氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法
阅读：573发布：2020-05-15
专利汇可以提供氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了分离的多聚核苷酸和多肽，以及赋予 植物 增加的氮素利用效率的重组DNA构建体；包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或 种子 )，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作的连接植物中有功能的启动子的多聚核苷酸，其中所述多核苷酸编码非 生物 胁迫耐受性多肽。，下面是氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法专利的具体信息内容。
1.一种分离的多核苷酸，其包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、
10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列；与不含有增加所述多核苷酸表达的对照植物相比，增加所述多核苷酸的表达能提高植物低氮胁迫耐受性或氮素利用效率。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：
2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：
3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15一致性至少为99％的氨基酸序列。
4.一种重组DNA构建体，其包含权利要求1-3任一项的分离的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控序列。
5.一种修饰的植物或种子，其包含编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的至少一种多核苷酸，与对照植物或种子相比，所述多核苷酸的表达量是增加的，其中所述多核苷酸包含(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为
85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述植物显示出增加的氮素胁迫耐性或增加的产量。
6.根据权利要求5所述的植物，所述植物在其基因组中包含一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含权利要求1-3任一项的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件。
7.根据权利要求5所述的植物，所述编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的多核苷酸是内源多核苷酸。
8.根据5-7任一权利要求所述的植物，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
9.一种提高植物氮胁迫耐性或NUE的方法，其包括：与对照植物相比，增加植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为
85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；
(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为
90％。
10.根据权利要求9所述的方法，所述多核苷酸表达通过以下方法增加：
(a)通过重组DNA构建体增加植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的多核苷酸的表达，其中，所述重组DNA构建体包含编码DN-LTP8CYP76M5FBX25GH17或DN-LTP9多肽的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件；所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或
(b)增加内源多核苷酸的表达，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为95％。
11.一种方法，为与对照植物的野生型DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性相比，增加植物内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性方法；且与对照植物相比，所述植物表现出增加氮胁迫耐性、增加产量、增加非生物胁迫耐性和增加生物量的至少一种表型；所述方法包括以下步骤：在内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9基因和其调控元件所在的基因组区域(i)引入一段DNA片段或删除一段DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能有效增加内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述改变通过锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归巢核酸内切酶(Meganucleases)或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体引入。
氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因
相关的构建体和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物氮素利用效率和/或低氮耐性的重组DNA构建体。
背景技术
[0002] 生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、有效氮素的过量或不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。
[0003] 干旱、高盐和营养元素缺乏等非生物胁迫严重影响植物的生长和生产力，包括作物，这大大限制了世界范围内作物的产量。总之，这些因素预计将导致农业生产平均减产70％。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态建成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。
[0004] 氮素的吸收在植物生长发育的过程中发挥着重要的作用(Gallais等(2004)，J.Exp.Bot.55(396)：295-306)，植物吸收环境中的无机氮合成氨基酸，因此施用氮肥成为提高栽培作物(如玉米、水稻和大豆)产量强有力的方法。在植物最佳生长发育阶段，植物可利用氮素的缺失就成为了非生物胁迫。现在，为了避免硝酸盐对环境的污染，同时保持足够的利润，农民希望减少氮肥的使用。如果一个植物品种增加了氮的同化能力，它也将有望增加生长和产量。因此，具有较好氮利用效率的植物新品种是可取的。
[0005] 激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel，D.等(2000)Plant Physiol.122：1003-1013)。转录增强子元件的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于鉴定特定性状如植物氮素利用效率的基因，当将基因转入植物中，可以改变该性状。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明包括以下具体实施方案：
[0008] 一个实施方案中，包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸过量表达时能够提高植物的氮胁迫耐性，包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中与不增加所述多核苷酸表达的对照植物相比，增加所述多核苷酸在植物中的表达能够提高植物的氮胁迫耐性或提高NUE。所述核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15；或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15一致性至少为99％的氨基酸序列。
[0009] 另一个实施方案中，包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一种分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。
[0010] 另一实施方案中，包括一种修饰的植物或种子，在所述修饰的植物或种子中，包含编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的至少一种多核苷酸，与对照植物或种子相比，所述多核苷酸的表达是增加的，其中，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述植物显示增加的氮胁迫耐性或增加的产量。
[0011] 修饰的植物，在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列；与对照植物相比，所述植物显示出增加的氮素利用效率(NUE)。
[0012] 编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的多核苷酸是内源多核苷酸。
[0014] 另一实施方案中，提供了一种提高植物氮素胁迫耐性或NUE的方法，其包括，与对照植物相比，提高植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中，所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或
14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、
12或15的一致性至少为90％。
14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、
12或15的一致性至少为90％。
[0015] 所述多核苷酸的表达量通过下述的一个步骤增加：(a)通过重组DNA构建体增加植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的多核苷酸的表达量，其中所述重组DNA构建体包含编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQI ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；(b)增加内源多核苷酸的表达量，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为95％。
[0016] 另一实施方案，提供了一种方法，为与对照植物的野生型DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性相比，增加植物内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性方法；且与对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性/NUE、增加的产量、增加的非生物胁迫或增加的生物量的至少一种表型；所述方法包括以下步骤：在内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9基因和其调控元件所在的基因组区域(i)引入一段DNA片段或者删除一段DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能有效增加内源DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的表达水平或活性。所述改变通过锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归巢核酸内切酶(Meganucleases)或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体引入。
[0017] 另一实施方案中，本发明涉及一个重组DNA构建体，其包含本发明中任一分离的多聚核苷酸，并与至少一个调控序列可操作连接；以及包含重组DNA构建体的细胞、植物和种子。所述细胞包括真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，如细菌。
[0019] 表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号
[0020]
[0021]
[0022] 此处的序列描述和序列表遵守37C.F.R.§1.821-1.825中列出的专利申请的核苷酸和/或氨基酸序列披露管理规则，序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。
[0023] 详细描述
[0024] 本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。
[0025] 如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
[0026] 如本发明所述：
[0027] 术语“OsDN-LTP8”是低氮耐性蛋白8(Low nitrogen Tolerance Protein 8)，指水稻基因位点LOC_Os09g26530.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关的等位变异体。“DN-LTP8多肽”此处指OsDN-LTP8多肽和其它植物中的同源物。
[0028] OsDN-LTP8多肽(SEQ ID NO：3)是水稻基因位点LOC_Os09g26530.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：2)或核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR(rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中注释为“表达蛋白”，在NCBI(ncbi.nlm.nih.gov/)中注释为“未知蛋白”。
[0029] 术语“OsCYP76M5”是细胞色素P450 76M5(cytochrome P450 76M5)，指水稻基因位点LOC_Os08g43440.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“CYP76M5多肽”此处指OsCYP76M5多肽和其它植物的同源物。
[0030] OsCYP76M5多肽(SEQ ID NO：6)是水稻基因位点LOC_Os08g43440.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：5)或核苷酸序列(SEQ ID NO：4)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“细胞色素P450，表达的”，在NCBI中注释为“细胞色素P4590 76M5类似”，但没有在先的功能介绍。
[0031] 术语“OsFBX25”指水稻基因位点LOC_Os01g55210.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“FBX25多肽”此处指OsFBX25多肽和其它植物中的同源物。
[0032] OsFBX25多肽(SEQ ID NO：9)是水稻基因位点LOC_Os01g55210.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：8)或核苷酸序列(SEQ ID NO：7)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“含有OsFBX25-F-盒结构域的蛋白，表达的”，在NCBI中注释为“未知蛋白”，但没有在先的功能介绍。
[0033] 术语“OsGH17”是糖基水解酶家族17(glycosyl hydrolases family 17)，指水稻基因位点LOC_Os03g22530.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“GH17多肽”此处指OsGH17多肽和其它植物的同源物。
[0034] OsGH17多肽(SEQ ID NO：12)是水稻基因位点LOC_Os03g22530.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：11)或核苷酸序列(SEQ ID NO：10)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“糖基水解酶家族17，推测，表达”，在NCBI中“β-葡聚糖-2样”，但没有在先的功能介绍。
[0035] 术语“OsDN-LTP9”是低氮耐性蛋白9(Low nitrogen Tolerance Protein 9)，指水稻基因位点LOC_Os04g57804.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“DN-LTP9多肽”此处指OsDN-LTP9多肽和其它植物的同源物。
[0036] OsDN-LTP9多肽(SEQ ID NO：15)是水稻基因位点LOC_Os04g57804.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：14)或核苷酸序列(SEQ ID NO：13)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“表达蛋白，表达”。
[0037] 本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
[0038] “植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0039] “子代”包括植物的任何后续世代。
[0040] “修饰的植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。T0植物直接源于转化和再生过程，T0植物的子代为T1代(第一个子代)，T2代(第二个子代)等。
[0041] 针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
[0042] “转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
[0043] “对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
[0044] 对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)相同基因型并用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因型作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。对照可以包括多种代表上述一种或多种类型的个体，例如，(c)中性状分离后非转基因的材料的混合通常认为是bulk null。
[0045] 本发明中，ZH11-TC和DP0158指对照植物。ZH11-TC表示通过组织培养中花11获得的水稻植株；DP0158表示转化空载体DP0158获得水稻植株。
[0046] “性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的耐性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。
[0047] “农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
[0048] “表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
[0049] “收获指数”指籽粒重量除以总植株重量。
[0050] 可以测量增加的生物量，例如与对照植物相比，增加的植物高度、植物总叶面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量等。
[0052] 人们对叶片大小的增加特别有兴趣。增加的叶片的生物量可用于增加植物源药或工业产品的生产。
[0053] 增加的分蘖数可以增加产量，增加植物叶片面积可提高植物总的光合作用，增加的光合合成能力可以增加特定植物组织的产量，并使植物在低光强或高光强下生长，所述特定植物组织包括叶片、根、果实或种子。
[0054] 其它组织如根的生物量的改变有利于提高植物在严酷条件下生长的能力，所述严酷条件包括营养贫瘠、水分缺失，因为大量的根系可以更好地吸收水分和营养。
[0055] “环境条件”指植物生长的条件，诸如可利用水分、可利用营养物(例如氮素)、或存在的昆虫或病害。
[0056] “氮素限制条件”指可利用总氮量(例如，硝酸盐、氨或其它可知氮源)不足以维持植物的最佳生长发育的条件，本领域的技术人员应当知道维持植物最佳生长发育的可利用总氮量的条件，本领域的技术人员应当知道什么组成了足够的可利用总氮量，什么组成了土壤、介质和施入的肥料为植物提供氮素。氮素限制条件取决于多种因素，包括但不限于特定的植物和环境条件。
[0057] 术语“氮素胁迫耐性”、“低氮耐性”和“氮素缺乏耐性”此处可互换使用，指植物的一种性状，即植物在氮素限制条件或低氮条件下存活的能力。
[0058] 一个多肽“增加的氮胁迫耐性”是指与参照或对照相比，在转基因植物中过表达该多肽能增加转基因植物的氮胁迫耐受性。
[0059] 植物“增加的氮胁迫耐性”是与参照或对照相比后衡量的，反映了植物在氮限制条件下存活和/或生长更好的能力；与参照或对照植物相比，氮胁迫耐性的植物增加的数量可以是任何数量。
[0060] “植物氮胁迫耐性”是植物表现为氮素胁迫耐受性。一个氮胁迫耐性的植物可能表现为与对照植物相比在氮素限制条件下提高至少一种农艺性状。
[0061] “NUE”是氮素利用效率，具体指植物在低肥料或高肥料水平下利用氮素的能力。它反映了植物吸收、同化和/或其它氮素利用的能力。
[0062] 土壤植物分析发展(SPAD)值是SPAD-502plus叶绿素仪(KONICA MINOLTA生产)测定的SPAD读数。SPAD值是叶片叶绿素相对含量，是植物健康的一个重要指标。许多研究表明，叶片氮素含量与SPAD值成正相关性(Swain D.K.和Sandip S.J.(2010)Journal of Agronomy 9(2)：38-44)，叶片SPAD值可用于作物中氮素状况的分析指标(Cai H.-G.et al.(2010)Acta metallurgica sinica 16(4)：866-873)。
[0063] 水稻对于低氮胁迫响应和耐受是一个综合和全面的生理生化过程。植物的耐受性将在植物发育的不同阶段和不同胁迫条件下以不同的方式反映。环境因子，例如光照和温度是影响水稻生长的关键因素，环境因子的变化将影响水稻的生长发育。研究证明对水稻植株低氮处理可观察到叶片中叶绿素含量降低，分蘖数减少，或生物量减少。我们在试验中测量了叶片颜色(反映叶绿素含量，SPAD值)、植物鲜重和分蘖数，通过这三个参数综合选择耐低氮植物。
[0064] “氯酸盐”指含有氯酸根阴离子的化合物，是一种氯酸盐化合物。它是一种硝酸盐类似物，植物通过硝酸盐同一个转运系统吸收，通过硝酸盐还原酶将氯酸盐还原成亚氯酸盐，亚氯酸盐是有毒的，能够导致植物损伤、枯萎或死亡。本发明中将氯酸钾用于试验。
[0065] “氯酸盐敏感性”是一种植物性状，反映了氯酸盐溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物吸收、转运或还原氯酸盐后造成的损伤甚至死亡情况。
[0066] 植物“增加的氯酸盐敏感性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了氯酸盐或硝酸盐溶液中，与参照或对照植物相比，较高的吸收、转运或同化氯酸盐或硝酸盐的能力。通常，氯酸盐的敏感性可用作NUE的指标，植物对氯酸盐越敏感，氮素利用效率越高。
[0067] “氯酸盐敏感幼苗”指整株表型萎蔫，没有绿色叶片的损伤植株，可认为是氯酸盐溶液处理后死亡的植株。
[0068] “基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
[0069] “全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
[0070] “多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
[0071] “多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
[0072] “信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。
[0073] “cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段合成双链形式。
[0074] “成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
[0076] “分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上是游离的，或者以其他方式从通常与自然环境中的物质相伴或者相互作用的组份中分离出来的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
[0077] “重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
[0078] “重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
[0079] 术语“入门克隆”和“入门载体”本发明可互换使用。
[0080] “调控序列”、“调控元件”和“调控区域”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
[0081] “启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
[0082] “植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
[0083] “组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。
[0084] “发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0085] “可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0086] “表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
[0087] 有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
[0088] “转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
[0089] 本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
[0090] “稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
[0091] “瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
[0092] “等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
[0093] “基因”是一段可表达功能分子的核苷酸片段，所述功能分子，包括但不限于，特定蛋白，所述基因包括位于编码序列上游的调控序列(5’非编码序列)和下游序列(3’非编码序列)。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。
[0094] “突变基因”是通过人工干预后的产生的基因。由此产生的“突变基因”的序列与非突变基因的序列相比，至少有一个核苷酸增加，删除或替换。“突变植物”是指含有突变基因的植物。
[0095] 应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明中“靶向突变”是指通过双链断裂诱发剂诱导靶序列DNA双链断裂，改变内源基因的特定序列，从而导致内源基因突变。
[0096] “遗传修饰”指通过蓄意人为活动而导入植物的基因组核苷酸序列的改变。
[0097] “核定位信号”是指靶向核蛋白的信号多肽(Raikhel，(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。
[0098] “CRISPR-相关基因”是指编码成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组合物的核苷酸序列，所述基因通常耦合存在，与CRISPR位点侧翼片段相关或相邻。术语“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，Cas3和Cas9,它们分别为CRISPR类型I和CRISPR类型II系统编码的内切酶。
[0099] “Cas内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，所述Cas蛋白能导致DNA靶序列双链断裂。向导多核苷酸引导Cas内切酶识别，并有选择性导致细胞基因组特定位点的双链断裂。
[0100] “向导RNA(gRNA)”是指一个由可改变的DNA元件编码的crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合的杂合RNA分子，gRNA通常包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于CRISPR复合体的相关Cas内切酶结合的结合域。
[0101] “向导多核苷酸”是指一个可与Cas内切酶形成复合体、且使Cas内切酶识别和选择DNA剪切靶位点的多核苷酸序列。所述向导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。
[0102] 术语“向导多核苷酸/Cas内切酶体系”是指含有一个Cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致DNA靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导RNA识别靶序列，Cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列，并对DNA双链进行剪切。
[0104] “前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的DNA序列(12-40个核苷酸)，所述前间区是基于crRNA或sgRNA的间隔序列的碱基互补配对，以CRISPR体系内切酶而导致酶促断裂。
[0105] “前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。
[0106] CRISPR位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为SPIDRs-间隔散布定向重复)组成最近描述的DNA位点家族。CRISPR位点由短的、高度保守的DNA重复序列(一般24-40个核苷酸，重复1-140次，因此也称为CRISPR-重复单元)组成，所述DNA重复序列部分是回文重复。所述重复序列(通常存在物种特异性)被固定长度(一般20-58个核苷酸，依赖于CRISPR位点)的可变序列间隔(WO2007/025097公开于2017年3月1日)。
[0107] 核酸内切酶是可切断多核苷酸链的磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点切割DNA而不破坏碱基的限制性核酸内切酶。所述限制性核酸内内切酶包括类型I、类型II、类型III和类型IV核酸内切酶及其亚类型。在类型I和类型III系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。核酸内切酶也包括归巢核酸内切酶(meganucleases或HEases)，其类似于限制性核酸内切酶，能结合和剪切特定识别位点，然而归巢核酸内切酶识别位点通常更长，约18个核苷酸或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，归巢核酸内切酶可分为四个家族，分别为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒子家族。这些基序参与到金属离子和磷酸二酯键的水解过程的协调。归巢核酸内切酶的显著点在于其长识别位点和在其DNA底物中容忍一些序列多态性。
[0108] TAL效应因子核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能导致植物或其他生物基因组特定靶序列双链断裂。TAL效应因子核酸酶通过将一个天然或人工合成的转录激活样(TAL)效应因子或其功能区，融合到核酸内切酶的催化结构域而产生的，诸如Foki内切酶。所述独特的、模块化的TAL效应因子DNA结合域允许设计具有潜在给定DNA识别特异性的蛋白(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFNs)是一种人工合成的双链断裂诱发剂，含有一个锌指DNA结合结构域和一个双链断裂诱导剂结构域。
锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如，有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFNs由一个设计的DNA结合锌指结构域和与其链接的一个非特异性内切核酸酶结构域构成，例如，源于诸如FokI的类型l的核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活结构域，转录阻遏结构域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶DNA的3个碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。
锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如，有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFNs由一个设计的DNA结合锌指结构域和与其链接的一个非特异性内切核酸酶结构域构成，例如，源于诸如FokI的类型l的核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活结构域，转录阻遏结构域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶DNA的3个碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。
[0109] “靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶位置”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位置”在本发明中可互换使用，具体指植物细胞基因组中的一段多核苷酸序列(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)，且在植物细胞基因组中能被Cas内切酶诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，也可以是非自然发生在基因组中的植物异源位点，或靶位点可以是与自然存在的基因组位点异源的位点。本发明中“内源靶序列”和“天然靶序列”可以互换使用，具体指植物基因组内源或天然基因组的靶序列，且是植物基因组靶序列的内源或天然位点。
[0110] “变异靶位点”、“变异靶序列”、“修饰靶位点”、“修饰靶序列”在本发明中可互换使用，具体指本发明公开的靶序列，其与未改变的靶序列相比，包括至少有一处变异。所述变异包括，例如：(i)至少一个核苷酸替换，(ii)至少一个核苷酸删除，(iii)至少一个核苷酸插入，或(iv)上述(i)-(iii)的任意组合。
[0111] “序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的氨基酸保守型替换。例如，利用诸如BLAST,BLAST-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)。
[0112] 本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
[0113] 现在转向实施方案：
[0114] 实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予提高的氮素利用效率的重组DNA构建体、包含重组DNA构建体的诸如植物或种子的组合物、以及利用这些重组DNA构建体的方法。
[0115] 分离的多核苷酸和多肽：
[0116] 本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
[0117] 一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体，所述多肽优选为DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽。提高所述多肽的表达量优选的能够提高植物低氮耐性/NUE活性。
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体，所述多肽优选为DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽。提高所述多肽的表达量优选的能够提高植物低氮耐性/NUE活性。
[0118] 一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。所述多肽优选为DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽。
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。所述多肽优选为DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽。
[0119] 一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明任一重组DNA构建体。所述分离的多核苷酸优选为编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽，提高所述多肽的表达量优选的能够提高植物低氮耐性活性。
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明任一重组DNA构建体。所述分离的多核苷酸优选为编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽，提高所述多肽的表达量优选的能够提高植物低氮耐性活性。
[0120] 应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
[0121] 重组DNA构建体：
[0122] 一方面，本发明包括重组DNA构建体。
[0123] 在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
[0124] 在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
[0125] 在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽，所述多肽优选为具有低氮耐性，并可来自，例如水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
[0126] 调控元件：
[0127] 本发明的重组DNA构建体包含至少一个调控元件。
[0128] 调控元件可以是启动子或增强子。
[0129] 多个启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。
[0130] 一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
[0131] 当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物氮素耐性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
[0132] 适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素启动子(Christensen)等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,
144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
[0133] 在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子[0134] 组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并通常限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
[0135] 可用于本发明的种子或胚特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079-1093)，convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等，(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等，(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等，(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)，玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等，(1988)EMBO J.7：1249-1255)，菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)，植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等，(1987)EMBO J.6：3571-3577)，B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等，(1988)EMBOJ.7：297-302)，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等，(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等，(1987)EMBO J.6：3559-3564)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等，(1989)Bio/Technology 7：L929-932)，表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等，(1989)PlantSci.63：47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等，(1987)EMBOJ6：3559-3564)。
[0136] 诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。诱导启动子或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
[0137] 用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等，(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)；2)胁迫诱导启动子Rab17(Vilardell等，(1991)Plant Mol.Bio.17:985-993；Kamp Busk等(1997)Plant J 11(6)：1285-1295)；3)大麦启动子B22E；B22E是发育中玉米籽粒中的柄所特异表达的启动子(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed inImmature Aleurone Layers”(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)Klemsdal,S.S.等，(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；和4)玉米启动子Zag2(“Identification and
molecularcharacterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis
floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等，(1993)Plant Cell 5(7)：729-737；
“Structural characterization，chromosomal localizationand phylogenetic
evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-boxgenes from maize”，Theissen等，(1995)Gene 156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。
其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
molecularcharacterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis
floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等，(1993)Plant Cell 5(7)：729-737；
“Structural characterization，chromosomal localizationand phylogenetic
evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-boxgenes from maize”，Theissen等，(1995)Gene 156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。
其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。
[0138] 对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚胎启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。
[0139] 早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/
12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,
403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和
20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,
403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和
20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
[0140] 本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。
[0141] 启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。
[0142] 用于本发明特定实施例的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。
[0143] 本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在特定实施方案中，重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
[0144] 内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。
[0145] 组合物：
[0146] 本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。
[0147] 在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物(例如氮素限制条件下改良农艺特征)，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米。
[0148] 植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、黍、甘蔗或柳枝稷。
[0149] 重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
[0150] 实施方案包括但不限于以下实施方案：
[0151] 1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种异源调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的一致性，并且，与不含有所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性，所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的一致性，并且，与不含有所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性，所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
[0152] 2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种异源调控元件，其中所述多核苷酸编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽；与不含有所述重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性，所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。所述DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽源于拟南芥(Arabidopsis thaliana,)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
[0153] 3.实施方案1-2所述的植物的任何子代植物，实施方案1-2所述的植物的任何种子，实施方案1-2所述的植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-2的植物和其子代植物的细胞。
[0154] 前述实施方案1-3或其它实施方案中，重组DNA构建体包含至少一个植物中有功能的启动子作为调控序列。
[0155] 前述实施方案1-3或其它实施方案中，至少一种农艺性状的变化可以是增加也可以是减少。
[0156] 前述实施方案1-3或其它实施方案中，与不含有所述重组DNA构建体的对照植物相比，在氮素胁迫条件下，所述植物显示出至少一个农艺性状的变化。
[0157] 本领域的技术人员熟悉模拟限制或者不限制氮素条件的方案，用于评价在模拟的或天然发生的限制或不限制氮素条件下测试植物。例如可以通过一段时间内给植物提供比正常需要较少的氮素或不提供氮素来模拟低氮素条件，并通过寻找农艺性状的差别(例如生理和/或物理状的变化)评价这些植物，所述农艺性状包括但不限于活力、生长、大小或根的长度，尤其是叶色或叶面积的大小。评价这些植物的其它技术包括测定叶绿素荧光、光合速率、根生长或气体交换速率。
[0158] 下述实施例描述了模拟氮限制条件和/或在此条件下评价植物的代表性技术方法。
[0159] 本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的低氮或高氮条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估氮胁迫耐性，例如，低氮或高氮条件下产生与正常条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，低氮或高氮条件下产量减少较少。
[0160] 田间和温室条件下，可通过叶绿素仪测量低氮或高氮条件下的SPAD值。SPAD值能反映植株健康状态，并通过预测叶绿素含量反映植株氮素含量。与对照或参照植物相比，具有较高的低氮耐受性的植株的SPAD值更高。
[0161] 参数是相对于对照细胞或对照植物呈现的，例如基因表达水平、编码蛋白的水平或活性、SPAD值、分蘖数、籽粒产量或其他本领域技术人员很容易找到适当的对照或参照植物，当采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型时。例如，但不限于下述举例：
[0162] 1.转化植物的子代，所述转化植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，所述子代分离成包含或不包含该DNA构建体植株：包含该重组DNA构建体的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。
[0163] 2.重组DNA构建体基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
[0164] 3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
[0165] 4.包含重组DNA构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体的植株相比较，该核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性)。
[0166] 另，本领域技术人员很容易想到，所述用于评估或测量转基因植物农艺性状或表型的合适的对照或参照植物不包括通过诱变或转换得到期望的农艺性状或表型的植物。
[0167] 方法：
[0168] 方法包括但不限于：提高植物氮素胁迫耐性的方法，评价植物氮素胁迫耐性的方法，提高植物氯酸盐敏感性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，和生产种子的方法。植物可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，例如水稻、玉米、拟南芥或大豆，植物也可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦或粟；种子是水稻、玉米、拟南芥或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交种子。
[0169] 方法包括但不限于：
[0170] 转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞例如细菌细胞。
[0171] 产生转基因植物的方法包括转化将本发明公开的任意分离的核苷酸或重组DNA构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生转基因植物，本发明还涉及通过该方法生产的转基因植物，以及从该转基因植物获得的转基因种子。
[0172] 用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
[0173] 改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。
[0174] 增强植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。
[0175] 评价植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价转基因植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价所述转基因植物的子代植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价转基因植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价所述转基因植物的子代植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。
[0176] 确定植物一种农艺性状变化的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。所述方法可能还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。所述方法可能还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
[0177] 生产种子(例如耐氮素胁迫的，用于销售的种子)的方法包括前述的任一方法，还包括获得所述子代植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体。
[0178] 在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定转基因植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。
[0179] 在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定子代植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定子代植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。
[0180] 在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于自交玉米植株。
[0181] 在前述任一方法或本发明披露的其它实施方案中的任一方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。
[0182] 在前述任一方法或本发明的其它实施方案的方法中，在氮素胁迫条件条件下，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现为至少一个农艺性状的改变。
[0183] 在前述任一方法或者本发明其它实施方案的任一方法中，存在将重组DNA构建体导入可再生植物的供选方案，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，例如可以将一个调控序列(如一个或多个增强子、任选的转座子元件的一部分)导入可再生植物细胞，接着筛选带有调控序列和与其可操作连接的编码本发明多肽的内源基因的转基因事件。
[0184] 可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接DNA吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
[0185] 本领域的技术人员熟悉将编码所关注多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
[0186] 另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或包括调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其它的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活样(TAL)效应因子-DNA修饰酶(transcription activator-like effector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic Acids Res.39(12)和Boch等(2009)，Science 326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj等(2013)，Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。
[0187] 转基因植物中性状的重叠
[0188] 转基因植物可包含本发明公开的一个或多个耐旱性多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含靶多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本发明公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本发明所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本发明所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则靶多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与靶多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)，可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制靶多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。
实施例
实施例
[0189] 本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。
[0190] 实施例1.非生物胁迫耐性基因的克隆和载体的构建
[0191] 基于水稻激活标签突变体库的初步筛选和表2所示的基因ID的序列信息，设计引物，克隆水稻OsDN-LTP8、OsCYP76M5、OsFBX25、OsGH17和OsDN-LTP9基因。扩增引物和期望扩增的片段长度如表3所示。
[0192] 通过PCR的方法，以中花11水稻植株的叶、茎和根组织的混合cDNA为模板克隆OsDN-LTP9基因的cDNA；以中花11水稻植株的基因组DNA为模板克隆OsDN-LTP8、OsCYP76M5、OsFBX25和OsGH17基因的gDNA。
[0193] 表2.水稻基因名称、基因ID(TIGR)和构建体ID
[0194]基因名称 基因LOC ID 构建体ID
OsDN-LTP8 LOC_Os09g26530 DP0749
OsCYP76M5 LOC_Os08g43440 DP0788
OsFBX25 LOC_Os01g55210 DP0963
OsGH17 LOC_Os03g22530 DP0979
OsDN-LTP9 LOC_Os04g57804 DP1154
OsDN-LTP8 LOC_Os09g26530 DP0749
OsCYP76M5 LOC_Os08g43440 DP0788
OsFBX25 LOC_Os01g55210 DP0963
OsGH17 LOC_Os03g22530 DP0979
OsDN-LTP9 LOC_Os04g57804 DP1154
[0195] 表3克隆水稻非生物胁迫耐性基因的引物
[0196]
[0197] PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将这些基因克隆到植物双元载体DP0158(pCAMBIA1300-DsRed)中。
[0198] 所产生的过表达构建体见表2。DP0749构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-LTP8基因的编码序列为SEQ ID NO：1和2所示，OsDN-LTP8的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；DP0788构建体中克隆的核苷酸序列和OsCYP76M5基因的编码序列为SEQ ID NO：4和5所示，OsCYP76M5的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；DP0963构建体中克隆的核苷酸序列和OsFBX25基因的编码序列为SEQ ID NO：7和8所示，OsFBX25的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；DP0979构建体中克隆的核苷酸序列和OsGH17基因的编码序列为SEQ ID NO：10和11所示，OsGH17的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；DP1154构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-LTP9基因的编码序列为SEQ ID NO：13和14所示，OsDN-LTP9的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
[0199] 实施例2.转化获得转基因水稻株系
[0200] 在本研究中，所有过表达构建体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant Cell Rep.23:540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻(Oryza sativa L.)。中花11号水稻是中国农业科学院作物研究所培育的，我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子。载体通过农杆菌被转入水稻胚诱导的愈伤组织。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中，过表达载体含有标记基因，在绿色荧光灯下表现为红色的T1和T2代种子为转基因种子，用于后续性状筛选试验。
[0201] 实施例3.基因表达分析
[0202] 采用标准的实时RT-PCR程序分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。EF1αmRNA水平用于规范基因表达量。
[0203] 采用实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsDN-LTP8基因的相对表达量水平，ZH11-TC水稻中的表达量水平设置为1.00，与ZH11-TC相比，转基因株系中OsDN-LTP8基因表达水平增加了15-915倍，ZH11-TC为组织培养的ZH11水稻。OsDN-LTP8基因的实时RT-PCR引物如下：
[0204] DP0749-F1：5'-ACCAGTGAAGAGAAAGGCG-3'(SEQ ID NO：26)
[0205] DP0749-R1：5'-CTTGACATTTGCGAACTGGC-3'(SEQ ID NO：27)
[0206] 实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsFBX25基因的相对表达水平，ZH11-TC为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsFBX25基因的表达量在657-2128之间变动。OsFBX25在所有转基因株系中过量表达。
[0207] DP0963-F1：5'-AGTTGACGGTTGCCCAATAG-3'(SEQ ID NO：28)
[0208] DP0963-R1：5'-GTAGATGAAGATGGCCCGAG-3'(SEQ ID NO：29)
[0209] 实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsGH17基因的相对表达水平，DP0158为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsGH17基因的表达量在3408-
11266之间变动。DP0158是转化空载体的ZH11水稻植株，OsGH17在几乎所有转基因株系中过量表达。
11266之间变动。DP0158是转化空载体的ZH11水稻植株，OsGH17在几乎所有转基因株系中过量表达。
[0210] DP0979-F1：5'-GAATCTGAGACAGGAACGACAG-3'(SEQ ID NO：30)
[0211] DP0979-R1：5'-ATCTCGGTGACTTTGCTCG-3'(SEQ ID NO：31)
[0212] 实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsDN-LTP9基因的相对表达水平，ZH11-TC为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsDN-LTP9基因的表达量在253-1252之间变动。所有测试的OsDN-LTP9株系中基因的表达水平高于ZH11-TC幼苗。
[0213] DP1154-F1：5'-TTCATCTCCACTTCCCAACAC-3'(SEQ ID NO：32)
[0214] DP1154-R1：5'-CAGCAACCTGTGTCAAGAAAC-3'(SEQ ID NO：33)
[0215] 实施例4.转基因水稻植株的温室NUE筛选
[0216] 为了调查这些基因是否能增加水稻植株的低氮耐受性或氮素利用效率(NUE)，进行了转基因水稻植株的温室低氮试验。温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000-20,000lx，阴天时为6,000-10,000lx；温室相对湿度为30％-90％，温度为20-35℃。
[0217] NUE试验方法：
[0218] T2代转基因种子和对照种子首先采用800ppm的多菌灵在32℃消毒8h，然后使用蒸馏水冲洗3～5次，然后32℃浸种16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。发芽后的种子种植在装有蛭石的小盆中。本试验采用随机区组设计。每个筛选单元分为6个区块，其中包括1到2个对照(ZH11-TC和/或空载体)和9-12个转基因株系。每个转基因株系的12株幼苗种在6个盆中，并位于6个区块的不同位置。
[0219] 培养7-10天后，用表4所示含有0.75mM的氮素(KNO3)的改良的Hoagland营养液代替蒸馏水浇灌植株。为了提供有氧条件，每周一、三和五排出营养液，静置2-3小时后加入新的提供低氮条件的改良的Hoagland营养液。当在低氮溶液中培养35-40天后，测量分蘖(包括主茎和所有的分蘖)，使用SPAD仪(SPAD 502plus，KONICA MINOLTA公司制造)测定正数第二片叶三个不同位置的SPAD值，取其平均值作为SPAD值；并以百分之一的天平测量幼苗鲜重(从根和茎的连接处剪断)。将所有数据(分蘖数、SPAD值和鲜重)统计分析后选取P<0.05的植株为阳性植株。
[0220] 表4.水稻培养的改良Hoagland营养液
[0221]
[0222]
[0223] NUE筛选结果
[0224] 1)OsCYP76M5转基因水稻(DP0788)的验证结果
[0225] 选择8个OsCYP76M5转基因株系进行验证，并以ZH11-TC幼苗为对照。如表5所示，5个株系的SPAD植显著高于ZH11-TC对照，3个株系的鲜重显著高于ZH11-TC对照，这些结果表明，OsCYP76M5转基因水稻植株可能提高低氮耐受性或提高NUE。
[0226] 表5温室低氮条件下OsCYP76M5转基因水稻植株的低氮试验
[0227]
[0228] 2)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的验证结果
[0229] 选择10个OsFBX25转基因水稻株系进行测试，ZH11-TC和DP0158幼苗用作对照。当幼苗生长到3-叶期时，采用含有0.75mM的硝酸钾的Hoagland营养液培养水稻植株40天，OsFBX25转基因水稻的平均分蘖数和鲜重大于ZH11-TC和DP0158对照。如表6所示，2个转基因株系的分蘖数显著高于ZH11-TC对照，4个转基因株系的SPAD值和鲜重显著高于ZH11-TC对照；如表7所示，3个转基因株系的分蘖数，4个转基因株系的鲜重显著高于DP0158对照。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株提高了低氮耐性或增加NUE。
[0230] 表6温室低氮条件下OsFBX25转基因水稻植株的低氮试验(ZH11-TC用作对照)
[0231]
[0232] 表7.温室低氮条件下OsFBX25转基因水稻植株的低氮试验(DP0158用作对照)
[0233]
[0234] 3)OsGH17转基因水稻(DP0979)的验证结果
[0235] 10个OsGH17转基因株系进行了测试，ZH11-TC幼苗用作对照，并采用随机区组设计。当水稻植株生长到3-叶期时，采用含有0.75mM的硝酸钾的Hoagland营养液培养水稻植株，低氮胁迫28天后，测定分蘖数、SPAD值和鲜重。OsGH17转基因水稻的平均SPAD值和鲜重高于ZH11-TC对照，8个转基因株系的SPAD值和鲜重显著高于ZH11-TC对照(表8)。这些结果表明OsGH17转基因水稻获得了增加的低氮耐性或增加的NUE，过量表达OsGH17在增加NUE中起作用。
[0236] 表8温室低氮条件下OsGH17转基因水稻植株的低氮试验(ZH11-TC为对照)
[0237]
[0238] 实施例5.转基因水稻植株的实验室氯酸盐筛选
[0239] 硝酸盐是高等植物无机氮利用的主要来源。氯酸盐是硝酸盐类似物，植物通过氮素的吸收、转运系统吸收和转运氯酸盐，并通过硝酸还原酶(NR)还原为有毒化合物(亚硝酸盐)。为了进一步证明转基因水稻植物的氮素利用效率，用氯酸盐溶液处理水稻幼苗，对氯酸盐敏感的幼苗被认为具有增加的氮素利用效率或低氮耐受性。
[0240] 实验室氯酸盐试验方法：
[0241] 每个构建体选择大约10个株系进行氯酸盐试验。ZH11-TC和空载体(DP0158)转基因植株为对照。
[0242] 如实施例4所描述对T2代转基因种子和对照种子的进行消毒和并使其萌发，本试验在温度为28-30℃、相对湿度约30％的培养室中进行。种子萌发后置于底部有孔的管中，30℃水培6天至一叶一心期。选取高度为5.5cm的一致性幼苗用于氯酸盐筛选。本试验选用随机区组设计。每个容器分为5个区域，每个区域中随机将每个转基因株系放1行(每列12株)，ZH11-TC和DP0158幼苗放3行(3x12棵植株)。幼苗置于0.4mM的氯酸盐溶液中培养3-5天，光照/黑暗时间为10h/14h。处理幼苗首先进入黑暗时期进行氯酸盐吸收，并在第三天更换氯酸盐溶液。处理3-5天后，幼苗转入1/10Hoagland营养液(表6)中恢复培养4天。整株叶片枯萎和叶片全部失绿的幼苗被视为敏感幼苗。仅叶片或茎部坏死的幼苗，或叶片褪色的幼苗视为非敏感幼苗。
[0243] 本筛选以敏感率为参数，所述敏感率为敏感植株数除以总植株数的百分比。
[0244] 构建体水平(所有转基因植物与对照相比)和转基因株系水平(不同转基因株系分别与对照相比)的数据分析均采用“Y～seg+line(seg)+rep+error”统计模型，随机效应为“rep”，统计方法为“SAS Proc Glimmix”。
[0245] 氯酸盐试验结果：
[0246] 1)OsDN-LTP8转基因水稻(DP0749)的验证结果
[0247] 第一次试验中，对OsDN-LTP8转基因水稻用0.8mM的氯酸盐溶液进行处理5天后置于1/10的Hoagland营养液中恢复培养4天，480株OsDN-LTP8转基因幼苗中235株死亡(49％)，而300株ZH11-TC幼苗死亡60株(20％)，180株DP0158幼苗死亡52株(29％)。OsDN-LTP8转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果显示，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP8转基因幼苗在载体水平显示增强的氯酸盐敏感性。表9为转基因株系水平的分析，6个株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
[0248] 表9.OsDN-LTP8转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验)
[0249]
[0250] 在第二次试验中，测试同样的8个转基因株系，氯酸盐处理后，480株OsDN-LTP8转基因幼苗中251株死亡(52％)，而300株ZH11-TC幼苗死亡88株(29％)，180株DP0158幼苗死亡62株(34％)。OsDN-LTP8转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的进一步分析证明所有8个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC幼苗，4个转基因株系的敏感率显著高于DP0158幼苗(表10)。这些结果清楚一致的表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP8转基因水稻植株在载体水平和转基因株系水平增加幼苗的氯酸盐敏感性。OsDN-LTP8转基因水稻被认为具有较好的氮素利用效率或低氮耐性，过表达OsDN-LTP8基因可增加转基因植株的氯酸盐敏感性，并提高转基因植物的氮素利用效率或耐低氮性。
[0251] 表10.OsDN-LTP8转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)
[0252]
[0253] 2)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的验证结果
[0254] 第一次试验中，600株OsFBX25转基因幼苗中260株死亡(43％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡75株(42％)，180株DP0158幼苗死亡59株(33％)。OsFBX25转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照。这些结果表明，OsFBX25转基因幼苗在在载体水平显示增强的氯酸盐敏感性。转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的6个株系的敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照，且5个转基因株系的敏感率显著高于DP0158幼苗(表11)。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，OsFBX25提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。
[0255] 表11.OsFBX25转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感试验(第一次试验)
[0256]
[0257]
[0258] 第二次试验中，600株OsFBX25转基因幼苗中500株死亡(83％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡72株(40％)，180株DP0158幼苗死亡114株(63％)。OsFBX25转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的分析表明10个转基因株系中的9个株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158幼苗(表12)。这些结果进一步表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsFBX25转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，OsFBX25提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。OsFBX25转基因水稻也具有较好的氮素利用效率或低氮耐性，过量表达OsFBX25提高了转基因植物的氯酸盐敏感性，可能进一步提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。
[0259] 表12.OsFBX25转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)
[0260]
[0261]
[0262] 3)OsGH17转基因水稻(DP0979)的验证结果
[0263] 第一次试验中，氯酸盐处理后，600株OsGH17转基因幼苗中400株死亡(67％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡117株(65％)，180株DP0158幼苗死亡78株(43％)。OsGH17转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照，表明，OsGH17转基因幼苗提高了氯酸盐敏感性。转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的8个株系的敏感率高于DP0158对照(表13)。
这些结果表明，与DP0158幼苗相比，OsGH17转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，过量表达OsGH17提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。
这些结果表明，与DP0158幼苗相比，OsGH17转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，过量表达OsGH17提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。
[0264] 表13OsGH17转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验)
[0265]
[0266] 第二次试验中，氯酸盐处理后，600株OsGH17转基因幼苗中305株死亡(51％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡75株(42％)，180株DP0158幼苗死亡68株(38％)。OsGH17转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的分析表明8个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158幼苗(表14)。这些结果表明，OsGH17转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性。OsGH17转基因水稻也具有较好的氮素利用效率或低氮耐性，过量表达OsGH17提高了转基因植物的氯酸盐敏感性，可能进一步提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。
[0267] 表14OsGH17转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性分析(第二次试验)
[0268]
[0269] 4)OsDN-LTP9转基因水稻(DP01154)的验证结果
[0270] 第一次试验中，氯酸盐处理后，600株OsDN-LTP9转基因幼苗中196株死亡(33％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡49株(27％)，180株DP0158幼苗死亡41株(23％)。OsDN-LTP9转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照并高于ZH11-TC对照，表明，OsDN-LTP9转基因幼苗提高了氯酸盐敏感性。转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的6个株系的敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照(表15)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP9转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，过量表达OsDN-LTP9提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。
[0271] 表15.OsDN-LTP9转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感试验(第一次试验)
[0272]
[0273]
[0274] 第二次试验中，氯酸盐处理后，600株OsDN-LTP9转基因幼苗中380株死亡(63％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡64株(36％)，180株DP0158幼苗死亡87株(48％)。OsDN-LTP9转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsDN-LTP9转基因幼苗提高了氯酸盐敏感率。转基因株系水平的分析表明9个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC对照和5个株系的氯酸盐敏感率显著高于DP0158对照(表16)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP9转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性。OsDN-LTP9转基因水稻也具有较好的氮素利用效率或低氮耐性，过量表达OsDN-LTP9提高了转基因植物的氯酸盐敏感性，可能进一步提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。
[0275] 表16.OsDN-LTP9转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)
[0276]
[0277] 实施例6.转基因水稻的田间低氮筛选
[0278] 田间耐低氮试验在北京进行。设置两个氮素水平：N-0(不含氮的化肥)和N-1(每亩正常施用180kg氮)。种子萌发和幼苗培养如实施例4所述。萌发种子种植于田间苗床中，三叶期将幼苗移栽入试验田中，重复4次，每个转基因株系每个重复种植10株，4个重复种于同一个田块中。同一田块中临近转基因株系的ZH11-TC和DP0158植株作为对照，并用于统计分析。
[0280] 株高为抽穗后20天的水稻茎基部到穗顶端的长度，或茎基部到最高叶的长度。每行中间的六株水稻植株的株高被测量，其算数平均值视为转基因水稻的株高。
[0281] 生长季节结束时，从每个转基因株系中间收获六株代表植株。利用ASReml软件的混合线性模型统计分析株高和粒重数据。基于分析选择阳性转基因株系(P＜0.1)。
[0282] 1)OsDN-LTP8转基因水稻(DP0749)的田间NUE验证结果
[0283] 如表17所示，低氮条件下，载体水平上OsDN-LTP8转基因水稻的单株籽粒重量为31.07g，高于ZH11-TC对照的单株籽粒产量，并显著高于DP0158对照的单株籽粒产量。转基因株系水平上，所有12个株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照，6个株系的单株产量显著高于DP0158对照。
[0284] 如表18所示，低氮条件下，载体水平上OsDN-LTP8转基因水稻比ZH11-TC和DP0158幼苗高；转基因株系水平上，4个OsDN-LTP8转基因株系显著高于ZH11-TC对照，7个株系显著高于DP0158对照。这些结果表明OsDN-LTP8转基因水稻提高了低氮耐性。
[0285] 表17.OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)[0286]
[0287]
[0288] 表18OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的植株高度分析(第一次试验)
[0289]
[0290] 选择5个OsDN-LTP8转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。
[0291] 如表19、20和21所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsDN-LTP8转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsDN-LTP8转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsDN-LTP8基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。
[0292] 表19.OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)[0293]
[0294]
[0295] 表20.OsDN-LTP8转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析
[0296]
[0297] 表21.OsDN-LTP8转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析
[0298]
[0299] 2)OsCYP76M5转基因水稻(DP0788)的田间NUE验证结果
[0300] 12个OsCYP76M5转基因水稻株系(DP0788)、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表22所示，载体水平上，OsCYP76M5转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，2个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，1个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。这些结果表明OsCYP76M5转基因水稻可以提高低氮耐性。
[0301] 表22.OsCYP76M5转基因水稻在田间的籽粒产量分析
[0302]
[0303]
[0304] 3)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的田间NUE验证结果
[0305] 12个OsFBX25转基因水稻株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表23所示，载体水平上，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，9个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，5个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。
[0306] 表23.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮素条件下的籽粒产量分析(第一次试验)[0307]
[0308]
[0309] OsFBX25转基因水稻株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但并没有在测试田间产生低氮胁迫。如表24所示，载体水平上，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，1个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，8个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。
[0310] 表24.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)[0311]
[0312] 选择5个OsFBX25转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。
[0313] 如表25,26,27所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsFBX25基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。
[0314] 表25.OsFBX25转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析
[0315]
[0316]
[0317] 表26.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析
[0318]
[0319] 表27.OsFBX25转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析
[0320]
[0321] 4)OsGH17转基因水稻(DP0979)的田间NUE验证结果
[0322] 12个OsGH17转基因株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表28所示，载体水平上，OsGH17转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，并高于DP0158对照；转基因株系水平上，11个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。
[0323] 表28.OsGH17转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)
[0324]
[0325]
[0326] OsGH17转基因株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表29所示，载体水平上，OsGH17转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，所有12个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。
[0327] 表29.OsGH17转基因水稻在田间正产氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)
[0328]
[0329] 5)OsDN-LTP9转基因水稻(DP1154)的田间NUE验证结果
[0330] 12个OsDN-LTP9转基因株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表30所示，载体水平上，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照和P0158对照；转基因株系水平上，6个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。
[0331] 表30.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)[0332]
[0333] OsDN-LTP9转基因水稻株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表31所示，载体水平上，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照和DP0158对照；转基因株系水平上，4个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。
[0334] 表31.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)[0335]
[0336]
[0337] 选择5个OsDN-LTP9转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。
[0338] 如表32,33,34所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsDN-LTP9转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsDN-LTP9基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。
[0339] 表32.OsDN-LTP9转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析
[0340]
[0341] 表33.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析
[0342]
[0343] 表34.OsDN-LTP9转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析
[0344]
[0345] 实施例7.在玉米中转化和评价水稻低氮耐受性基因
[0346] 在玉米植株中过表达水稻耐低氮基因或来自于玉米、拟南芥或其它物种的同源基因。在玉米转化载体中组成型启动子控制基因的表达水平，所述组成型启动子可为玉米泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632and Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)或诸如胁迫应答类启动子等其它启动子。重组DNA构建体能通过粒子轰击法(国际专利WO 2009/006276)被转入玉米细胞中，或者，重组DNA构建体也可通过农杆菌介导转化法转入玉米植株中(Zhao等(2006)Meth.Mol.Biol.318：315-323；Zhao等(2001)Mol.Breed.8：323-333；美国专利No.5,981,840公开于1999年11月9日)。
农杆菌介导法的转化过程包括接种、共培养、静置、选择和植株再生。
农杆菌介导法的转化过程包括接种、共培养、静置、选择和植株再生。
[0347] 再生植株子代，如T1代植株，进行土壤中的低氮胁迫。在氮素胁迫之前和期间，利用图像分析软件多次测量植物面积、体积、生长率和颜色。在氮素胁迫期间，与对照相比其叶面积减少显著延迟，黄色积累减少，和/或生长率增加将被认为该基因在玉米中有增强的氮素利用效率。
[0348] 实施例8.水稻低氮耐受性基因在拟南芥中的实验室NUE筛选
[0349] 为了确认水稻耐低氮基因是否能提高双子叶植株的氮素胁迫耐受力或其它性状，通过农杆菌介导转化程序的花粉浸渍法将水稻耐低氮基因过表达载体转入拟南芥(哥伦比亚型)，并鉴定转基因植株(Clough,S.T.和Bent,A.F.(1998)The Plant Journal 16,735-743；Zhang,X.等(2006)Nature Protocols 1：641-646)。
[0350] 一个称为pBC-yellow的16.8-kb T-DNA双元载体用于本试验。所述载体包括RD29a启动子用以驱动ZS-Yellow基因的表达，ZS-Yellow基因能使种子表现黄色荧光。采用实施例1描述的方法克隆基因，并将基因构建到Gateway载体中。通过INVITROGENTM 技术，LR重组反应产生插入克隆，所述插入克隆包含定向克隆的PCR产物和pBC-yellow载体，用以产生过表达载体。
[0351] 生长室NUE筛选方法：
[0352] 挑选T1代有荧光的种子，表面消毒后，4℃黑暗层积处理3天。32株T1代植株与32株空载体(pBCyellow-空载体)对照植株相邻播种于低氮介质中，所述低氮介质包含如表35所述的0.5倍不含氮的Hoagland营养液，0.4mM硝酸钾，0.1％蔗糖，1mM MES和0.25％肌醇六磷酸TM。该试验重复两次。将培养盘水平放于生长室培养10天，生长室温度为22℃，相对湿度为60％，光照/黑暗时间为16h/8h。层积处理10-13天通过成像整个培养盘以评价植株状态。
[0353] 在屏蔽板图像去除背景颜色，每个植株收集两种不同的测量数据：莲座叶总面积，和归入绿色色调的百分比。利用色调、饱和度和数据强度(HSI)，绿色系的色调值为50-66。莲座叶总面积利用植株生物量衡量，然而绿色色调是氮积累剂量反应的指标(专利申请US20110209245)
[0354] 通过Nitrosight软件分析上述成像，通过比较每个32/64转基因幼苗和32/64空载体幼苗的像素值(分析植株大小)和Bin2密度(分析绿色叶片)用以分析类似参数。与空载体对照幼苗相比，叶片更绿和生长更好的转基因幼苗被认为具有显著增加氮素利用效率的能力。通过统计分析后，P值小于10-3的数据被认为验证的基因具有氮素利用效率。统计分析获得的数据，当一个重复或多个重复中在多天(试验的10-13天)的Bin2和叶面积的P值＜10-4时，认为基因具有较弱的功能，当P值＜10-5时，认为基因具有较强的功能。
[0355] 表35.培养拟南芥的改良后的Hoagland营养液
[0356]分子式 分子量 浓度(mM)
KNO3 101.1 0.4
MgSO4·7H2O 246.49 1.0
CaCl2 110.98 2.5
Na2HPO4 141.96 1.0
K2SO4 174.26 1.3
Fe-EDTA 367.1 4.6x10-3
MES 195.2 1.0
H3BO3 61.84 12.5x10-3
MnSO4·H2O 169.01 1.0x10-3
ZnSO4·7H2O 287.5 1.0x10-3
-3
CuSO4·5H2O 249.71 0.25x10
Na2MoO4·2H2O 241.95 0.25x10-3
KNO3 101.1 0.4
MgSO4·7H2O 246.49 1.0
CaCl2 110.98 2.5
Na2HPO4 141.96 1.0
K2SO4 174.26 1.3
Fe-EDTA 367.1 4.6x10-3
MES 195.2 1.0
H3BO3 61.84 12.5x10-3
MnSO4·H2O 169.01 1.0x10-3
ZnSO4·7H2O 287.5 1.0x10-3
-3
CuSO4·5H2O 249.71 0.25x10
Na2MoO4·2H2O 241.95 0.25x10-3
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