扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因及其编码蛋白和克隆
方法
技术领域
背景技术
[0002]
植物地上部表皮蜡质是植物减少非气孔性
水分散失，抵御病虫害入侵的最重要屏障之一，因此表皮蜡质合成相关基因与植物抗旱、抗病虫害能
力密切相关。扁果枸杞是宁夏枸杞的一个品种，具发达的表皮蜡质和极强的抗旱耐盐特性。扁果枸杞通过增加表皮蜡质积累提高地上部保水能力进而提高其抗旱性是扁果枸杞抵御干旱和渗透胁迫的主要机制之一。将扁果枸杞表皮蜡质合成相关基因用在提高其它中生植物抗逆性方面存在巨大的开发潜力。
[0003]
醛脱羰基酶(ECERIFERUM1，CER1)是植物表皮蜡质合成主要途径——脱羰基途径的关键酶，催化长链偶数
碳的醛转化为长链奇数碳的烷
烃，参与C29烷烃及其衍生物的合成。拟南芥AtCER1基因对干旱胁迫十分敏感，低湿条件下处理3h，拟南芥AtCER1表达丰度就达到最大，为对照组的40倍。水稻Glossyl(GL1)基因与拟南芥AtCER1基因同源，其表达也受渗透胁迫的诱导，可见醛脱羰基酶基因与植物干旱和渗透胁迫响应密切相关，但仅在拟南芥等少数中生植物的得到部分验证。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种来源于扁果枸杞，与逆境胁迫响应相关的醛脱羰基酶基因LbCER1及其编码蛋白和克隆方法。本发明公布的扁果枸杞醛脱羰基酶在核苷酸序列和
氨基酸序列上与拟南芥的同源性低于80％，表明Lb CER1基因与AtCER1基因存在差异，在CER1基因功能鉴定和植物抗逆传改良方面有巨大的潜力。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因，所述与逆境胁迫响应相关基因为醛脱羰基酶基因LbCER1；作为优选，所述LbCER1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；或，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列相似性在90％以上的基因。
[0007] 作为优选，所述醛脱羰基酶基因LbCER1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
[0008] 本发明提供上述扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因的克隆方法，包括如下步骤：
幼苗培养，叶总RNA提取及反转录合成第一链cDNA，设计核心
片段的引物，以上述cDNA为模板，通过PCR扩增得到核心片段产物，将产物回收后克隆入T载体，转化至感受态细胞诱导表达，筛选阳性克隆并测序，得到核心片段序列；再由5’-RACE法和3’-RACE法克隆得到5’和3’片段序列；通过序列拼接得到醛脱羰基酶基因LbCER1基因的核苷酸序列；
[0009] 作为优选，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。
[0010] 作为优选，所述幼苗培养方法包括以下步骤：3周龄扁果枸杞幼苗用含有80mmol/L D-山梨醇的1/2Hoagland
营养液渗透处理24h。
[0011] 作 为 优 选 ，所 述 核 心 片 段 产 物 制 备 方 法 为 ：以 序 列 为 5’-CATCAYCAYTCWATTGYWACWGARCC-3’的P1引物为上游引物，以序列为5’-CAACWGCYARDCTRCTTCCRTCYACC-3’的引物P2为下游引物，PCR程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，54.5℃
退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；
[0012] 其中，P1引物中，Y，W，R为简并引物，Y为C/T，W为A/T，R为A/G。
[0013] P2引物中，W，Y，R，D为简并引物，W为A/T，Y为C/T，R为A/G，D为A/G/T。
[0014] 作为优选，所述RACE法克隆5’端时，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGCTTCCGTCTACCACCTTCA-3'的引物GSP1为上游引物，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCATCAGGCACTTCAGCTTCCC-3'的引物NGSP1为巢式下游引物。
[0015] 作为优选，所述RACE法克隆3’端时，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTCCTTGGCCTCGGAGCCTCACACCT-3'的引物GSP2为上游引物，以序列为5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGAGTGAGGTGGTAGACGG-3'的引物NGSP2为巢式下游引物。
[0016] 本发明提供用qRT-PCR法分析上述的扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因转录丰度的方法，所述qRT-PCR反应体系中包括内参基因LbACT的上下游引物以及内参基因LbCER1基因的的上下游引物；所述内参基因LbACT的上游引物QA1序列为5’-CTATGAGTTGCCAGATGGACAG-3’，下游引物QA2序列为5’-TGGCTGGAAAAGGACTTCTG-3’；所述LbCER1基因的的上游引物QC1序列为5’-CACTGGGACTGCCTCTATGG-3’，下游引物QC2序列为
5’-GTAGTGAGTGGTACGAGGGC-3’；所述qRT-PCR反应的程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃10s，40个循环。
[0017] 本发明提供上述扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因在渗透胁迫、
盐胁迫下转录丰度提高。
[0018] 本发明提供上述扁果枸杞中与逆境胁迫响应相关基因在制备抗逆、抗盐胁迫或抗旱的转基因植物中的应用。
[0019] 本发明通过实时
荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)法分析扁果枸杞叶LbCER1基因转录丰度，验证了在渗透胁迫和盐胁迫下LbCER1基因转录丰度大幅增加(图2)，表明LbCER1在植物抵御渗透胁迫、盐胁迫等非
生物逆境胁迫时发挥重要作用。本发明可用于植物遗传转化，提高植物在干旱、高盐条件下的抗性，在植物抗逆改良研究与应用中具有极高的价值。
附图说明
[0020] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成
说明书的一部分，与本发明的
实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0021] 图1为LbCER1与其他植物CER1氨基酸序列系统进化分析。
[0022] 图2为扁果枸杞叶LbCER1基因在不同条件下的转录丰度分析。
具体实施方式
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化
试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0024] 实施例1
[0025] 本发明的步骤如下：
[0026] (1)材料的准备：挑选籽粒饱满的
种子，先用2％
次氯酸钠溶液消毒8～10min，蒸馏水冲洗后，均匀铺在湿润
滤纸上，避光培养4～5天，待种子露白后，种在蛭石中并加入1/2Hoagland营养液，置于昼夜
温度(26±2)℃/(23±2)℃，光照16h·d-1，光强600μmol·m-2·s-1，空气
相对湿度40％～60％的
温室中，每2～3天换一次营养液。待幼苗长至3周龄，用含有80mmol/L D-山梨醇的1/2Hoagland营养液渗透处理24h后，取80～100mg叶置于液氮中速冻用于提取总RNA。
[0027] (2)提取总RNA和cDNA第一链的合成：总RNA提取和反转录分别用上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提
试剂盒和TAKARA公司PrimeScriptTMⅡ第一链cDNA合成试剂盒进行提取，提取方法参照相应说明书进行。
[0028] (3)核心片段克隆：以cDNA模板为模板，在50μLPCR反应体系中加入4μL cDNA模板、序列为5’-CATCAYCAYTCWATTGYWACWGARCC-3’的P1引物2μL和序列为5’-CAACWGCYARDCTRCTTCCRTCYACC-3’的P2引物2μL，在94℃预变性3min、94℃变性30s、54.5℃退火30s、72℃延伸90s的PCR条件下循环30次，然后72℃延伸10min。可得到长度为828bp的LbCER1基因核心片段。应用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒胶回收上述目的条带，操作方法参照该胶回收试剂盒说明书。根据pMD18-T载体PCR产物克隆试剂盒说明书，将核心片段装载入pMD18-T，用热激法将含有核心片段的pMD18-T载体转化至感受态细胞大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，再用菌液PCR鉴定阳性克隆后测序，得到核心片段序列。
[0029] 其中，P1引物中，Y，W，R为简并引物，Y为C/T，W为A/T，R为A/G。
[0030] P2引物中，W，Y，R，D为简并引物，W为A/T，Y为C/T，R为A/G，D为A/G/T。
[0031] (4)5’端克隆：根据SMARTerTM RACE cDNA试剂盒说明书合成5'RACE-Ready cDNA第一链。在已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液配制溶液1：15.5μL的PCR-Grade H2O，25.0μL的2×SeqAmpTM Buffer，1.0μL的SeqAmp DNA Polymerase。在另一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行外侧PCR扩增：2.5μL的5'RACE-Ready cDNA，5.0μL的10×UPM，1.0μL的GSP1(10μM)，41.5μL的溶液1。在94℃预变性3min、94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸3min的PCR条件下循环25次，然后72℃延伸10min，得到外侧PCR扩增产物。
[0032] 吸取5μL外侧PCR的扩增产物至一新的已灭菌的200μL PCR管，加入245μL TE buffer进行稀释，稀释后的外侧PCR产物用于巢式PCR扩增。在已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液配制溶液2用于巢式PCR扩增：17.0μL的PCR-Grade H2O、25.0μL的2×SeqAmpTM Buffer、1.0μL的SeqAmp DNA Polymerase。在另一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行巢式PCR：5.0μL稀释后的外侧PCR产物、1.0μL的UPM short、1.0μL NGSP1(10μM)、43.0μL的溶液2。在94℃预变性3min、94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸3min的PCR条件下循环20次，然后72℃延伸10min，得到巢式PCR扩增产物。应用与RACE cDNA PCR扩增试剂盒相配套的NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up胶回收试剂盒，纯化和回收巢式PCR扩增产物，操作方法参见其说明书。用In-Fusion法将5’端巢式PCR扩增产物装载入pRACE载体，用热激法将含有5’端巢式PCR扩增产物的pRACE载体转化至感受态细胞大肠杆菌DH5α，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，菌液PCR的方法鉴定阳性克隆后测序。
[0033] 其中，GSP1的序列为：5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGCTTCCGTCTACCACCTTCA-3'。
[0034] NGSP1的序列为：5'-GATTACGCCAAGCTTAGCATCAGGCACTTCAGCTTCCC-3'。
[0035] 在一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行菌液PCR：8.5μL灭菌水、1.0μL的UPM short、1.0μL的NGSP1(10μM)、12.5μL的Premix Taq、2.0μL的5'RACE菌悬液。在
94℃预变性3min、94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸3min的PCR条件下循环30次，然后72℃延伸10min，用1.2％的琼脂糖凝胶
电泳对菌液PCR扩增产物进行检测，若出现与5'RACE巢式PCR扩增产物相同的条带，即为5'RACE的阳性克隆。然后将对应编号的菌悬液送至华大基因北京测序部测序，测序引物为通用引物M13 F/R。根据测序结果中的正反向序列以及内侧引物UPM short和NGSP1对测序结果进行分析，确定5'核苷酸序列。
[0036] (5)3’端克隆：根据SMARTerTM RACE cDNA试剂盒说明书合成3'RACE-Ready cDNA第一链。在已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液配制溶液1：15.5μL的PCR-Grade H2O，25.0μTML的2×SeqAmp Buffer，1.0μL的SeqAmp DNA Polymerase。在另一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行外侧PCR扩增：2.5μL的3'RACE-Ready cDNA，5.0μL的10×UPM，
1.0μL的GSP2(10μM)，41.5μL的溶液1。在94℃预变性3min、94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸3min的PCR条件下循环25次，然后72℃延伸10min，得到外侧PCR扩增产物。
[0037] 吸取5μL外侧PCR的扩增产物至一新的已灭菌的200μL PCR管，加入245μL TE buffer进行稀释，稀释后的外侧PCR产物用于巢式PCR扩增。在已灭菌的200μLPCR管中加入以下溶液配制溶液2用于巢式PCR扩增：17.0μL的PCR-Grade H2O、25.0μL的2×SeqAmpTM Buffer、1.0μL的SeqAmp DNA Polymerase。在另一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行巢式PCR：5.0μL稀释后的外侧PCR产物、1.0μL的UPM short、1.0μL NGSP2(10μM)、43.0μL的溶液2。在94℃预变性3min、94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸3min、72℃延伸
10min的PCR条件下循环20次，得到巢式PCR扩增产物。根据与RACE cDNAPCR扩增试剂盒相配套的NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up胶回收试剂盒说明书，纯化和回收巢式PCR扩增产物。用In-Fusion法将3’端巢式PCR扩增产物装载入pRACE载体，用热激法将含有3’端巢式PCR扩增产物的pRACE载体转化至感受态细胞DH5α，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，菌液PCR的方法鉴定阳性克隆后测序得到。
[0038] 其中，GSP2的序列为：5'-GATTACGCCAAGCTTCCTTGGCCTCGGAGCCTCACACCT-3'。
[0039] NGSP2的序列为：5'-GATTACGCCAAGCTTAGCTGAGTGAGGTGGTAGACGG-3'。
[0040] 在一个新的已灭菌的200μL PCR管中加入以下溶液进行菌液PCR：8.5μL灭菌水、1.0μL的UPM short、1.0μL的NGSP2(10μM)、12.5μL的Premix Taq、2.0μL的5'RACE菌悬液。在
94℃预变性3min、94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸3min的PCR条件下循环30次，然后72℃延伸10min，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳对菌液PCR扩增产物进行检测，若出现与3'RACE巢式PCR扩增产物相同的条带，即为3'RACE的阳性克隆。然后将对应编号的菌悬液测序，测序引物为通用引物M13 F/R。根据测序结果中的正反向序列以及内侧引物UPM short和NGSP2对测序结果进行分析，确定3'核苷酸序列。
[0041] (6)用DNAman 6.0
软件将5’端序列、3’端序列和核心序列拼接得到如SEQ ID NO：1所示LbCER1基因的cDNA序列和如SEQ ID NO：2所示LbCER的氨基酸序。
[0042] (7)取3周龄幼苗用含有80mmol/L、160mmol/L山梨醇的1/2 Hoagland营养液分别在处理0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后取80～100mg叶置于液氮中速冻，用于qRT-PCR法分析LbCER1在渗透胁迫下转录丰度的变化。以在不含山梨醇的1/2Hoagland营养液中生长的幼苗为对照。
[0043] (8)取3周龄幼苗用含有50、100、150、200、300mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液分别在处理0h、6h、12h、24h、48h、72h后取80～100mg叶置于液氮中速冻，用于qRT-PCR法分析LbCER1在盐透胁迫下转录丰度的变化。以在不含NaCl的1/2Hoagland营养液生长中的幼苗为对照。
[0044] (9)用qRT-PCR法分析LbCER1基因在扁果枸杞叶中转录丰度的方法如下：以从叶中TM提取的总RNA反转录得到的第一链cDNA为模板，根据 Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书，在96孔板中分别加入浓度10μM序列为5’-
CTATGAGTTGCCAGATGGACAG-3’的内参基因LbACT的上游引物QA1和序列为5’-
TGGCTGGAAAAGGACTTCTG-3’的内参基因LbACT的下游引物QA2各0.8μL，或加入浓度10μM序列为5’-CACTGGGACTGCCTCTATGG-3’的LbCER1基因的上游引物QC1和序列为5’-GTAGTGAGTGGTACGAGGGC-3’的下游引物QC2各0.8μL，10.0μL的SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.4μL的ROX Reference Dye(50×)，2.0μL的cDNA模板，纯水6.0μL，在ABI Onestep实时定量PCR仪中进行qRT-PCR。qRT-PCR程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，
60℃退火30s，72℃10s，40个循环。
[0045] 实施结果为：
[0046] (1)得到如SEQ ID NO.1所示LbCER1基因的cDNA序列，长2168bp，开放阅读框为1881bp，5’非翻译区(UTR)长107bp，3'非翻译区(3’UTR)长180bp，其中包含26bp的poly(A)尾巴。此cDNA编码626个氨基酸，预测有4个跨膜区，一个
脂肪酸羟化酶结构域和一个位于C-末端的Wax2结构域。氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。用MEGA 5.0软件基于邻位相连法构建系统进化树分析表明，扁果枸杞LbCER1与
烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)等茄科植物亲缘关系极近，同源性达100％，与可可(Theobroma cacao)、油菜(Brassica campestris)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、亚麻荠(Camelina sativa)等双子叶植物的同源性也在72％以上，但与小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等单子叶植物则亲缘关系较远(图1)。
[0047] 扁果枸杞(Lycium barbarum ssp.Bianguo)醛脱羰基酶基因LbCER1的核苷酸序列：
[0048]
[0049] 序列特征：全长2168bp，包括1881bp的开放阅读框(ORF)，107bp的5'非翻译区(5'UTR)，以及180bp的3'非翻译区(3’UTR)，其中包含26bp的poly(A)尾巴。
[0050] 扁果枸杞(Lycium barbarum ssp.Bianguo)醛脱羰基酶LbCER1的氨基酸序列：
[0051]
[0052]
[0053] 序列特征：全长626个氨基酸，预测有4个跨膜区，一个脂肪酸羟化酶结构域和一个位于C-末端的Wax2结构域。LbCER1与茄科植物亲缘关系近，同源性达100％。
[0054] (2)通过qRT-PCR法验证了LbCER1基因在渗透、盐胁迫下叶转录丰度显著提高(图2)。
[0055] 从上述结果可以看出，本发明所述的扁果枸杞LbCER1基因的克隆、转录丰度分析方法可行，重复性好。LbCER1基因在培育抗旱、抗盐作物方面具有广阔的应用前景。
[0056] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
