一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用专利检索-非生物胁迫作物管理专利检索查询-专利查询网

一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用

阅读：75发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用，属于植物基因工程技术领域，所述基因ZmCASPL2B2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述ZmCASPL2B2基因具有调控玉米叶表皮蜡质结构的功能，通过调控叶表皮蜡质结构，进而影响叶面水分的散失以及非生物胁迫的抗性；本发明通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述ZmCASPL2B2基因的功能，为玉米育种提供宝贵的基因资源。，下面是一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种调控玉米叶表皮蜡质结构的ZmCASPL2B2基因，其特征在于，所述基因ZmCASPL2B2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.扩增权利要求1所述ZmCASPL2B2基因的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因或权利要求2所述的蛋白质在调控植物叶表皮蜡质结构中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米。
6.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因或权利要求2所述的蛋白质在调控玉米叶表皮通透性中的应用。
7.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因或权利要求2所述的蛋白质在提高玉米耐旱性能中的应用。
8.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因或权利要求2所述的蛋白质在提高玉米耐盐性能中的应用。
9.权利要求1所述的ZmCASPL2B2基因或权利要求2所述的蛋白质在玉米育种中的应用。

说明书全文

一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋

白质和应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

[0002] 干旱和盐胁迫是影响植物生产的两大主要的非生物胁迫。植物主要通过改变代谢、生理以及生长发育来响应这些胁迫，最大程度地降低这些胁迫对于自身生长发育的影响(Qin,T.and Zhao,H.(2017)ANucleus-Localized Long Non-Coding RNA Enhances Drought and Salt Stress Tolerance.175,1321-1336)。由于干旱胁迫和盐胁迫都能够引起细胞的脱水以及渗透胁迫，因此植物响应这两种胁迫的机制也颇为相似，主要包括；一方面通过抑制侧根的生长来维持主根的生长，保证吸收深层的水分(Xiong,L.,Wang,R.G.,Mao,G.and Koczan,J.M.(2006)Identification of drought tolerance determinants by genetic analysis of root response to drought stress and abscisic Acid.Plant physiology,142,1065-1074.)；另一方面通过调节表皮结构以及气孔的开关来减少水分的散失(Wu,Q.,Wang,M.,Shen,J.,Chen,D.,Zheng,Y.and Zhang,W.(2019)ZmOST1 mediates abscisic acid regulation of guard cell ion channels and drought stress responses.Journal of integrative plant biology,61,478-491.)。在陆生植物的进化过程中，半通透性的表皮的进化是至关重要的一步，它不仅有效地阻止了植物水分的散失，同时也能够通过气孔完成气体的交换过程。(Jenks,M.A.,Joly,R.J.,Peters,P.J.,Rich,P.J.,Axtell,J.D.and Ashworth,E.N.(1994)Chemically Induced Cuticle Mutation Affecting Epidermal Conductance to Water Vapor and Disease Susceptibility in Sorghum bicolor(L.)Moench.Plantphysiology,105,1239-1245.)。就像木质化是次生细胞壁的修饰，植物表皮层可以认为是细胞壁的脂质化修饰。(Yeats,T.H.and Rose,J.K.(2013)The formation and function of plant
cuticles.Plantphysiology,163,5-20.)。基于组织染色情况以及化学成分组成，植物表皮层又可以被细化为两个结构：被多糖包埋富含角质的角质层，以及覆盖在表层富含蜡质的蜡质层(Nawrath,C.(2006)Unraveling the complex network of cuticular structure and function.Current opinion inplant biology,9,281-287.)。其中角质主要由16个碳至18个碳的1,2,3-羟基脂肪酸，通过酯链和醚链联结的脂肪性物质所组成。(Pollard,M.,Beisson,F.,Li,Y.and Ohlrogge,J.B.(2008)Building lipid barriers:biosynthesis of cutin and suberin.Trends in plant science,13,236-246.).表皮蜡质主要由长链脂肪酸组成(VLCFAs；C20–C34)，主要包括：烷烃、醛、醇、酮、酯等。大多数被鉴定到的蜡质缺陷突变体是由于表皮蜡质的减少造成的，包括：osgl1-1、wsl2、oswr1、abcg11、and cer2等，这些突变往往造成植株形态以及叶表皮通透性的改变(Wang,Y.,Wan,L.,Zhang,L.,Zhang,Z.,Zhang,H.,Quan,R.,Zhou,S.and Huang,R.(2012)An ethylene response factor OsWR1 responsive to drought stress transcriptionally activates wax synthesis related genes and increases wax production in rice.Plant molecular biology,
78,275-288.)。然而，不规则的表皮蜡质的分布所造成的表皮蜡质层结构的缺陷也能够影响到叶表皮通透性，例如：wdl1、shine、knb1、bcf1等(Park,J.J.,Jin,P.,Yoon,J.,Yang,J.I.,Jeong,H.J.,Ranathunge,K.,Schreiber,L.,Franke,R.,Lee,I.J.and An,G.(2010)Mutation in Wilted Dwarf and Lethal 1(WDL1)causes abnormal cuticle formation and rapid water loss in rice.Plant molecular biology,74,91-103.)。拟南芥以及水稻中所鉴定到的蜡质缺陷突变体通常表现出较快的叶绿素浸出速率以及叶片的失水速率、较低的叶表温度以及较强的干旱敏感性(Mao,B.,Cheng,Z.,Lei,C.,Xu,F.,Gao,S.,Ren,Y.,Wang,J.,Zhang,X.,Wang,J.,Wu,F.,Guo,X.,Liu,X.,Wu,C.,Wang,H.and Wan,J.(2012)Wax crystal-sparse leaf2,a rice homologue of WAX2/GL1,is involved in synthesis of leaf cuticular wax.Planta,235,39-52.)。另外，有些表皮蜡质缺陷突变体也可能造成叶片形态的改变(Moose,S.P.and Sisco,P.H.(1994)Glossy15 Controls the Epidermal Juvenile-to-Adult Phase Transition in Maize.ThePlantcell,6,
1343-1355.)。因此鉴定和克隆控制表皮蜡质合成以及积累相关基因，不仅有利于解析控制表皮蜡质组成以及结构的遗传机制，也为干旱以及盐胁迫等非生物胁迫研究提供宝贵的基因资源。

[0003] 在玉米中，据报道有三十多个glossy(gl)突变体表皮蜡质的积累发生改变(Li,L.,Li,D.,Liu,S.,Ma,X.,Dietrich,C.R.,Hu,H.C.,Zhang,G.,Liu,Z.,Zheng,J.,Wang,G.and Schnable,P.S.(2013)The maize glossy13 gene,cloned via BSR-Seq and Seq-walking encodes a putative ABC transporter required for the normal accumulation of epicuticular waxes.PloS one,8,e82333.)，然而，只有少数几个位点被克隆。被鉴定到的这些基因编码不同种类的蛋白，包括蜡质合成相关的酶、转录因子、以及转运蛋白等。GL1和GL2,分别是拟南芥中的CER3和CER2的同源基因，编码叶表皮蜡质合成相关酶类(Tacke,E.,Korfhage,C.,Michel,D.,Maddaloni,M.,Motto,M.,Lanzini,S.,Salamini,F.and Doring,H.P.(1995)Transposon tagging of the maize Glossy2 locus with the transposable element En/Spm.The Plant journal:for cell and molecular biology,8,907-917.,Hansen,J.D.,Pyee,J.,Xia,Y.,Wen,T.J.,Robertson,D.S.,Kolattukudy,P.E.,Nikolau,B.J.and Schnable,P.S.(1997)The glossy1 locus of maize and an epidermis-specific cDNA from Kleinia odora define a class of receptor-like proteins required for the normal accumulation of cuticular waxes.Plantphysiology,113,1091-1100.)；GL4和GL8，分别编码冷凝酶和β酮脂酰还原酶，在长链脂肪酸的合成过程中发挥着重要功能(Xu,X.,Dietrich,C.R.,Delledonne,M.,Xia,Y.,Wen,T.J.,Robertson,D.S.,Nikolau,B.J.and Schnable,P.S.(1997)Sequence analysis ofthe cloned glossy8 gene of maize suggests that it may code for a beta-ketoacyl reductase required for the biosynthesis of cuticular waxes.Plantphysiology,115,501-510.,Liu,S.,Dietrich,C.R.and Schnable,P.S.(2009)DLA-based strategies for cloning insertion mutants:cloning the gl4 locus ofmaize using Mu transposon tagged alleles.Genetics,183,1215-1225.)；GL3和GL15，分别编码MYB和AP2转录因子，它们通过调节蜡质合成相关基因的表达来调节表皮蜡质合成(Moose,S.P.and Sisco,P.H.(1994)Glossy15Controls the Epidermal Juvenile-to-Adult Phase Transition in Maize.The Plant cell,6,1343-1355.,Liu,S.,Yeh,C.T.,Tang,H.M.,Nettleton,D.and Schnable,P.S.(2012)Gene mapping via bulked segregant RNA-Seq(BSR-Seq).PloS one,7,e36406.)；GL6和GL13分别编码DUF538结构域蛋白以及ABC转运蛋白，参与着表皮蜡质的胞内转运(Li,L.,Du,Y.,He,C.,Dietrich,C.R.,Li,J.,Ma,X.,Wang,R.,Liu,Q.,Liu,S.,Wang,G.,Schnable,P.S.and Zheng,J.(2019a)The maize glossy6 gene is involved in cuticularwax deposition and drought tolerance.Journal of experimental botany.,Li,L.,Du,Y.,He,C.,Dietrich,C.R.,Li,J.,Ma,X.,Wang,R.,Liu,Q.,Liu,S.,Wang,G.,Schnable,P.S.and Zheng,J.(2019b)

[0004] Maize glossy6 is involved in cuticular wax deposition and drought tolerance.Journal of experimental botany,70,3089-3099.)。

[0005] 植物CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEINs(CASPs)是定位在凯氏带的一种具有四个跨膜结构域的膜蛋白，参与着凯氏带的结构的形成(Roppolo,D.,De Rybel,B.,Denervaud Tendon,V.,Pfister,A.,Alassimone,J.,Vermeer,J.E.,Yamazaki,M.,Stierhof,Y.D.,Beeckman,T.and Geldner,N.(2011)A novel protein family mediates Casparian strip formation in the endodermis.Nature,473,380-383.)。CASPs通过和分泌的过氧化物酶相互作用，来介导木质素的合成以及凯氏带的形成。Naseer,S.,Lee,Y.,Lapierre,C.,Franke,R.,Nawrath,C.and Geldner,N.(2012)Casparian strip diffusion barrier in Arabidopsis is made of a lignin polymer without suberin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109,10101-10106.,Lee,Y.,Rubio,M.C.,Alassimone,J.and Geldner,N.(2013)A mechanism for localized lignin deposition in the endodermis.Cell,153,402-412.)。在植物中，存在着CASPs的同源基因，CASP-Likes(CASPLs)，它们同样拥有着相似的结构(四个跨膜域)。在拟南芥中，CASPLs家族不同成员在各个组织中特异表达，包括毛状体、离层区域细胞、根冠细胞以及木质部细胞等。基于此，提出了一个CASPLs可能的功能假设，(1)与CASPs一样参与细胞膜骨架形成；(2)招募细胞壁修饰相关的酶类，在不同的组织部位行使着特定的功能(Roppolo,D.,Boeckmann,B.,Pfister,A.,Boutet,E.,Rubio,M.C.,Denervaud-Tendon,V.,Vermeer,J.E.,Gheyselinck,J.,Xenarios,I.and Geldner,N.(2014)Functional and Evolutionary Analysis of the CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN Family.Plant physiology,165,1709-1722.,Roppolo,D.,De Rybel,B.,Denervaud Tendon,V.,Pfister,A.,Alassimone,J.,Vermeer,J.E.,Yamazaki,M.,Stierhof,Y.D.,Beeckman,T.and Geldner,N.(2011)A novel protein family mediates Casparian strip formation in the endodermis.Nature,473,380-383.)。

[0006] 然而，目前为止，CASPLs基因家族功能研究很少有报道。因此，CASPLs家族基因的挖掘不仅能够丰富该基因家族功能的研究，同时也能够很好地验证以上假设的真实性与可靠性。

发明内容

[0007] 鉴于此，本发明的目的在于提供一种调控玉米叶表皮蜡质结构基因ZmCASPL2B2及其编码的蛋白质和应用。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0009] 本发明提供了一种调控玉米叶表皮蜡质结构的ZmCASPL2B2基因，所述ZmCASPL2B2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0010] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0011] 本发明提供了扩增所述ZmCASPL2B2基因的引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0012] 本发明提供了所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质在调控植物叶表皮蜡质结构中的应用。

[0013] 优选的，所述植物包括玉米。

[0014] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在调控玉米叶表皮通透性中的应用。

[0015] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在提高玉米耐旱性能中的应用。

[0016] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在提高玉米耐盐性能中的应用。

[0017] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在玉米育种中的应用。

[0018] 本发明的有益效果：本发明提供的调控玉米叶表皮蜡质结构的ZmCASPL2B2基因，来源于玉米植株的自然突变体；所述ZmCASPL2B2基因具有调控玉米叶表皮蜡质结构的功能，所述ZmCASPL2B2基因通过调控叶表皮蜡质结构，进而影响叶面水分的散失以及非生物胁迫的抗性；所述ZmCASPL2B2基因属于玉米CASP LIKE家族成员，是CASPs家族的同源基因，所述CASP LIKE家族基因的功能没有被报道过；本发明通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述ZmCASPL2B2基因的功能，为玉米育种提供了宝贵的基因资源。附图说明

[0019] 图1为zmcaspl2b2突变体表型鉴定，其中(a)成株期的WT以及zmcaspl2b2植株，(b)穗位叶形态，(c)叶片的横截面，(d-e)展开最大叶片宽度(MLW；d)，以及自然叶片宽度(NLW；e)，(f)卷叶指数(LRI)，(g-h)雌穗(g)以及雄穗(h)表型，(i)穗长(EL)，(j)穗粒重(KWPE)，(k)雄穗长(TL)，(l)雄穗分枝数(TBN)；数据展示以平均值±SD。Student’s t-test用于差异显著性分析，***代表p<0.001；

[0020] 图2为叶片的显微结构，其中(a-b)野生型(a)与突变体zmcaspl2b2(b)叶片横截面，BC为泡状细胞，(c-d)苗期野生型(c)及突变体zmcaspl2b2(d)叶片上表皮蜡质结构扫描电镜观察，箭头指示叶表皮蜡质结构，(e-f)野生型(e)及突变体zmcaspl2b2(f)叶片表皮的透射电镜观察；虚线所示区域为蜡质层结构，箭头指示蜡质层缺陷区域；其中CW为细胞壁；WL为蜡质层。

[0021] 图3为叶表皮蜡成分分析，其中(a)野生型以及突变体zmcaspl2b2三叶期表皮蜡总成分分析，(b)野生型以及突变体zmcaspl2b2表皮蜡单体成分分析；AK为烷烃；FA为脂肪酸；PA为初级醇；AH为荃；数据展示以平均值±SD；Student’s t-test用于差异显著性分析；**代表p<0.001；NS，差异不显著；

[0022] 图4为野生型以及突变体zmcaspl2b2气孔密度以及气孔运动，其中(a-b)野生型(a)与突变体zmcaspl2b2(b)叶表皮细胞；(c)为每个视野中气孔的数目；(d–e)在无添加ABA缓冲液中的野生型(d)以及突变体zmcaspl2b2(e)气孔状态；(f)无添加ABA缓冲液中的气孔孔径大小；(g-h)在50mM ABA缓冲液中的野生型(g)以及突变体zmcaspl2b2(h)气孔状态；(i)50mMABA缓冲液中的气孔孔径大小；箭头指示孔径大小(d，e，g，h)；Scale bar＝100μm(a-b)；Scale bar＝10μm(d，e，g，h)；数据展示以平均值±SD；Student’s t-test用于差异显著性分析；NS，差异不显著；

[0023] 图5为zmcaspl2b2突变体叶表皮通透性分析，其中(a)野生型和zmcaspl2b2突变体离体叶片叶绿素浸出动力学分析；(b)野生型和zmcaspl2b2突变体离体叶片的水分散失速率；(c)室温下离体0小时和12小时的野生型和zmcaspl2b2突变体叶片形态；(d)正常生长条件下的野生型和zmcaspl2b2突变体叶表面彩色红外成像；(e)离体2min的野生型和zmcaspl2b2突变体叶表面彩色红外成像；

[0024] 图6为Zmcaspl2b2突变体对干旱以及盐胁迫敏感，其中(a-c)干旱处理前二叶期野生型与zmcaspl2b2突变体的表型(a)，干旱处理的表型(b)，以及复水后七天的表型(c)；(d)复水前的叶片相对含水量；(e)复水7天后的存活率；(f-h)盐胁迫处理前二叶期野生型与zmcaspl2b2突变体的表型(f)，200Mm NaCl处理7天后的表型(g)，200Mm NaCl处理13天后的表型(h)；(i)200Mm NaCl处理13天时的存活率；(j)200mM NaCl处理后第7天以及13天时Na+含量；数据展示以平均值±SD；Student’s t-test用于差异显著性分析；NS，差异不显著；***代表p<0.001。

[0025] 图7为zmcaspl2b2的分子克隆，其中(a)zmcaspl2b2的精细定位(b)Zm00001d028160基因结构图，且在zmcaspl2b2突变体中，存在3745-bp插入；(c)RNA-Seq数据验证ZmCASPL2B2转录本的提前终止；(d)RT-PCR验证ZmCASPL2B2转录本的提前终止。(e)ZmCASPL2B2编码一个具有四个跨膜域的CASP like蛋白。(f)ZmCASPL2B2进化树分析。

[0026] 图8为ZmCASPL2B2组织表达及其蛋白的亚细胞定位；其中(a)为ZmCASPL2B2基因组织表达，(b)为ZmCASPL2B2-GFP融合蛋白亚细胞定位；

[0027] 图9为采用CRISPR/Cas9系统创建的等位突变体具有和zmcaspl2b2相似的表型，其中(a)为CRISPR/Cas9靶标位置示意图；(b)野生型与基因敲除系(KO1和KO2)两个靶标之间的序列展示；靶标序列已列出，方框里的是PAM序列，缺失的用破折号表示，序列长度或者缺失长度在上面有相应的数字标识；KO2中替换的碱基用下划线标识；(c)野生型和基因敲除系成株期的株型；(d)野生型和基因敲除系穗位叶叶片(e)野生型和基因敲除系离体叶片在离体0小时和12小时的表型；(f)离体12小时的叶片失水率；数据展示以平均值±SD；Student’s t-test用于差异显著性分析；***代表p<0.001；(g)野生型和基因敲除系的上表皮蜡质层的扫描电镜(SEM)观察；箭头指示蜡质的分布情况。

[0028] 图10为转录组分析结果，其中(a)zmcaspl2b2突变体下调表达基因的GO富集分析；P为生物学过程；F为分子功能；C为细胞组成；(b)为蜡质合成相关基因的表达。

具体实施方式

[0029] 本发明提供了一种调控玉米叶表皮蜡质结构的ZmCASPL2B2基因，所述ZmCASPL2B2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在本发明中，所述ZmCASPL2B2基因，来源于玉米植株的自然突变体；所述ZmCASPL2B2基因属于玉米CASP LIKE家族成员，是CASPs家族的同源基因。所述ZmCASPL2B2基因的第一个内含子处存在着一个3745bp的插入片段，所述插入片段会导致转录的提前终止。本发明提供的ZmCASPL2B2基因具有调控玉米叶表皮蜡质结构的功能，所述ZmCASPL2B2基因通过调控叶表皮蜡质结构，进而影响叶面水分的散失以及非生物胁迫的抗性。

[0030] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

[0031] MNHGGGADNGVSPGNVPVCYYGAAGRVPAALERRVRAAELFMRCAACGLAVLAAALLGADRQTRTFFSVEKAARFTDMQSLVFLVIANGMAACYSLLQGGRCLVSILTGGGVLINRPMAWAIFSCDQVMAYFTISAVAVAMEAAMIGKYGSQQFQWMKTCHLYKRFCAQAGGAVACAVAASLNMVGVSLVSAFNLFRLYGSGKGRK。

[0032] 本发明提供了扩增所述ZmCASPL2B2基因的引物对，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：tttactcggcaccagaaagaa，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：aagcaaaatgtcatgaggtcaa。

[0033] 本发明提供了所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质在调控植物叶表皮蜡质结构中的应用。在本发明中，所述植物优选的包括玉米。本发明构建了所述ZmCASPL2B2基因缺失的突变体zmcaspl2b2，并通过对突变体zmcaspl2b2表型的观察、细胞学观察和叶表皮生理实验分析确定所述ZmCASPL2B2基因及其编码的蛋白质能够调控植物叶表皮蜡质结构。

[0034] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在调控玉米叶表皮通透性中的应用。本发明中，所述ZmCASPL2B2基因通过调控叶表皮蜡质结构，进而影响叶面水分的散失，影响玉米叶片表皮通透性。本发明利用叶绿素浸出速率分析、离体叶片失水速率分析、叶表面温度测定等试验，发现ZmCASPL2B2基因缺失的zmcaspl2b2突变体具有较快的叶绿素流出速率、快速的叶表失水速率导致叶表面温度的下降，与野生型相比，zmcaspl2b2突变体叶表面温度显著下降，上述结果表明zmcaspl2b2突变体叶表皮通透性显著提高。

[0035] 本发明提供了所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质在提高玉米耐旱性能中的应用。本发明对所述zmcaspl2b2突变体与野生型进行干旱胁迫，zmcaspl2b2突变体表现出叶片极端萎蔫卷曲的表型，而野生型仅表现出轻微的萎蔫表型；叶片相对含水量测定结果显示，野生型具有89％相对含水量，而zmcaspl2b2突变体仅有
11％相对含水量。复水7天后的存活率调查结果显示，野生型有100％的存活率，而zmcaspl2b2突变体全部死亡。上述结果表明zmcaspl2b2突变体对干旱胁迫极度敏感；从而说明所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质能够提高玉米耐旱性能。

[0036] 本发明提供了所述的ZmCASPL2B2基因或所述的蛋白质在提高玉米耐盐性能中的应用。本发明对所述zmcaspl2b2突变体与野生型进行盐胁迫处理，处理7天后，zmcaspl2b2突变体新叶出现枯萎，而野生型新叶没有受到明显影响；处理13天后，zmcaspl2b2突变体几乎整株都表现出枯萎的症状，而野生型只表现出轻度萎蔫，此时野生型具有100％的存活率，而突变体仅有18％的存活率，并且严重萎蔫。盐胁迫处理第7天以及第13天取样进行地上部分Na+含量测定；结果表明，盐处理第7天时，野生型钠离子含量为25mg/g，而突变体的含量为36mg/g；处理第13天时，野生型钠离子含量为63mg/g，而突变体的含量为80mg/g。上述结果表明zmcaspl2b2突变体对于钠离子的吸收和储存量大大增加，从而造成了对盐胁迫的高度敏感性，进而证明了所述ZmCASPL2B2基因或所述蛋白质具有提高玉米耐盐性能的作用。

[0037] 本发明还提供了所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质在玉米育种中的应用。本发明在确定所述ZmCASPL2B2基因或所述ZmCASPL2B2基因编码的蛋白质的具体功能后，能够通过基因工程的手段超表达所述ZmCASPL2B2基因从而增强玉米的耐盐、耐旱性能；进而获得性状更优的玉米种质资源。

[0038] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0039] 实施例1

[0040] 1)突变表型的观察

[0041] zmcaspl2b2突变体来自于田间的自然突变，其背景材料为玉米自交系LY8405。在苗期，zmcaspl2b2突变体和LY8405形态相似，然而，随着支柱的生长发育，zmcaspl2b2突变体表现为叶片卷曲且直立的表型，且该表型在成株期最为明显，图1(a)-图1(c)。为了描述卷叶表型，测量了LY8405以及zmcaspl2b2穗位叶自然宽度(NLW)、最大叶片宽度(MLW)，并获得了卷叶指数(LRI,NLW/MLW)，统计结果显示在zmcaspl2b2突变体中，上述三个性状都显著下降图1(d)-图1(f)，表明zmcaspl2b2突变体出现了叶片变窄以及卷曲的表型。除了叶片的结构，雄穗以及雌穗的生长发育也在一定程度上受到了影响图1(g)-图1(h)。统计分析表明，穗长(EL)、穗粒重(KWPE)、雄穗长(TL)以及雄穗分枝数(TBN)等性状在zmcaspl2b2中受到了不同程度的抑制，图1(i)-图1(l)。上述结果表明，zmcaspl2b2突变体存在着多性状的改变，尤其是叶部形态。

[0042] 2)zmcaspl2b2突变体叶片显微结构的改变

[0043] 成熟叶片近轴端泡状细胞结构和数目的改变往往是造成卷叶表型的一个直接原因。为了检测zmcaspl2b2突变体叶片卷曲的表型是否是由于泡状细胞的改变造成的，对成熟叶片横切面进行了细胞学观察，结果显示：与野生型相比，zmcaspl2b2薄壁细胞形态没有明显差别，而泡状细胞的数目显著增多，图2(a)-图2(b)，这可能是造成叶片卷曲的一个直接原因。

[0044] 另外，表皮蜡质以及气孔的缺陷同样会造成叶片卷曲的表型。本发明又进一步采用扫描电镜(SEM)以及透射电镜(TEM)观察野生型以及突变体zmcaspl2b2叶表皮的显微结构。扫描电镜结果显示，在野生型中，叶片上表皮被蜡质均匀致密地覆盖，图2(c)，而zmcaspl2b2突变体则呈现出不规则、不连续的条块状蜡质分布，图2(d)。与扫描电镜结果一致，透射电镜同样显示在zmcaspl2b2突变体中，蜡质呈现出不连续不规则的分布，图2(e)-图2(f)。

[0045] 为了探究表皮蜡质层结构的改变是否是由蜡质成分的改变引起的，采用氯仿提取了三叶期叶表皮蜡质，并通过GC-MS的方法进行成分含量分析。结果显示，与野生型相比，zmcaspl2b2突变体表皮蜡质的总量并没有改变，图3(a)。进一步进行各成分分析，结果显示：脂肪酸、醛、和初级醇含量也没有显著差异，只有烷烃在zmcaspl2b2突变体中有稍微上升，图3(b)。

[0046] 通过对野生型以及zmcaspl2b2突变体叶片表皮细胞进行观察，气孔的密度以及形态不存在差异，图4(a)-图4(c)。同时也对气孔在脱落酸(ABA)存在以及不存在的缓冲液中的孔径大小做了统计分析，结果表明，在ABA不存在的情况下，野生型和zmcaspl2b2突变体都表现为气孔张开，并且张开的孔径大小无差异，图4(d)-图4(f)；相反，当放入50mM ABA缓冲液中，野生型以及突变体zmcaspl2b2的气孔都表现出关闭的状态，孔径大小也无差异，图4(g)-图4(i)。综上可以得出，zmcaspl2b2突变对气孔的形态以及生理都没有影响。

[0047] 3)zmcaspl2b2突变体叶表皮的通透性以及非生物胁迫敏感性增强

[0048] 叶表皮蜡质的积累以及结构往往会影响植物叶表皮的通透性以及对干旱和盐胁迫的抗性。为了检测这些相关性状在zmcaspl2b2有没有受到影响，进行如下实验，包括：叶绿素浸出速率分析、离体叶片失水速率分析、叶表面温度测定、以及干旱和盐胁迫处理。

[0049] 所述叶绿素浸出速率分析以及叶片失水速率分析叶表面温度测定方法：

[0050] 测定叶绿素浸出速率：取样三叶期野生型LY8405以及突变体zmcaspl2b2幼苗的第二片叶浸没于80％的乙醇中，然后分别在第2、4、6、8、10以及48小时有放回的取样1ml利用分光光度计(647and 664nm)进行叶绿素含量的测定。叶绿素含量的计算公式:7.93×A664+19.53×A647(Lolle SJ,Berlyn GP,Engstrom EM,Krolikowski KA,Reiter WD,Pruitt RE.Developmental regulation of cell interactions in the arabidopsis fiddlehead-1mutant:A role for the epidermal cell wall and cuticle.Dev Biol,
1997,189:311-321)。采用5个生物学重复。

[0051] 测定叶片失水速率：同样采用三叶期的野生型LY8405以及突变体zmcaspl2b2幼苗第二片叶，离体以后每隔30分钟进行称重，直到第12小时(Chen X,Goodwin SM,Boroff VL,Liu X,Jenks MA.Cloning and characterization of the wax2 gene of arabidopsis involved in cuticle membrane andwax production.Plant Cell,2003,15:1170-1185)。采用五个生物学重复。

[0052] 叶表面温度测定采用红外温度彩图成像技术进行拍照。

[0053] 实验结果：

[0054] 对于叶绿素浸出速率进行分析，连续等时间点有放回地取样测定叶绿素的含量，并以24小时叶绿素含量为总量，将每个时间点叶绿素含量换算百分比，结果发现zmcaspl2b2突变体具有较快的叶绿素流出速率。如浸泡10小时，野生型的叶绿素流出量仅为15％左右，而zmcaspl2b2突变体达到60％，图5(a)。与叶绿素浸出速率一致，zmcaspl2b2突变体离体叶片的失水速率显著快于野生型，图5(b)。当离体12小时后，野生型仅表现出轻度的萎蔫，而突变体叶片出现严重棒状卷曲，失水量是野生型的两倍多，图5(c)。快速的叶表失水速率会导致叶表面温度的下降，利用红外线成像技术对正常生长的植株以及离体叶片进行了叶表温度测定，结果显示，与野生型相比，zmcaspl2b2突变体叶表面温度显著下降，图5(d)-图5(e)。上述结果表明zmcaspl2b2突变体叶表皮通透性显著地提高。

[0055] 用两叶期的幼苗进行干旱以及盐胁迫处理。对于干旱处理，当幼苗生长至两叶期时，停止浇水，让其逐渐进入干旱状态，直到表型产生，图6(a)-图6(b)。停止浇水后第5天，zmcaspl2b2突变体表现出叶片极端萎蔫卷曲的表型，而野生型仅表现出轻微的萎蔫表型，图6(b)。与此同时叶片相对含水量测定结果显示，野生型具有89％相对含水量，而突变体仅有11％相对含水量，图6(d)。复水7天后的存活率调查结果显示，野生型有100％的存活率，而突变体全部死亡，图6(c)、图6(e)。上述结果表明zmcaspl2b2突变体对干旱胁迫极度敏感。

[0056] 对于盐胁迫处理，二叶期幼苗采用200mM NaCl浇灌，图6(f)。处理7天后，zmcaspl2b2突变体新叶出现枯萎，而野生型新叶没有受到明显影响，图6(g)；处理13天后，zmcaspl2b2突变体几乎整株都表现出枯萎的症状，而野生型只表现出轻度萎蔫，图6(h)，此时野生型具有100％的存活率，而突变体仅有18％的存活率，并且严重萎蔫，图6(i)。盐处理+第7天以及13天取样进行地上部分Na 含量测定。结果表明，盐处理第7天时，野生型钠离子含量为25mg/g，而突变体的含量为36mg/g；处理第13天时，野生型钠离子含量为63mg/g，而突变体的含量为80mg/g，图6(j)。上述结果表明zmcaspl2b2突变体对于钠离子的吸收和储存量大大增加，从而造成了对盐胁迫的高度敏感性。

[0057] 4)ZmCASPL2B2的定位及克隆

[0058] 在2675个zmcaspl2b2和B73杂交构建的F2单株中，有675个单株表现为zmcaspl2b2的表型，野生型与突变体的分离比符合3:1(χ2test,p＝0.78)，表明所述突变表型受单个隐性核基因控制。为了克隆ZmCASPL2B2基因，首先采用了BSA策略进行初定位。根据表型分别选取15株野生型材料以及15株突变体材料进行DNA混池，然后利用均匀分布在10条染色体上的1051对SSR标记(表1)对两个混池以及两亲本材料进行多态性筛选。结果显示，1号染色体上的四个SSR标记在两池以及两亲本之间表现出多态性，分别是：umc2225、umc1070、umc1976以及bnlg1007，图7(a)。采用了221个F2单株将zmcaspl2b2定位于两个新开发的标记M4与M5之间图7(a)，

[0059] M4_F tggacaactcaccacagagg(SEQ ID No.5)

[0060] M4_R cctggagcgcataattggta(SEQ ID No.6)

[0061] M5_F acttccccaactaatgtatagcca(SEQ ID No.7)

[0062] M5_R caacgtctaggtacgcgtca(SEQ ID No.8)

[0063] 根据玉米参考基因组(B73 RefGen_v4)显示，所述M4与M5区间大约2Mb。

[0064] 进一步的精细定位，采用了4375个F2单株将zmcaspl2b2定位至新开发的标记M10和M11之间,

[0065] M10_F cacctcctgcctgaccac(SEQ ID No.9)

[0066] M10_R caaggacagtagtcccagacg(SEQ ID No.10)

[0067] M11_F ggtgctctcgttttgttgct(SEQ ID No.11)

[0068] M11_R ttgtggttttaattggctcaaa(SEQ ID No.12)

[0069] 根据玉米参考基因组(B73 RefGen_v4)显示，大约为90kb的物理区间，图7(a)。参考基因组显示，该区间有两个候选基因，图7(a)。

[0070] 分别设计引物对两个基因在野生型以及突变体zmcaspl2b2进行PCR扩增测序。

[0071] 8160_F3 TTTACTCGGCACCAGAAAGAA(SEQ ID No.3)

[0072] 8160_R3 AAGCAAAATGTCATGAGGTCAA(SEQ ID No.4)

[0073] 以及序列比对，结果显示，与野生型相比，突变体中Zm00001d028160的第一个内含子处存在一个3,745bp插入片段，图7(b)；Zm00001d028159在两个材料之间并没有序列的差异。发育中的叶片的RNA-seq结果显示，突变体中Zm00001d028160转录本提前终止，图7(c)，形成一个不完整的转录本，该结果也被分段RT-PCR结果所验证，图7(d)。因此将Zm00001d028160作为候选基因，并命名为ZmCASPL2B2。

[0074] 分段RT-PCR的引物：

[0075] RT_F1 acgtcccggtgtgctactac(SEQ ID No.13)

[0076] RT_R1 tctccacggagaagaaggtg(SEQ ID No.14)

[0077] RT_F2 tggtgatagcaaacgggatg(SEQ ID No.15)

[0078] RT_R2 gtacagccggaagaggttga(SEQ ID No.16)

[0079] F1/R1，F2/R2，F1/R2三个组合。

[0080] Zm00001d028160基因由两个内含子以及三个外显子组成，产生一个包含621bp编码区的启动子，能够编码一个包含206氨基酸的蛋白质。根据基因注释显示Zm00001d028160编码一个CASP-LIKE 2B2蛋白，所述蛋白包含四个跨膜域，是跨膜蛋白CASPLs家族成员之一，图7(e)。采用ZmCASPL2B2蛋白序列全长进行进化树分析，结果显示，拟南芥中与之同源性较高的是CASPL2B2(AT2G35760)蛋白，图7(f)，所述基因的功能还没有被报道。

[0081] 上述实验过程中，单株DNA的提取采用CTAB法，具体步骤：

[0082] 1.在研钵中加入700μL CTAB(83.5mM Tris-HCl，pH 8.0，16.7mM EDTA pH 8.0，1.17M NaCl，1.67％CTAB)，取适量新鲜幼嫩叶片于冰上研磨至匀浆，转移至2mL的离心管中；

[0083] 2.65℃水浴40min，期间颠倒混匀几次；

[0084] 3.冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，轻摇混匀15min左右后，12000rpm离心10min；

[0085] 4.取200μL上清至另一新的1.5mL离心管中，加入二倍体积的冰乙醇，轻摇混匀后静置30min；

[0086] 5.12000rpm离心10min，弃上清。用75％的乙醇洗沉淀2次；

[0087] 6.离心去上清，室温放置干燥后，加入100μLddH2O溶解，-20℃保存备用。

[0088] PCR反应体系

[0089]

[0090] PCR反应程序

[0091]

[0092] 单株基因型检测采用琼脂糖凝胶电泳。

[0093] 5)ZmCASPL2B2广泛表达，ZmCASPL2B2蛋白定位于细胞膜上

[0094] 采用RT-qPCR对ZmCASPL2B2在多各组织中(根、茎、成熟叶片、未成熟叶片、雄穗、雌穗、花丝以及15DAP的肧)进行表达分析，结果显示，该基因在各个组织中均广泛表达，并且在发育的叶片中高表达，成熟的叶片中低表达，图8(a)。为了确定ZmCASPL2B2蛋白亚细胞定位，将融合GFP标签ZmCASPL2B2基因编码区全长在烟草表皮细胞中进行瞬时表达，在表皮细胞外围检测到GFP 信号，并且该信号和膜marker FM4-64重定位，图8(b)。所述结果表明，ZmCASPL2B2蛋白定位细胞膜上。

[0095] 步骤5)是设计的试验方法如下：

[0096] Trizol法提取植物基因组RNA、RNA纯化及反转录

[0097] Trizol法提取植物基因组RNA

[0098] 1.液氮充分研磨样品，每1.5ml离心管分装0.1g样品，立刻加入1mlTrizol(Invitrogen)，迅速混匀，室温静置10min。

[0099] 2.加200ul氯仿，剧烈摇荡30s，室温静置15min；

[0100] 3.4℃，12000rpm离心15min，转移上清至新离心管，加入2/3体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃沉淀2h(或-80℃沉淀30min)。

[0101] 4.4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入1ml75％乙醇(DEPC水配制)清洗RNA，[0102] 震荡片刻后(使沉淀悬浮)12000rpm离心5min,小心弃上清；

[0103] 5重复4的操作；

[0104] 6室温静置5-15min，使RNA沉淀恰好干燥，加入40ulDEPC水溶解，-80℃超低温冰箱保存。

[0105] 总RNA纯化

[0106] 1.向总RNA中依次加入4μL10×buffer，4μLDNaseⅠ(1U/μL)，1μLRNAinhibitor(40U/μL)，补充DEPC-H2O至40μL；

[0107] 2.37℃水浴锅水浴30min；

[0108] 3.加入2.5μLEDTA(25mM)，80℃水浴2min；

[0109] 4.加入核酸助沉剂4μL，2min后加入冰乙醇250μL，混匀后于-80℃静置20-30min；

[0110] 5.12000rpm，4℃离心5min，弃上清；

[0111] 6.75％乙醇洗涤后干燥透明，加入40μLDEPC-H2O溶解。

[0112] 7.测定总RNA的浓度。

[0113] 反转录体系及程序

[0114] 1.在离心管中依次加入1μg纯化后RNA(约3μL)，1μLdNTP(10mMeach)，1μLoligodTprimer(50μM)，7μLRNasefreeH2O；

[0115] 2.65℃水浴5min，冰上骤冷；

[0116] 3.向上述反应中加入4μL5×PrimeScriptBuffer，2μL0.1MDTT，1μLRNAinhibitor(40U/μL)；

[0117] 4.37℃处理2min；

[0118] 5.室温下加入1μLM-MLV逆转录酶；

[0119] 6.37℃反应50min；

[0120] 7.70℃反应15min使酶失活，产物即为cDNA。

[0121] qRT-PCR(Quantitative real time PCR)

[0122] 将上述cDNA稀释10倍左右，直接用作qRT-PCR的模板。

[0123] 反应体系如下：

[0124]

[0125]

[0126] 反应程序如下：

[0127]

[0128] RT-PCR

[0129] 1、采用野生型以及突变体cDNA为模板，以Actin-F/R为引物，采用循环数梯度进行模板的定量。记录下所用模板的体积。

[0130] 2、采用定量的野生型以及突变体cDNA为模板，以F1/R1，F2/R2，F1/R2三个组合进行循环数梯度PCR扩增，并选取合适的循环数。以此循环数进行最终的RT-PCR[0131] RT-PCR体系

[0132]

[0133] 反应程序：

[0134]

[0135] 6)CRISPR/Cas9创建的等位突变体检测ZmCASPL2B2基因的功能。

[0136] 为了检测ZmCASPL2B2基因功能，采用CRISPR/Cas9体系将玉米自交系ZC01内源基因ZmCASPL2B2进行基因敲除，在第一个外显子处设计了两个20-bp的序列作为Cas9切割靶标，图9(a)。经愈伤组织的遗传转化，共获得了20个独立的T0代转化株系。通过在靶标的外侧设计引物CRISPR160_F/R，对这些单株进行PCR扩增、测序以及序列比对，鉴定到两个纯合敲除系突变体(KO1，KO2)，图9(b)。在KO1中，在两个靶标之间存在着一个110-bp的缺失，造成了序列的丢失以及移码突变；在KO2中，同样也存在着110-bp的碱基缺失，另外还存在两个碱基的替换，其中第一个碱基的替换会造成起始密码子ATG变为AAG，从而导致了起始密码子的丢失。

[0137] CRISPR160_F ccctcatcagtggcagcta(SEQ ID No.17)

[0138] CRISPR160_R gctggggatttgtgacatct(SEQ ID No.18)

[0139] 在植株生长发育的后期，两个突变体都表现出叶片皱缩、卷曲且直立的表型，图9(c)～图9(d)。对野生型CO1以及两个敲除系做了离体叶片的失水速率分析，当离体12小时时，敲除系KO1以及KO2都因失水过多表现出严重的萎蔫及卷曲，而野生型则表现出轻微的萎蔫，图9(e)。同时也对离体12小时的相对失水率做了统计分析，野生型出现了26％的失水率，而敲除系KO1和KO2分别为65.6％和60.2％的失水率，图9(f)。叶表皮扫描电镜结果显示，野生型叶表皮被蜡质致密均匀的覆盖，而基因敲除系KO1以及KO2表皮蜡质呈现不规则不连续的块状分布，图9(g)。以上结果表明，与zmcaspl2b2突变体类似，基因敲除系KO1以及KO2表现叶表皮蜡质层存在结构缺陷以及较高叶片失水速率，说明ZmCASPL2B2基因突变是造成zmcaspl2b2突变表型的原因。

[0140] 7)zmcaspl2b2突变体发育叶片的转录组分析

[0141] 为了进一步揭示ZmCASPL2B2参与的生物学过程，对野生型以及zmcaspl2b2突变体发育中的叶片做了转录组分析。转录组采用了两个生物学重复，每个生物学重复采用三个混样。reads被比对到玉米参考基因组上(B73RefGen_v4)，并量化基因的表达水平。与野生型相比，在zacaspl2b2中鉴定到鉴定到1,837差异表达基因(DEGs)(p<0.01)，其中包含762(41.5％)上调基因，以及1,075(58.5％)下调基因。GO分析显示，下调的基因主要在以下几个生物学过程中富集，包括胁迫及刺激的响应、催化活性以及胞外区域的细胞组成，图10(a)。

[0142] 蜡质的生物合成是一个复杂的生物学过程。在拟南芥中，很多参与蜡质合成的基因都已经被鉴定和克隆。但是从RNA-Seq中获取蜡质合成相关基因的表达分析结果显示，大多数参与蜡质合成的基因表达在两个材料之间差异不显著，图10(b)，只有少数存在较低倍数差异，表明zmcaspl2b2突变对蜡质合成相关基因表达影响较小，或几乎没影响。

[0143] 由上述实施例可知，本发明提供的调控玉米叶表皮蜡质结构的ZmCASPL2B2基因具有调控玉米叶表皮蜡质结构的功能，本发明通过基因工程的手段结合生理生化试验，首次确定了所述ZmCASPL2B2基因的功能，为玉米育种提供宝贵的基因资源。

[0144] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0145] 表1 1051对SSR标记

[0146]

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