齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途
阅读：607发布：2020-05-15
专利汇可以提供齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，该基因ScELIP1和ScELIP2具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP1，编码区长度为711bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.2，编码236个 氨 基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:3；所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP2，编码区长度为624bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.5，编码207个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6。通过 种子 萌发率实验证明：ScELIP1和ScELIP2基因能够显著提高拟南芥在红光、蓝光、UVB和高光 环境胁迫 下的萌发率；高光处理后，ScELIP1和ScELIP2基因能够在拟南芥 幼苗 中起到 光保护 作用，保护 植物 叶绿素，减少光损伤。在培育抗逆 生物 ，尤其是抗 非生物胁迫 生物品种中的应用。，下面是齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途专利的具体信息内容。
齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途
技术领域
背景技术
[0002] 光合作用是植物基础的生命过程，高光会严重影响植物生长发育和作物产量(Li et al.2009)。植物通过改变叶片方位角及叶绿素排列方式、叶黄素循环(Krishna K.Niyogi 1998)、光呼吸(陶宗娅，邹琦1999)、非光化学淬灭(Zsolt Csintalan 2000)、产生抗氧化物质(贾虎森等，2000)和光保护蛋白等保护机制都能在不同层面减轻光氧化损伤(Gill and Tuteja 2010)进而降低光抑制现象(Demmigadams and Adams 1992)。利用常规方法提高光保护能力受到复杂调控网络及周期长的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物光保护机制，发现强光下光系统II核心组分D1蛋白裂解，进而导致光反应中心光破坏，因此修复及重新合成D1蛋白是一种快速有效的修复光损伤的机制(Aro et al.2005)。通过拟南芥ape突变体证明，APE1基因在改变LHC蛋白量中起重要作用(Walters et al.2003)，使光反应中心面积变小，从而使吸收的光能变少，缓解光损伤。通过拟南芥npq突变体证明，强光导致类囊体膜pH降低，使PsbS蛋白的谷氨酸残基质子化，从而引起蛋白构象变化，能够结合玉米黄质进行叶黄素循环，进而起到光保护作用。目前，利用光保护相关基因提高植物的抗高光能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
[0003] ELIP蛋白(the early light-induced protein)即早期光诱导蛋白，属于叶绿素结合蛋白超家族(Chlorophyll a/b binding Superfamilly,CABs)，在原核和真核细胞中都有存在(Harari-Steinberg et al.2001)。ELIP蛋白是一种临时性色素结合蛋白，高光条件下，光合系统中蛋白降解，ELIP结合这些蛋白释放的色素，防止叶绿素三聚体和活性氧的形成，还可以参与叶黄素循环将多余的光能以热能的形式散失，进而行使光保护的作用，提高植物抗高光能力(Montane and Kloppstech 2000)。
[0004] ELIP蛋白最早发现于黄化豌豆幼苗转绿的过程，由于它的mRNA和蛋白产物受光强正调控且比其他光诱导蛋白出现的都早并呈现瞬时积累的特性，在叶绿体结构发育完整后消失，因此将其命名为早期光诱导蛋白(Meyer and Kloppstech 1984；Grimm and Kloppstech 1987)。自1984年发现该基因至2002年，关于ELIP的研究主要集中在高光、冷、干旱等非生物胁迫下的表达量分析，结果表明ELIP蛋白对大多数非生物胁迫都有一定程度的响应。对ELIP蛋白的表达分析研究以大麦、豌豆为主，Kloppstech等在大麦中证明ELIP受高光、冷胁迫诱导表达(Klaus Kloppstech 1997)，并且在顶端叶片中表达量比底部更高(Adamska et al.1993)；Adamska等在豌豆中证明高光、蓝光、冷诱导表达ELIP，而红光、远红光抑制ELIP表达(Adamska et al.1992)，同时ELIP表达受发育阶段调控，在开花和开花后表达量降低(Adamsk 2003)；Hutin等证明ELIP在拟南芥中也受高光、冷诱导表达，UVB会抑制ELIP蛋白表达(Hutin et al.2003)。
[0005] 自2002年至今，已从拟南芥、豌豆、大麦、烟草、杜鹃、葡萄、苜蓿、盐生杜世藻等十几种植物中分离并鉴定出响应低温、高光抗性的ELIP基因，并利用这些基因得到了抗寒性增强的转基因烟草(Zhuo et al.2013)，以及能够减少光损伤的转基因拟南芥(Tzvetkova-Chevolleau et al.2007)。但目前关于ELIP的研究主要集中于维管植物，对于苔藓的研究较少，目前关于苔藓中ELIP蛋白的报道仅见于山墙藓(Zeng et al.2002)，且研究仅局限于验证各类胁迫条件对ELIP表达调控与高等植物是否相同的层面，没有深入的基因光保护功能的研究。总体来说，目前对ELIP基因的功能研究较少，可为植物抗逆基因工程提供优质候选ELIP基因资源的基因更少。
[0006] 齿肋赤藓(Syntrichia caninervis Mitt.)隶属丛藓科赤藓属，高0.5-1.2cm，单株个体平均质量仅为0.5mg，是极端耐干藓类，是构成藓类结皮的优势种，在极端干旱和高辐射条件下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮，不仅具有较强的抗逆能力，而且在维持荒漠生态系统的稳定性和受损生态系统的恢复重建中起着重要的作用(Zhang et al.2007)。一旦遇到降水，该种20s迅速通过再水化过程而转变为鲜活的绿色，再水化过程中齿肋赤藓能够快速重组类囊体膜蛋白，并开始执行光合作用恢复生长(Li et al.2014)。同时，通过齿肋赤藓干旱复水转录组结果分析表明，该种在复水阶段能够快速上调表达光反应中心及光修复等光合相关基因(Gao et al.2014)，其独特的生理特性决定了其具有强大的光保护机制，且有很重要的研究价值，光合相关基因资源必定丰富且独特。
[0007] 综上，荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓是挖掘优良抗逆基因特别是光保护相关基因的好材料。然而，目前，对齿肋赤藓光保护ELIP基因的研究还未见报道。因此，本发明旨在从本土极端耐干荒漠苔藓中寻找、克隆新的ELIP基因，获得其编码蛋白，并对其抗逆功能特别是光保护功能进行深入分析。本发明报道的ScELIPs基因在培育抗逆性增强特别是耐高光的植物品种具有重要的实践意义。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于，提供一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，所述早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2在植物抗逆性育种中抵抗高光非生物胁迫中的应用，本发明提供的齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2，它们具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP1，编码区长度为711bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.2，编码236个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:3；所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP2，编码区长度为624bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.5，编码207个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6。通过种子萌发率实验证明：ScELIP1和ScELIP2基因能够显著提高拟南芥在红光、蓝光、UVB和高光环境胁迫下的萌发率；高光处理后，ScELIP1和ScELIP2基因能够在拟南芥幼苗中起到光保护作用，保护植物叶绿素，减少光损伤。同样，在高光处理拟南芥成苗也证明ScELIP1和ScELIP2基因具有光保护能力，能够维持更强的光合作用，更高的叶绿素含量，说明极端耐干藓类齿肋赤藓ScELIP1和ScELIP2基因具有光保护能力。可用于作物高光保护转基因育种研究。在培育抗逆生物，尤其是抗非生物胁迫生物品种中的应用。
[0009] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，所述早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2在植物抗逆性育种中抵抗高光非生物胁迫中的应用。
[0010] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，其中齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2，它们具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
[0011] 所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP1，编码区长度为711bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.2，编码236个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:3；
[0012] 所述的早期光诱导蛋白基因ScELIP2，编码区长度为624bp，其核苷酸序列SEQ ID NO.5，编码207个氨基酸，其氨基酸序列SEQ ID NO:6。
[0013] 将所示的核苷酸序列按常规方法进行植物表达载体构建，植物表达载体转化拟南芥，其中拟南芥为Atelip缺失突变体，得到转ScELIP1和ScELIP2基因的转基因株系。
[0014] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，将所示的ScELIP1和ScELIP2基因编码区核苷酸序列按常规方法进行植物表达载体构建，植物表达载体导入拟南芥，其中拟南芥为哥伦比亚型，得到具备抗逆能力的分别转ScELIP1和ScELIP2基因的转基因植株。该基因在制备植物抗逆性育种和改良的用途。
[0015] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，为苔藓植物齿肋赤藓早期光诱导蛋白ScELIP1和ScELIP2的基因，具体方法为：
[0016] 野外材料齿肋赤藓复水24h后取样，提取总RNA；
[0017] 用总RNA进行反转录得到cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到两个ELIP基因，命名为ScELIP1和ScELIP2；
[0018] 对齿肋赤藓分别进行红光、蓝光、UVA、UVB、高光处理，监测ScELIP1和ScELIP2基因的表达量；
[0019] 构建ScELIP1和ScELIP2植物表达载体pCAMBIA1301，稳定转化拟南芥，利用该系统验证这两个基因提高胁迫环境下拟南芥萌发率的情况；
[0020] 构建ScELIP1和ScELIP2植物表达载体pCAMBIA1301，稳定转化拟南芥，利用该系统验证这两个基因提高胁迫环境下拟南芥幼苗的生长发育情况；
[0021] 构建ScELIP1和ScELIP2植物表达载体pCAMBIA1301，稳定转化拟南芥，利用该系统验证这两个基因提高胁迫环境下拟南芥成苗的抗高光能力。
[0022] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，以极端耐干苔藓齿肋赤藓为材料，克隆了两个ELIP基因ScELIP1和ScELIP2，并对该基因的表达量进行了研究，同时，利用稳定转化拟南芥验证了该基因具有抗非生物胁迫尤其是抗高光的能力。
[0023] 本发明所述的一种齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途，其中苔藓植物齿肋赤藓早期光诱导蛋白ScELIP1和ScELIP2的基因为：
[0024] SEQ ID NO:1 ScELIP1基因的核苷酸序列
[0025] GTGCAGCTCTGAAGAGCTGTAGTTTCATCTCAATATTCGCTATCGATCATCTTTCGAGTACTAGAAATAGCTAGAAAGCATCAGTCATAACGTTGAAGAATCAGTCACGAAGCAGGAAGATACAGGGCTACAGTCTTCATCATGGCAGCGATGGCGTCGCAGATGAGGAATGTGTGTGCCATGACGGGAGGAGCTCTCGGAGGGATCGCCTTGCCTTCACGAAACGTGAGGACCGCGAGGATGCCCGCCCAGCTTGTGCCAGGGCGTGTGGTGCGGTGTGAGGCGTTGCCGGAGGAGAAGTACGTGAACCCGATCGACCAGGCCACGAAGAAGACCATCACGCGGGAAGAGGTGCTGCAGAACCAGGCCACGAACGAGTCGGAGCAGCGCTCCATCTTCGGCGAGAAGCCGCCGGCGGGGTCGCCCTACGGACGCCCCGAGGTGGAGCGGCGCCCGGAGACCGGCAACCTGTCGCCCTGGAGCGTGTTCGCGTTCGACGGCGCCGCGCCGGAGACGATCAACGGCCGCCTGGCTATGCTGGGATTCGTGTGGGCGATAATCGGCGAGAAGACCACCGGGCTGTCCGTGGCGGACCAGCTGTTCAGTCCCGGAGCGACGGGGTTGATCTGGTTCCTGGCGTCCGTGCAGATTCTGAGCTACGCGTCGCTGGTGCCGATCTTCAACGCGCGCGAGTCGACCGACGCACGCAGCTTCGGGCCGTTCCGAGCGAAGGCCGAGCGGTGGAACGGACGCGCCGCCATGATCGGGTTCGCGTCTCTCATCCTCACCGAGGCCATCATCCAGGGCCCGCTCTTCGTTTGGTTCTTCAACAACGCACGCTTCCCTGTCTAGATTGCCCCTATTTTTTGCAGAGCATTTTTGTACCTTAGCTCGAGTTATGTCATCGATATGAGCTGTTGAATATAAATGTACATACTTTCGATCAGAATTTTGTAGTAAATTGATTCCCACGCAAAAAATAGGGGCAATCTAGA
[0026] SEQ ID NO:2 ScELIP1基因编码区的核苷酸序列
[0027] ATGGCAGCGATGGCGTCGCAGATGAGGAATGTGTGTGCCATGACGGGAGGAGCTCTCGGAGGGATCGCCTTGCCTTCACGAAACGTGAGGACCGCGAGGATGCCCGCCCAGCTTGTGCCAGGGCGTGTGGTGCGGTGTGAGGCGTTGCCGGAGGAGAAGTACGTGAACCCGATCGACCAGGCCACGAAGAAGACCATCACGCGGGAAGAGGTGCTGCAGAACCAGGCCACGAACGAGTCGGAGCAGCGCTCCATCTTCGGCGAGAAGCCGCCGGCGGGGTCGCCCTACGGACGCCCCGAGGTGGAGCGGCGCCCGGAGACCGGCAACCTGTCGCCCTGGAGCGTGTTCGCGTTCGACGGCGCCGCGCCGGAGACGATCAACGGCCGCCTGGCTATGCTGGGATTCGTGTGGGCGATAATCGGCGAGAAGACCACCGGGCTGTCCGTGGCGGACCAGCTGTTCAGTCCCGGAGCGACGGGGTTGATCTGGTTCCTGGCGTCCGTGCAGATTCTGAGCTACGCGTCGCTGGTGCCGATCTTCAACGCGCGCGAGTCGACCGACGCACGCAGCTTCGGGCCGTTCCGAGCGAAGGCCGAGCGGTGGAACGGACGCGCCGCCATGATCGGGTTCGCGTCTCTCATCCTCACCGAGGCCATCATCCAGGGCCCGCTCTTCGTTTGGTTCTTCAACAACGCACGCTTCCCTGTCTAG
[0028] SEQ ID NO:3 ScELIP1基因编码的氨基酸序列
[0029] MAAMASQMRNVCAMTGGALGGIALPSRNVRTARMPAQLVPGRVVRCEALPEEKYVNPIDQATKKTITREEVLQNQATNESEQRSIFGEKPPAGSPYGRPEVERRPETGNLSPWSVFAFDGAAPETINGRLAMLGFVWAIIGEKTTGLSVADQLFSPGATGLIWFLASVQILSYASLVPIFNARESTDARSFGPFRAKAERWNGRAAMIGFASLILTEAIIQGPLFVWFFNNARFPV
[0030] SEQ ID NO:4 ScELIP2基因的核苷酸序列
[0031] TGCAGTCGTTGAAGTTCAGAGCTCTCGTAGTTGAATTTGCAGTTCTGTTCGCGTGTTTGTTAAGATGGCGATGACTTTGGGAGCGATGACGGCGACGACGACGGGCGCCATGTCGATGTCGTCTGTGCGCGCAAGGAATGTTGCTGTTTCTTCTCCGATGAATATCCAAGGGATGCGCTTGGGGCAGATGTCTCGTGTGTCGAGGACGCGGTGCATGGCTGTTGAGCCTGAACAGAGTAAAAGTGAGGTTGATGCTACTCCCGTCACTCCAATGGCAACTCCGGCGACACCTGCAATGGCGACTCCTTTGCCAGCCACCCCATCGCCTTCCAAGAGTAAAAAGGTGAGCACGAACTTCTTTGATGTCTTCTCTTTCGCGGGACCTGCGCCGGAAACGATCAATGGACGCTTGGCCATGCTCGGATTCACGACAGCCCTGGGAGTCGAGCTCTTCACGGGAGAAGACCTTGCCACTCAAATCGGCCTAGGCGGCGTCCAGTGGTTCATCGTCGTGGCTGCAATCTTCACTGGCGCCTCCCTTATCCCCATGTTCCGGGGTGTGACAGTGGACGACAAGTCCAAGCCCGTCTTCTCCTCTACCGCCGAGAAATGGAACGGACGCTTCGCAATGATCGGACTTGTCGCGCTTGCAATCACCGAGTTTGTGAAGGGCAGCCCACTTGTATAAATTCCTCGAACCAGGGCTTCGAAAGTAAGTATGAGGGAGATAGTATTCTGCCTTACGCCCATTGCATTGACATACAATTTCTACTTGATGTAGATAAATAGACATCATAGGAATTTTTTTTGATATAGATCTCTACTACACCTGCTGTGAACAATCCGTTTTTCCAATTCATTTTTGAACACGGATATCAGATTCCACTTTCAGCAATTCAGCAAG
[0032] SEQ ID NO:5 ScELIP2基因编码区的核苷酸序列
[0033] ATGGCGATGACTTTGGGAGCGATGACGGCGACGACGACGGGCGCCATGTCGATGTCGTCTGTGCGCGCAAGGAATGTTGCTGTTTCTTCTCCGATGAATATCCAAGGGATGCGCTTGGGGCAGATGTCTCGTGTGTCGAGGACGCGGTGCATGGCTGTTGAGCCTGAACAGAGTAAAAGTGAGGTTGATGCTACTCCCGTCACTCCAATGGCAACTCCGGCGACACCTGCAATGGCGACTCCTTTGCCAGCCACCCCATCGCCTTCCAAGAGTAAAAAGGTGAGCACGAACTTCTTTGATGTCTTCTCTTTCGCGGGACCTGCGCCGGAAACGATCAATGGACGCTTGGCCATGCTCGGATTCACGACAGCCCTGGGAGTCGAGCTCTTCACGGGAGAAGACCTTGCCACTCAAATCGGCCTAGGCGGCGTCCAGTGGTTCATCGTCGTGGCTGCAATCTTCACTGGCGCCTCCCTTATCCCCATGTTCCGGGGTGTGACAGTGGACGACAAGTCCAAGCCCGTCTTCTCCTCTACCGCCGAGAAATGGAACGGACGCTTCGCAATGATCGGACTTGTCGCGCTTGCAATCACCGAGTTTGTGAAGGGCAGCCCACTTGTATAA
[0034] SEQ ID NO:6 ScELIP2基因编码的氨基酸序列
[0035] MAMTLGAMTATTTGAMSMSSVRARNVAVSSPMNIQGMRLGQMSRVSRTRCMAVEPEQSKSEVDATPVTPMATPATPAMATPLPATPSPSKSKKVSTNFFDVFSFAGPAPETINGRLAMLGFTTALGVELFTGEDLATQIGLGGVQWFIVVAAIFTGASLIPMFRGVTVDDKSKPVFSSTAEKWNGRFAMIGLVALAITEFVKGSPLV。附图说明
[0036] 图1为本发明齿肋赤藓ELIP基因RT-PCR扩增电泳图，其中1：cDNA为模板的扩增ScELIP1基因的三个重复；2：cDNA为模板的扩增ScELIP2基因的三个重复；M：分子量Maker DL2000。
[0037] 图2为本发明齿肋赤藓ScELIP1和ScELIP2基因构建到pCAMBIA载体后转化农杆菌的菌液PCR图，其中泳道1-5为ScELIP1基因的五个农杆菌阳性菌株；泳道6-10为ScELIP2基因的五个农杆菌阳性菌株；M：分子量Maker DL2000。
[0038] 图3为本发明ScELIP1和ScELIP2基因转化拟南芥后阳性苗筛选图，其中圆圈内是长出真叶的阳性转基因植株。
[0039] 图4为本发明ScELIP1和ScELIP2基因转基因拟南芥RT-PCR扩增电泳图，其中图A：转ScELIP1基因拟南芥阳性鉴定；图B：转ScELIP2基因拟南芥阳性鉴定。
[0040] 图5为本发明ScELIP1和ScELIP2基因转基因拟南芥RT-qPCR分析表达量图。
[0041] 图6为本发明ScELIP1和ScELIP2基因在UVA、UVB、红光、蓝光、高光胁迫下的相对表达量分析，其中a为UVA，b为UVB，c为红光，d为蓝光，e为高光处理。
[0042] 图7为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株在红光、蓝光、UVB、高光胁迫下的种子萌发率统计分析图，其中a为对照，b为红光，c为蓝光，d为UVB，e为高光，1为ScELIP1基因，2为ScELIP2基因。
[0043] 图8为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株幼苗在对照、红光、蓝光、UVB处理后状态观察图，其中a为对照，b为红光，c为蓝光，d为UVB，1为ScELIP1基因，2为ScELIP2基因。
[0044] 图9为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株幼苗在对照、红光、蓝光、UVB处理后根长、叶片数、侧根数及叶绿素含量分析，其中a为根长，b为侧根数，c为叶片数，d为叶绿素含量。
[0045] 图10为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株幼苗经高光处理后状态观察及叶绿素含量分析，其中a为ScELIP1，b为ScELIP2，c为叶绿素含量。
[0046] 图11为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株成苗在高光处理不同时间段结果观察图，其中A为WT，B为Atelip突变体，C为ScELIP1-line1，D为ScELIP1-line2，E为ScELIP1-line3，F为ScELIP2-line1，G为ScELIP2-line2，H为ScELIP2-line3，横向第一排为处理前，横向第二排为高光处理3天，横向第三排为高光处理3周。
[0047] 图12为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株成苗在高光处理不同时间段光合相关指标统计分析，其中a为Fv/Fm，b为Y(Ⅱ)，c为ETR。
[0048] 图13为本发明ScELIP1和ScELIP2转基因植株成苗在高光处理不同时间段叶绿素含量分析，其中a为叶绿素a加b(chla+chlb)，b为类胡萝卜素(car)，c为叶绿素a(chla)，d为叶绿素b(chlb)，e为chlb/chla，f为car/chl。
具体实施方式
[0049] 以下结合实施例对本发明做进一步阐述。
[0050] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规实验操作进行，如《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G塞德曼主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行：
[0051] 实施例1
[0052] 齿肋赤藓早期光诱导蛋白ScELIP1和ScELIP2基因的克隆：
[0053] 植物材料的获得：
[0054] 本试验中的植物材料为古尔班通古特沙漠生长状态良好且长势一致的齿肋赤藓放入牛皮纸袋干燥保存，所有实验开始前需先加入无菌水复水24h，用无菌水反复冲洗，直至将沙子等杂质清洗干净为止，用滤纸吸去多余的水分，用于后续实验；
[0055] 齿肋赤藓总RNA的提取和反转录：
[0056] RNA提取用TAKARA的RNAiso reagent试剂，具体步骤按说明书进行。经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定后，完整性和纯度都较好的RNA样本可用于下游反转录实验，用1μg RNA进行反转录，反转录试剂是TAKARA的PrimerScript RT-PCR试剂盒，反转录反应如下：
[0057]
[0058] 反转录反应条件为：温度37℃，时间30min；温度85℃，时间5s；
[0059] cDNA全长序列的获得：
[0060] ScELIP1和ScELIP2基因用特异引物扩增：
[0061] 根据ScELIP1和ScELIP2基因设计特异引物序列见下表1：
[0062]
[0063] PCR体系如下：
[0064]
[0065] 反应条件：温度95℃,时间5min；温度94℃，时间30s；温度56℃,时间30s；温度72℃,时间30s；温度72℃,时间7min；30个循环；
[0066] 反应完毕后，电泳检测并分别回收约995bp和904bp的片段，与预期目的片段大小一致，将所得片段连接pMD19-T克隆载体，操作步骤参照TAKARA公司产品pMD19-T vector说明书进行，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定后，送阳性克隆进行序列测定，保守片段的核苷酸序列结果见SEQ ID NO:1：
[0067] GTGCAGCTCTGAAGAGCTGTAGTTTCATCTCAATATTCGCTATCGATCATCTTTCGAGTACTAGAAATAGCTAGAAAGCATCAGTCATAACGTTGAAGAATCAGTCACGAAGCAGGAAGATACAGGGCTACAGTCTTCATCATGGCAGCGATGGCGTCGCAGATGAGGAATGTGTGTGCCATGACGGGAGGAGCTCTCGGAGGGATCGCCTTGCCTTCACGAAACGTGAGGACCGCGAGGATGCCCGCCCAGCTTGTGCCAGGGCGTGTGGTGCGGTGTGAGGCGTTGCCGGAGGAGAAGTACGTGAACCCGATCGACCAGGCCACGAAGAAGACCATCACGCGGGAAGAGGTGCTGCAGAACCAGGCCACGAACGAGTCGGAGCAGCGCTCCATCTTCGGCGAGAAGCCGCCGGCGGGGTCGCCCTACGGACGCCCCGAGGTGGAGCGGCGCCCGGAGACCGGCAACCTGTCGCCCTGGAGCGTGTTCGCGTTCGACGGCGCCGCGCCGGAGACGATCAACGGCCGCCTGGCTATGCTGGGATTCGTGTGGGCGATAATCGGCGAGAAGACCACCGGGCTGTCCGTGGCGGACCAGCTGTTCAGTCCCGGAGCGACGGGGTTGATCTGGTTCCTGGCGTCCGTGCAGATTCTGAGCTACGCGTCGCTGGTGCCGATCTTCAACGCGCGCGAGTCGACCGACGCACGCAGCTTCGGGCCGTTCCGAGCGAAGGCCGAGCGGTGGAACGGACGCGCCGCCATGATCGGGTTCGCGTCTCTCATCCTCACCGAGGCCATCATCCAGGGCCCGCTCTTCGTTTGGTTCTTCAACAACGCACGCTTCCCTGTCTAGATTGCCCCTATTTTTTGCAGAGCATTTTTGTACCTTAGCTCGAGTTATGTCATCGATATGAGCTGTTGAATATAAATGTACATACTTTCGATCAGAATTTTGTAGTAAATTGATTCCCACGCAAAAAATAGGGGCAATCTAGA
[0068] 和SEQ ID NO:4：
[0069] TGCAGTCGTTGAAGTTCAGAGCTCTCGTAGTTGAATTTGCAGTTCTGTTCGCGTGTTTGTTAAGATGGCGATGACTTTGGGAGCGATGACGGCGACGACGACGGGCGCCATGTCGATGTCGTCTGTGCGCGCAAGGAATGTTGCTGTTTCTTCTCCGATGAATATCCAAGGGATGCGCTTGGGGCAGATGTCTCGTGTGTCGAGGACGCGGTGCATGGCTGTTGAGCCTGAACAGAGTAAAAGTGAGGTTGATGCTACTCCCGTCACTCCAATGGCAACTCCGGCGACACCTGCAATGGCGACTCCTTTGCCAGCCACCCCATCGCCTTCCAAGAGTAAAAAGGTGAGCACGAACTTCTTTGATGTCTTCTCTTTCGCGGGACCTGCGCCGGAAACGATCAATGGACGCTTGGCCATGCTCGGATTCACGACAGCCCTGGGAGTCGAGCTCTTCACGGGAGAAGACCTTGCCACTCAAATCGGCCTAGGCGGCGTCCAGTGGTTCATCGTCGTGGCTGCAATCTTCACTGGCGCCTCCCTTATCCCCATGTTCCGGGGTGTGACAGTGGACGACAAGTCCAAGCCCGTCTTCTCCTCTACCGCCGAGAAATGGAACGGACGCTTCGCAATGATCGGACTTGTCGCGCTTGCAATCACCGAGTTTGTGAAGGGCAGCCCACTTGTATAAATTCCTCGAACCAGGGCTTCGAAAGTAAGTATGAGGGAGATAGTATTCTGCCTTACGCCCATTGCATTGACATACAATTTCTACTTGATGTAGATAAATAGACATCATAGGAATTTTTTTTGATATAGATCTCTACTACACCTGCTGTGAACAATCCGTTTTTCCAATTCATTTTTGAACACGGATATCAGATTCCACTTTCAGCAATTCAGCAAG
[0070] RT-PCR获得基因编码区：
[0071] 将测序得到的约995bp和904bp的序列在NCBI里比对，比对结果显示，从齿肋赤藓克隆得到的ELIP片段含有ELIP基因的保守结构域，且该序列与小立碗藓，拟南芥等模式植物ELIP序列相似性高，因此这两条序列为基础，设计引物，引物序列如表2：
[0072]
[0073] PCR反应体系同上，PCR反应条件：温度95℃，时间5min；温度94℃，时间30s；温度56℃，时间30s；温度72℃，时间30s；温度72℃，时间5min；34个循环；序列扩增产物电泳结果如图1，第一道是分子量marker，1是cDNA为模板的扩增ScELIP1的三个重复，2是以DNA为模板的扩增ScELIP2的三个重复，由电泳图可以看出以齿肋赤藓cDNA为模板扩增的片段大小一致，ScELIP1为700bp左右，ScELIP2为600bp左右，对扩增片段按照上述方法进行克隆和测序；
[0074] 序列分析：
[0075] 序列分析表明从齿肋赤藓中克隆的两个基因是ELIP基因(图1)，ScELIP1基因开放阅读框长711bp,编码236个氨基酸，ScELIP2基因开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸，ScELIP1基因编码区的核苷酸序列见SEQ ID NO:2：
[0076] ATGGCAGCGATGGCGTCGCAGATGAGGAATGTGTGTGCCATGACGGGAGGAGCTCTCGGAGGGATCGCCTTGCCTTCACGAAACGTGAGGACCGCGAGGATGCCCGCCCAGCTTGTGCCAGGGCGTGTGGTGCGGTGTGAGGCGTTGCCGGAGGAGAAGTACGTGAACCCGATCGACCAGGCCACGAAGAAGACCATCACGCGGGAAGAGGTGCTGCAGAACCAGGCCACGAACGAGTCGGAGCAGCGCTCCATCTTCGGCGAGAAGCCGCCGGCGGGGTCGCCCTACGGACGCCCCGAGGTGGAGCGGCGCCCGGAGACCGGCAACCTGTCGCCCTGGAGCGTGTTCGCGTTCGACGGCGCCGCGCCGGAGACGATCAACGGCCGCCTGGCTATGCTGGGATTCGTGTGGGCGATAATCGGCGAGAAGACCACCGGGCTGTCCGTGGCGGACCAGCTGTTCAGTCCCGGAGCGACGGGGTTGATCTGGTTCCTGGCGTCCGTGCAGATTCTGAGCTACGCGTCGCTGGTGCCGATCTTCAACGCGCGCGAGTCGACCGACGCACGCAGCTTCGGGCCGTTCCGAGCGAAGGCCGAGCGGTGGAACGGACGCGCCGCCATGATCGGGTTCGCGTCTCTCATCCTCACCGAGGCCATCATCCAGGGCCCGCTCTTCGTTTGGTTCTTCAACAACGCACGCTTCCCTGTCTAG
[0077] ScELIP2基因编码区的核苷酸序列见SEQ ID NO:5：
[0078] TGCAGTCGTTGAAGTTCAGAGCTCTCGTAGTTGAATTTGCAGTTCTGTTCGCGTGTTTGTTAAGATGGCGATGACTTTGGGAGCGATGACGGCGACGACGACGGGCGCCATGTCGATGTCGTCTGTGCGCGCAAGGAATGTTGCTGTTTCTTCTCCGATGAATATCCAAGGGATGCGCTTGGGGCAGATGTCTCGTGTGTCGAGGACGCGGTGCATGGCTGTTGAGCCTGAACAGAGTAAAAGTGAGGTTGATGCTACTCCCGTCACTCCAATGGCAACTCCGGCGACACCTGCAATGGCGACTCCTTTGCCAGCCACCCCATCGCCTTCCAAGAGTAAAAAGGTGAGCACGAACTTCTTTGATGTCTTCTCTTTCGCGGGACCTGCGCCGGAAACGATCAATGGACGCTTGGCCATGCTCGGATTCACGACAGCCCTGGGAGTCGAGCTCTTCACGGGAGAAGACCTTGCCACTCAAATCGGCCTAGGCGGCGTCCAGTGGTTCATCGTCGTGGCTGCAATCTTCACTGGCGCCTCCCTTATCCCCATGTTCCGGGGTGTGACAGTGGACGACAAGTCCAAGCCCGTCTTCTCCTCTACCGCCGAGAAATGGAACGGACGCTTCGCAATGATCGGACTTGTCGCGCTTGCAATCACCGAGTTTGTGAAGGGCAGCCCACTTGTATAAATTCCTCGAACCAGGGCTTCGAAAGTAAGTATGAGGGAGATAGTATTCTGCCTTACGCCCATTGCATTGACATACAATTTCTACTTGATGTAGATAAATAGACATCATAGGAATTTTTTTTGATATAGATCTCTACTACACCTGCTGTGAACAATCCGTTTTTCCAATTCATTTTTGAACACGGATATCAGATTCCACTTTCAGCAATTCAGCAAG
[0079] ScELIP1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列
[0080] MAAMASQMRNVCAMTGGALGGIALPSRNVRTARMPAQLVPGRVVRCEALPEEKYVNPIDQATKKTITREEVLQNQATNESEQRSIFGEKPPAGSPYGRPEVERRPETGNLSPWSVFAFDGAAPETINGRLAMLGFVWAIIGEKTTGLSVADQLFSPGATGLIWFLASVQILSYASLVPIFNARESTDARSFGPFRAKAERWNGRAAMIGFASLILTEAIIQGPLFVWFFNNARFPV
[0081] ScELIP2基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列
[0082] MAMTLGAMTATTTGAMSMSSVRARNVAVSSPMNIQGMRLGQMSRVSRTRCMAVEPEQSKSEVDATPVTPMATPATPAMATPLPATPSPSKSKKVSTNFFDVFSFAGPAPETINGRLAMLGFTTALGVELFTGEDLATQIGLGGVQWFIVVAAIFTGASLIPMFRGVTVDDKSKPVFSSTAEKWNGRFAMIGLVALAITEFVKGSPLV。
[0083] 实施例2
[0084] 不同胁迫环境下ScELIP1和ScELIP2表达量分析：
[0085] 不同的胁迫处理：
[0086] 准备所述复水24h的齿肋赤藓，分别放在红光、蓝光、UVA、UVB、高光光源下照射后取样，提取RNA，反转录cDNA方法，红光光强100μmol/m2/s，红光照射0h，2h，4h，另外先红光照射2h后蓝光照射2h，在这些时间点分别测定表达量；蓝光光强100μmol/m2/s，蓝光照射0h，2h，4h，另外先蓝光照射2h后红光照射2h，在这些时间点分别测定表达量；分别用光强10μmol/m2/s的UVA、UVB照射0h，1h，2h，4h，12h后测定表达量；高光处理是用5种不同强度的光照0，60，225，750，1500μmol/m2/s照射齿肋赤藓2h后分别测定表达量；
[0087] 结果如图6所示，ScELIP1和ScELIP2的表达量随着光照强度的升高不断提高，2
ScELIP2的表达量在1500μmol/m/s时达到最高值；ScELIP1和ScELIP2对UVA、UVB胁迫均有相应，但ScELIP1对UVA的响应微弱且有瞬时性，而ScELIP2对UVA的响应比ScELIP1晚，但反应明显且持久；ScELIP1对UVB的响应速度比ScELIP2慢，但程度高。ScELIP2对红光的响应比ScELIP1早且明显，蓝光能促进红光的诱导作用；蓝光对二者的诱导模式一直，且红光对蓝光的诱导作用有抑制性，这些说明ScELIPs基因响应各种光照胁迫。
ScELIP2的表达量在1500μmol/m/s时达到最高值；ScELIP1和ScELIP2对UVA、UVB胁迫均有相应，但ScELIP1对UVA的响应微弱且有瞬时性，而ScELIP2对UVA的响应比ScELIP1晚，但反应明显且持久；ScELIP1对UVB的响应速度比ScELIP2慢，但程度高。ScELIP2对红光的响应比ScELIP1早且明显，蓝光能促进红光的诱导作用；蓝光对二者的诱导模式一直，且红光对蓝光的诱导作用有抑制性，这些说明ScELIPs基因响应各种光照胁迫。
[0088] 实施例3
[0089] ScELIP1和ScELIP2基因提高种子萌发率：
[0090] ScELIP1和ScELIP2转基因株系的获得：
[0091] 设计带酶切位点KpnI和XbalI的ScELIP1引物，以pMD19-T-ScELIP1质粒为模板引入带酶切位点的ScELIP1基因，构建到pMD19-T-simple载体，测序，将测序正确的转化子质粒和植物表达载体pCAMBIA1301共同双酶切，回收，连接，转化，测序鉴定,得到构建正确的植物表达载体pCAMBIA1301-ScELIP1，将该载体转化农杆菌EHA105感受态，农杆菌菌液PCR筛选阳性菌株，结果如图2所示，泳道1-5为ScELIP1基因的五个农杆菌阳性菌株；泳道6-10为ScELIP2基因的五个农杆菌阳性菌株。用浸花法将目的基因ScELIP1转入拟南芥，用含有潮霉素的培养基筛选转基因阳性株系，结果如图3所示，圆圈中标出的是长出真叶的阳性株系。用RT-PCR进一步验证阳性转基因株系，结果如图4，ScELIP1和ScELIP2各选3个株系继代用于萌发率，幼苗及成苗实验，ScELIP2转基因株系的构建构成与ScELIP1相同；
[0092] ScELIP1和ScELIP2转基因株系萌发率检测：
[0093] 将野生型WT，突变体Atelip及ScELIP1和ScELIP2转基因株系各2个的种子，分别用3％次氯酸钠消毒5min，无菌水清洗5遍后播种于无菌的1/2MS固体培养基，温度4℃春化2天，接着每天统计萌发率，如图7所示，结果表明，在红光、蓝光、高光胁迫环境下，ScELIP1和ScELIP2基因能够显著提高种子萌发速率，说明ScELIP1和ScELIP2基因具有抗逆功能。
[0094] 实施例4
[0095] ScELIP1和ScELIP2转基因株系幼苗不同胁迫处理：
[0096] 不同的胁迫处理：
[0097] ScELIP1和ScELIP2转基因株系构建过程如上所述。将7天大小的野生型WT，突变体Atelip及ScELIP1和ScELIP2转基因株系在对照、红光、蓝光、UVB环境中生长，一周后观察表型，统计根长、叶片数、侧根数，测定叶绿素，如图8所示：红光处理后叶片变小、变黄；蓝光处理后幼苗根系发达，叶片较红光、UVB处理后长势更好；UVB处理后幼苗整体长势弱，如图9所示：红光、蓝光、UVB处理后幼苗根长相比对照显著变短，UVB处理尤其明显；蓝光处理后侧根数显著提高，甚至比对照高；红光和UVB处理后叶片数显著降低，蓝光处理变化不大；三种处理后叶绿素含量都明显降低，其中红光处理后含量最低。
[0098] 实施例5
[0099] ScELIP1和ScELIP2转基因株系幼苗高光处理：
[0100] 将构建的ScELIP1和ScELIP2转基因株系7天大小的野生型WT，突变体Atelip及ScELIP1和ScELIP2转基因株系在高光(1500μmol/m2/s)环境中照射2h，转移到正常条件下恢复24h后，观察表型，测定叶绿素含量，如图10所示：ScELIP1和ScELIP2转基因株系受光损伤程度更低，相比于突变体和野生型叶绿素含量也更高。
[0101] 实施例6
[0102] ScELIP1和ScELIP2转基因株系成苗高光处理：
[0103] 将构建ScELIP1和ScELIP2转基因株系4周大小的野生型WT，突变体Atelip及ScELIP1和ScELIP2转基因株系在高光(1000μmol/m2/s)环境中处理，在处理前、处理3天、处理3周分别观察表型，测定光合指标、叶绿素含量以及光合相关基因表达量，如图11所示，ScELIP1和ScELIP2转基因株系在高光处理前长势一致，处理3天后，突变体Atelip叶片颜色比野生型和转基因株系更深，说明受光损伤程度更严重，处理3周后，大部分叶片已变白，叶绿素降解，不过转基因叶片明显比突变体更绿，因此ScELIP1和ScELIP2基因能提高植物光保护能力；如图12结果所示，ScELIP1和ScELIP2转基因株系经高光处理后Fv/Fm，Y(Ⅱ)，ETR值都明显高于突变体，说明转化ScELIP1和ScELIP2基因后植株光合效率更强，光抑制更弱，因此ScELIP1和ScELIP2基因能够在高光环境下更有效的维持植物光合能力；如图13结果所示，ScELIP1和ScELIP2转基因植株成苗在高光处理后叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素含量更高，ScELIP1和ScELIP2两个基因在转基因株系起到保护叶绿素的功能，同时chlb/chla，car/chl值也比突变体高，再次验证ScELIP1和ScELIP2基因光保护能力更强。
[0104] 综上所述，通过转基因拟南芥初步验证了从荒漠极端耐干藓类齿肋赤藓中克隆得到的ScELIP1和ScELIP2因具有抗高光的特性，在植物抗逆基因工程育种方面具有重大的潜能。
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