展现增加的产量和干旱耐受的转基因玉米植物
阅读：401发布：2020-05-14
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1.包含以下作为转基因的转基因玉米植物
i)能够表达红叶藜(Chenopodium rubrum)细胞壁转化酶或其功能性部分的核酸，ii)通过遗传密码的简并而修饰的第i)项的所述能够表达所述红叶藜细胞壁转化酶或所述其功能性部分的核酸，
iii)能够表达与第i)项的所述红叶藜细胞壁转化酶或所述其功能性部分具有至少
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸相同性或者至少70％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的细胞壁转化酶或其功能性部分的核酸，或
iv)能够在严格条件下与第i)-iii)项中任一项的核酸的互补序列杂交的核酸，从而所述核酸能够表达细胞壁转化酶，
其中作为表达所述红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分的结果，所述转基因玉米植物表现出对非生物胁迫的增强的耐受性和/或增加的产量，任选地与参照相比。
2.根据权利要求1所述的转基因玉米植物，其中所述核酸通过密码子优化衍生自第第i)至iv)项中任一项的核酸。
3.根据权利要求1或2的转基因玉米植物，其中权利要求1的第i)项的所述核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的转基因玉米植物，其包含作为转基因的包含所述核酸的表达盒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的转基因玉米植物，其中所述核酸或所述表达盒稳定整合到所述玉米植物的基因组中或在所述玉米植物中瞬时表达，例如在载体上存在于所述玉米植物中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的转基因玉米植物，其中所述核酸的表达受启动子，优选组成型启动子的控制。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的转基因玉米植物，其中所述非生物胁迫选自干旱、盐度、热或寒冷，和/或所述产量是生物质产量或谷粒产量。
8.权利要求1至7中任一项所述的转基因玉米植物的植物细胞、组织、可收获部分或种子，其中所述植物细胞、所述组织、所述部分或所述种子包含权利要求1-6中任一项定义的转基因。
9.一种产生权利要求1至7中任一项的转基因玉米植物的方法，包括以下步骤：
向玉米植物的至少一个细胞引入权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求
4或6所定义的表达盒或包含权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求4或6所定义的表达盒的载体，和
从所述至少一个细胞再生所述转基因玉米植物。
10.一种增强玉米植物对非生物胁迫的耐受性和/或提高玉米植物产量潜力的方法，包括以下步骤：
向玉米植物的至少一个细胞引入权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求
4或6所定义的表达盒或包含权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求4或6所定义的表达盒的载体，和
引起所述核酸、所述表达盒或所述载体的表达。
11.权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求4或6所定义的表达盒或包含权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求4或6所定义的表达盒的载体用于增强玉米植物对非生物胁迫的耐受性、用于增加玉米植物的产量潜力和/或用于保护玉米植物免受非生物胁迫的用途。
12.权利要求10的方法或权利要求11的用途，其中所述非生物胁迫选自干旱、盐度、热或寒冷，和/或所述产量潜力是生物质产量潜力或谷粒产量潜力。
13.权利要求2所定义的核酸，或包含所述核酸的表达盒，或包含所述核酸或表达盒的载体，优选其中所述核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
14.载体，其包含权利要求1至3或6中任一项所定义的核酸或权利要求4或6所定义的表达盒。
15.一种用于产生乙醇或甲烷的方法，包括以下步骤：
切割根据权利要求1至7中任一项的转基因玉米植物或根据权利要求8的可收获部分，任选地用青贮剂处理所述切割的玉米植物或所述切割的可收获部分，
任选地储存所述任选地用青贮剂处理过的切割的玉米植物或切割的可收获部分，和通过厌氧消化从所述切割的玉米植物或所述切割的可收获部分产生乙醇或甲烷。
展现增加的产量和干旱耐受的转基因玉米植物
[0001] 植物在其生命期内暴露于一系列非生物胁迫条件，例如热胁迫、寒冷胁迫、低温胁迫、盐度胁迫、干旱胁迫等。这些胁迫条件是植物生长和生产力的重要限制因素。因此，植物暴露于例如热和/或干旱条件下可通常会导致植物材料(例如叶片、种子、果实和其他可食用或可用产品)的产量降低。经济上重要的植物，如玉米、水稻或小麦的这种产量降低代表了重要的经济因素，其中特别是在许多欠发达国家，这种产量降低可能导致食物短缺，其危及人口的粮食供应。
[0002] 玉米是世界上产量最高的作物。这种谷粒以总产量超过10亿公吨在全世界至少164个国家生长。在凉爽和炎热的气候中，玉米生长的纬度变化于从赤道到南和北50度略高、从海平面到海拔3000米以上，并且以生长周期的范围从3到13个月。因此，玉米植物供应保持在高水平对于世界人口的食物供应而言是重要的。然而，特别是极端天气条件(如极度高温、极度寒冷、极度潮湿、极度干旱等)下的地区会导致无法确保食物供应的危险，其鉴于过去几年的明显天气变化，已成为甚至更重要的主题。此外，鉴于例如油、煤炭和天然气的资源的燃烧导致世界气候变暖，并且需要由于其再生不会导致负二氧化碳平衡的资源的事实，过去几年玉米作为可再生资源的重要性已经增加。
[0003] 鉴于此，提供以其所有形式和其他非生物因素来面对气候，并且尽管有高温、寒冷、干旱、盐度、潮湿等，仍能提供高产量的玉米植物和其他作物植物是科学的需求。
[0004] 细胞壁转化酶(invertase)，也称为细胞外转化酶，是植物适当代谢、生长和分化的关键酶。它们通过在细胞外将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，其随后通过单糖转运子输入到靶细胞中。单糖不仅可以作为用于植物的碳和能量的来源，而且它们也是可能在植物中调节细胞分裂、生长、分化、代谢和资源分配的关键信号分子。细胞壁转化酶被认为是通过质外体途径向库组织提供碳水化合物的关键。
[0005] 细胞壁转化酶在本领域中已知可能增加某些植物的谷粒产量和生物质。因此，Li等(Li B.et.al.,Plant Biotechnology Journal,2013,11,1080-1091)公开了转基因玉米植物中三种细胞壁转化酶基因(AtCWIN1，OsGIF1和ZmMn1)的组成型过表达，其导致谷粒产量的增加。Schweinichen和Büttner(Schweinichen C.and Büttner M.,Plant Biol.(Stuttg),2005,7,469-475)公开了拟南芥中红叶藜(Chenopodium rubrum)细胞壁转化酶的根特异性表达，其可能是由于广泛根生长而导致整株植物的早开花和增加的生物质。Albacete A.等，Journal of Experimental Botany,2015,66,863-878公开了转基因番茄中红叶藜细胞壁转化酶的果实特异性表达可导致干旱耐受性提高，但是他们没有观察到增加的苗重或叶面积，即生物质。
[0006] 尽管有这些提高植物产量的成功，仍然需要提供即使在不利的非生物条件下也能产生高的生物质产量的经济上重要的植物。
[0007] 为了解决该问题，本发明人成功地开发了玉米植物，其中因这些玉米植物显示出增强的干旱耐受性和增强的生物质产生而克服了先前玉米植物的缺点。因此，本发明人将红叶藜细胞壁转化酶(CrCIN)引入玉米植物中，并发现这些玉米植物产生了增加的产量并且对干旱具有增加的耐受性。
[0009] 在下文中，详细描述了本发明。在各个段落中描述了本发明的特征。然而，这并不意味着段落中描述的特征与其他段落中描述的一个或多个特征隔离。相反，段落中描述的特征可以与其他段落中描述的一个或多个特征组合。
[0010] 这里使用的术语“包含”意味着“包括或含有”所公开的特征和未具体提及的其他特征。术语“包含”还意味着“由所指出的特征组成”的意思，因此不包括除了所指出的特征之外的其他特征。因此，本发明的产品和方法的特征还可以在于除了所指出的特征之外的额外特征。
[0011] 在第一方面，本发明涉及转基因玉米植物，其包含作为转基因的i)能够表达红叶藜细胞壁转化酶(CrCIN)或其功能性部分的核酸，ii)通过遗传密码的简并而修饰的第i)项所述的能够表达红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分的核酸，iii)能够表达与第i)项的红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸相同性或至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的细胞壁转化酶或其功能性部分的核酸，或iv)能够在严格条件下与第i)-iii)项中任一项的核酸的互补序列杂交的核酸，从而第iv)项的所述核酸能够表达细胞壁转化酶，其中作为表达所述红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的结果，所述转基因玉米植物表现出对非生物胁迫的增强的耐受性和/或增加的产量，任选地与参照相比。
[0012] 在其一个实施方案中，所述核酸通过密码子优化衍生自第i)至iv)项中任一项的核酸。
[0013] 在上述实施方案中，第i)项的核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
[0014] 在上述实施方案中，所述转基因玉米植物包含作为转基因的包含所述核酸的表达盒。
[0015] 在上述实施方案中，所述核酸或所述表达盒稳定整合到所述玉米植物的基因组中或在所述玉米植物中瞬时表达，例如在载体上存在于玉米植物中。
[0016] 在上述实施方案中，所述核酸的表达受启动子，优选组成型启动子控制。
[0017] 在上述实施方案中，所述非生物胁迫选自干旱、盐度、热或寒冷和/或所述产量是生物质产量或谷粒产量。
[0018] 本发明人已令人惊奇地证明红叶藜细胞壁转化酶在增强玉米植物对干旱胁迫的耐受性和/或增加玉米植物的产量中有效。这是令人惊讶的，因为本发明人还证明向小麦植物中引入相同基因在增加生物质或谷粒产量中无效。这表明在异源环境中一般的细胞壁转化酶且特别是红叶藜细胞壁转化酶的作用是不可预测的。
[0019] 因此，通过引入编码红叶藜细胞壁转化酶的基因，本发明人能够在正常和/或胁迫条件下增强玉米植物对非生物胁迫的耐受性和/或增加玉米植物的(生物质)产量。具体地，本发明人表明，向玉米植物中引入编码红叶藜细胞壁转化酶的基因被表达，并且与参照相比，该基因的表达导致叶产生的增加，导致更高植物的产生，和导致干旱抗性更高的玉米植物的产生。
[0020] 本发明的转基因玉米植物表达红叶藜细胞壁转化酶(CrCIN)。编码衍生自红叶藜的CIN1细胞壁转化酶的基因是本领域已知的，并且例如特征在于可获得自NCBI数据库(National Centre for Biotechnology Information；National Library of Medicine 38A,Bethesda,MD20894,USA；www.ncbi.nih.gov)的登记号，其中登记号为X81792.1(SEQ ID NO：1)，编码登记号为CAA57389.1(SEQ ID NO：2)的蛋白质。红叶藜细胞壁转化酶和编码细胞壁转化酶的基因不限于SEQ ID NO：1和2，但包括由红叶藜天然表达的任何红叶藜细胞壁转化酶和编码红叶藜细胞壁转化酶的基因。此外，本发明的转基因玉米植物包含表达红叶藜细胞壁转化酶的“同源物”的核酸。如本文所定义的“同源物”是与如SEQ ID NO：2示例鉴定的红叶藜细胞壁转化酶具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸相同性的细胞壁转化酶，或与如SEQ ID NO：2示例鉴定的红叶藜细胞壁转化酶具有至少
70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的细胞壁转化酶。因此，“氨基酸同源性”是指相同或同源的氨基酸。同源氨基酸残基具有相似的化学-物理性质，例如，属于同一组的氨基酸：芳香族(Phe，Trp，Tyr)，酸(Glu，Asp)，极性(Gin，Asn)，碱性(Lys，Arg，His)，脂肪族(Ala，Leu，lie，Val)，具有羟基(Ser，Thr)，或具有短的侧链(Gly，Ala，Ser，Thr，Met)。预期这些同源氨基酸之间的取代不会改变蛋白质表型(保守取代)。可选地，“同源物”是由核酸编码的细胞壁转化酶，所述核酸能够在严格条件下与编码如SEQ ID NO：2示例鉴定的红叶藜细胞壁转化酶的核酸的互补序列杂交，或能够在严格条件下与编码与如上述鉴定的红叶藜细胞壁转化酶具有氨基酸相同性或氨基酸同源性的细胞壁转化酶的核酸的互补序列杂交。
70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸同源性的细胞壁转化酶。因此，“氨基酸同源性”是指相同或同源的氨基酸。同源氨基酸残基具有相似的化学-物理性质，例如，属于同一组的氨基酸：芳香族(Phe，Trp，Tyr)，酸(Glu，Asp)，极性(Gin，Asn)，碱性(Lys，Arg，His)，脂肪族(Ala，Leu，lie，Val)，具有羟基(Ser，Thr)，或具有短的侧链(Gly，Ala，Ser，Thr，Met)。预期这些同源氨基酸之间的取代不会改变蛋白质表型(保守取代)。可选地，“同源物”是由核酸编码的细胞壁转化酶，所述核酸能够在严格条件下与编码如SEQ ID NO：2示例鉴定的红叶藜细胞壁转化酶的核酸的互补序列杂交，或能够在严格条件下与编码与如上述鉴定的红叶藜细胞壁转化酶具有氨基酸相同性或氨基酸同源性的细胞壁转化酶的核酸的互补序列杂交。
[0021] 如SEQ ID NO：2鉴定的红叶藜细胞壁转化酶或其同源物赋予玉米植物对非生物胁迫增强的耐受性，和/或携有编码如SEQ ID NO：2鉴定的红叶藜细胞壁转化酶或其同源物的核酸的玉米植物具有增加的产量，任选地与参照相比。优选地，如SEQ ID NO：2鉴定的红叶藜细胞壁转化酶或其同源物可能不能赋予已经转化其的小麦植物对非生物胁迫的耐受性和/或不能增加小麦植物的产量，更具体地说，红叶藜细胞壁转化酶或其同源物可能不能增加小麦植株高度或谷粒产量。
[0022] 如本文所用，红叶藜细胞壁转化酶或其同源物的“功能性部分”是指蛋白质的任何部分，其具有与如SEQ ID NO：2鉴定的全长红叶藜细胞壁转化酶相同的活性，即所述功能性部分将蔗糖水解成葡萄糖和果糖。此外，所述功能性部分赋予玉米植物对非生物胁迫的增强的耐受性和/或携有所述功能性部分的玉米植物具有增加的产量，任选地与参照相比。优选地，所述功能性部分可能不能赋予已经转化其的小麦植物对非生物胁迫的耐受性和/或不能增加小麦植物的产量，更具体地，所述功能性部分可能不能增加小麦植物高度或谷粒产量。
[0023] 如本文所用，术语“玉米植物”是指玉米(Zea mays)物种的任何植物。
[0024] 如本文所用，术语“核酸”可以是DNA、RNA或DNA和RNA的杂交体。优选地，所述DNA是双链的。它可以是包含内含子序列和可能的5’和/或3’区域中的调节序列的基因组DNA或不含内含子序列的cDNA。如本文所用，术语“核酸”包括编码如上文所定义的红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸。此外，术语“核酸”包括通过编码天然存在的红叶藜细胞壁转化酶的核酸的遗传密码的简并而修饰的核酸。
[0025] 如本文所用，术语“核酸”还意指包括编码红叶藜细胞壁转化酶或其同源物的核酸的一部分，其中所述核酸的一部分编码如上定义的红叶藜细胞壁转化酶的或其同源物的功能性部分。
[0026] 术语“遗传密码的简并”是指密码子的简并性，其是本领域已知的术语并且意指表现为指定给定氨基酸的三碱基对密码子组合的多重性的遗传密码的冗余。因此，可以特异性地改变编码氨基酸的密码子而不改变氨基酸。这导致编码相同的红叶藜细胞壁转化酶的多种核酸。
[0027] 如本文所用，“序列相同性”或“序列同源性”的百分比是指在两个最佳比对序列中的相应位置上分别为相同或同源的氨基酸残基的百分比。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗口中的氨基酸序列的片段可以包含与参照序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(例如，空位或突出端)以使两个序列最佳比对。通过确定两个序列中相同或同源氨基酸残基出现的位置数来计算百分比，以产生匹配的位置的数量，将匹配的位置的数量除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行：通过Smith T.F.and Waterman M.S.,Add APL Math,1981,2,482-489的局部同源性算法，通过Needleman S.B.and Wunsch C.D.,J.Mol.Biol.,1970,48,443-453的同源性比对算法，通过Pearson W.R.and Lipman D.J.,PNAS,1988,85,2444-2448的相似性方法搜索，通过由Karlin S.and Altschul S.F.,PNAS,1993,90,5873-5877修改的Karlin S.and Altschul S.F.,PNAS,1990,87,2264-2268的算法，或通过这些算法的计算机化实现(GAP,BESTFIT,BLAST,PASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)，或通过视查。优选使用GAP和BESTFIT来确定最佳比对。通常，可以使用空位重量的默认值为5.00和空位重量长度的默认值为0.30。
[0028] 如本文所用，术语“杂交”是指通过互补核苷酸的碱基配对在两个核酸分子之间形成杂交体。术语“在严格条件下杂交”是指在特定条件下的杂交。这种条件的实例包括这样的条件，其中基本上互补的链(例如由具有至少80％互补性的核苷酸序列组成的链)与给定链杂交，而较少互补的链不杂交。可选地，这些条件是指钠盐浓度、温度和洗涤条件的特定杂交条件。例如，高严格条件包括在42℃，50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠、5x Denhardt`s溶液、10x硫酸葡聚糖、20mg/ml剪切的鲑鱼精核酸下孵育并在约65℃下在0.2×SSC(SSC代表0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸三钠缓冲液)中洗涤。可选地，高严格条件可意指在68℃下在0.25M磷酸钠、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，并在68℃下用2×SSC和0.1％SDS洗涤两次。进一步可选地，高度严格的杂交条件是，例如：在65℃下在4×SSC中杂交，并然后在65℃下在0.1×SSC中多次洗涤总共约1小时，或在68℃下在0.25M磷酸钠、pH 7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，并随后用2×SSC和0.1％SDS在68℃洗涤两次。
[0029] 本发明人显示，编码红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸可在玉米植物中表达。表达的细胞壁转化酶赋予所述玉米植物对非生物胁迫的增强的耐受性和/或所述玉米植物表现出增加的产量。“对非生物胁迫的耐受性”是指在玉米植物中引入和表达红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物使得玉米不易受到不利的非生物条件的影响，由此由于不利的非生物因素的典型的胁迫症状不会发生或以低于参照中的程度发生。可选地或额外地，在玉米植物中引入和表达红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物增加了玉米植物的产量，任选地与参照相比。如本文所用，“增加的产量”是指转基因玉米植物在不会对植物产生胁迫的正常条件或非生物胁迫条件下表现出增加的生长速率，任选地与参照相比。增加的生长速率包括整株植物或其一部分增加的物质(mass)产生，例如植物地上部分如茎、叶、花、穗轴(cob)和/或谷粒等的增加的物质产生，和/或植物的地下部分的增加的物质产生。“增加的物质产生”可以包括转基因玉米植物的任何部分，并且特别是指茎、叶、穗轴和/或谷粒。“增加的产量”还包括延长的生长和存活，也导致增加的物质产生。
[0030] 如本文所用，术语“参照”可以指与本发明的转基因玉米植物具有相同基因型的玉米植物，其中所述参照不包含编码红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的转基因。包括参照玉米植物的参照实验可以与用于测试本发明的转基因玉米植物的性质的实验平行进行。然而，参照实验也可以在可比较的条件下在不同的时间点进行，并且可以在完成所有实验后比较结果。可选地，“参照”可以是特定的(预)确定的产量或症状的量度，例如在干旱条件下显示叶卷曲症状的叶片的百分比，其表征玉米植物具有对非生物胁迫因素的耐受性或具有对非生物胁迫因素没有耐受性。例如，参照量度可以是已经确定的量度或公开可用的量度，其向本领域技术人员提供阈值量度并帮助他/她确定转基因玉米植物耐受或不耐受非生物胁迫因素或具有增加的产量，这取决于转基因玉米植物的量度是低于还是高于该量度。基于该参照测量(例如具有卷曲症状的叶片的数量)，如果玉米植物具有比参照量度更低的具有卷曲症状的叶片数量，本领域技术人员然后可以将玉米植物鉴定为对胁迫因素耐受，或者如果如果玉米植物表明产量高于参照量度，本领域技术人员然后可以将玉米植物鉴定为具有增加的产量。因此，用于建立参照量度的玉米植物不需要是，但可以是与转基因玉米植物具有相同基因型的玉米植物。例如，参照玉米植物可以是对非生物胁迫因素具有一定程度的耐受性的玉米植物，所述对非生物胁迫因素具有一定程度的耐受性反映适应特定的环境的玉米植物群体的平均耐受程度。希望开发更适应特定环境的玉米植物的本领域技术人员可以使用该量度作为参照并开发表现出更好的量度并因此更好地适应特定环境的转基因玉米植物。或者参照玉米植物可以是对非生物胁迫因素具有一定程度耐受性的玉米植物，并且其目的是产生对非生物因素具有更高耐受性的转基因玉米植物。同样地，本领域技术人员可能想要在特定条件下开发具有高产量的转基因玉米植物，并且可以使用与参照量度的比较来确定转基因玉米植物是否满足该目标。
[0031] 为了确定转基因玉米植物是否显示“对非生物胁迫的耐受性”或“增加的产量”，可以根据本领域已知的方法确定来自转基因的CrCIN转录物和/或蛋白质表达和/或表达水平。因此，确定携有红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的转基因玉米植物是否具有对非生物胁迫的耐受性或增加的产量不一定需要与参照进行比较。本发明人已经发现，红叶藜细胞壁转化酶的引入和表达导致增加的产量和增加的对非生物胁迫因素的耐受性，如本说明书的示例性部分所示。
[0032] 术语“非生物胁迫”或“非生物胁迫条件”是指由非生物因素，即非生命因素引起的对于玉米植物的胁迫条件。这些非生物因素包括干旱、盐度(盐浓度)、热或冷。虽然不希望受以下限制，但可以认为红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物在玉米中的作用与增加的碳水化合物库有关，其由于在过量表达酶的玉米植物中红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的活性增加而生成。通常已知对渗透胁迫具有保护作用的糖可以在玉米植物中导致分子细胞表型，所述分子细胞表型保护玉米植物免受渗透事件起作用的诸如干旱、盐度和/或热条件的胁迫条件。此外，通常已知对寒冷或霜温度影响具有保护作用的糖可导致分子细胞表型，所述分子细胞表型保护玉米植物免受诸如寒冷的胁迫条件。
[0033] 在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的玉米植物所包含的核酸是密码子优化的。一旦已经选择了细胞壁转化酶用于转化玉米植物，可以修饰密码子并使其适应宿主的特定要求以最大化表达。用于在异源宿主细胞中表达的核酸的密码子优化是本领域技术人员已知的。有许多商业提供者已经开发了算法，所述算法考虑相关的转录和翻译优化参数并给出配置成核酸和宿主需求的核酸序列。例如，密码子优化可以通过GeneOptimizerTM软件(GeneArt，ThermoFisher Scientific)实现。如本发明所包含的优选核酸是编码SEQ ID NO：4的多肽的衍生自SEQ ID NO：1的密码子优化序列SEQ ID NO：3。密码子特别适应于玉米植物中的密码子使用。
[0034] 术语“表达(expression of)”或“表达(expressing)”是指(1)将本发明包含的核酸转录成RNA或mRNA和/或(2)将所述RNA或mRNA翻译成红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物。
[0035] 如本文所用，“表达盒”是由一个或多个开放阅读框或基因序列和控制其表达的在5’和任选地3’位置的调控元件组成的核酸分子，所述一个或多个开放阅读框或基因序列在已引入表达盒的玉米植物中表达为蛋白质。因此，表达盒可含有与开放阅读框或另一基因序列可操作连接的启动子调控序列(也称为启动子)和可含有多腺苷酸化位点的3'终止子调节区。启动子指导细胞的机制以产生RNA和/或蛋白质。所述调节元件可以来自引入玉米植物的细胞壁转化酶核酸或可以来自不同基因，只要所述调节元件能够在玉米植物中起作用。此外，5’位置的调节元件可以衍生自与3’位置中的调节元件相同的基因，或者可以衍生自不同的基因。如本文所用，“可操作地连接”是指连接的核酸序列的表达发生在玉米植物中。表达盒可以是用于克隆和将核酸引入细胞的载体的一部分。
[0036] 为了将能够表达红叶藜细胞壁转化酶或其同源物或其功能性部分的核酸分子引入细胞，可以将核酸分子或携有核酸的表达盒插入载体中。携有核酸分子的载体是本领域技术人员已知的。除所述核酸分子外，所述载体还可包含在5'和任选3'位置的调节元件，所述调节元件能够在玉米植物中起作用。调节元件优选与红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物是异源的。因此，所述载体可包含与所述核酸分子可操作地连接的启动子调节序列，和任选的终止子调节序列。优选地，载体是用于转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的穿梭载体，并且随后通过转化的根癌农杆菌感染玉米植物将编码红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸分子转移到玉米植物细胞中。更优选地，所述载体是二元载体，其是由根癌农杆菌介导的高等植物转化中的标准工具。它由T核酸的边界、多克隆位点、用于大肠杆菌和根癌农杆菌的复制功能、可选择标记基因、报告基因和其他可以提高系统的效率和/或为系统提供进一步功能的辅助元件组成。另一种更优选的载体是超级双元载体，其携带来自Ti质粒的额外毒力基因并且表现出非常高的转化频率，这对于诸如谷类的顽抗植物是有价值的。本领域可获得许多有用的载体。特别优选的是包含玉米的泛素启动子(例如，US 5,510,474 A、US 6,020,190 A、US 6,054,574 A、US 6,878,818 B l、US 6,977,325 B2)和根癌农杆菌的nos终止子序列或花椰菜花叶病毒的35S终止子序列作为转录调节序列并且优选通过除草剂抗性基因(例如用于赋予Basta抗性的pat基因(例如，US 7,112,665 B 1))和/或大观霉素抗性基因作为可选择标记基因而扩展的双元载体。
[0037] 根据本发明，术语“启动子调节序列”或“启动子”意指可以在玉米植物中表达的基因的任何启动子。这种启动子可以是在玉米植物中天然表达的启动子或是真菌、细菌或病毒来源的启动子。所述启动子可包括组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，其中组成型表达是优选的。本领域可获得许多合适的启动子。例如，可用于本发明的组成型启动子是来自玉米的泛素启动子。另一种启动子是来自水稻的Act-1启动子(例如，US 5,641,876 A)。来自大豆褪绿斑驳病毒(SoyCMV)的NCR启动子(Hasegawa,A.,et al."The complete sequence of soybean chlorotic mottle virus DNA and the
identification of a novel promoter."Nucleic acids research 17.23(1989):9993-
10013)也已显示可用于单子叶植物。其他有用的启动子是35S CaMV(Franck A.et al.,
1980,Cell 21:285-294)和来自花椰菜花叶病毒的19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/
02913)或来自Rubisco小亚基(US 4,962,028)的那些植物启动子。
identification of a novel promoter."Nucleic acids research 17.23(1989):9993-
10013)也已显示可用于单子叶植物。其他有用的启动子是35S CaMV(Franck A.et al.,
1980,Cell 21:285-294)和来自花椰菜花叶病毒的19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/
02913)或来自Rubisco小亚基(US 4,962,028)的那些植物启动子。
[0038] 用于本发明方法的启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是能够响应诱导物而直接或间接激活核酸序列转录的启动子。在不存在诱导物的情况下，所述核酸序列将不被转录。诱导性表达可能是理想的。诱导型启动子的刺激物是不同类型的并且包括环境条件，例如光、温度和/或非生物胁迫条件，例如水胁迫、盐胁迫条件、冷胁迫或热胁迫。用于诱导型启动子的其他类型的刺激物是激素(例如赤霉素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、乙烯、生长素)或化学品(四环素、地塞米松、雌二醇、铜、乙醇和苯并噻二唑)。因此，红叶藜细胞壁转化酶或其功能片段或其同源物在特定诱导条件下，优选在非生物胁迫条件下的表达，通过预防胁迫症状和允许物质形成来导致玉米植物的保护。诱导型启动子是例如苄基磺酰胺诱导型(EP 0 388 186)、四环素诱导型(Gatz C.et al.,Plant J.2,1992:397-404)、脱落酸诱导型(EP 0 335 528)或乙醇或环己烯醇诱导型(WO 93/21334)的启动子。
[0039] 除启动子序列外，表达盒或载体还可含有结构基因下游的终止子以提供有效终止。根据本发明，术语“终止子”或“终止子调节序列”意指在终止玉米植物中核酸表达中起作用的任何此类序列，也任选地包含多腺苷酸化序列。所述终止子可以从与所述启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。因此，它可以是病毒来源的(例如优选的一个是CaMV 35S终止子)、是细菌来源的(如根癌农杆菌的章鱼碱合酶或胭脂碱合成酶终止子)、或植物来源的(如组蛋白终止子)。多腺苷酸化序列包括但不限于农杆菌章鱼碱合酶信号。
[0040] 如本文所用，术语“引入(introducing)”或“引入(introduction)”是指通过本领域已知的任何方法将核酸插入玉米植物中，例如使用非病毒引入方法的“转化”或使用病毒介导的基因转移的“转导”。为了将核酸分子引入玉米植物中，本领域已知许多方法(参见，例如Miki et al.,"Procedures for Introducing Foreign nucleic acid into Plants"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993),pages 67-88)。此外，可得到用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法(参见，例如，Gruber et al.,"Vectors for Plant Transformation"in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993),pages 89-119)。
[0041] 应用于本发明的优选方法是通过使用农杆菌属的细菌，优选通过用根癌农杆菌感染玉米植物的细胞或组织，转化携有核酸分子的核酸分子、表达盒或载体(Knopf U.C.,1979,Subcell.Biochem.6:143-173；Shaw C.H.et al.,1983,Annu.Rev.Genet.16:357-
384；Tepfer M.and Casse-Delbart F.,1987,Microbiol.Sci.4(1):24-28)。例如，用根癌农杆菌转化玉米植物细胞或组织是根据Hiei Y.et al.(1994,Plant J.6(2):271-282)描述的方案实施的。
384；Tepfer M.and Casse-Delbart F.,1987,Microbiol.Sci.4(1):24-28)。例如，用根癌农杆菌转化玉米植物细胞或组织是根据Hiei Y.et al.(1994,Plant J.6(2):271-282)描述的方案实施的。
[0042] 将核酸引入玉米植物的另一种方法是生物射弹转化方法，其中用颗粒轰击细胞或组织，所述颗粒上吸附本发明所包含的核酸、表达盒或载体(Bruce W.B.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24):9692-9696；Klein T.M.et al.,1992,Biotechnology 10(3):286-291；US Patent No.4,945,050)。另一种方法是广泛使用的原生质体转化。因此，植物细胞被果胶酶分离，并随后细胞壁降解生成原生质体。为了转化，可以加入聚乙二醇或可以应用电穿孔。其他方法使植物细胞或组织与聚乙二醇(PEG)和本发明的核酸、表达盒或载体接触(Chang S.and Cohen S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.168(1):111-115；
Mercenier A.and Chassy B.M.,1988,Biochimie 70(4):503-517)。电穿孔是另一种方法，其由使待转化的细胞或组织和本发明包含的核酸、表达盒或载体经受电场而组成(Andreason G.L.and Evans G.A.,1988,Biotechniques 6(7):650-660；Shigekawa K.and Dower W.J.,1989,Aust.J.Biotechnol.3(1):56-62)。另一种方法包括通过显微注射将本发明包含的核酸、表达盒或载体直接注射到细胞或组织中(Gordon and Ruddle,1985,Gene
33(2):121-136)。将核酸物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理(Zhang et al.,Bio/Technology 9:996(1991))。可选地，脂质体或原生质球融合可用于将本发明包含的核酸、表达盒或载体引入植物中(Deshayes et al.,EMBO J.,4:2731(1985),Christou et al.,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:3962(1987))。还已经报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将核酸直接摄取到原生质体中(Hain et al.,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)；Draper et al.,Plant Cell Physiol.23:451(1982))。
Mercenier A.and Chassy B.M.,1988,Biochimie 70(4):503-517)。电穿孔是另一种方法，其由使待转化的细胞或组织和本发明包含的核酸、表达盒或载体经受电场而组成(Andreason G.L.and Evans G.A.,1988,Biotechniques 6(7):650-660；Shigekawa K.and Dower W.J.,1989,Aust.J.Biotechnol.3(1):56-62)。另一种方法包括通过显微注射将本发明包含的核酸、表达盒或载体直接注射到细胞或组织中(Gordon and Ruddle,1985,Gene
33(2):121-136)。将核酸物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理(Zhang et al.,Bio/Technology 9:996(1991))。可选地，脂质体或原生质球融合可用于将本发明包含的核酸、表达盒或载体引入植物中(Deshayes et al.,EMBO J.,4:2731(1985),Christou et al.,Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:3962(1987))。还已经报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将核酸直接摄取到原生质体中(Hain et al.,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)；Draper et al.,Plant Cell Physiol.23:451(1982))。
[0043] 如上所述，用于鉴定包含核酸的转基因玉米植物的选择步骤可以通过载体上存在的可选择基因实施。可选择基因可以包含可操作地连接的启动子调节序列和在玉米细胞中起作用的可能的终止子调节序列。在可用于本发明的可选择标记中，参考用于针对抗生素的抗性的基因，如大观霉素抗性基因、潮霉素磷酸转移酶基因、诱导对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因、或氨基糖苷3'-腺嘌呤基转移酶基因、对双丙氨膦耐受的bar基因(White J.et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:1062)、对异恶唑耐受的EPSPS基因(US 5,188,642)、对草甘膦耐受的HPPD基因(WO 96/38567)、编码可识别酶例如GUS酶的基因、GFP蛋白或编码调节转化的细胞中色素产生的色素或酶的基因。这些可选择标记基因特别描述于专利申请WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567和WO 97/04103中。在优选的实施方案中，大观霉素抗性基因和pat基因用作本发明中二元载体上的可选择基因。
[0044] 无标记基因转化是将如上所述的核酸、表达盒或载体转移到玉米植物中的另一种选择。
[0045] 在一个实施方案中，核酸或表达盒稳定整合到转基因玉米植物的基因组中，优选整合到植物的染色体(例如核、质体和/或线粒体染色体)中。然而，整合也可以发生在染色体外的元件中。通过稳定整合到植物的基因组中，所述核酸序列可以传递给转基因植物的后续世代。在本发明中优选稳定整合并传递给下一代玉米植物。使用根癌农杆菌介导的植物转化方法作为优选的转化方法，将红叶藜细胞壁转化酶核酸稳定整合到玉米植物基因组中。可选地，可以将携有核酸或表达盒的核酸或表达盒或载体转化为自主复制子。可选地，所述核酸分子或表达盒在用于引入核酸分子的载体上存在于植物细胞内，并且不稳定地整合到植物的基因组中，或者所述核酸被瞬时表达，例如转化的mRNA。因此，所述核酸序列可能不会传递给玉米植物的后续世代。
[0046] 如本文所用，术语“异源的”是指其中分子存在于其天然不存在的环境下的条件。例如，在其中不天然表达的宿主细胞中表达的核酸分子是异源核酸。因此，所述宿主细胞然后是异源宿主细胞。异源调节元件是与它们不天然连接的核酸分子连接的那些。
[0047] 如本文所用，“转基因玉米植物”是指玉米植物，其含有能够表达红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸，所述核酸整合到其核基因组或细胞器基因组中或存在在自主复制子上或用于引入本发明所包含的核酸的载体上，或仅作为编码序列而没有其它元件而存在。该术语进一步涵盖后代，例如T1、T2或连续世代，以及其与非转基因或其他转基因植物的杂交品种。转基因玉米植物有利地含有至少一个本发明包含的核酸的拷贝。
[0048] 红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物在玉米植物中的表达增强了对非生物胁迫条件的耐受性。本发明的转基因玉米植物针对其表现出增强的耐受性的优选“非生物胁迫”包括干旱、盐度(盐浓度)、热和/或寒冷。
[0049] “干旱”或“干旱条件”是指长期低水供应或无水供应(水胁迫条件)引起的水缺乏条件，尤其是不利影响玉米植物的生长和/或生存条件的条件。在干旱条件下，植物将显示受伤的症状，例如枯萎、叶片褐变和/或叶片卷曲，生长受到阻碍并且植物最终将死亡。干旱条件可以通过使V2、V3、V4、V5、V6、V7或V8(根据下面描述的叶圈法)阶段的玉米植物在1/4强度Hoagland溶液中生长一周，并然后将其在25％PEG6000中处理一天来生成。如本文所用，“对干旱的耐受性”可以意指转基因玉米植物在干旱条件下(例如用Hoagland溶液和25％PEG6000处理植物)显示出显著降低的叶卷曲症状。“显著降低”意味着与参照相比，具有卷曲症状的叶片的百分比降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。可选地，如果保持在干旱条件下如果在V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和/或VT(具有花序的完全成熟植物)阶段中的玉米植物的叶片的最多60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％或更少％显示出卷曲症状，则玉米植物对干旱耐受。
[0050] “盐度”或“盐度条件”是指用于灌溉的高浓度盐的条件，例如100mM NaCl溶液，特别是在空气和/或土壤中，特别是对玉米植物的生长和/或生存条件产生不利影响的条件。植物耐受盐的能力由多种生化途径确定，所述多种生化途径有助于保留和/或获取水、保护叶绿体功能和维持离子稳态。必需途径包括导致渗透活性代谢物、特定蛋白质或某些自由基清除酶合成的途径，所述自由基清除酶酶控制离子和水通量并支持清除氧自由基或分子伴侣。细胞壁转化酶保护玉米植物免受不利盐度影响的原因可能在于它们合成渗透活性化合物的能力。在盐度条件下，玉米植物的产量将低于非盐度条件下的产量。在延长和/或非常高的盐度条件下，玉米植物最终将死亡。“对盐度的耐受性”可能意味着与不再生长或以较低程度生长，因而在非常高的盐度条件下和/或在长时间的盐度下，玉米植物最终将死亡的参照相比，V2、V3、V4、V5、V6、V7或V8阶段的转基因植物在盐度条件下存活和/或生长。通过“存活”是指转基因玉米植物比参照存活更长时间，例如至少10、11、12、13或更多天。通过“生长”是指整个玉米植物或其部分如茎、叶、穗轴或谷粒的产量与对照的产量相比增加至少20、30、40、50、60、70、80、90或100％。
[0051] “热”或“热条件”是指在高温(例如在随开花前期15天的穗水平下ca.33-40℃)下的条件，特别是不利影响玉米植物的生长和/或生存条件的条件。植物生长和发育的速率取决于植物周围的温度。营养期期间发生的极端高温事件似乎对植物生产力产生了最显著的影响；因此，极端高温可能导致谷粒产量下降。通常，在繁殖阶段期间的极端高温可能影响花粉活力、受精和谷粒形成。在初始谷粒结实的授粉阶段期间长期暴露于极端温度将降低谷粒产量潜力。在发育的生殖阶段，急性暴露于极端事件可能是最不利的(Hatfield J.L.and Prueger J.H.,2015,Weather and Climate Extremes,10:4-10)。考虑到由于世界气候变暖，预计温度和极端温度事件会增加，迫切需要开发具有增强的热胁迫条件耐受性的玉米植物。如本文所用，“对热耐受”可以意指与不再生长或以较小程度生长的参照的相比，V2、V3、V4、V5、V6、V7或V8和授粉阶段的转基因植物在热条件下存活和/或生长。通过“存活”是指转基因玉米植物比参照存活更长时间段，例如至少10、11、12、13或更多天。通过“生长”是指整个玉米植物或其部分如茎、叶、穗轴或谷粒的产量与对照的产量相比增加至少为20、30、40、50、60、70、80、90或100％。
[0052] “寒冷”或“寒冷条件”是指在寒冷温度下例如低于10℃但高于冰点的条件，特别是不利影响玉米植物的生长和/或生存条件的条件。寒冷可能导致损害(萎黄)并中断营养物和水流动的途径。在寒冷条件下，植物将产生较低的产量。“对寒冷的耐受性”可能意味着与不再生长或以较低程度生长的参照相比，V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8(？？？？)阶段的转基因植物在寒冷条件下存活和/或生长。通过“存活”是指转基因玉米植物比参照存活更长的时间段。通过“生长”是指整个玉米植物或其部分如茎、叶、穗轴或谷粒的产量与对照的产量相比增加至少20、30、40、50、60、70、80、90或100％。
[0053] 本领域技术人员将理解，由于在广谱气候和其他非生物条件下生长的大量不同玉米品种，很难指出关于干旱、盐度、热或者寒冷的具体值，例如干旱天数、盐度程度或温度高度，其指导本领域技术人员应该在何种条件下测试对非生物因素的耐受性。例如，具有高干旱耐受性的玉米植物将比具有较低干旱耐受性的玉米植物需要更强的干旱条件，以评估相应的转基因玉米植物是否显示更高的耐受性或将产生更高的产量。因此，测试条件将取决于用于插入转基因的玉米植物和/或取决于转基因玉米植物将用于的目的。
[0054] 由于红叶藜细胞壁转化酶的引入和表达导致转基因玉米植物在正常和干旱条件下产量的增加以及导致干旱耐受表型的事实，因此如果应该确定转基因玉米植物是否具有对非生物胁迫(例如干旱、盐度、热和/或寒冷)的耐受性，不一定需要如本文所述，将表达红叶藜细胞壁转化酶的转基因玉米植物或其功能性部分或其同源物的转基因玉米植物与参照进行比较。为了检测存在对非生物胁迫因素干旱、盐度、热和/或寒冷的耐受性，确定红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的表达(例如通过确定转录物或蛋白质的量)可能就足够了。
[0055] 可以通过将转基因玉米植物暴露于非生物胁迫因素并确定胁迫因素症状的程度和/或产量来确定对非生物胁迫因素的抗性。可以将获得的量度与参照进行比较。抗性也可以通过确定由本发明包含的转基因表达的转录物的表达或表达水平来检测。
[0056] 在第二方面，本发明涉及本发明的转基因玉米植物的植物细胞、组织、可收获部分或种子，其中所述植物细胞、所述组织、所述部分或所述种子包含本发明包括的转基因。
[0057] 原则上，玉米植物的任何部分、组织或器官都包括在本发明内，以包含作为转基因的编码红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸。因此，以下包括在本发明内：芽营养器官/结构，例如叶片、茎、根、花或花器官/结构，例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药或胚珠；种子，包括胚、胚乳或种皮；谷粒或成熟子房；植物组织，例如维管组织或地面组织；或细胞，例如保卫细胞、卵细胞或毛状体；或其后代。术语“细胞”是指植物内的细胞或细胞积累以及分离的细胞或分离的细胞积累。细胞可以具有细胞壁或可以是原生质体。本发明还涉及种子，其包含本发明包含的核酸、表达盒或载体。优选地，转基因玉米植物的种子保留本发明包含的核酸、表达盒或载体，使得从种子产生的新植物继续包含所述核酸、表达盒或载体。
[0058] “可收获部分”是植物的任何可以由人类收获和使用的部分。优选地，所述可收获部分可以是玉米植物的整个地上部分，其可以被切割、可能被发酵并用作动物饲养中的动物食物或在生物气体植物中作为能量源用于生成能量提供物质(例如生物燃料，例如乙醇或甲烷)。优选地，可收获部分可以是穗轴，尤其是谷粒，其用于人和动物的营养。
[0059] 在第三方面，本发明涉及产生转基因玉米植物的方法，包括向玉米植物的至少一个细胞中引入本发明所包含的核酸或表达盒或载体，并从所述至少一个细胞再生转基因玉米植物的步骤。
[0060] 如本文所用，“再生(regenerating)”或“再生(regeneration)”是指从单个细胞、一组细胞、玉米植物的一部分或玉米植物的组织生长整个玉米植物的过程。本领域技术人员知道将核酸引入玉米植物的至少一个细胞并从中生长玉米植物的方法。“至少一个细胞”是指单个细胞、一组细胞、玉米植物的一部分或玉米植物的组织。
[0061] 在第四方面，本发明涉及增强对玉米植物的非生物胁迫的耐受性和/或增加玉米植物的产量潜力的方法，包括向玉米植物的至少一个细胞中引入本发明包含的核酸或表达盒或载体的步骤，并引起所述核酸、所述表达盒或所述载体的表达。
[0062] 如本文所用，术语“引起表达”是指在保持和/或培养植物的条件下，发生引入玉米植物中的核酸的转录。例如，如果所述启动子是组成型启动子，则表达始终如一地发生，而在启动子是诱导型启动子的情况下，所述启动子的活性可以通过特定生物或非生物因素的存在或不存在来诱导。
[0063] 如本文所用，术语“产量潜力”是指转基因玉米植物增加产量的能力。通过表达红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物，赋予玉米植物可以提高其产量的能力。
[0064] 在第五方面，本发明涉及本发明包含的核酸或表达盒或载体用于增强玉米植物对非生物胁迫的耐受性、用于增加玉米植物的产量潜力和/或用于保护玉米植物免受非生物胁迫的用途。
[0065] 如本文所用，“保护玉米植物免受非生物胁迫”意指赋予玉米植物抗非生物胁迫的抗性。抗性玉米植物不会受到非生物胁迫因素的破坏，或者与参照相比受到较小程度的破坏。通过确定了对非生物胁迫的耐受性可以确定抗性。这包括可以通过确定转基因的转录物和/或蛋白质表达或表达水平来确定抗性。
[0066] 在一个实施方案中，在第四方面的方法或第五方面的用途中，所述非生物胁迫选自干旱、盐度、热或寒冷，和/或所述产量潜力是生物质产量潜力或谷粒产量潜力[0067] 术语“生物质产量潜力”或“谷粒产量潜力”具有上文关于“产量潜力”所述的含义，从而分别指生物质产量或谷粒产量。
[0068] 术语“生物质”通常是指源自植物的有机物质。术语“生物质”可以用作能量来源，而不是指食物或饲料。因此，如本文所用，术语“生物质”是指玉米植物的部分，通常是地上部分，例如整个地上玉米植物，其可以通过将其转化为各种形式的生物燃料(例如乙醇或甲烷)而用作能源。
[0069] 在第六方面，本发明涉及通过密码子优化衍生自编码红叶藜细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸的核酸，优选其中所述核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。本发明还涉及包含所述核酸的表达盒或包含所述核酸或表达盒的载体。
[0070] 在第七方面，本发明涉及载体，其包含如本发明所定义的核酸或表达盒。
[0071] 在第八方面，本发明涉及一种产生乙醇或甲烷的方法，包括以下步骤：切割根据本发明的转基因玉米植物或可收获部分，任选地用青贮剂处理所述切割的玉米植物或所述切割的可收获部分，任选地储存所述任选地用青贮剂处理的切割的玉米植物或切割的可收获部分，并通过厌氧消化从所述切割的玉米植物或所述切割的可收获部分产生乙醇或甲烷。
[0072] 第八方面用于提供一种方法，通过该方法，转基因玉米植物用作提供生物燃料例如乙醇或甲烷的能量源，所述乙醇或甲烷用于汽油中、用于加热、用于获取电力等。从玉米植物获得能量的工艺在生物气回收技术领域中已知，其中在厌氧细菌的帮助下，在称为青贮的过程中储存和发酵切割的玉米或其他植物材料。
[0073] 用青贮剂处理切割的生物质用于改善青贮结果。通过添加用于生物质的厌氧消化的强力乳酸菌或其他细菌和/或化学试剂，抑制了不希望的细菌如生成丁酸的细菌。化学试剂可以是用于减少不需要的细菌(例如生成丁酸的细菌)的亚硝酸钠或六胺，或用于防止酵母和霉菌的生长的苯甲酸钠或山梨酸钾。因此，可以防止厌氧消化失败和/或升温后过程，并且可以控制厌氧消化过程。
[0074] 通过“储存切割的玉米植物或切割的可收获部分”是指将其放入容器、筒仓或坑中并压缩它以便尽可能少地留下氧气或将其保持在厌氧条件下以避免需氧细菌的生长。储存优选在对于合适的温度、湿度、低氧或无氧等合适的条件下进行，以允许厌氧消化。本领域技术人员知道用于储存和厌氧消化的条件和装置。
[0075] 本发明公开了一种赋予玉米植物对非生物胁迫耐受性的方法，包括以下步骤：向玉米植物的至少一个细胞中引入能够表达细胞壁转化酶或其功能性部分或同源物的核酸、包含所述核酸的表达盒或包含所述核酸或所述表达盒的载体，并引起所述核酸、所述表达盒或所述载体的表达。
[0076] 本发明公开了能够表达细胞壁转化酶或其功能性部分或其同源物的核酸、包含所述核酸的表达盒或包含所述核酸或所述表达盒的载体，用于赋予玉米植物对非生物胁迫的耐受性或用于保护玉米植物免受非生物胁迫。
[0077] 上述方法或用途可包括非生物胁迫干旱、盐度、热和/或寒冷。
[0078] 上述方法和用途中提及的细胞壁转化酶可以是任何细胞壁转化酶，不限于红叶藜细胞壁转化酶或其同源物或其功能性部分，其具有在细胞外将蔗糖水解成葡萄糖和果糖然后将其转运到细胞中的功能以及赋予玉米植物对非生物胁迫的耐受性的功能。这些功能也适用于所述“部分”和所述“同源物”，其如上所述定义。由该方法或用途所包括的其他特征(如耐受性、非生物胁迫、表达盒、载体等)的定义如本文所包括。
[0080] 附图简述
[0081] 图1A-C：用于克隆CrCIN的载体：三种载体用于克隆CrCIN。A：第一载体是从GeneArt(ThermoScientific)收到的，其含有合成的密码子优化的CrCIN基因(SEQ ID NO：3)。B：使用限制酶BamHI和HindIII切下该基因，并克隆到含有克隆盒(ubi启动子和NosT终止子)的穿梭载体pABM中。C：使用标记的酶SfiI切除整个基因盒，并克隆到二元载体pZFNmcherb中用于转化到农杆菌中并最后转化到玉米中。
[0082] 图2：纯合T1 CrCIN植物的表达水平：RT-qPCR显示选择的CrCIN事件与内源对照基因ZmEF1的相对表达。非转化的A188和转化对照(用空载体转化的A188)均未显示表达，而含有CrCIN作为转基因的那些A188系显示CrCIN表达。
[0083] 图3：2015年冬季的Tl CrCIN植物(A)和2016年冬季的T2 CrCIN植物(B)：转基因CrCIN植物的照片，事件1、事件5、事件8和事件9(El、E5、E8和E9)的选择的事件在第9周的2个生长期内，和2个对照(A188 WT(野生型)和TC(转化对照))排列。在2016年的实验中没有事件1。这里显示的所有事件显示产量(生物质)显著增加。
[0084] 图4：第8周的T1 CrCIN植物生理学测量：使用爱荷华州立大学营养阶段叶片计数方法在播种后8周时比较转基因T1 CrCIN事件E9、E5和E8植物与A188和转化对照植物(n＝5)的产量比较。与A 188相比显著不同的植物(学生t检验)用星号标记，而与转化对照显著不同的植物用井号标记。
[0085] 图5：第8周的T1 CrCIN植物生理学测量：播种后8周时比较转基因T1 CrCIN事件E9、E5和E8植物与A188和转化对照植物(n＝5)的植物高度比较。与A188相比显著不同的植物(学生t检验)用星号标记，而与转化对照显著不同的植物用井号标记。
[0086] 图6：第8周的T2植物生理学测量：使用爱荷华州立大学营养阶段叶片计数方法在播种后8周时比较转基因T2 CrCIN事件E9、E5和E8植物(n＝20)与A188和转化对照植物(n＝40)的产量比较。与A188相比显著不同的植物(学生t检验)用星号标记，而与转化对照显著不同的植物用井号标记。
[0087] 图7：实验1：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：展示用25％PEG6000处理的与未处理的植物(n＝10)显示叶片的叶卷曲症状的叶片百分比的图表。所有植物在1/4强度Hoagland溶液中生长1周并然后在添加的25％PEG6000中处理1天。两个对照事件都显示出高水平的叶卷曲。事件5显示叶卷曲症状减少。事件8和事件9显示叶卷曲症状显著减少。
[0088] 图8：实验1：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：发芽后1周在1/4强度Hoagland中然后用25％PEG6000处理2天的事件8CrCIN幼苗的照片。在这里可以看出，事件8的叶片显示出比WT更少的叶卷曲症状。
[0089] 图9：实验1：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：用25％PEG6000处理2天后的代1
表性CrCIN植物相对于在/4强度Hoagland溶液中生长的对照的照片。所有植物在发芽后首先在1/4强度的Hoagland中生长1周，然后转移至25％PEG6000。
表性CrCIN植物相对于在/4强度Hoagland溶液中生长的对照的照片。所有植物在发芽后首先在1/4强度的Hoagland中生长1周，然后转移至25％PEG6000。
[0090] 图10：实验2：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：展示用25％PEG6000处理的相对于未处理的植物(n＝10)显示叶片的叶卷曲症状的叶片百分比的图表。所有植物在发芽后在1/4强度Hoagland溶液中生长1周并然后在添加的25％PEG6000中处理1天。两个对照事件均显示高水平的叶卷曲，事件5和事件9显示叶卷曲水平减少，并且事件8显示叶卷曲症状显著减少。
[0091] 图11：实验2：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：用25％PEG6000处理2天后事件8CrCIN植物的照片。在这里可以看出，事件8的叶片显示出比WT更少的叶卷曲症状。所有植物在发芽后首先在1/4强度Hoagland中生长1周，然后转移至25％PEG6000。
[0092] 图12：实验2：在模拟干旱胁迫下的CrCIN玉米幼苗：用25％PEG6000处理2天后三种代表性CrCIN植物的照片。最大的区别是事件8和事件9植物的第3叶相对于对照的第3叶的发育。所有植物在发芽后首先在1/4强度Hoagland中生长1周，然后转移至25％PEG6000。
[0093] 图13：来自小麦CrCIN转基因植物的数据：A：小麦pABM-ubi-CrCIN(Apr_氨苄青霉素抗性)的质粒图谱和B：小麦pLHAB-ubi-CrCIN的质粒图谱(aadA：大观霉素抗性，ColEl ori：用于大肠杆菌的复制起点，pVS1 REP：对于农杆菌的复制起点)。
[0094] 图14：小麦：CrCIN T1筛选，CrCIN表达：平均值±SE。使用五个生物学重复。从在温室中生长的四周龄植物的叶片来分析CrCIN表达。TaEF的表达用作内部对照。所有植物在温室中完全随机化。
[0095] 图15：CrCIN过表达不会增加温室中小麦的产量或产量相关参数。在温室生长的植物的4个首先成熟的分蘖上测量了(A)穗长、(B)每穗粒数、(C)每穗粒重和(D)粒重。显示了平均值+标准误差，N≥10个生物学重复。统计分析由双向Anova完成。其他生长参数(例如植物高度)也没有显示出任何显著差异。
[0096] 图16.CrCIN过表达不会增加田间产量。数目以在不同位置的对照植物(非转基因TAIFUN)的百分比表示。单个和多个位置的ANOVA分析未显示转基因CrCIN系和对照之间的任何显著差异。
[0097] 图17.小麦(TAIFUN)中的CrCIN过表达不会导致对于叶干质量(上图)和根干质量(下图)方面的可检测的干旱耐受表型，黑色柱：没有干旱胁迫的对照；白色柱：通过施加10％PEG模拟干旱胁迫；1、2、3：具有CrCIN过表达的转基因CrCIN系；5和6：没有CrCIN过表达的株系(对照)。
实施例
实施例
[0098] 转基因玉米植物的结果
[0099] 我们首先合成了红叶藜细胞壁转化酶(CrCIN)基因，并然后将其转化至含有来自玉米的泛素启动子(含有内含子)和35S终止子序列的穿梭载体盒中，以诱导该基因在玉米植物中的组成型过表达(图1A和B)。然后将该盒转化至含有例如除草剂基因(例如：BASTA抗性、草甘膦抗性或ALS抑制剂抗性)和大观霉素抗性基因的二元载体中，用于随后转化到根癌农杆菌中以用于农杆菌介导的植物转化至玉米(Zea mays)基因型A 188中(图1C)。
[0100] 然后通过除草剂处理选择这些随后转化的玉米胚，并再生成植物用于温室中的种子产生。从该种子批次T1培养纯合植物。已经通过RT-qPCR的方式确定了再生的纯合T1 CrCIN植物的表达水平，所述RT-qPCR展示了选择的CrCIN事件与内源对照基因ZmEF1的相对表达(图2)。未转化的A188和转化对照(用空载体转化的A188)均未显示表达，而含有CrCIN作为转基因的那些A188系显示不同水平的CrCIN表达。
[0101] 此外，主要使用叶阶段方案在温室中分析T1纯合植物的一般生理变化，所述叶阶段方案包括根据爱荷华州立大学方案计数所有叶片，包括从植物基部开始到第一个暴露叶片的所有叶片-也称为叶圈法(Abendroth et al,2011,Corn Growth and Development,Iowa State University,Available Inventory:9182)。
[0102] 叶圈法通过计数具有可见叶圈的植物上的叶片数来确定玉米中的叶片阶段，从最下面的短的圆形尖端的真叶开始，并且截止至最上面具有可见叶圈的叶片。叶圈是浅色的圈状“带”，其位于暴露的叶刃的底部，靠近叶刃与植物茎接触的位置。在这种叶片分期方法中不包括轮生体内的叶片、尚未完全展开的叶片以及没有可见叶圈的叶片。这种说法的例外情况可能是，当您在一天早时对植物分期时，可以计数几乎看不到叶圈的叶片，认识到叶圈可能在一天结束时完全可见。叶片阶段通常被描述为“V”阶段，例如，V2＝具有可见叶圈的两片叶片。叶圈法通常是美国的大学和工业农学家最广泛使用的方法。在所有显示表达的事件中，观察到与对照植物相比，CrCIN植物中的质量积累从生长的V8阶段增加直到生殖阶段(图3A)。这通过计数植物的V阶段来测量，其中转基因植物具有比对照A188植物显著更多的叶片(图4)。
[0103] 在一个实验中，还通过将叶片聚集在一起然后向上拉并测量从土壤/植物茎基部到最高叶片顶部的植物高度来测量植物高度(图5)。
[0104] 然后第二次生长从这些植物收集的T2纯合种子，并通过在温室和田间条件下确定8周生长的V阶段再次确认生物质表型(图6)。在T2植物中不再测量植物高度，因为这可以通过眼睛清楚地看到(参见图3B)。
[0105] 在水培试验中用在0.25x强度Hoagland溶液中的25％PEG6000以模拟干旱胁迫(渗透胁迫)来测试T2幼苗。在这种干旱胁迫下，玉米幼苗通常会出现严重的叶片脱水和叶卷曲症状。因此，在类似玉米的禾本科植物中的叶片可以用作对水分亏缺的明显影响的估计(O'Toole,John C,and Rolando T.Cruz."Response of leaf water potential,stomatal resistance,and leaf rolling to water stress."Plant physiology 65.3(1980):428-432.)。用在T2幼苗重复实验(实验1：图7-9：实验2：图10-12)中相比于对照A188植物和转化对照显示对PEG6000施用的耐受性增强的CrCIN事件E5、E8和E9的幼苗进行叶卷曲水平的研究(图7-12)。在这些实验中，似乎存在剂量效应，其中表达最强的事件显示最强表型。从实验中可以看出，已经引入了CrCIN核酸并且表达CrCIN的所有玉米植物在正常和干旱条件下产生增加的产量并且具有干旱耐受表型。
[0106] 转基因小麦植株的阴性结果
[0107] 使用泛素启动子(pABM-ubi-CrCIN和pLHAB-ubi-CrCIN；图13A和B)在小麦中过表达CrCIN。在温室中筛选纯合T1植物。从在温室中生长的四周龄植物的叶片分析CrCIN表达。TaEF的表达用作内部对照。所有植物在温室中完全随机化。非转基因对照(用空载体转化的TAIFUN)未显示表达，而含有CrCIN作为转基因的TAIFUN系显示不同水平的CrCIN表达。然而，与在玉米中观察到的结果相反，CrCIN在小麦中的过表达令人惊讶地不会增加温室中的产量或产量相关参数。尽管已经执行了不同类型的产量测量，例如，测量植物高度(数据未显示)、穗长(图15A)、计数每穗粒数(图15B)、测量每穗粒重(图15C)和在温室生长的植物的
4个首先成熟分蘖上测量的谷粒重量，没有已经确定显著的差异。已经在温室和田间用T2和T3系重复测量。用随机完全区组设计(RCBD)在5个不同位置重复4次进行田间试验，虽然这些试验显示与非转基因背景TAIFUN相比，产量没有显著差异(图16)。
4个首先成熟分蘖上测量的谷粒重量，没有已经确定显著的差异。已经在温室和田间用T2和T3系重复测量。用随机完全区组设计(RCBD)在5个不同位置重复4次进行田间试验，虽然这些试验显示与非转基因背景TAIFUN相比，产量没有显著差异(图16)。
[0108] 此外，小麦中的CrCIN过表达对小麦潜在的干旱耐受性没有显著影响。响应于通过施加PEG的干旱胁迫，CrCIN过表达株系和没有CrCIN过表达的对照株系之间的叶干质量或根干质量中没有可检测的差异(图17)。
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