一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法
阅读：945发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种同时提高油菜氮素利用效率和抗镉胁迫能 力 的方法，包括如下步骤：培育 幼苗 ，进行移栽培养，将培养后得到的作物置于环境非 生物 镉胁迫模拟池中，将含有氯离子通道 抑制剂 的抑制剂溶液喷洒到作物 叶片 上进行抑制处理，喷洒的量以该溶液完全湿润所有叶片为准。与 现有技术 相比，本发明提供的方法所使用的氯离子通道抑制剂能够有效地抑制CLCa通道蛋白的活性，从而改变NO3‑在 细胞质 和液泡中的分配，进一步调节 能量 的分配，从而为同时提高 植物 NUE和抗Cd胁迫能力提供可行的调节手段。，下面是一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法专利的具体信息内容。
1.一种同时提高油菜氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法，包括如下步骤：培育油菜幼苗，进行移栽培养，将培养后得到的作物置于浓度为100μmol·L-1的CdCl2的环境非生物镉胁迫模拟池中，将含有浓度为50nmol·L-1的氯离子通道抑制剂R(+)-IAA-94的抑制剂溶液喷洒到作物叶片上进行抑制处理，喷洒的量以该溶液完全湿润所有叶片为准，每6～10天喷洒一次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油菜幼苗的培养包括以下步骤：将油菜籽粒浸种于体积分数为20％的次氯酸钠进行表面消毒30～50min，用蒸馏水冲洗3～6次后在玻璃网室的土培中发芽，所用营养液为贺格兰德完全营养液，每5天浇一次营养液，每次浇100ml，玻璃网室中昼夜平均温度29℃/19℃，自然湿度和光照，光照强度为205～
230Ue/(m2·s)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述贺格兰德完全营养液的组分及含量包-1 -1 -1
括KNO3 4～6mmol·L 、KH2PO4 0.5～1.5mmol·L 、MgSO4 6～8mmol·L 、Ca(NO3)2·4H2O
4～6mmol·L-1、Fe-EDTA 2～4mmol·L-1、B 0.4～0.6mg·L-1、Mn 0.4～0.6mg·L-1、Zn 0.04～0.06mg·L-1、Cu 0.01～0.03mg·L-1和Mo 0.005～0.015mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油菜幼苗的移栽密度为8000株/亩。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油菜幼苗进行抑制处理的时期为油菜移栽后的幼苗期到角果发育期。
一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法
技术领域
背景技术
[0002] 在农业现代化和集约化生产的今天，工业污染和城市垃圾大量向农业环境转移，农业生产中长期大量不合理使用新型农用化学物质，畜禽排泄物中兽用药物残留等的增加，使农业环境正面临着一系列严重的环境污染和生态破坏的问题，土壤污染逐年加剧，其中重金属Cd对土壤的污染是目前世界上需要解决的一大问题。
[0003] 在我国南方地区，特别是湘南地区，由于农业和工业面源污染，以及土壤成土母质Cd2+(Cd)背景值高等问题，导致了较为严重的土壤Cd污染，明显影响了农作物的产量和品质。且专家指出，土壤污染造成有害物质在农作物中积累，并通过食物链进入人体，引发各种疾病，最终危害人体健康。因此，降低农作物中镉的积累量，提升农作物的抗逆性势在必行。
[0004] 在实际生产过程中，生长状况好的作物抗逆性差，抗逆性强的作物生长状况不佳，作物的营养生长和抗环境非生物胁迫永远是一个矛盾。因此，在非生物胁迫环境中种植作物，就必需同时考虑作物的营养生长和抗环境胁迫能力，使其得以协调，从而获得最大的经济效益。然而，对于在非生物胁迫尤其是重金属胁迫的条件下增强植物抗性的同时提高植物NUE的研究很少，在此之前还没有一种方法能够将营养调控和环境非生物胁迫的调控相协调。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明通过抑制CLCa通道蛋白活性的方式来改变NO3-在细胞质和液泡中的分配比例，从而改变能量的分配，在提高植物NUE的同时增强植物抗Cd胁迫能力。其方案具体是提供一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法，包括如下步骤：培育幼苗，进行移栽培养，将培养后得到的作物置于环境非生物镉胁迫模拟池中，将含有氯离子通道抑制剂的抑制剂溶液喷洒到作物叶片上进行抑制处理，喷洒的量以该溶液完全湿润所有叶片为准。
[0007] 方法原理：(1)氯离子通道抑制剂喷洒到叶片可以抑制CLCa通道蛋白的活性；(2)CLCa通道蛋白的活性被抑制后，NO3-能更多地分配在植物细胞质中，液泡累积NO3-所需的能量减少，从而可以使更多地能量用于将Cd区隔到植物液泡中；(3)更多NO3-分配到细胞质中能提高其利用效率，并且由于NO3-向液泡累积减少，所需质子泵提供的能量减少，能量的重新分配导致Cd向液泡的累积增多，从而提高了植物对Cd的抗性。
[0008] NO3-是陆生植物主要的氮源，NO3-在硝酸还原酶(NR)的作用下可以代谢为铵盐，通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS-GOGAT)循环转变为谷氨酸，而谷氨酸可以进一步生成其他的氨基酸，从而参与构建蛋白质、核苷酸、叶绿素等各类分子。在植物的细胞内，NO3-一部分被还原利用，一部分转运至植物的液泡内储存起来。细胞质中NO3-的浓度为3-5mol·m-3，而在占据了成熟细胞体积60％-95％的液泡中NO3-的浓度为30-50mol·m-3，NO3-在液泡膜质子泵(V-ATPase和V-PPase)提供能量的前提下，在CLCa转运蛋白的作用下累积到植物液泡中，虽然液泡内有NO3-的大量累积，但液泡内不含有NR，不能被植物吸收利用，因此，液泡被称为NO3-的储存库。而细胞质中存在NR，是硝态氮的还原场所，被称为硝态氮的代谢库。- -
改变NO3在植物细胞质和液泡中的分配，使更多比例的NO3分配到细胞质中能提高植物对NO3-的代谢，从而提高植物的氮素利用效率(NUE)。
改变NO3在植物细胞质和液泡中的分配，使更多比例的NO3分配到细胞质中能提高植物对NO3-的代谢，从而提高植物的氮素利用效率(NUE)。
[0009] 液泡占据了植物成熟细胞体积的60％-95％，不仅是许多营养元素的储存器官，也是存储和解毒非必需有毒重金属元素Cd的主要细胞器。Cd胁迫条件下，虽然植物细胞壁能阻挡一部分Cd进入植物细胞，但仍有一部分Cd会在转运蛋白的作用下进入细胞质，此时植物螯合肽合成酶被激活形成植物螯合肽螯合镉，降低其有效性和毒性，并将其转运至液泡中。液泡占据了植物细胞体积的大部分，并且液泡内不存在具有生理活性的酶类物质，因此液泡区隔化作用成为了植物缓解Cd毒害最普遍有效的机制，而这一解毒机制同样依赖于液泡膜质子泵以及各类Cd转运蛋白。例如，作为HMA家族成员中的一员，OsHMA3是定位在水稻根部液泡膜上负责将Cd转运至液泡的转运蛋白，研究表明，OsHMA3的过表达能有效降低水稻籽粒中Cd累积和提高植物对Cd的抗性；AtCAX4是定位在液泡膜上的转运蛋白，在烟草中表达这两种基因能提高烟草对Cd2+、Zn2+和Mn2+三种重金属离子的抗性，同时能降低Cd向地上部的转运。
[0010] NO3-和Cd向液泡的累积一方面依赖于各自的转运蛋白，一方面均需要液泡膜质子泵提供跨膜运输的能量。植物液泡膜上存在的两类功能和物理特性完全不同的质子泵，共同致力于跨膜△H+的建立，并通过定位在植物液泡膜的Cd2+/H+和2NO3-/H+逆向转运蛋白进行液泡Cd和NO3-的累积，其中液泡内、外的质子(H+)浓度梯度通过液泡膜质子泵提供能量得以维持。可见，液泡膜质子泵是液泡Cd和NO3-累积的能量来源，同时调控着液泡Cd和NO3-的累积。
[0011] 液泡膜质子泵活性的调控还可以显著影响植物的抗环境非生物胁迫，比如重金属胁迫等。植物过表达V-PPase基因可以增强其抗环境非生物胁迫能力，比如盐胁迫、淹水、干旱和低温胁迫等。例如，大麦幼苗根部施用微量V-ATPase活性抑制剂(5nM bafilomycin)就显著加剧了大麦的Cd胁迫(5μM)程度。抑制液泡膜质子泵的活性能有效增加细胞质中NO3-的比例，从而提高植物的NUE，但当质子泵活性的受到抑制时，植物对非生物胁迫的抗性变弱。由此可见，植物氮素利用效率的提高和抗非生物胁迫的增强是一对矛盾，无法通过改变质子泵活性来调节，但通过改变CLCa通道蛋白的活性，即使用氯离子通道抑制剂能有效调节这一对矛盾。从理论上来讲，所有的作物液泡膜上都存在转运NO3-的CLCa通道蛋白，因此本发明的技术方案对所有作物都能产生相同的技术效果。
[0012] 上述的方法，优选的，所述幼苗为油菜幼苗。
[0013] 优选的，将油菜籽粒浸种于体积分数为20％的次氯酸钠进行表面消毒30～50min，用蒸馏水冲洗3～6次后在玻璃网室的土培中发芽，所用营养液为贺格兰德完全营养液，每5天浇一次营养液，每次浇100ml，玻璃网室中昼夜平均温度29℃/19℃，自然湿度和光照，光照强度为205～230Ue/(m2·s)。
[0014] 优选的，所述贺格兰德完全营养液的组分及含量包括KNO34～6mmol·L-1、KH2PO40.5～1.5mmol·L-1、MgSO46～8mmol·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 4～6mmol·L-1、Fe-EDTA 2～4mmol·L-1、B 0.4～0.6mg·L-1、Mn 0.4～0.6mg·L-1、Zn 0.04～0.06mg·L-1、Cu 0.01～0.03mg·L-1和Mo 0.005～0.015mg·L-1。
[0015] 优选的，所述油菜幼苗的移栽密度为8000株/亩。
[0016] 优选的，所述油菜幼苗进行抑制处理的时期为油菜移栽后的幼苗期到角果发育期。
[0017] 优选的，所述环境非生物镉胁迫模拟池中镉胁迫浓度为50～200μmol·L-1CdCl2；
[0018] 优选的，所述抑制剂溶液中，氯离子通道抑制剂的浓度为50～100nmol·L-1；所述抑制剂溶液的喷洒频率为每6～10天喷洒一次。
[0019] 油菜中的研究表明，液泡膜质子泵活性抑制剂处理以后液泡膜质子泵活性显著降低(活性降低30％以上)，原生质体中液泡NO3-的储存比例从93％左右下降到80％左右，促使更大比例的NO3-分配到细胞质中得以代谢，显著降低了植物组织中NO3-含量，同时显著提高了植物的氮素利用效率(NUE)。
[0020] 与现有技术相比，本发明提供的方法所使用的氯离子通道抑制剂能够有效地抑制CLCa通道蛋白的活性，从而改变NO3-在细胞质和液泡中的分配，进一步调节能量的分配，从而为同时提高作物NUE和抗Cd胁迫能力提供可行的调节手段，具体表现为：
[0021] (1)目前还没有一种方法能够将营养调控和环境非生物胁迫的调控相协调，而本方法采用喷施氯离子通道(CLCs)抑制剂可以将作物的抗逆性与硝态氮的分配调控相结合；
[0022] (2)现有的技术可以通过调节液泡膜质子泵活性促使更多的NO3-分配到细胞质中，从而提高植物的NUE，但质子泵活性的降低势必会削弱植物抗Cd胁迫能力，抗环境非生物胁迫和NUE是一个对立的矛盾，而本方法通过改变液泡膜NO3-转运蛋白的活性调节液泡NO3-的分配，从而改变能量的分配，在NUE提高的同时增强植物抗Cd胁迫能力。附图说明
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024] 图1为本发明实施例中在100umol·L-1的镉处理下喷施了氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜幼苗。
[0025] 图2为本发明实施例中在100umol·L-1的镉处理下未喷施氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜幼苗。
[0026] 图3为本发明实施例中油菜叶绿素相对降解率对比图。
[0027] 图4为本发明实施例中油菜丙二醛含量的对比图。
[0028] 图5为本发明实施例中油菜脯氨酸含量的对比图。
[0029] 图6为本发明实施例中油菜氮素利用效率的对比图。
具体实施方式
[0031] 除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0032] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0033] 实施例：
[0034] 一种同时提高作物氮素利用效率和抗镉胁迫能力的方法，以油菜为例，包括以下步骤：
[0035] (1)将油菜籽粒浸种于体积分数为20％的次氯酸钠进行表面消毒30～50min，用蒸馏水冲洗3～6遍以后在玻璃网室的土培中发芽，所用营养液为贺格兰德完全营养液，每5天浇一次营养液，每次浇100ml，玻璃网室中昼夜平均温度29℃/19℃，自然湿度和光照，光照强度为205～230Ue/(m2.s)；贺格兰德完全营养液的组分及含量包括KNO34～6mmol.L-1、-1 -1 -1KH2PO4 0.5～1.5mmol.L 、MgSO46～8mmol.L 、Ca(NO3)2·4H2O 4～6mmol.L 、Fe-EDTA 2～
4mmol.L-1、B 0.4～0.6mg.L-1、Mn 0.4～0.6mg.L-1、Zn 0.04～0.06mg.L-1、Cu 0.01～
0.03mg.L-1和Mo 0.005～0.015mg.L-1。
4mmol.L-1、B 0.4～0.6mg.L-1、Mn 0.4～0.6mg.L-1、Zn 0.04～0.06mg.L-1、Cu 0.01～
0.03mg.L-1和Mo 0.005～0.015mg.L-1。
[0036] (2)作物的非生物胁迫处理：油菜幼苗的移栽(采用育苗移栽方法)，9月30日前后按照第一步所述方法育苗，一个月以后移栽到环境非生物胁迫的模拟池中(模拟池中的镉胁迫100μmol·L-1CdCl2)，每小区10m2(长5m,宽2m)，按8000株/亩的密度进行移栽，共3个小区，随机区组排列，按苗期、抽薹期、开花期、角果发育期和成熟期这5个生长时期进行划分，于当年的5月中旬收获，苗期移栽返青后补施尿素5kg/亩，适期灌水并追施薹花肥，春季结合春灌追施蕾薹肥尿素7.5kg/亩。
[0037] (3)抑制剂的施用：移栽后的油菜氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的处理，同时含有50nmol·L-11-抑制剂溶液于每次的上午10点均匀的喷洒到油菜的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准，从移栽后的幼苗期开始每6天均匀的喷洒一次直到进入油菜的角果发育期结束。
[0038] 测定结果：
[0039] 移栽后的油菜氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的处理，同时含有50nmol·L-11-抑制剂溶液于每次的上午10点均匀的喷洒到油菜的叶片上，喷洒的量以生长调节剂溶液完全湿润所有叶片为准，从移栽后的幼苗期开始每6天均匀的喷洒一次直到进入油菜的角果发育期结束。取30～60天的油菜幼苗拍照并进行相关指标的测定。结果表明，由图1和图2可以看出，喷施了氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜幼苗在100umol·L-1的镉处理下叶片比不喷施氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜幼苗偏绿；同时测定了叶绿素、丙二醛以及脯氨酸的含量，结果表明，在cd胁迫条件下，与未喷施氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜相比，喷施了氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜叶绿素降解率和丙二醛含量较低(图3和图4)，而脯氨酸含量更高(图5)，并且都达到了显著差异，这些测定结果均表明喷施效氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜有更高的抗cd胁迫能力，此外还测定了未喷施氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)和喷施了氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜的氮素利用效率，结果表明，在cd胁迫条件下，喷施了氯离子通道抑制剂(R(+)-IAA-94)的油菜具有更高的氮素利用效率(NUE)(图6)。
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