만이 보존하고 있는 배열 QxVxG motif가 존재한다. 따라서 아미노산 구조로 볼 때 BrCPI1 유전자의 산물인 cystatin은 papain subfamily 중 cathepsin L 이었다.

1-2. 유전자의 계통주 분석

본 실험에서 분리한 BrCPI1 유전자의 아미노산 배열과 이미 보고된 유전자 간에 계통주를 작성하였다. 계통주 작성에는 NCBI 검색 결과 얻어진 파이토시스타틴 관련 유전자 이름으로 대신하였다. 계통주 작성 결과, 현재 보고된 시스테인 프로테아제 저해제 관련 유전자군은 크게 4개의 그룹으로 나뉘어지는 것을 알 수 있었다.

유전자 기능에 대한 정보가 거의 없는 실정이라 그 기능은 예측할 수 없으나, 4개 그룹의 유전자간 기능적으로 분리되어 있을 가능성을 시사하고 있다. 본 발명에서 분리된 BrCPI1은 애기장대 및 양배추 유래의 시스타틴 유전자와 같은 cluster를 형성하고 있는 것이 확인되었다(도 3). 이러한 결과들로부터 BrCPI1 유전자는 애기장대 및 양배추 유래 유전자와 거의 유사한 기능을 가지고 있을 것으로 예측된다.

실시예 2. BrCPI1 유전자의 copy 수 및 발현 분석

순무 게놈 상에서 BrCPI1 유전자의 copy 수를 알아보기 위해 순무 잎을 채취해서 cDNA의 염기서열 중 순무의 다른 시스테인 프로테아제 저해제와 상동성이 낮은 3'말단 영역 특정 염기서열 부위를 프로브로 하여 Southern blot 분석한 결과 사용된 4개의 제한효소에서 모두 단일 밴드로 보였다 (도 4).

또한 순무의 기관별 BrCPI1 유전자의 발현 양상을 분석하기 위해 배추에서 알려진 CPI 유전자들 (BrCC2, BrCC3, BrCC4, BrCC5)과 함께 RT-PCR을 수행한 결과, 뿌리, 줄기, 잎, 주두, 꽃잎, 수술, 꽃받침, 화경 등에서 높게 발현됨을 알 수 있었다 (도 5).

또한, 순무의 발육 단계에 따른 BrCPI1 유전자의 발현 양상을 살펴본 결과는 도 6과 같다. 배추유래 CPI 유전자들 BrCC2, BrCC3, BrCC4, BrCC5 및 BrCPI1의 발현양상은 BrCC4을 제외하고 거의 유사한 발현 패턴을 보였다. BrCPI1 유전자는 BrCC2, BrCC3 및 BrCC5와 유사하게 발아 15일 후부터 발현이 증가되었다. 그러나 발현 패턴이 발아 후 20일까지 강하게 유지되는 BrCC3, 발아 후 30일까지 유지되는 BrCC5 유전자와는 달리 BrCPI1과 BrCC2는 발아후 15일경에 강하게 발현되다가 그 후 발현이 줄어드는 양상을 보였다. 따라서 순무 유래 BrCPI1 유전자는 배추 유래의 BrCC2 유전자와 거의 유사한 발현 양상을 보이는 것을 미루어 볼 때 같은 기능을 갖고 있는 것으로 예상된다.

따라서 BrCPI1 유전자는 순무 게놈 내에 단일 copy로 존재하며 조직 및 기관별 발현 양상으로 보아 방어 기작을 갖고 있는 유전자로서 기관분화 및 생장점에 주로 발현하는 유전자로 종자의 발육 및 식물생장에 관여하는 유전자로 생각된다.

실시예 3. BrCPI1 유전자 도입 형질전환 및 후대 육성

3-1. 식물 발현 binary 벡터 구조 분석

식물 발현 binary 벡터 구축을 위하여 pBIG 벡터을 SfiI 처리하여 순무에서 분리한 BrCPI1 유전자의 양끝에 SfiI 제한효소 자리를 합성하여 만든 유전자 단편을 삽입시켰다 (도 7). 따라서 BrCPI1 유전자는 35S 프로모터의 지배하에 발현하도록 하였다. 선발 마커 유전자로 하이그로마이신 저항성 유전자 (HPT)를 포함하고 있어 재분화 과정상 강한 선발을 할 수 있을 것으로 생각된다.

3-2. 형질전환 애기장대 선발 및 순화, 세대육성

BrCPI1 유전자의 형질전환은 스프레이 방법에 의해 수행하였다. 애기장대의 개화 전에 아그로박테리움을 스프레이로 화아 기관에 촉촉하게 감염시킨 후, 종자를 채취하였다.

얻어진 T1 종자를 하이그로마이신이 포함된 MS 배지에서 형질전환체 30개체 중 정상적으로 생육한 10개의 식물체를 선발하여 T2 세대를 육성하였다(도 8).

3-3. 도입유전자의 확인 및 발현 분석

형질전환 식물체에서 도입한 유전자의 유·무를 알기 위해 항생제에 내성을 가진 T1 식물체와 대조 식물체를 이용하여 HPTⅡ 및 BrCPI1 유전자 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석을 실시하였다. 그 결과 유전자를 도입하지 않은 대조 식물체에서는 증폭 산물을 얻을 수 없었으나, 형질전환 식물체들에서 HPT 유전자 산물이 확인되었다. 또한 BrCPI1 유전자의 PCR 분석에서 증폭산물을 확인할 수 있었다. 따라서 유전자 수분에서 선발 마커로 사용된 유전자 및 목적으로 하는 BrCPI1 유전자가 배추 게놈에 안정적으로 도입되어 있다고 할 수 있다. 형질전환 식물체에서 BrCPI1 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 각 계통에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR 분석을 실시한 결과 도입한 BrCPI1 유전자가 정상적으로 mRNA로 전사되고 있음을 확인하였다. 이상의 결과로부터 순무로부터 분리된 BrCPI1 유전자가 애기장대 게놈 내에 도입되어 안정적으로 발현하고 있다고 할 수 있다.

3-4. 비생물학적 스트레스 변화에 따른 BrCPI1 유전자의 발현 분석

BrCPI1 유전자가 방어 기작에 영향을 주며, 종자의 발달 및 식물 생장에서 크게 관여하고 있다고 생각된다. 따라서 식물생장에 영향을 주는 비생물학적 스트레스인 염, cold 및 생장조절물질 중 ABA 처리 후 BrCPI1 유전자의 발현 정도를 살펴본 결과, ABA 처리구에서는 대조구와 거의 유사한 발현량을 보였다 (도 9). 또한 환경 스트레스 변화에 따른 BrCPI1 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해 250 mM NaCl, 4℃ cold를 처리하여 지상부의 발현량을 분석한 결과 식물체가 환경 스트레스를 받으면 유전자의 발현 정도가 증가하는 것을 볼 수 있었다 (도 9). 염해 스트레스는 NaCl에서 유래되는 Na+와 Cl- 이온 농도가 원인이 되어 세포 내에 Ca2+ 이온의 증가를 초래하게 되고, 순간적으로 변화된 세포질 내의 Ca2+ 이온농도는 second messager로서 작용하여, 세포의 스트레스에 대한 신호전달체계를 활성화하고 세포 내의 염해 스트레스 적응에 관여하는 K+ 이온의 유입과 K+/Na+ 관계를 조절하게 된다. ABA는 식물의 비생물학적 스트레스에서 중요한 역할을 하는 식물 호르몬으로서 스트레스 반응에 관여하는 유전자들의 발현 조절을 매개하는 것으로 알려져 있다. 따라서 BrCPI1 유전자가 염 및 cold 스트레스를 받은 애기장대 잎에서 발현량이 증가하는 것으로 미루어 볼 때, 환경 스트레스를 받은 식물체는 유전자의 발현량이 증가되어 식물이 정상적으로 어느 시기까지 유지되도록 하는 생장 관련 분자기구를 갖고 있지 않나 생각된다.

따라서, BrCPI1 유전자가 세포 내에서 발현함에 따라 세포 내 다른 효소활성의 변화가 초래되여 세포 내에서 프로테아제간의 상호작용에 의해 활성 차이를 보이는 것으로 생각된다. 프로테아제는 세포 내에서 대사 작용 신호전달, 아미노산 합성 등 식물의 생장과 발육하는 과정상에 생리적으로 변화되는 것으로 노화과정상에 변화가 많다고 알려졌다. 따라서 순무 유래의 BrCPI 유전자는 식물의 방어기작에 관여하여 식물 생장과 발육에 커다란 역할을 하고 있음을 시사한다.

도 1은 순무 식물에서 시스테인 프로테아제 저해제를 코딩하는 BrCPI1 유전자의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열을 보여준다.

도 2는 시스타틴 유전자 (AtCPI, BoCPI, GmCPI, OsCPI, RcCPI, ZmCPI; NCBI 데이타, BrCPI1)의 코딩 영역의 연역된 아미노산 서열 및 이의 정렬을 보여준다. 가상적인 신호 펩티드 및 활성 부위 도메인은 흐리게 표시되어 있다.

도 3은 Clustal W에 의한 식물 시스타틴 유전자의 계통주를 보여준다. 마디 옆의 숫자는 100 반복으로부터의 bootstrap values을 나타낸다.

도 4는 순무 식물에서 BrCPI1을 이용한 서던 블롯 분석을 보여준다. BrCPI1 유전자에 특이적인 3' 영역을 프로브로서 이용하였다. 이용된 제한효소는 하기와 같다; M: 분자량 마커 , B : BamHI , E : EcoRI , H : HindIII , P : Pst I.

도 5는 순무 식물 기관에서 BrCPI1 발현 분석을 보여준다. A: 뿌리, B; 줄기, C; 어린 잎, D; 성숙 잎, E; 주두, F; 수술, G; 꽃잎, H; 꽃받침, I; 화경. BrCC2-BrCC5; 양배추에서 시스테인 프로테아제 저해제 코딩 유전자들.

도 6은 순무 식물의 발육 단계에 따른 BrCPI1 발현 분석을 보여준다. A; 발아 후 5일, B; 발아 후 10일, C; 발아 후 15일, D; 발아 후 20일, E; 발아 후 30일. BrCC2-BrCC5; 양배추에서 시스테인 프로테아제 저해제 코딩 유전자들.

도 7은 BrCPI1 유전자 과발현용 Ti-플라스미드 벡터 구축물을 보여준다. Nos-p; nos 유전자 프로모터, Nos-t; nos 유전자 터미네이터, HPT; 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 35S-p; 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S-프로모터, LB; left border, RB; right border.

도 8은 BrCPI1 유전자를 포함하는 pBIG 벡터로 형질전환된 애기장대 식물을 보여준다. 왼쪽 사진; 선발 배지 상의 형질전환 식물, 오른쪽 사진; 형질전환 식물의 표현형.

도 9는 BrCPI1 유전자를 포함하는 형질전환 애기장대 T2 식물의 염, cold 및 ABA 스트레스 하의 성장 패턴(A) 및 염, cold 및 ABA 스트레스 하의 BrCPI1 유전자의 발현 패턴(B)을 보여준다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> BrCPI gene enhancing plant tolerance to abiotic stress and uses thereof <130> PN09231 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 880 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> gene <222> (64)..(672) <223> BrCPI coding sequence <400> 1 atgatgcaaa gccgtttctc aatcttcctc ttcatcttcg tctcctctgt gatcgctagt 60 gacatggcct tgctcggcgg cgttcgcgat gtacctgctt atcagaacag cgacgaggtc 120 gagagcctcg ctcgtttcgc cgtcgatgaa cataacaaga aagagaatgt actgctagag 180 tttgcgaggg ttgtgaaagc gaaggaacaa gttgtggcgg gaacgatgca tcatttaacg 240 ctggagatcg tcgaggctgg gaagaagaag ctttacgaag ccaaagtgtg ggtgaagccg 300 tggttgaact tcaaggagtt gcaggagttc aagcctgcct ctgatggtgc tccttccatc 360 actccctctg atcttggctg caagaaaggt gaacatgaat ctgggtggag ggaagttcca 420 ggggatgatc cagaggtaca gcacgttgct gatcatgctg ttaagactat tcagcagagg 480 tctaactctt tgttccctta tgagcttcag gaggttgttc atgctaacgc tgaggttact 540 ggtgaggctg caaagtacaa catggttctg aagttgaaga gaggagaca a ggaggagaag 600 ttcaaggtgg aggttcacaa gaaccatcaa ggtgttcttc atctcaacca catggagcaa 660 caccatgact agccttattt gactaacttc atttctttgt tcgtaaagtc ccataatata 720 atcggacaaa aaccaaaatg tgtatgatgt gaatctatta gcaatgggtt aatagtttgg 780 tctataaaga tgttttacgt tgtacataaa taaaggtaaa atatgttatg aagatgtgat 840 aaattactga aattttgcgt cgtcaaaaaa aaaaaaaaaa 880 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Ala Leu Leu Gly Gly Val Arg Asp Val Pro Ala Tyr Gln Asn Ser 1 5 10 15 Asp Glu Val Glu Ser Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp Glu His Asn Lys 20 25 30 Lys Glu Asn Val Leu Leu Glu Phe Ala Arg Val Val Lys Ala Lys Glu 35 40 45 Gln Val Val Ala Gly Thr Met His His Leu Thr Leu Glu Ile Val Glu 50 55 60 Ala Gly Lys Lys Lys Leu Tyr Glu Ala Lys Val Trp Val Lys Pro Trp 65 70 75 80 Leu Asn Phe Lys Glu Leu Gln Glu Phe Lys Pro Ala Ser Asp Gly Ala 85 90 95 Pro Ser Ile Thr Pro Ser Asp Leu Gly Cys Lys Lys Gly Glu His Glu 100 105 110 Ser Gly Trp Arg Glu Val Pro Gly Asp Asp Pro Glu Val Gln His Val 115 120 125 Ala A sp His Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln Arg Ser Asn Ser Leu Phe 130 135 140 Pro Tyr Glu Leu Gln Glu Val Val His Ala Asn Ala Glu Val Thr Gly 145 150 155 160 Glu Ala Ala Lys Tyr Asn Met Val Leu Lys Leu Lys Arg Gly Asp Lys 165 170 175 Glu Glu Lys Phe Lys Val Glu Val His Lys Asn His Gln Gly Val Leu 180 185 190 His Leu Asn His Met Glu Gln His His Asp 195 200 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaacttggaa ggtactg 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agttttgcgc ttcaggca 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgtgaccta ttgcatctcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttctacacag ccatcggtcc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atggcttcca aagttcaact cgtg 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcaagtttca gaaaccatct t 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atggcttcca aagttcaact cgtg 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcaagtttca gaaaccatct t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atggttggga tgggtcaaaa a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tctttaatgt cacggacgat t 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaacttggaa ggtactg 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agttttgcgc ttcaggca 18