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使用组织技术的复杂性状

阅读：127发布：2020-05-17

专利汇可以提供使用组织技术的复杂性状专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供产生近交植物的方法，所述植物包括L1幼芽分生组织层中的第一和第二性状以用于产生周缘嵌合体植物，因而获得的近交植物，所述近交植物在产生所述周缘嵌合体植物中的应用，用所述近交植物产生所述周缘嵌合体植物的方法，因而获得的周缘嵌合体植物，所述周缘嵌合体植物在产生植物产品中的应用以及因而获得的植物产品。，下面是使用组织技术的复杂性状专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于产生周缘嵌合体植物的方法，所述植物包含至少第一和第二定位于L1的感兴趣的性状的组合，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供第一植物，其包含所述定位于L1的感兴趣的性状的组合；
b)提供第二植物，其不包含所述性状的组合；和
c)制备周缘嵌合体植物，其包含所述第一植物的L1幼芽分生组织层和所述第二植物的L2及L3幼芽分生组织层。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一性状是来自不包含所述第二性状的野生物种的定位于L1的性状，且其中所述第二性状是来自不包含所述第一性状的栽培品种的定位于L1的性状。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一性状是生物或非生物胁迫抗性性状，且所述第二性状是果实颜色性状和/或接受由第二植物所产生的花粉的能力。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一植物是包含所述第一性状的第一亲本植物与包含所述第二性状的第二亲本植物的F1-杂交种或近交植物。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过遗传修饰引入所述组合的定位于L1的性状的至少一种而获得所述第一植物。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物或非生物胁迫抗性衍生自下组中的任何一种：抗旱性、昆虫抗性、抗真菌性、抗卵菌性、酰基糖产生水平和/或组成，或其任何组合。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种其他定位于L1的性状选自下组中的任何一种：果实颜色、接受由植物本身所产生的花粉的能力，和其组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一植物是商业无关的植物，且其中第二植物是商业相关品种或栽培品种。
9.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述第一亲本植物是商业无关品种或野生物种，且其中第二亲本植物是商业相关品种或栽培品种。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和第二植物属于茄属。
11.包含前述权利要求中任一项所定义的至少第一和第二定位于L1的感兴趣的性状的组合的第一植物在产生周缘嵌合体植物中提供L1幼芽分生组织层的用途。
12.通过权利要求1-10中任一项所述的方法可获得的周缘嵌合体植物，或其无性衍生的植物。
13.如权利要求12所定义的周缘嵌合体植物用于产生植物产品的用途。
14.一种从权利要求12所定义的周缘嵌合体植物产生植物产品的方法，其中所述方法包括以下步骤：
A)提供权利要求12的周缘嵌合体植物；
B)使步骤A)的周缘嵌合体植物生长；
C)从步骤B)中生长的植物获得植物产品；和
D)任选地，进一步加工步骤C)所得的植物产品。
15.通过权利要求14所述的方法可获得的植物产品。

说明书全文

使用组织技术的复杂性状

技术领域

[0001] 本发明涉及农业领域。具体地，本发明涉及用组织技术产生具有复杂性状的植物。

[0002] 发明背景

[0003] 增强作物性状的标准解决方案是遗传学和育种。然而，通过杂交(有性杂交)在商业相关品种中引入新性状，同时维持(多基因组和/或复杂)商业相关性状如果实大小和作物产量，需要繁琐而长期的过程或杂交和选择(基因渗入)。尽管遗传修饰工具可以在相对快速的时间跨度中获得新性状，但这些技术尚未被广泛接受用于修饰(作物)植物性状。因此，需要创新的但商业上可接受的方式在植物，尤其是作物中引入性状。

[0004] 本发明提供的解决方案

[0005] 本发明人首次以与本领域杂交和选择的情况相比显著缩短的时间跨度产生了携带新性状的商业相关作物，而不采用遗传修饰技术。本发明人联用组织技术与经典杂交技术来达到此目标。通过使用组织技术，本发明大幅减少所需回交和/或自交的量和连锁累赘问题。事实上，本发明允许产生另外情况下不存在的表型。

[0006] 在双子叶植物中，在幼芽(shoot)分生组织中通常存在3个单独细胞层(L1-、L2-和L3-幼芽分生组织层)。这些不同的幼芽分生组织层产生自限制性定向细胞分裂。幼芽分生组织层以有序模式产生所有地上器官：最外层是L1，直接位于下面的细胞包括L2，且内部组织确定L3。衍生自顶端(shoot apical)分生组织三个细胞层中各干细胞的细胞和组织具有顶端分生组织三个细胞层中这些干细胞的各种基因型。尽管空间上分开，这些层彼此整合且联通(如Curr Opin Plant Biol.2008年2月；11(1)；42-48)。组织技术方法过去用于研究这些分生组织层中的差异基因表达和性状定位(如Filippis等.Using a periclinal chimera to unravel layer-specific gene expression in plants,The Plant Journal,2013,75:1039-1049)，所述技术方法中，栽培种的1个或2个幼芽分生组织层被另一个取代，产生所谓的周缘嵌合体。此外，进行了研究此技术对提供新品种的有用性的初步研究，例如通过制备茄属植物和正使用的番茄的嵌合体，然而结果令人失望(Lindsay等.Graft chimeras and somatic hybrids for new cultivars,New Zealand journal of Botany,1995,第33卷:79-92)。

[0007] 发明人现在首次使用这些组织技术方法在相对短时间跨度内成功产生包含新性状的商业相关作物。发明人鉴定了定位于L1幼芽分生组织层的某些性状。通过使用组织技术方法，第一植物的L1幼芽分生组织层优化成包括这类感兴趣的定位于L1的性状且优选具有本文定义的具体基因型，能与没有所述性状的商业相关的第二植物的其他幼芽分生组织层组合，以产生具有新的感兴趣的性状的商业相关周缘嵌合体植物。由于第一植物不需要整体优化成商业相关，获得包含新的感兴趣的性状的商业相关植物所需的步骤数显著减少。另外，本发明提供解决方案以引入过于复杂而无法基因渗入的性状。

发明内容

[0008] 条款1.

[0009] 一种用于产生周缘嵌合体植物的方法，所述植物包含至少第一和第二定位于L1感兴趣性状的组合，其中所述方法包括以下步骤：

[0010] a)提供第一植物，其包含所述定位于L1感兴趣性状的组合；

[0011] b)提供第二植物，其不包含所述性状的组合；和

[0012] c)制备周缘嵌合体，其包含第一植物的L1幼芽分生组织层和第二植物的L2及L3幼芽分生组织层。

[0013] 条款2.

[0014] 如条款1所述的方法，其中所述第一性状是来自不包含所述第二性状的野生物种的定位于L1的性状，且其中所述第二性状是来自不包含所述第一性状的栽培品种的定位于L1的性状。

[0015] 条款3.

[0016] 如条款1或2所述的方法，其中所述第一性状是生物或非生物胁迫抗性性状且所述第二性状是果实颜色性状和/或接受由第二植物所产生的花粉的能力。

[0017] 条款4.

[0018] 如前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一植物是包含所述第一性状的第一亲本植物与包含所述第二性状的第二亲本植物的F1-杂交种或近交植物。

[0019] 条款5.

[0020] 如前述条款中任一项所述的方法，其中通过遗传修饰引入所述组合的至少第一和第二定位于L1的性状中的至少一种获得所述第一植物。

[0021] 条款6.

[0022] 如前述条款中任一项所述的方法，其中所述生物或非生物胁迫抗性衍生自下组中的任何一种：抗旱性、抗昆虫(粉虱)性、抗真菌(白粉病)性、抗卵菌(疫霉)性、酰基糖产生水平和/或组成，或其任何组合。

[0023] 条款7.

[0024] 如前述条款中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他定位于L1的性状选自下组中的任何一种：果实颜色、接受由植物本身所产生的花粉的能力，和其组合。

[0025] 条款8.

[0026] 如前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一植物是商业无关的植物，且其中第二植物是商业相关品种或栽培品种。

[0027] 条款9.

[0028] 如条款2-8中任一项所述的方法，其中所述第一亲本植物是商业无品种或野生物种，且其中第二亲本植物是商业相关品种或栽培品种。

[0029] 条款10.

[0030] 如前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一和第二植物属于茄属(Solanum)。

[0031] 条款11.

[0032] 包含前述条款中任一项所定义至少第一和第二定位于L1感兴趣性状的组合的第一植物在产生周缘嵌合体植物中提供L1幼芽分生组织层的用途。

[0033] 条款12.

[0034] 通过条款1-10中任一项所述方法可获得的周缘嵌合体植物，或其无性衍生的植物。

[0035] 条款13.

[0036] 如条款12所定义的周缘嵌合体植物用于产生植物产品的用途。

[0037] 条款14.

[0038] 从条款12所定义周缘嵌合体植物产生植物产品的方法，其中所述方法包括以下步骤：

[0039] A)提供条款12的周缘嵌合体植物；

[0040] B)使步骤A)的周缘嵌合体植物生长；

[0041] C)从步骤B)中生长的植物获得植物产品；和

[0042] D)任选地，进一步处理步骤C)所得的植物产品。

[0043] 条款15。

[0044] 通过条款14所述的方法可获得的植物产品。

[0045] 附图简要说明

[0046] 图1：3种植物基因型上成年烟粉虱(Bemisia Tabaci)的平均数目。A：番茄(S.lycopersicum)，其上转移潘那利番茄(S.pennellii)×番茄的L1幼芽分生组织层(测试植物；周缘嵌合体，具有番茄L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄杂交的F1的L1)；B：番茄(易感性对照)；C：潘那利番茄×番茄(F1；抗性对照)。

[0047] 图2：3种植物基因型上烟粉虱卵的平均数目。A：番茄，其上转移潘那利番茄×番茄的L1幼芽分生组织层(测试植物；周缘嵌合体，具有番茄L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄杂交的F1的L1)；B：番茄(易感性对照)；C：潘那利番茄×番茄(F1；抗性对照)。

[0048] 图3：3种植物基因型上烟粉虱若虫的平均数目。A：番茄，其上转移潘那利番茄×番茄的L1幼芽分生组织层(测试植物；周缘嵌合体，具有番茄L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄杂交的F1的L1)；B：番茄(易感性对照)；C：潘那利番茄×番茄(F1；抗性对照)。

[0049] 图4：3种植物基因型上烟粉虱的蜕皮的平均数目。A：番茄，其上转移潘那利番茄×番茄的L1幼芽分生组织层(测试植物；周缘嵌合体，具有番茄L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄杂交的F1的L1)；B：番茄(易感性对照)；C：潘那利番茄×番茄(F1；抗性对照)。

[0050] 图5：种子的密度分布。在密度级“3”，线从上到下表示：F1_嵌合体(嵌合体与株系PP异花受精的后代)和F1_TT(非嵌合植物TT与株系PP异花受精的后代)。

[0051] 图6：种子的发芽速率(germination rate)。左侧柱代表F1_TT(非嵌合植物TT与株系PP异花受精的后代)，右侧柱代表F1_嵌合体(嵌合体与株系PP异花受精的后代)。

[0052] 图7：体外发芽能力。顶部的线代表F1_嵌合体(嵌合体与株系PP异花受精的后代)，底部的线代表F1_TT(非嵌合植物TT与株系PP异花受精的后代)。

[0053] 图8：TH杂种种子的具体重量。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系HH异花受精的后代)，灰线代表F1_TT(对照；TT与株系HH异花受精的后代)。

[0054] 图9：TH杂种种子的发芽速率。黑色的柱代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系HH异花受精的后代)，灰色的柱代表F1_TT(对照；TT与株系HH异花受精的后代)。

[0055] 图10：TH杂种种子的发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系HH异花受精的后代)，灰线代表F1_TT(对照；TT与株系HH异花受精的后代)。

[0056] 图11：说明有不同发芽能力的株系发芽种子随着时间发展的百分比。发芽能力是发芽种子数目，表示为给定时间段内种植种子总数的百分比。采用的时间段长到足以确保发芽种子数随时间平稳并达到平台期。例如，此时间段是峰值时间的3倍。当所有种子发芽时，此平台期可以是100％，或者在一些种子根本没发芽的情况中，其可以是更低的百分比。在图中，株系B是有80％发芽能力的对照株系。株系A是发芽能力提高(100％)的株系示例，株系C是较低发芽能力的示例。

[0057] 图12：说明峰值时间的概念的图。峰值时间是发芽曲线切线最陡的时间点，即每单位时间的发芽种子增加最高。峰值时间是与发芽动力学相关的时间点，能用于定义评价发芽能力所需的时间段，如等于从种子种植到峰值时间的时间跨度的2、3、4或5倍，优选3倍的时间段。

[0058] 图13：4种植物基因型上成年温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)数目(均值±标准偏差)。A：番茄(易感性对照)；B：周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄F1的L1(测试植物)；C：周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自多毛番茄(S.habrochaites)×番茄F1的L1(测试植物)；D：周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自醋栗番茄(S.pimpinellifolium)×番茄F1的L1(测试植物)。

[0059] 图14：3种植物基因型上烟粉虱在5天后的死亡率。A：番茄(易感性对照)；B：转移来自番茄与潘那利番茄×番茄的杂交的BC1S3(测试植物)；C：转移来自番茄与潘那利番茄×番茄的杂交的BC1S4(测试植物)。

[0060] 图15：3种植物基因型上烟粉虱卵在5天后的死亡率(均值±标准偏差)。A：番茄(易感性对照)；B：番茄×潘那利番茄(供体植物)的BC1S3；C：番茄×潘那利番茄(供体植物)的BC1S4。

[0061] 图16：3种植物基因型上蓟马在2天后的死亡率。A：番茄(易感性对照)；B：番茄×潘那利番茄(供体植物)的F1；C：周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄F1的L1(测试植物)。

[0062] 图17：3种植物基因型上沉积的卵数目(均值±标准偏差)。A：番茄(易感性对照)；B：周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自潘那利番茄×番茄F1的L1(测试植物)；C：
周缘嵌合体，具有来自番茄的L2和L3以及来自多毛番茄×番茄F1的L1(测试植物)。

[0063] 图18：2种植物基因型上以mm计的损伤直径(均值±标准偏差)。A：番茄(易感性对照)；B：周缘嵌合体，具有来自番茄L2和L3以及来自多毛番茄×番茄F1的L1(测试植物)。

[0064] 图19：通过牛肉番茄(beef tomato)植物(对照)或嵌合体自交产生的BB种子的体外发芽能力，所述嵌合体包含牛肉番茄的L2和L3以及来自杂交种Ailsa Craig×樱桃型番茄近交系F1的L1(嵌合体：黑线)。

[0065] 图20：MH2种子的体外发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系H2H2异花受精的后代)，灰线代表F1_MM(对照；MM与株系H2H2异花受精的后代)。

[0066] 图21：MH2种子的体外发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系H2H2异花受精的后代)，灰线代表F1_MM(对照；MM与株系H2H2异花受精的后代)。

[0067] 图22：MP2种子的体外发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系P2P2异花受精的后代)，灰线代表F1_MM(对照；MM与株系P2P2异花受精的后代)。

[0068] 图23：MP2种子的体外发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系P2P2异花受精的后代)，灰线代表F1_MM(对照；MM与株系P2P2异花受精的后代)。

[0069] 图24：MP3种子的体外发芽能力。黑线代表F1_嵌合体(嵌合体；嵌合体与株系P3P3异花受精的后代)，灰线代表F1_MM(对照；MM与株系P3P3异花受精的后代)。

[0070] 发明描述

[0071] 定义

[0072] 在下列描述和实施例中，使用一些术语。为了提供对说明书和权利要求的清晰一致的理解，包括给予这类术语的范围，提供以下定义。除非本文另有定义，所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的意义。

[0073] 本文所用的术语“包含(comprising)”和“包含(comprise)”及其词形变化，指这样的情况，其中使用所述术语非限制性地指，包括单词后面的项目，但不排除没有具体提及的项目。还涵盖更限制性的动词“由...组成”。另外，通过不定冠词“一(a)”或“一(an)”提到要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一种速素。不定冠词“一(a)”或“一(an)”因而通常指“至少一种”。

[0074] 本文所用的术语“和/或”指这样的情况，其中可出现一种或多种规定情况，单独或与至少一种规定情况，多至所有规定情况组合。

[0075] “近交”在本文中理解为受控自花受精、同胞交配或回交轮回亲本，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10代，优选至少连续3代的受控自花受精、同胞交配或回交轮回亲本。产生自F1-杂交植物自花受精、同胞交配或回交的植物在本文命名为近交植物。

[0076] 本文所用的术语“性状”指表型性状，即可观察和可测量的性质。性状由基因表达以及环境因素，和基因表达与环境因素之间的相互作用确定。植物性状的示例是(但不限于)：果实大小、果实数、每公顷的kg产量、植物高度、相对生长速率、开花时间、改善的种子发芽、叶面积、疾病和/或有害生物抗性、抗旱性、产量构成和果实颜色。优选地，性状是商业相关性状。本文定义的另一性状应理解为能在表型基础上彼此区分的不同性状。任选地，性状能在基因型基础上评价，如果本领域技术人员已知负责所述性状的一或多个基因和/或多态性。所述一种或多种其它本文所定义性状可能是复杂性状，意思是多个基因参与且有助于所述性状。“其它性状”应理解成第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十性状等等。可以期望，性状增加(改善)或减少(恶化)的，且与亲代相比，群体特征的平均值的各种变化能提高植物代(plant generation)的经济价值。在本文中，如果植物与对照植物(优选相同或类似植物)(称为不包含、显示、携带或具有性状)相比，显示所述性状显著更多或增加(如至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％或更多)，所述植物称为“包含、显示、携带或具有所述性状”。植物性状相对于对照植物的增加在受控环境情况下确定，所述环境情况对于感兴趣植物和对照植物而言在本质上是相同或类似的。本领域技术人员能选择测量性状的受控环境情况或条件。

[0077] “类似的环境条件”指使用类似的温度、湿度、营养和光条件，以及类似的灌溉、昼夜节律和施肥制度。例如，这些条件是植物生长的条件，所述植物能用于本发明方法，包括但不限于具有周缘嵌合体L3幼芽分生组织层干细胞基因型的非嵌合植物，或具有周缘嵌合体L1幼芽分生组织层干细胞基因型的非嵌合植物。类似的环境条件包括相同的环境条件。

[0078] 性状可以是“商业相关性状”，只要这类性状与植物或植物品种的经济价值相关，这由市场和植物或作物类型确定。本领域技术人员知道在特定情况下哪些是商业相关性状。例如，若植物是作物且市场需要来自所述作物的特定产量(以每公顷kg计)，充足的产量能视作商业相关性状。本领域技术人员知道在给定情况下哪些被视作特定作物的“充足产量”。此外，如果植物是结实作物且市场需要具有特定颜色的果实，此性状能视作商业相关性状。结实作物的另一商业相关性状可以是接受由植物本身所产生的花粉的能力，用于使植物结果，而不需要(人工)给植物异花传粉。

[0079] “有害生物抗性”或“有害生物抗性增加/提高”在本文中用于指植物承受一种或多种植物有害生物攻击的能力提高(相较于不携带抗性的对照植物)，或换言之，指植物的疾病症状相较于对照植物显著减少。有害生物抗性或有害生物抗性提高可用多种方法确定。通常，如下用视觉方法评分(生物检测或实地)疾病症状：在感染或接触有害生物(如节肢有害生物、昆虫有害生物、真菌有害生物、细菌有害生物、卵菌或病毒有害生物)后的一个或多个时间点，评价疾病症状。替代的方法包括检测且任选定量有害生物的方法。因此，如果组织之中/之上检测到的有害生物量或数目相较于对照显著较少，或如果有害生物传播显著慢于对照，则植物可显示提高的有害生物抗性。最后，当在等同昆虫有害生物压力(优选田间)下生长时，有害生物抗性相较于对照显著增加(如至少1％、2％、5％、10％或更多)可提供对有害生物抗性提高的间接测量。

[0080] “生物胁迫抗性”或“有害生物抗性”可以是抵御有害节肢动物、有害真菌、有害细菌、有害卵菌或有害病毒的抗性。节肢有害节肢动物可以是但不限于螨(叶螨(spider mite)如二斑叶螨(Tetranychus urticae)和伊氏叶螨(Tetranychus evansi))、鳞翅目(咀嚼组织的毛虫如番茄斑潜蝇(Tuta absoluta))、鞘翅目(咀嚼组织的甲虫如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata))、半翅目(吸汁蚜虫如大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)或粉虱如烟粉虱等)、缨翅目(细胞内含物食性蓟马如西花蓟马(Frankliniella occidentalis))和双翅目(潜叶蝇如斑潜蝇(Liriomyza bryoniae))；有害真菌可以是但不限于白粉菌(Oidium neolycopersici)(导致白粉病)、黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)(导致叶霉病)和灰霉菌(Botrytis cinerea)(导致灰霉病)；有害细菌可以是但不限于辣椒斑点病黄单孢菌(Xanthomonas vesicatoria)(导致细菌性叶斑病)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(导致细菌性斑点病)；有害卵菌可以是致病疫霉(Phytophthora infestans)(导致晚疫病)抗性；且有害病毒可以是但不限于马铃薯X病毒和凤果花叶病毒。

[0081] “非生物胁迫抗性”在本文中用于指植物在特定环境下承受一种或多种非生命(如物理)因素对活生物负面影响的能力提高(相较于不携带抗性的对照植物)，如干旱、渗透胁迫和/或盐度、UV、冷、热、异生物质处理(如除草剂和/或激素)以及机械胁迫。换言之，其指植物在非生物胁迫条件下相较于对照植物(优选不携带抗性的植物)不良反应显著减少或生长(如产量)显著增加。

[0082] “定位于L1的性状”在本文中应理解为“定位于L1幼芽分生组织层的性状”，其是基本上位于L1幼芽分生组织层内的性状，且至少基本上通过L1幼芽分生组织层基因型，可能与一种或多种环境因素一起，确定。使用具有性状L1幼芽分生组织层产生周缘嵌合体植物时，位于L1幼芽分生组织层内的此性状传递到周缘嵌合体植物，即使用于产生所述周缘嵌合体植物的L2和/或L3幼芽分生组织层没有所述性状。这类性状的示例是但不限于果实颜色、有害生物抗性、抗旱性、接受由特定植物优选植物本身所产生的花粉的能力以及改善的种子发芽。性状是否是位于L1幼芽分生组织层内的性状，可通过组织技术评价，即通过研究植物内所包含的性状是否转移到周缘嵌合体植物，该周缘嵌合体植物用包含所述性状的所述植物的L1幼芽分生组织层以及不显示所述性状的植物的L2和L3幼芽分生组织层制备。

[0083] “品种”在本文中应理解为具有类似性状的一组个体或植物，所述性状能一代代“纯种”复制。

[0084] “商业相关植物或植物品种”在本文中应理解为具有足够商业相关性状以满足市场需求的植物或植物品种，即具有经济价值。因此，这类品种包括至少某些本质性状以商业相关，这取决于所述品种的作物种类和进一步的特定环境情况如气候。本领域技术人员了解商业相关品种的这些性状要求。这些性状在上文定义为商业相关性状。

[0085] “商业无关植物或植物品种或植物种类”在本文中应理解为没有至少一种基本商业相关性状的植物或品种或种类，需要所述性状以使植物或品种或种类在商业相关。例如，若番茄植物缺乏接受植物本身所产生的花粉的能力，这类番茄植物不具有商业相关的经济价值或价值不足，因为这些植物需要人工授粉。

[0086] “栽培品种”在本文中应理解为由人为干预产生的商业相关品种，即通过就所需性状进行育种和选择而产生。

[0087] “野生物种”是天然发育和出现的植物物种，即没有育种和选择的人为干预。

[0088] “作物”在本文中应理解为收获用于食物、衣服、牲畜、饲料、生物燃料、药物或其他用途如装饰用途的植物。

[0089] 术语“后代”指通过互交获得的第一或更多代。F1-杂交种在本文中应理解为第一代的后代，其产生自基因上不同个体的杂交，优选来自不同品种的2种植物之间的杂交，或来自栽培品种与野生物种之间的杂交。

[0090] 术语“表型”指个体性状的综合，例如但不限于形态、物理、生化、发育或行为性状，因而其通过基因表达以及环境因素，和基因表达与环境因素之间的相互作用来确定。

[0091] 本文所用的术语“基因型”指细胞、生物或个体的基因组成(即个体的特异等位基因组成)，通常是关于研究中的感兴趣的具体特征或表型性状。然而，不是所有表型相同的生物必定看上去或表现相同，因为外观和行为是通过环境和发育条件修饰的。同样，不是所有看起来像的生物必定具有相同表型。

[0092] 本文所用的术语“基因分型”或“确定基因型”指确定物种中个体间遗传变异的过程。单核苷酸多态性(SNP)是用于基因分型的最常见遗传变异类型，且定义为在大于1％群体中发现的特定基因座处的单碱基差异。SNP在基因组的编码和非编码区域中都发现且可能与感兴趣表型性状相关，如感兴趣的定量表型性状。由此，SNP能用作感兴趣的定量表型性状的标记物。另一用于基因分型的常见遗传变异类型是“InDel”或不同长度的核苷酸插入和缺失。对于SNP和InDel遗传变异，存在许多方法以确定基因分型和个体。所选方法一般取决于所需通量，其是就各个体而言正在进行基因分型的个体数目和正在测试的个体数目的函数。所选方法还取决于可获自各个体或样品的样品材料量。例如，测序可用于确定标记物如SNP的存在与否，例如桑格测序和高通量测序技术(HTS)。桑格测序可涉及经检测通过(毛细管)电泳测序，其中多至384个毛细管可以是在一轮中分析的序列。高通量测序涉及数千或数百万或更多序列的一次平行测序。HTS能定义为二代测序(Next Generation sequencing)，即基于固相焦磷酸测序的技术，或基于单核苷酸实时测序(SMRT)的三代测序(Next-Next Generation sequencing)。HTS技术可用，如由Roche、Illumina和Applied Biosystems(Life Technologies)提供。其他高通量测序技术由以下描述和/或获得：Helicos、Pacific Biosciences、Complete Genomics、Ion Torrent Systems、Oxford Nanopore Technologies、Nabsys、ZS Genetics、GnuBio。这些测序技术每个都有自己的制备样品方法，然后是实际测序步骤。这些步骤可纳入高通量测序方法。某些情况中，出于效率或经济原因，特定用于测序步骤的步骤可纳入样品制备操作，然后是实际测序步骤。例如，连接片段的连接物(adapter)可包含能用于后续测序步骤的区段(所谓的测序adapter)。用于在测序前扩增片段亚组的引物可包含在其序列内引入区段的部分，所述区段能随后用于测序步骤，例如通过扩增步骤引入测序适配子或扩增子的捕获部分，该部分能用于后续测序步骤。还根据所用测序技术，可省略扩增步骤。

[0093] 本文所用的术语“分子标记技术”指(基于DNA的)试验，其指示(直接或间接)个体(作物)植物中是否存在感兴趣的标记等位基因。优选地，其允许例如通过测序确定，特定等位基因是否存在于任何个体中的基因座的位置之一。

[0094] 本文所用的术语“基因座(locus)”或“基因座(loci)”(复数)指基因组上的一个或多个特异位点(位置)。例如，“基因座”指基因组中的位点，其中发现基因座的2个等位基因(对于二倍体生物)，或在多倍体个体或植物情况中的多个等位基因。数量性状基因座(QTL)是含有数量性状相关等位基因的基因组位点(基于基因型/表型关系模型)。

[0095] 术语“等位基因”指在特定基因座位置之一存在的核苷酸序列变体。对于每基因座1个等位基因，二倍体个体具有2个位置，1个位置在2条同源染色体中的任一上。对于特定基因座的各个位置，群体内可存在一个或多个替代核苷酸序列变体，即对于各位置，群体内可存在不同的可能的等位基因。然而，各个体能在基因座各位置上仅具有一个可能的等位基因。替代的核苷酸序列变体即不同的可能等位基因，至少在核苷酸序列中略有差异，且通常能根据至少一个SNP或InDel存在与否来区分。当本文指“等位基因状态”时，即提及特定基因座内某一位置处是否存在等位基因，这能表示为各标记物(如SNP或InDel)在特定基因座的存在与否。

[0096] 本文所用的术语“杂合”指当2个不同等位基因位于特异基因座时存在的基因情况，所述特异基因座例如具有等位基因A/B的基因座，其中A和B各位于2条同源染色体中任一上。相反，本文所用的术语“纯合”指2个相同等位基因位于特异基因座时存在的基因情况，所述特异基因座例如具有等位基因A/A的基因座，各位于2条同源染色体中任一上。

[0097] “周缘嵌合体”是这样的嵌合体，其中一个或多个完整细胞(组织)层L1、L2、和/或L3在遗传上不同于另一细胞层。在周缘嵌合体的情况中，单一组织层本身是同源的且不嵌合。周缘嵌合体是最稳定的嵌合体形式，产生独特和有价值的植物表型。这些植物产生腋芽，与生成其的终端分生组织(terminal meristem)具有相同的顶端组织形式。因此，周缘嵌合体能通过营养繁殖进行繁殖且维持其嵌合的层组织形式。周缘嵌合体能通过一个幼芽分生组织层(L1-,L2-,L3-)中干细胞的体细胞诱变来制备。周缘嵌合体也能通过合成方法产生，例如Szymkowiak,E.J.,和Sussex,I.M.(1992)，The internal meristem layer(L3)determines floral meristem size and carpel number in tomato periclinal chimeras,Plant Cell 4,1089-1100所述。所述周缘嵌合体是2个嫁接品种之间出现的种间细胞层移植示例。此特定方法在环境条件、生长室或温室中实施。其由2种植物的常规嫁接组成，一种作为砧木且另一种作为接穗。嫁接部在愈合后切除并允许再生不定芽。在这些不定芽中，嵌合体能自发出现。体外合成技术也被开发成以产生周缘嵌合体。这些包括：(1)共培养细胞，其中来自2种不同植物的毗邻茎段切片一起培养成嵌合体愈伤组织，且不定嵌合芽再生自补充激素的体外生长培养基中的这些愈伤组织。(2)混合的愈伤组织培养物，其中混合2种不同植物的细胞悬液，混合物生长成嵌合体愈伤组织，且不定嵌合芽再生自补充激素的体外生长培养基中的这些愈伤组织。(3)共培养原生质体，其中2种不同植物的原生质体悬液包埋于琼脂糖并生长到极高细胞密度，在其上嵌合芽再生于补充激素的体外生长培养基。(4)体外嫁接培养，其中2种籽苗在无菌条件下沿其子叶下轴嫁接，且培养嫁接物接近顶点的横截面以诱导嵌合不定愈伤组织和芽。这类技术被归入组织培养的共同性质，且由大量不同操作组成，所述操作可特异于个体株系或物种。技术人员应了解如何将2种不同植物的细胞在组织培养中集合起来，以使植物再生，所述植物可以是或不是周缘嵌合体。对于植物嵌合体的详细综述，参见“Plant Chimeras”,Richard A.E.Tilney-Bassett(Cambridge University Press,1991)。

[0098] “茄科”在本文中指属于茄科的植物属、物种和其品种。这些包括属于茄属(包括番茄，其曾称为Lycopersicon esculentum)、烟草属、辣椒属、矮牵牛属和其他属的物种[0099] 本说明书引用的所有专利和参考文献通过引用全文纳入本文。

[0100] 发明详述

[0101] 预期本文所述的任何方法、用途、植物或植物产品能结合本文所述任何其他方法、用途、植物或植物产品来实施。在本发明的方法、用途、植物和/或植物产品上下文中讨论的实施方案可结合本文所述任何其他方法、用途、植物或植物产品来使用。因此，涉及一种方法、用途、植物或植物产品的实施方案也可应用于本发明其他方法、用途、植物和植物产品。

[0102] 提供产生包含感兴趣的L1-定位的性状的周缘嵌合体植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

[0103] a)提供包含所述感兴趣的L1-定位的性状的第一植物；

[0104] b)提供不包含所述感兴趣的L1-定位的性状的第二植物；

[0105] c)制备包含第一植物L1幼芽分生组织层和第二植物L2及L3幼芽分生组织层的周缘嵌合体植物。

[0106] 优选地，本发明方法用于产生包含感兴趣的L1-定位的性状组合的周缘嵌合体植物，其中所述方法包括以下步骤：

[0107] a)提供包含所述感兴趣的L1-定位的性状组合的第一植物；

[0108] b)提供不包含所述感兴趣的L1-定位的性状组合的第二植物；

[0109] c)制备包含第一植物L1幼芽分生组织层和第二植物L2及L3幼芽分生组织层的周缘嵌合体植物。

[0110] 还提供本文所定义的第一植物和所述第一植物在产生包含所述第一植物的L1幼芽分生组织层的周缘嵌合体植物中的用途。

[0111] 感兴趣的L1-定位的性状组合应理解为至少2种感兴趣的L1-定位的性状的组合，换言之，所述组合包括至少第一和第二感兴趣的L1-定位的性状。

[0112] 在实施方案中，所述第一性状是L1-定位的性状，获自或可获自不包含所述第二性状的第一亲本植物，且所述第二性状是L1-定位的性状，获自或可获自不包含所述第一性状的第二亲本植物。第一亲本植物和第二亲本植物可以是近交系、栽培品种和/或野生品种(accession)或物种。在优选实施方案中，所述第一性状是L1-定位的性状，获自或可获自不包含所述第二性状的野生物种，所述第二性状是L1-定位的性状，获自或可获自不包含所述第一性状的栽培品种。这类野生物种和栽培品种如本文进一步所定义。本发明人鉴定了野生物种中的数个L1-定位性状，其对在包含所述野生物种中不包含的其他L1、L2和/或L3-定位性状(如栽培品种中存在的性状)的植物中具有性状有价值。野生物种中存在的特定L1-定位性状是生物和非生物胁迫抗性性状。栽培品种中存在的特定L1-定位性状是果实颜色和接受由特定植物，优选本文所定义的第二植物所产生的花粉的能力。这些和其他L1-定位性状如本文进一步详述。在一个优选实施方案中，所述感兴趣的L1-定位性状的组合天然地，即没有人为干预如杂交和选择、遗传修饰和/或组织技术，不出现在单一植物或植物物种中。换言之，所述组合的出现优选需要人为干预以在单一植物或植物品种中出现。

[0113] 任选地，感兴趣的L1-定位性状的组合是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个感兴趣的L1-定位的性状的组合。

[0114] 感兴趣的L1-定位的性状的组合可通过杂交和选择或通过遗传修饰引入第一植物。

[0115] 例如，第一植物可获自或获自使包含第一感兴趣性状的第一亲本植物与包含第二感兴趣性状的第二亲本植物杂交，任选之后是数轮近交，以获得第一和第二感兴趣的L1-定位的性状的组合。这类杂交和选择方法在第一和/或第二性状是复杂性状的情况中是尤其优选的。在作物学领域中应理解，需要多种通常是复杂性状以使植物商业相关。引入新性状需要多个杂交和选择步骤，以得到商业相关植物。发明人明白，通过产生周缘嵌合体来引入新型感兴趣的L1-定位的性状的重要优势是用于得到商业相关植物的所需杂交和选择步骤显著减少。使用本发明的方法，可进行进行杂交和选择，直至获得商业相关L1幼芽分生组织层，即包含新的感兴趣的性状和一个或多个其他商业相关的L1-定位的性状的组合，而植物作为整体仍显示不利性质或缺乏与例如作物相关的商业性质，因为这会通过第二植物的L2和L3层补偿。

[0116] 因此，本发明方法的步骤a)之前可以是第一亲本植物与第二亲本植物杂交，任选之后是在选择感兴趣的L1-定位的性状组合下进行数轮近交。

[0117] 换言之，本发明还提供产生包含感兴趣的L1-定位的性状的第一植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

[0118] a1)提供包含第一感兴趣的L1-定位的性状的第一亲本植物；

[0119] a2)提供包含第二感兴趣的L1-定位的性状的第二亲本植物；

[0120] a3)使第一亲本植物与第二亲本植物杂交以获得F1-杂交种，和任选使所述F1-杂交种近交；

[0121] a4)选择步骤a3)的F1-杂交种或近交植物，其包含第一和第二感兴趣的L1-定位的性状的组合。

[0122] 因此，如产生周缘植物方法中所定义的第一植物可以是F1-杂交种或近交植物。优选地，所述第一植物是第一亲本植物与第二亲本植物的F1-杂交种或近交植物，第一亲本植物包含所述第一性状且第二亲本植物包含所述第二性状。还提供通过上面方法获得或可获得的F1-杂交种或近交植物，其特征在于其包含第一和第二感兴趣的L1-定位的性状的组合。可使用此F1-杂交种或近交植物，用于或适用于产生周缘嵌合体植物，所述周缘嵌合体植物包含所述F1-杂交种或近交植物的L1幼芽分生组织层。因此，还提供所述F1-杂交种或近交植物在产生周缘嵌合体植物中的用途，所述周缘嵌合体植物包含所述杂交种或近交植物的L1幼芽分生组织层。

[0123] 产生上文所定义周缘嵌合体植物的方法可包括产生上文所定义第一植物的方法。更具体地，产生本文所定义的周缘嵌合体植物的方法可在产生第一植物的方法中包括本文所定义的方法步骤a1)-a4)。第一和第二植物优选具有不同基因型。此外，第一亲本植物和第二亲本植物优选具有不同基因型。任选地，第一亲本植物可以是野生物种且第二亲本植物可以是商业相关品种或栽培品种。第一亲本植物可以是天然包含所述第一性状的野生物种且所述第二植物可以是包含所述第二性状的栽培品种。本发明人鉴定的定位于野生物种L1幼芽分生组织层的具体性状是特定生物和非生物胁迫抗性以及改善的种子发芽性质，尤其是具有所述野生物种与栽培品种杂交基因型的种子的改善种子发芽性质。定位于栽培品种L1幼芽分生组织层的特定性状是果实具有特定颜色的性状(即番茄情况中的红色果实)和/或接受由特定植物，优选是本文定义的第二植物，其优选是栽培品种，所产生的花粉的能力。这类存在于栽培品种但野生物种中没有的L1-定位性状是本文定义的商业相关性状。

[0124] 在产生上文所定义第一植物的方法中，野生物种可与栽培品种杂交，然后在选择至少所述第一性状下进行数轮近交。任选地，所述方法的F1-杂交种包含感兴趣的L1-定位的性状的组合。在那种情况下，不需要进一步的近交。任选地，上面方法的F1-杂交种不包含组合的所有L1-定位性状。后一种情况下，优选使F1-杂交种近交以获得包含感兴趣的L1-定位的性状组合的近交植物。

[0125] 可继续近交，直至获得含感兴趣的L1-定位的性状组合的近交植物。任选地，继续近交，直至获得就所述组合而言基因固定的近交植物。任选地，如上所定义方法中的近交是在连续选择组合所有L1-定位性状的条件下。换言之，各轮杂交或近交后，根据组合中所有L1-定位性状的存在情况而选择用于进一步近交的后代。或者，在数轮近交后可进行选择。任选地，在数轮近交后，根据组合中至少一种性状而选择用于进一步近交的后代，同时在数轮近交后进行基于更多性状的选择。优选进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10轮，优选至少3轮连续近交。优选地，进行不超过10、9、8、7、6、5、4或3轮连续近交。

[0126] 任选地，第一植物是植物，其中第二亲本植物对第一植物总基因型的基因型贡献是至少0.5％，优选至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或至少70％。任选地，第一植物是植物，其中第一亲本植物对第一植物总基因型的基因型贡献是至少0.5％，优选至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或至少70％。

[0127] 如上所示，任选地，本文所定义的第一植物的感兴趣的L1-定位的性状组合是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个感兴趣的L1-定位的性状的组合。任选地，部分这些性状源自第一亲本植物，部分源自第二亲本植物。例如，第一亲本植物可包含生物和/或非生物胁迫抗性的组合，而第二亲本植物包含一个或多个L1-定位性状，如果实颜色和/或接受由第二植物所产生的花粉的能力。任选地，第一植物包含生物和/或非生物胁迫抗性的组合，具有一种或多种改善的种子发芽性质(优选具有特定所需基因型的种子)，而第二亲本植物包含一种或多种性状如果实颜色和/或接受由第二植物所产生的花粉的能力。

[0128] 提供本文所定义的周缘嵌合体植物L2和L3幼芽分生组织层的第二植物，可以是不同于上文所定义第一植物或第一和第二亲本植物中任一种的植物。优选地，第二植物是不包含上文所定义的感兴趣的L1-定位的性状组合的植物。优选地，第二植物包含至少充足性状以归类植物为商业相关。任选地，第二植物不包含获自上面所定义第一亲本植物的第一感兴趣性状，但可包含第二和任选更多获自上面所定义的第二亲本植物的性状。第二植物可具有与上面所定义的第二亲本植物相同的品种。第二植物可具有与所述第二亲本植物相同的基因型。

[0129] 在另一个实施方案中，第一植物通过用遗传修饰产生。在已鉴定与所述性状相关基因的情况中，尤其优选用遗传修饰以引入感兴趣性状。优选地，所述性状是能通过改变单一基因表达或改变基因核苷酸序列，或优选甚至通过改变所述基因内的单核苷酸引入的简单性状。本发明也涵盖遗传修饰技术与上文所定义杂交和选择的组合。任选地，本文所定义的组合的至少一种L1-定位性状通过遗传修饰引入植物，其中所述植物已包含组合的一种或多种其他L1-定位性状。这种方法可以没有经典育种和/或选择技术。本发明还涵盖本文所定义的组合的至少一种L1-定位性状通过遗传修饰引入植物。所述至少一种性状可在本文所定义的第一与第二亲本植物杂交和/或近交之前或之后引入。综合起来，本发明设想且涵盖杂交和选择与遗传修饰的组合，以产生第一植物。用经遗传修饰第一植物产生周缘嵌合体以提供所述嵌合体L1幼芽分生组织层的一个重要优势是，所述嵌合体产生的配子获自第二植物的基因型且可因而视作没有遗传修饰，认为第二植物没有遗传修饰。另一优势是等位基因可在一个层(如L1)产生有益表型影响，但可能在其他层(如L2和L3)导致多效性作用。这种等位基因的多效性作用可通过使用本发明的组织技术，并通过本发明方法产生周缘嵌合体植物而避开。这种周缘嵌合体的示例是包含番茄植物L1层，其具有表皮特异的(L1)霉病基因座O(Mildew Locus O)或DMR6(霜霉病抗性6)同源物敲除，还包含表达所述同源物野生型的番茄L2和L3的嵌合体。分别评价这类植物对茄科特异性霜霉病或有活体营养生活方式的其他病原体的抗性，如白粉菌(Oidium neolycopersici)(Nekrasov等,2017)和辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)(de Teledo Thomazella等,2016)。

[0130] 本发明所涵盖的遗传修饰方法是引起一种或多种感兴趣性状相关基因修饰的方法。这种修饰可以是但不限于并入、缺失或改变任何一种待用常规随机或靶向诱变方法修饰的所述基因核苷酸序列。后者包括但不限于采用锌指核酸酶、Cas9样、Cas9/crRNA/tracrRNA或Cas9/gRNA CRISPR系统的那些方法，或采用诱变寡核苷酸(如 or TALENs)的靶向诱变方法。改变可以是插入、缺失和/或取代至少一个核苷酸。这种修饰还可以是向植物、植物细胞或植物原生质体瞬时或稳定并入载体如表达载体例如沉默载体，或其他构建体。这类表达载体可以是用于过表达或从头表达感兴趣性状相关基因的载体。这类载体还可以是使感兴趣性状相关基因沉默(如RNAi表达构建体)、敲减或敲除(如通过T-DNA插入)的载体。这类载体任选地包含组织特异启动子，优选表皮特异启动子，如毛状体特异或气孔特异启动子。优选地，所述启动子可操作连接遗传修饰所需序列，如编码待(过度或从头)表达基因的序列、编码用于定向突变酶的序列或编码RNAi的序列。

[0131] 待在所述植物中(过度或从头)表达的感兴趣基因可以是编码作为有害生物毒素或驱除剂(repellent)(如用于某些昆虫或真菌有害生物的毒素或驱除剂)的蛋白的基因，编码参与产生针对有害生物毒素或驱除剂(如萜类、萜类衍生物、甲基酮和酰基糖)(参见例如Kuai等.Plant Physiol 1997,115:1581-1587；Yu和Pichersky,Plant Physiol.2014,164(2):612-622；Yu和Pichersky,Plant Physiol.2014,164(2):612-622；Palma等.Toxins(Basel).2014,6(12):3296–3325；Schilmiller等.Plant Physiol.2016,170(3):1331-
1344)，蜡产生(Lee和Suh,Plant Cell Rep.2015；34(4):557-572；Chang等.Theor Appl Genet.2016；129(8):1531-1539；Yang等.Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Jul 19；108(29):11836-11841；Tian等.Planta.2012；236(4):1053-1066)，毛状体形成(Kang等.J Exp Bot.2016；67(18):5313-5324)和/或气孔形成的蛋白或酶的基因。还对产生或编码靶向昆虫特异基因的RNAi的构建体感兴趣，所述基因对其发育是关键的(Gordon和Waterhouse,Nat Biotechnol.2007；25(11):1231-1232)。

[0132] 提供本文所定义周缘嵌合体植物L2和L3幼芽分生组织层的第二植物，可以是物种或品种与用于产生经遗传修饰的第一植物相同的植物。第二植物具有与通过遗传修饰引入感兴趣的L1-定位的性状或感兴趣的L1-定位的性状的组合前的第一植物，即用作遗传修饰起始材料的植物或植物细胞或原生质体，相同的基因型。

[0133] 如上定义的第一植物、第二植物、第一亲本植物和第二亲本植物可属于茄科，优选属于茄属。商业相关植物或栽培品种可以是栽培的番茄植物，优选番茄品种(如Ailsa Craig)。商业不相关植物可以是野生番茄，优选潘那利番茄(如株系LA716)、多毛番茄(如品种PI127826)、Solanum galapagense或醋栗番茄。优选地，第一亲本植物是野生番茄物种，优选潘那利番茄，第二亲本植物且任选地第二植物是栽培品种，优选番茄品种。优选地，第一、第二、第一亲本和/或第二亲本植物不是龙葵(Solanum nigrum)物种。

[0134] 本文所定义感兴趣的L1-定位的性状可以是但不限于生物或非生物胁迫抗性、改善的种子发芽、果实颜色和接受由植物本身所产生的花粉的能力。生物胁迫抗性性状可以是但不限于本文定义的节肢动物、真菌有害生物、细菌有害生物、卵菌和/或病毒。生物胁迫抗性性状还可涵盖增加产生有害生物毒素或驱除剂如萜类、萜类衍生物、甲基酮和酰基糖(包括用长度不同的短和/或中等链长度脂肪酸酰化的葡萄糖的一组糖的任一种)以及增加蜡产生。

[0135] 本文所定义感兴趣的L1-定位的性状组合可以是但不限于任何组合的以下L1-定位性状：生物胁迫抗性、非生物胁迫抗性、本文所定义的改善的种子发芽、果实颜色和接受由本文所定义的第二植物所产生的花粉的能力。

[0136] 在一个优选实施方案中，第一感兴趣的L1-定位的性状是野生植物物种所包含的性状，而本文所定义感兴趣的L1-定位的性状组合的第二L1-定位性状包含于栽培品种。优选地，所述第一性状是生物或非生物胁迫抗性。第一性状也可以是一种或多种改善的种子发芽性质，优选种子的改善的发芽性质，其中种胚具有特定所需基因型如来自所述野生植物物种与本文所定义的第二植物杂交的种子的基因型。优选地，来自栽培品种的所述第二性状是商业相关的L1-定位性状，如果实颜色和/或接受来自周缘嵌合体植物本身和/或本文所定义第二植物的花粉的能力。

[0137] 在一个优选实施方案中，第一感兴趣性状是生物胁迫抗性。优选地，感兴趣的L1-定位的性状的组合是：生物胁迫抗性，优选粉虱抗性，与特定果实颜色，在植物所产生果实是番茄的情况中优选红色，和接受来自周缘嵌合体植物本身和/或本文所定义的第二植物的花粉的能力组合。任选地，本文所定义第一亲本植物包含生物胁迫抗性，其可以是潘那利番茄品种，而第二亲本植物包含果实颜色和/或接受来自周缘嵌合体植物本身和/或本文所定义的第二植物的花粉的能力，其可以是番茄栽培品种。优选地，包含这三个L1-定位性状组合的第一植物如下获得或可获得：使第一和第二亲本植物杂交且随后使所得F1-杂交种近交至少3轮。优选地，F1-杂交种与第二亲本植物回交3次且自交1次以获得第一植物，其能用于产生本文所定义的周缘嵌合体植物。

[0138] 如上所示，本发明的方法需要选择后代或遗传修饰的植物以产生周缘嵌合体和/或产生本文所定义的第一植物。传递给其后代的显性性状评价能通过表型完成。然而，在隐性性状的情况中，这种性状是否传递给其后代可通过基因型(任选经分子标记技术)和/或表型在后期评价，即在一个或多个引起该隐性性状纯合基因型的其他杂交步骤(近交)后评价。

[0139] 基于基因型的选择优选需要感兴趣的表型性状和特异基因型的直接且已知的关联。在感兴趣的性状不直接关联已知基因型的情况中或在关联复杂的情况中，选择可基于表型试验，例如生物测试。

[0140] 生物胁迫抗性性状或有害生物抗性性状可以但不限于粉虱抗性、疫霉抗性、潜叶虫抗性(番茄斑潜蝇(Tuta absoluta))、叶螨抗性、温室白粉虱抗性、马铃薯/番茄蚜虫抗性、蓟马抗性、白粉病抗性、枝孢菌抗性、灰霉菌(Botrytis cinerea)抗性、细菌抗性，或其任何组合。任选地，粉虱抗性、番茄斑潜蝇、蓟马和蚜虫抗性是衍生自潘那利番茄物种的性状。任选地，疫霉抗性、枝孢菌抗性和/或细菌抗性是衍生自醋栗番茄物种的性状。任选地，白粉病抗性、灰霉菌抗性和疫霉抗性是衍生自多毛番茄物种的性状。“衍生自”在此应理解为指性状能通过使用所示野生物种作为第一亲本植物，任选地通过使所述第一亲本植物与第二亲本植物杂交且任选地进一步近交，引入本文所定义第一植物，第二亲本植物是番茄品种或栽培品种。

[0141] 用于检测和选择这类抗性的合适的生物测试基于温室/现场试验，其中能用有害生物，如上示节肢、真菌、细菌、卵菌和/或病毒有害生物，攻击植物，其中所述植物随后可靠地就抗性评分。在粉虱抗性的情况中，抗性标准可包括植物上存在的成虫数量，或产卵数，或发育成成虫的卵数目，或这些标准的组合。在潜叶虫(番茄斑潜蝇)的情况中，抗性标准可包括植物上存在的潜叶虫数量、产卵数、被吃掉和/或受损的叶面。在白粉病的情况中，抗性标准可包括植物上存在的感染斑点数量和/或大小，或分生孢子(孢子)数目。

[0142] 用于检测烟粉虱(粉虱)的合适生物测试描述于WO2012/165961，其通过引用纳入本文。简言之，待就烟粉虱(B.tabaci)抗性进行测试的植物和对照植物接受4个夹笼(clip cage)，其各含有20只成年烟粉虱(优选生物型Q)且在黄瓜上于实验室条件连续培养(参见Bleeker等,2009-Plant Physiol.)。5天后，确定死亡成虫的总数和百分比以及卵的总数(组合叶片的远轴面与近轴面)。

[0143] 用于检测温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)(温室白粉虱)抗性的合适的(表型)生物测试也描述于WO2012/165961，其通过引用纳入本文。简言之，温室粉虱(目：半翅目)在番茄(S.lycopersicum)上培养。选择分析进行24小时。成虫在有待测试植物和对照植物的笼中释放。随后，在植物叶片上确定成虫的停留偏好。

[0144] 用于检测大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)(土豆/番茄蚜虫)抗性的合适生物测试也描述于WO2012/165961，其通过引用纳入本文。简言之，大戟长管蚜(目：半翅目)在番茄(S.lycopersicum)上培养。无选择分析进行48小时。一只成年蚜虫被置于有待测试植物和对照植物的夹笼中。随后，确定蚜虫表现(存活和后代数)。

[0145] 用于检测番茄斑潜蝇抗性的合适生物测试也描述于WO2012/165961，其通过引用纳入本文。简言之，番茄斑潜蝇(目：鳞翅目)在番茄(S.lycopersicum)上培养。无选择分析进行7天。允许5只成虫在待测试植物和对照植物上产卵。7天后，在各植物基因型的远轴面与近轴面上确定番茄斑潜蝇产卵(沉积的卵数目)。

[0146] 用于检测叶螨(二斑叶螨(Tetranychus urticae)和/或伊氏叶螨(Tetranychus evansi))的合适生物测试也描述于WO2012/165961，其通过引用纳入本文。叶螨如昆虫属于节肢动物，但是不同的生物类别。简言之，节肢动物在普通四季豆上喂养。进行4日无选择分析，有二斑叶螨和/或伊氏叶螨的同步群体。螨虫被置于待测试植物和对照植物的叶盘。随后，评估螨虫存活和繁殖力(卵的数量/螨虫)。

[0147] 有害生物抗性也可通过表皮细胞之中或之上存在的毒素和/或驱除剂分子产生增加(如萜类、萜类衍生物、甲基酮和酰基糖)，毛状体数量增加和/或蜡的量增加评价或结合以上内容评价。

[0148] 非生物胁迫抗性可以是抗旱性，其应理解为相较于无抗旱性的对照植物具有改善的抗旱性。抗旱性改善的植物指，当提供改善的抗旱性时，在受到干旱或干旱胁迫时，相较于未提供改善抗旱性的植物，不显示影响或显示影响减少的植物。正常植物具有一定水平的抗旱性。通过在选定受控条件下(使得能在某一时期后观察到对照植物干旱迹象，即当植物受到干旱或干旱胁迫时)比较对照植物与提供改善的抗旱性的植物，能容易地确定植物是否有改善的抗旱性。相较于对照植物，抗旱性改善的植物会显示受到干旱的迹象，如萎蔫更少和/或减少。本领域技术人员会了解如何选择合适条件，例如示例中的受控条件。当植物具有“改善的抗旱性”时，其在受到干旱或干旱胁迫时能维持正常生长和/或正常发育，这在另外情况下会引起正常(对照)植物生长减少和/或发育减少。由此，“改善的抗旱性”能通过比较植物来确定，其中在干旱胁迫下最能维持(正常)生长的植物是具有“改善的抗旱性”的植物。本领域技术人员非常清楚如何选择合适条件以确定植物的抗旱性以及如何测量干旱迹象，如描述于例如IRRI所提供的手册，Breeding rice for drought prone environments,Fischer等,2003,和CIMMYT所提供的手册,Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize:from theory to practice,Banzinger等,2000。确定植物中抗旱性改善的方法示例由Snow和Tingey,1985,Plant Physiol.,77,602-7和Harb等,Analysis of drought stress in Arabidopsis,AOP 2010,Plant Physiology Review提供，且描述于下面的实施例章节。干旱胁迫抗性也可或结合以上内容如下评价：相较于对照植物，毛状体的量增加和/或气孔的量减少。

[0149] 发芽性质可以是但不限于发芽能力、峰值时间、发芽均匀度、发芽速率、种子密度和/或种子活力。在通过感兴趣植物产生的种子上评估发芽性质。更特定地，在就本发明嵌合体植物评估种子发芽性质的情况中，在所述植物授粉后就所述嵌合体植物产生的种子评估所述性质。改善的发芽在本文中应理解为相较获自非嵌合对照植物的种子，用类似花粉(即来自同一植物和具有相同基因型的花粉)授粉时，获自嵌合体植物的所述种子至少一种提高的发芽性质，其中所述嵌合体植物种子的种胚与获自所述对照植物的种子具有相同的基因型。在一个优选实施方案中，在用本文所定义第一亲本植物的花粉授粉后，获自本发明嵌合体植物的种子发芽能力与用所述第一亲本植物的花粉授粉后获自本文所定义第二植物的种子作比较。

[0150] 发芽能力应理解为播种或种植或分散的种子在适合给定植物物种的固定时间段内发芽，即显示出现胚根，的百分比。因此，发芽能力可计算为给定时间段内，发芽的种子数除以播种或种植或分散的种子总数，再计算为百分比。例如，种子发芽能力可在分选和选择过程如农业和园艺中常见的过程后确定，并针对特定植物物种。种子可例如通过液体密度分离，或通过X射线分选(例如可用于番茄种子)来分离。种子也可首先催芽。本领域技术人员已知就给定植物物种而言，多长的固定时间段是合适的。此时间段可以例如是峰值时间的2、3、4或5倍。其优选是峰值时间的3倍。技术人员还已知此时间段可根据环境条件而变化。优选这些条件是种子发芽的最优条件。时间段选择成较长，从而发芽速率或发芽均匀度的变化不影响发芽能力计算。如果技术人员可合理预期能发芽的大部分种子在此时间段内实际发芽，则该时间段合适。图11阐明发芽能力不同的株系随着时间的发芽种子百分比。采用的时间段长到足以确保发芽种子数随时间平稳并达到平台阶段。当所有种子发芽时，此平台阶段可以是100％，或者在一些种子根本没发芽的情况中，其可以是更低的百分比。根据植物物种，发芽能力是例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。因此，85％发芽能力意味着85％的播种或种植或分散的种子在对给定植物物种合适的时间段内发芽，即显示出现胚根，例如但不限于峰值时间的3倍。更高的发芽能力意味着更多种子显示出现胚根。对给定植物物种合适的固定时间段示例是例如但不限于约5天用于拟南芥，约7天用于大麦，约7天用于金丝桃，约7天用于烟草，约7天用于番茄，约28天用于毛茛，和约30天用于凤仙花，所述固定时间段用于在最优环境条件下确立发芽能力。

[0151] 峰值时间在本文中应理解为在播种、种植或分散种子以使其发芽后的时间段，可能在分选和选择种子后，或例如在对种子催芽和/或分层后，在其上达到曲线的最大切向，其中发芽种子的百分比在y轴上标绘且时间在x轴上。图12阐明峰值时间的概念。因此，峰值时间确定为达到每单元时间的发芽种子数增加最高的时刻所需的时间段。峰值时间能用于协助计算发芽能力或发芽速率，例如通过固定时间段为2、3、4或5倍的峰值时间，优选3倍的峰值时间。

[0152] 种子发芽均匀度或发芽均匀度应理解为达到固定百分比的发芽种子(X)所需的时间(T)。此固定百分比可以是50％(T50)、75％(T75)、80％(T80)、90％(T90)、95％(T95)、99％(T99)，或适合特定种子批次的任何百分比。该时间越短，均匀度越高。技术人员已知种子发芽均匀度可根据环境条件而变化。优选这些条件是种子发芽的最优条件。种子发芽均匀度以如此方式测量，从而其原则上但不必定独立于发芽能力或发芽速率。

[0153] 发芽速率定义为每天总发芽种子的加权和。公式：速率＝(第1天发芽种子数目，除以1)+(第2天发芽种子数目，除以2)+…..+(第Z天发芽种子数目，除以Z)，其中Z是测量的最后一天。此量度与美国种子分析家协会(Association of Official Seed Analysts，AOSA)定义的发芽指数(GI)相同(AOSA.,1983《. 种子活力测试手册》(Seed vigor testing handbook).种子测试手册的第32篇稿件(Contribution No.32).美国种子分析家协会。发芽速率在对给定植物物种合适的时间段中确定，且是技术人员能合理预期大部分能发芽的种子到实际发芽的时间段。技术人员知道如何确定此时间段。此时间段可以例如是峰值时间的2、3、4或5倍。其优选是峰值时间的3倍。技术人员已知发芽速率可根据环境条件而变化。优选这些条件是种子发芽的最优条件。然而，种子批次的品质改良可用次佳条件下提高的发芽速率评估，这可能在农艺或园艺实践中普遍。

[0154] 种子密度涉及种子的比重，且能通过例如种子的液体密度分离确定，如在蔗糖梯度中分离。

[0155] 种子活力指从种子到种植时存活和生长的幼苗出土能力。因此，如果在类似条件下有更高百分比的幼苗存活并生长成出现第一片真叶的幼苗或苗木，则种子具有更高活力，出现真叶首先是通过展开子叶，然后放大茎，最后产生第一片真叶。如果在相同条件下，某一时间段内能观察到更高百分比的出现第一片真叶的幼苗或苗木，则种子活力视作更高，所述时间段取决于植物物种。如果幼苗的总生物量(鲜重和/或干重)在播种后的固定时间段后更大，则种子活力也视作更高。因此，幼苗鲜重是种子活力的量度之一。

[0156] 接受由特定植物优选植物本身所产生的花粉的能力，即花粉来自待产生的周缘嵌合体植物，能如下评价：对待测试的F1-杂交种或近交第一(亲本)植物进行授粉，花粉来自第二植物，其提供周缘嵌合体植物的L2幼芽分生组织层。当这种授粉引起果实和种子形成时，花粉接受的得分为正。

[0157] 在一个特定实施方案中，感兴趣的L1-定位的性状是接受由本文所定义第一亲本植物所产生的花粉的能力。对此性状以及用所述第一亲本植物花粉授粉后产生的种子发芽性质改善性状，尤其感兴趣。具体地，如果所述第一亲本植物是野生物种且提供本发明嵌合体植物L2和L3层的第二植物是栽培品种，则杂交种子能通过嵌合体植物产生，其相较用非嵌合对照植物(即第二植物)产生的杂交种子在用所述第一亲本植物花粉授粉后显示发芽性质改善。在甚至另一个优选实施方案中，所述感兴趣的L1-定位的性状组合还包括生物或非生物胁迫抗性。

[0158] 本发明还提供可通过本文所定义的任何方法获得的周缘嵌合体。优选地，所得周缘嵌合体植物是商业相关植物，其特征在于其包括L1幼芽分生组织层中的(第一、第二和任选的更多)感兴趣性状。本发明还提供周缘嵌合体，其无性衍生自通过本文所定义的任何方法获得或可获得的周缘嵌合体。

[0159] 优选地，第一植物包含第一和第二感兴趣的L1-定位的性状。因此，不需要本文所定义第一植物整体成为商业相关植物。优选地，所述第一植物的L1幼芽分生组织层是商业相关的，意味着如果所述植物的L1幼芽分生组织层与第二、商业相关植物的L2和L3幼芽分生组织层组合以产生周缘嵌合体，这种周缘嵌合体是商业相关的。

[0160] 本文所用的“第一植物”、“第二植物”、“第一亲本植物”、“第二亲本植物”、“F1-杂交种”和“近交植物”在本文中可分别由“具有第一植物基因组的植物”、“具有第二植物基因组的植物”、“具有第一亲本植物基因组的植物”、“具有第二亲本植物基因组的植物”、“具有F1-杂交种基因组的植物”和“具有近交植物基因组的植物”取代。

[0161] 周缘嵌合体植物可用适合本领域的方法制备。例如，周缘嵌合体可通过嫁接提供L1幼芽分生组织层(上文所定义的第一植物)的植物或植物品种和提供L2和L3幼芽分生组织层(上文所定义的第二植物)的植物或植物品种的幼苗来制备，所述嫁接由以下步骤组成：(1)横向切割且随后邻接和重聚其下胚轴，(2)经嫁接结合点横向切割，和(3)让愈伤组织发育且自嫁接结合部位点再生不定芽以及(4)在再生的植物中选择嵌合体。步骤1-4的技术为本领域技术人员已知。一般，使用嫁接和再生，不定芽中出现周缘嵌合体的频率是～0.2％-10％。因此，优选大量第一植物和第二植物的幼苗，且产生许多独立不定芽。这些不定芽的每一个可生长成长度约5cm的小植物，带有一些叶片。从这些苗木中，可去除顶端茎尖以允许腋芽从叶腋中出现。周缘嵌合体可在这些腋芽中鉴定，这通过使用区分组成型第一植物与第二植物的遗传标记进行。这些标记可以是表型，例如独特的叶色，或任何形态或生化差异，如果果实形状。这些标记也可以是基因型的，如提供L1幼芽分生组织层的植物与提供L2和L3幼芽分生组织层的植物之间的DNA或RNA序列多态性。表型和/或基因型标记可通过合适检测方法检测并应用于来自所有不定芽的所有腋芽，所述不定芽再生自所有单独嫁接的植物对。周缘嵌合体能识别为在单一植物中具有组合的第一植物和第二植物的标记，这作为不定芽从嫁接结合点再生而不是有性杂交的结果。这种嵌合体在植物进一步生长中稳定保留这些标记，包括其腋芽、花序、花和植物的所有其他地上部分，其产生自周缘嵌合顶端分生组织的自然生长和发育。所需类型的周缘嵌合体采用其干细胞层L(1、2、3)构成形式，通过观察特定组织中标记的存在来鉴定，如表皮(L1)、脉管系统(L3)、花粉粒(L2)、或已知主要获自这些层的任何其他组织中的标记。

[0162] 例如，用于产生含第一和第二感兴趣性状的周缘嵌合体植物的第一植物可作为砧木或作为接穗嫁接上文定义的第二植物，然后是移植物愈合10天。嫁接结合点可随后横向切割，愈伤组织生长和幼芽再生自发在其上出现。在再生的幼芽中，目测选定周缘嵌合体可，例如使用表型标记xa(Szymkowiak,E.J.,和Sussex,I.M.(1992),The internal meristem layer(L3)determines floral meristem size and carpel number in tomato periclinal chimeras,Plant Cell 4,第1089-1100页)和毛状体密度。杂合状态下的半显性标记xa当存在于L2和/或L3时，导致黄叶。例如，如果第一植物(即提供L1幼芽分生组织层的植物)包括xa标记，而此标记不存在于本文所定义第二植物(即提供L2和L3幼芽分生组织层的植物)，第一植物具有第二植物中不存在的高毛状体密度表型，所需类型的嵌合体可通过具有绿叶(第二植物的L2和L3)加高毛状体密度(近交植株的L1)来识别。此外，L1层密度可通过对表皮细胞中SNP标记的存在/缺失打分来确定，该标记区分第一植物的基因型与第二植物的基因型。

[0163] 本发明还提供通过上面所定义方法获得或可获得的周缘嵌合体植物和/或无性衍生自所述周缘嵌合体植物的任何植物。所述周缘植物可通过以下识别：L1幼芽分生组织层的基因型不同于L2和L3幼芽分生组织层的基因型和/或植物包含上文所定义的(第一、第二和任选的更多)感兴趣的性状。本发明还提供已受精的周缘嵌合体植物，即包括种胚。优选地，周缘嵌合体植物通过具有第一植物或第二植物基因型的植物花粉受精。该植物可以是砧木品种。

[0164] 周缘植物还可通过以下识别：其优选是商业相关植物。周缘嵌合体植物(或其无性衍生植物)能用于产生植物产品。因此，还提供所述周缘嵌合体植物(或其无性衍生植物)在产生植物产品中的应用。更具体地，提供从包含第一和第二感兴趣性状的周缘嵌合体植物产生植物产品的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

[0165] A)提供包含第一和第二如上所定义的性状的周缘嵌合体植物和/或通过如上所定义的产生周缘嵌合体植物的方法可获得的周缘嵌合体植物；

[0166] B)使步骤A)的周缘嵌合体植物生长；

[0167] C)从步骤B)中生长的植物获得植物产品；和

[0168] D)任选地，进一步加工获自步骤C)的植物产品。

[0169] 还提供因而所得的植物产品。所述植物产品可选自例如但不限于：果实、植物器官、植物部分(如叶、根、根尖、茎、花、花芽、花药、种子、谷粒、花粉、胚珠)，还可以是无法产生植物本身(即非繁殖性)的产品，如植物脂肪、植物油、植物淀粉和植物蛋白级分。植物产品不需具有光合作用性质。所述步骤D)的加工可选自但不限于：压碎、碾磨或仍完整、与其他材料混合、干燥、冷冻和其任何组合。植物产品可通过L1幼芽分生组织层基因型以及L2和L3幼芽分生组织层基因型的存在来识别。

[0170] 在本发明方法或用途的一个实施方案中，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系与潘那利番茄的第一代F1杂交种基因型；第二植物以及周缘嵌合体植物L2和L3幼芽分生组织层具有番茄近交系的基因型。所有其他变量可如上文所定义。优选地，在此实施方案内，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系Ailsa Craig与潘那利番茄系LA716的第一代F1杂交种基因型。优选地，第二植物以及周缘嵌合体植物L2和L3幼芽分生组织层具有栽培番茄(Solanum lycopersicum cv.MoneyMaker)近交系的基因型。

[0171] 在本发明方法或用途的一个实施方案中，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系与樱桃型番茄近交系的第一代F1杂交种基因型；第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有牛肉番茄近交系的基因型。所有其他变量可如上文所定义。优选地，在此实施方案内，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系Ailsa Craig与樱桃型番茄近交系的第一代F1杂交种基因型。

[0172] 在本发明方法或用途的一个实施方案中，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系与多毛番茄的第一代F1杂交种基因型；第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有番茄近交系的基因型。所有其他变量可如上文所定义。优选地，在此实施方案内，第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有栽培番茄(Solanum lycopersicum cv.MoneyMaker)的基因型，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系Ailsa Craig与多毛番茄品种PI127826的第一代F1杂交种基因型。

[0173] 在本发明方法或应用的一个实施方案中，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系与潘那利番茄的第一代F1杂交种基因型，其随后作为雄性回交番茄雌性，以产生BC1群体；第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有番茄近交系的基因型。所有其他变量可如上文所定义。优选地，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系LA3579与潘那利番茄第一代F1杂交种基因型，其随后作为雄性回交番茄LA3579雌性，以产生BC1群体。优选地，选择此BC1群体以用于同步表型表达粉虱抗性，作为雌性与来自任何亲本品种的花粉的杂交亲和性以及LA3579的xa标记。

[0174] 在本发明方法或应用的一个实施方案中，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系与醋栗番茄的第一代F1杂交种基因型；第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有番茄近交系的基因型。所有其他变量可如上文所定义。优选地，在此实施方案内，第一植物和周缘嵌合体植物L1幼芽分生组织层具有番茄近交系Ailsa Craig与醋栗番茄品种CGN1552937的第一代F1杂交种基因型，第二植物以及周缘嵌合体L2和L3幼芽分生组织层具有栽培番茄(Solanum lycopersicum cv.MoneyMaker)的基因型。

[0175] 本公开中，番茄植物品种Ailsa Craig能具有登录号LA3579且番茄植物品种MoneyMaker能具有例如登录号LA2706。

[0176] 本发明还进一步在以下实施例中解释。这些实施例不限制本发明范围，但仅用于阐明本发明。

[0177] 实施例1

[0178] 抗粉虱(烟粉虱，生物型Q)的番茄植物如下制备。在粉虱抗性品种(潘那利番茄LA716)与粉虱易感品种(番茄LA3579)(含有半显性xa表型标记，适于销售的红色果实颜色，以及作为雌性与来自任何番茄亲本品种、株系或杂交种的花粉的杂交亲和性)之间制备F1杂交种。就同步表型表达粉虱抗性和LA3579的xa标记选择F1杂交种。

[0179] 所得F1杂交种作为接穗嫁接到番茄的商业相关的易感性近交品种，其在本文中进一步命名为“易感性对照”，然后是嫁接愈合7天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，目测选定周缘嵌合体，使用表型标记xa加杂交种接穗所带有的高毛状体密度。当存在于L2和/或L3时，杂合状态下的半显性标记xa导致黄叶。所需类型的嵌合体可通过具有绿叶(栽培品种的L2和L3)加高毛状体密度(杂交种的L1)来识别。嵌合体在发育和从腋芽的生根插枝繁殖期间非常稳定，如通过完全没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在叶和茎的黄色部分中观察到。

[0180] 如此产生的嵌合体在地中海生长条件(西班牙埃尔西多)下的温室试验中用烟粉虱和TYLCV(番茄黄化曲叶病毒)高压力测试粉虱抗性。植物如下就抗性进行可靠打分：计数植物上存在的成虫、卵、若虫和蜕皮数目，和在2.5个月的时间段中比较此抗性对照(F1杂交种)与易感性对照。

[0181] 发现抗性对照(F1杂交种)在整个实验长度(2.5个月)中表现良好。这些植物中检测到有限数量的粉虱(成虫和若虫期)，且实验快结束时，在植物顶部仅观察到轻微TYLCV症状。相反，易感植物覆盖有粉虱(全生命期)并早在2015年11月4日就显示TYLCV症状。TYLCV症状迅速恶化且植物在实验剩余时间中都发育不良(～50cm)。

[0182] 有趣的是，测试植物几乎没有粉虱(全生命期；与抗性对照植物类似)，生长有力且在实验快结束时仅发展出轻微TYLCV症状，所述测试植物是潘那利番茄×番茄的L1幼芽分生组织层转移到其上的番茄。

[0183] 图1-4代表重度感染的温室内随着时间在这些植物(A、B和C)上观察到的粉虱成虫、卵、若虫和蜕皮的平均数。所有数据显示当将A或C植物与易感性对照(B)比较时的显著差异。

[0184] 在此实验的独立重复中，其中含有至少4片真叶且如上所示产生的20株嵌合体植物用本文所定义夹笼试验测试Bt-抗性，48小时后在易感性对照植物(番茄)、F1供体植物和嵌合体植物之间发现Bt-死亡率有明显差异，如表1所示。用于此夹笼实验的粉虱为4周龄(卵-成虫期)，获自棉花上的同步饲养且用排气器(exhauster)收集。粉虱从管转移到夹笼，同时用CO2处理5秒使其失去知觉(每夹笼6只雌性粉虱)。48小时后，重新打开夹笼，再捕获粉虱并对死亡率评分。

[0185] 表1：田编号，植物数(n)，相对于总数以百分数计的平均死亡粉虱(％)和标准偏差(％)。

[0186]田编号数目(n) 均值(％) 标准偏差(％)
番茄 20 2.6 6.5
供体(F1番茄×潘那利番茄) 18 9.5 12.1
嵌合植物 20 54.6 34.0

[0187] 除了成虫死亡率，3周后测定这些植物中的蛹和蜕皮数目。如表2所示，相较于番茄，粉虱从卵到蜕皮的发育在供体和嵌合植物中显著较低，指示高水平的粉虱抗性。

[0188] 表2：田编号，植物数(n)，相对于总数以百分数计的蛹期后代平均数(％)和标准偏差(％)。

[0189]田编号数目(n) 均值(％) 标准偏差(％)
番茄 20 76.6 27.0
供体(F1番茄×潘那利番茄) 18 24.9 14.5
嵌合植物 20 9.6 8.7

[0190] 实施例2

[0191] 抗粉虱(烟粉虱，生物型Q)的番茄植物如下制备。在粉虱抗性品种(潘那利番茄LA716)与易感品种(番茄LA3579)(含有半显性xa表型标记，适于销售的红色果实颜色，以及作为雌性与来自任何番茄亲本品种、株系或杂交种的花粉的杂交亲和性)之间制备F1杂交种。所得F1杂交种作为雄性回交番茄LA3579雌性以产生BC1群体。就同步表型表达粉虱抗性，作为雌性与来自亲本品种的花粉的杂交亲和性以及LA3579的xa标记选择此F1群体。

[0192] 选择粉虱抗性如实施例1所示完成。另外，选择包括植物接受番茄花粉的能力。后者通过用来自番茄株系或杂交种的花粉对选定植物授粉来完成。当这种授粉引起果实和种子形成时，花粉接受的得分为正。选定植物随后分别近交3和4代，以产生BC1S3和BC1S4群体。在这些3和4代的每个中，选择以与上述相同的方式完成，包括适于销售的红色果实颜色性状，使得植物具有粉虱抗性，与番茄花粉相容，和成熟水果中携带红色素。粉虱(Bt)死亡率用本文所定义的夹笼试验测试，其中Bt死亡率在5天后测定。此外，计数产卵数。粉虱(Bt)死亡率在BC1S3和BC1S4植物中显著增加(图14)。更突出的是，在这些植物上观察到极少的卵(图15)。

[0193] 这些如上所示选定及繁殖的抗粉虱BC1S3和BC1S4植物(株系或克隆)在本文中进一步命名为“BC1S3”和“BC1S4”，作为砧木或接穗嫁接番茄的商业相关近交品种，该品种在本文中进一步命名为“栽培品种”。

[0194] 周缘体如下产生：首先嫁接BC1S3或BC1S4接穗到栽培品种砧木上，然后嫁接愈合7天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长且幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，目测选定周缘嵌合体，使用表型标记xa加BC1S3和BC1S4接穗带有的高毛状体密度。当存在于L2和/或L3时，杂合状态下的半显性标记xa导致黄叶。所需类型的嵌合体可通过具有绿叶(栽培品种的L2和L3)加高毛状体密度(BC1S3和BC1S4的L1)来识别。

[0195] 如此产生的嵌合体通过上述方法测试粉虱抗性，通过周缘嵌合体植物自花授精的测试花粉相容性和测试红色果实的形成。随后，通过将腋芽作为生根插条，嵌合体可作为克隆繁殖。这类克隆群体能用于以工业常见方式产生商业番茄果实。

[0196] 实施例3

[0197] 来自种间F1杂交种TP的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系TT与潘那利番茄的父本系PP杂交。

[0198] 周缘嵌合体由类型{L3(TT),L2(TT),L1(EP)}构成，其中TT和EP表示二倍性(其中T和E和P是单倍体)。TT是标准近交番茄(S.lycopersicum)品种。EP是番茄近交系EE(cv Ailsa Craig品种LA3579)和潘那利番茄株系PP(品种LA716)的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EP接穗到TT砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长且幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，目测选定周缘嵌合体，使用表型标记xa加EP接穗带有的高毛状体密度。当存在于L2和/或L3时，杂合状态下的半显性标记xa导致黄叶。所需类型的嵌合体可通过具有绿叶(TT的L2和L3)加高毛状体密度(EP的L1)来识别。嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过完全没有L1细胞自发侵入L2来判断的，其在叶和茎的黄色部分中观察到。嵌合体的繁殖行为用分离分析xa标记来分析。在来自回交PP的嵌合体的500株籽苗中，我们没有观察到单一黄色籽苗。这些数据显示嵌合体携带完全来自基因型T的配子体，EP组织仅起到孢子体作用。由于熟知L1层产生胚珠的珠被和随后成熟种子的种皮，EP在嵌合体种子发育中的孢子体作用是珠被和种皮的孢子体作用。

[0199] 种间TP F1杂交种种子产生自嵌合体以及非嵌合TT植物。为此，每个的6株植物嫁接到基因型TT的砧木上，以均衡其根系。其与来自株系PP的花粉交叉受精以产生TP杂交种种子(F1)。所有植物在常规温室的4月-8月阶段中生长。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在10摄氏度/10％相对湿度保存，待用。

[0200] 我们确定并测量种子的3种发芽性质：

[0201] (a)密度

[0202] (b)发芽速率

[0203] (c)发芽能力

[0204] 所有测量以下列顺序方式进行：

[0205] (a)密度

[0206] 成熟种子的密度是其生理组成的直接函数。其主要由胚乳和胚中代谢化合物的量及生化性质来确定，胚乳和胚占据种皮内的空间。密度(比重)由蔗糖水溶液中的液体密度分离来确定。～500个种子依序通过量筒中的0、200和400克蔗糖/升水。收集渗入较轻溶液的种子并放入下一个。这产生4个密度级分，从低到高为：0、200、400和400+。所述级分用自来水彻底冲洗，在滤纸上室温干燥至少72小时。计数每部分的种子数，测定密度级的分布。

[0207] 如图5所示，从非嵌合TT与PP杂交制备的种间F1种子的密度分布与嵌合体杂交PP大不相同。与嵌合杂交种不同，非嵌合杂交种具有高比例的不饱满的轻种子。由于这2个杂交种中胚乳和胚的基因型相同，断定密度分布差异通过EP孢子体在生理上传递给种子。高比例的不饱满种子是杂交番茄×潘那利番茄的特征，且是这些物种之间轻微种间杂交障碍的表现。嵌合体显著放松此障碍。

[0208] (b)发芽速率

[0209] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。在7天时间段，以
24小时间隔，以可见的胚根出现对发芽评分。速率随后根据下式计算：速率＝(#1/1)+(#2/
2)+…….+(#7/7)，其中#1是24小时后发芽的种子数，#2是48小时后发芽的种子数等。速率数越高，胚根出现越快。测试用100-种子样品完成。

[0210] 图6显示来自嵌合体和来自TT对照植物的F1种子的体外发芽速率测试结果。仅播种原始种子(raw seed)批次，即其在播种前未经密度分离。从图6显而易见的是，嵌合体产生具有更高发芽速率的种子批次。由于来自嵌合体和来自TT对照的胚及胚乳在基因上相同，断定发芽速率差异通过孢子体EP在生理上赋予。延迟的种子发芽是杂交番茄×潘那利番茄的特征，且是这些物种之间轻微种间杂交障碍的表现。嵌合体显著克服此障碍。

[0211] (c)发芽能力

[0212] 发芽能力以与上面章节(b)所述相同的阵列体外测量，这是通过对10天后发芽的种子总数(％)评分。结果示于图7。相较于TT对照植物，嵌合体种子的体外发芽能力更高。

[0213] 实施例4

[0214] 来自种间F1杂交种TH的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系TT与多毛番茄的父本系HH杂交。

[0215] 周缘嵌合体由类型{L3(TT),L2(TT),L1(EP)}构成，其中TT和EP表示二倍性(其中T和E和P是单倍体)。TT是标准近交番茄(S.lycopersicum)品种。EP是标准番茄近交系EE(cv Ailsa Craig品种LA3579)和潘那利番茄株系PP(品种LA716)的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EP接穗到TT砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长且幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，目测选定周缘嵌合体，使用表型标记xa加EP接穗带有的高毛状体密度。当存在于L2和/或L3时，杂合状态下的半显性标记xa导致黄叶。所需类型的嵌合体可通过具有绿叶(TT的L2和L3)加高毛状体密度(EP的L1)来识别。嵌合体在发育和从腋芽根插条中繁殖期间非常稳定，如通过完全没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在叶和茎的黄色部分中观察到。嵌合体的繁殖行为用分离分析xa标记来分析。在来自回交PP的嵌合体的500株籽苗中，我们没有观察到单一黄色籽苗。这些数据显示嵌合体携带完全来自基因型T的配子体，EP组织仅起到孢子体作用。由于熟知L1层产生胚珠的珠被和随后成熟种子的种皮，EP在嵌合体种子发育中的孢子体作用是珠被和种皮的孢子体作用。

[0216] 嵌合体以及非嵌合TT对照植物用来自多毛番茄品种PI127826(表示为HH)的花粉异花受精，以产生TH杂交种种子(F1)。所有植物在常规温室的4月-8月阶段中生长。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0217] 我们确定并测量种子的4种发芽性质：

[0218] (a)比重

[0219] (b)发芽速率

[0220] (c)发芽能力，

[0221] 所有测量以下列顺序方式进行：

[0222] (a)比重

[0223] 成熟种子的密度是其生理组成的直接函数。其主要由胚乳和胚中代谢化合物的量及生化性质来确定，胚乳和胚占据种皮内的空间。比重由蔗糖水溶液中的液体密度分离来确定。～500个种子依序通过量筒中的0、200和400克蔗糖/升水。收集渗入较轻溶液的种子并放入下一个。这产生4个密度级分，从低到高为：0、200、400和400+。所述级分用自来水彻底冲洗，在滤纸上室温干燥至少72小时。计数每部分的种子数，测定密度级的分布。

[0224] 如图8所示，从非嵌合TT与HH对照杂交制备的种间F1种子的密度分布与杂交HH的嵌合体不同。对照杂交种具有较高比例的不饱满的轻种子。由于这2个杂交种中胚乳和胚的基因型相同，断定密度分布差异通过EP孢子体在生理上传递给种子。高比例的不饱满种子是杂交番茄x多毛番茄的特征，且是这些物种之间轻微种间杂交障碍的表现。嵌合杂交种中的EP孢子体组织可校正其。

[0225] (b)发芽速率

[0226] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。在7天时间段，以
24小时间隔，以可见的胚根出现对发芽评分。速率随后根据式计算：速率＝(#1/1)+(#2/2)+…….+(#7/7)，其中#1是24小时后发芽的种子数，#2是48小时后发芽的种子数等。速率数越高，胚根出现越快。测试用3个100-种子样品完成。

[0227] 图9显示在嵌合体和TT对照植物上所产生F1种子的体外发芽速率测试结果。仅播种原始种子批次，即其在播种前未经密度分离。从图9显而易见的是，嵌合体产生具有更高发芽速率的种子批次。由于来自嵌合体和来自TT对照的胚及胚乳在基因上相同，断定发芽速率差异通过孢子体EP在生理上赋予。种子发芽极差是杂交番茄×多毛番茄的特征，且是这些物种之间轻微种间杂交障碍的表现。嵌合杂交种中的EP孢子体组织放松此障碍。

[0228] (c)发芽能力

[0229] 发芽能力以与上面章节(b)所述相同的阵列体外测量，通过对7天后发芽的种子总数(％)评分。结果示于图10。相较于TT对照植物，嵌合体上所制备种子的体外发芽能力高许多。

[0230] 实施例5

[0231] 来自牛肉品种BB的近交种子的发芽性质改善。牛肉番茄品种在本领域已知，作为具有大于2个优选大于3个小室的品种。此品种通过番茄近交系BB自花受精来产生。

[0232] 周缘嵌合体由类型{L3(BB),L2(BB),L1(ER)}构成，其中BB和ER表示二倍性(其中B和E和R是单倍体)。ER是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与樱桃型番茄近交系RR的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EP接穗到BB砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(ER杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用区分BB与EE的SNP标记进行基因分型。存在EE SNP指示该幼芽是周缘嵌合体，在BB的L2和L3层上携带基因型ER的L1层。嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0233] 嵌合体以及非嵌合BB对照植物自花受精。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0234] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。以24小时间隔对发芽评分，作为8天时间段中可见的胚根出现。如图19可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0235] 实施例6

[0236] 来自F1杂交种MH2的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系MM(MoneyMaker)与多毛番茄的父本系H2H2杂交。

[0237] 周缘嵌合体由类型{L3(MM),L2(MM),L1(EH1)}构成，其中MM和EH1表示二倍性(其中M和E和H1是单倍体)。EH1是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与多毛番茄品种PI127826的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EH1接穗到MM砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(EH1杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用SNP标记进行基因分型，该标记区分MM与EE。存在EE SNP指示该茎是周缘嵌合体，在MM的L2和L3层上携带基因型EH1的L1层。这类嵌合体能另外通过EH1杂交种的独特毛状体结构来容易地识别。

[0238] 嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0239] 嵌合体以及非嵌合MM对照植物用来自多毛番茄基因型H2(品种LA1625)的花粉异花受精以产生MH2杂交种种子。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0240] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。在7天时间段，以24小时间隔，以可见的胚根出现对发芽评分。如图20可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0241] 实施例7

[0242] 来自F1杂交种MH2的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系MM(MoneyMaker)与多毛番茄的父本系H2H2杂交。

[0243] 周缘嵌合体由类型{L3(MM),L2(MM),L1(EP1)}构成，其中MM和EP1表示二倍性(其中M和E和P1是单倍体)。EP1是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与潘那利番茄品种LA716的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EP1接穗到MM砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(EP1杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用SNP标记进行基因分型，该标记区分MM与EE。存在EE SNP指示该茎是周缘嵌合体，在MM的L2和L3层上携带基因型EP1的L1层。这类嵌合体能另外通过EP1杂交种的独特毛状体结构来容易地识别。

[0244] 嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0245] 嵌合体以及非嵌合MM对照植物用来自多毛番茄基因型H2(品种LA1625)的花粉异花受精，以产生MH2杂交种种子。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0246] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。在7天时间段，以24小时间隔，以可见的胚根出现对发芽评分。如图21可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0247] 实施例8

[0248] 来自F1杂交种MP2的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系MM(MoneyMaker)与潘那利番茄的父本系P2P2杂交。

[0249] 周缘嵌合体由类型{L3(MM),L2(MM),L1(EH1)}构成，其中MM和EH1表示二倍性(其中M和E和H1是单倍体)。EH1是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与多毛番茄品种PI127826的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EH1接穗到MM砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(EH1杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用SNP标记进行基因分型，该标记区分MM与EE。存在EE SNP指示该茎是周缘嵌合体，在MM的L2和L3层上携带基因型EH1的L1层。这类嵌合体能另外通过EH1杂交种的独特毛状体结构来容易地识别。

[0250] 嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0251] 嵌合体以及非嵌合MM对照植物用来自潘那利番茄基因型P2(品种LA1809)的花粉异花受精，以产生MP2杂交种种子。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0252] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。在7天时间段，以24小时间隔，以可见的胚根出现对发芽评分。如图22可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0253] 实施例9

[0254] 来自F1杂交种MP2的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系MM(MoneyMaker)与潘那利番茄的父本系P2P2杂交。

[0255] 周缘嵌合体由类型{L3(MM),L2(MM),L1(EP1)}构成，其中MM和EP1表示二倍性(其中M和E和P1是单倍体)。EH1是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与潘那利番茄品种LA716的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EP1接穗到MM砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的茎中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(EP1杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用SNP标记进行基因分型，该标记区分MM与EE。存在EE SNP指示该茎是周缘嵌合体，在MM的L2和L3层上携带基因型EP1的L1层。这类嵌合体能另外通过EP1杂交种的独特毛状体结构来容易识别。

[0256] 嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0257] 嵌合体以及非嵌合MM对照植物用来自潘那利番茄基因型P2(品种LA1809)的花粉异花受精，以产生MH2杂交种种子。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0258] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。以24小时间隔对发芽评分，作为7天时间段中可见的胚根出现。如图23可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0259] 实施例10

[0260] 来自F1杂交种MP3的番茄种子的发芽性质改善。此F1杂交种如下产生：使番茄的母本近交系MM(MoneyMaker)与潘那利番茄的父本系P3P3杂交。

[0261] 周缘嵌合体由类型{L3(MM),L2(MM),L1(EH1)}构成，其中MM和EH1表示二倍性(其中M和E和H1是单倍体)。EH1是番茄近交系EE(栽培品种Ailsa Craig品种LA3579)与多毛番茄品种PI127826的第一代F1杂交种。周缘体如下产生：首先嫁接EH1接穗到MM砧木上，然后嫁接愈合10天。嫁接结合点随后横向切割，由此，愈伤组织生长和幼芽再生自发出现。在再生的幼芽中，周缘嵌合体如下选择：首先用半显性表型标记xa(EP1杂交种中存在)目测鉴定周缘黄-绿叶嵌合体，然后选择全绿的腋枝。绿枝用SNP标记进行基因分型，该标记区分MM与EE。存在EE SNP指示该茎是周缘嵌合体，在MM的L2和L3层上携带基因型EH1的L1层。这类嵌合体能另外通过EH1杂交种的独特毛状体结构来容易识别。

[0262] 嵌合体在发育和从腋芽生根插条繁殖期间非常稳定，如通过没有L1细胞自发侵入L2来判断，其在另外绿色组织中作为黄色部分观察到。

[0263] 嵌合体以及非嵌合MM对照植物用来自潘那利番茄基因型P3(品种LA2657)的花粉异花受精，以产生MP3杂交种种子。杂交如下进行：就在开花期前使花去雄，接着在1-2天后授粉。从成熟果实中收获种子，浸泡于0.5％HCl 1小时，然后用自来水彻底冲洗，在滤纸上干燥并在环境条件下保存一到数周，待用。

[0264] 发芽速率如下体外确定：在密封培养皿的湿(自来水)滤纸上以网格化的阵列播种100个种子批次，然后在23摄氏度的人工气候室中于16/24小时的白光下温育。以24小时间隔对发芽评分，作为7天时间段中可见的胚根出现。如图24可见，嵌合体产生的种子具有极大改善的发芽速度和能力。

[0265] 实施例11

[0266] 温室粉虱(温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)；Tv)是番茄栽培中的严重有害生物。F1杂交种在潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579之间(潘那利番茄x番茄的F1)、多毛番茄品种PI127826与番茄品种LA3579之间(多毛番茄x番茄的F1)以及醋栗番茄品种CGN1552937与番茄品种LA3579之间(醋栗番茄x番茄的F1)分别产生。周缘嵌合体用实施例1所详述的方法产生，所述嵌合体带有衍生自这三个杂交种的每一个的表皮(L1)以及衍生自番茄Moneymaker的L2和L3。随后，确定周缘嵌合体是否显示对Tv抗性增加。番茄Moneymaker的30天插条和周缘嵌合体(每基因型2株植物)被转移到充斥Tv的温室(晚上最低温度为18-20℃，白天最高温度为25-26℃)。植物转移后3周，测定活的粉虱成虫数目(见图13)。此实验表明与易感栽培番茄(S.lycopersicum)相反，带有来自潘那利番茄×番茄的L1的周缘嵌合体和带有来自多毛番茄×番茄的L1的周缘嵌合体显示对Tv.抗性改善，但带有来自醋栗番茄×番茄的L1的周缘嵌合体没有。尽管图13未显示，对多毛番茄×番茄(均值±标准偏差:16.3±11.2)和醋栗番茄×番茄(均值±标准偏差:26.8±6.2)测试F1植物中的Tv抗性。

[0267] 实施例12

[0268] 蓟马(西花蓟马(Frankliniella occidentalis)；Fo)是番茄栽培中的严重有害生物。周缘嵌合体如实施例1所详述产生，该嵌合体带有衍生自潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579杂交种F1的L1以及衍生自番茄Moneymaker的L2和L3。随后，确定这些周缘嵌合体是否显示对Fo抗性增加。进行叶盘生物测定。简言之，番茄品种Moneymaker(易感性对照)、周缘嵌合体(对照植物)和来自潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579杂交种(供体植物)的叶盘被置于6孔板内，每个基因型使用24个叶盘(直径为30mm)。将叶盘置于琼脂顶部，远轴面向上。蓟马成虫用CO2麻醉且在每个叶盘上放一只成虫。各孔用泡沫聚苯乙烯和网笼密封。板置于25℃,60％HR和16h/8h光暗方案的受控的人工气候室中。48h后，移出成虫并记录存活情况。接种后6天，记录幼虫数目。

[0269] 与易感性对照植物相反，供体F1植物和周缘嵌合体显示对Fo的抗性提高(图16)。最引人注目的是，周缘嵌合体上没有Fo存活。此外，与易感性对照植物相反，在供体植物或周缘嵌合体中都没有观察到后代，这表明雌性蓟马没有产卵(表3)。

[0270] 表3：在番茄Moneymaker(易感性对照)、潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579杂交种(供体植物)F1，以及带有衍生自潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579杂交种F1的L1以及衍生自番茄Moneymaker的L2和L3(周缘嵌合体)上的后代数量。

[0271]

[0272] 实施例13

[0273] 二斑叶螨(二斑叶螨(Tetranychus urticae)；Tu)是番茄栽培中的严重有害生物。应注意此植物属于蛛形纲，而不是昆虫纲。

[0274] F1杂交种分别在潘那利番茄品种LA716与番茄品种LA3579之间(潘那利番茄×番茄的F1)以及多毛番茄品种PI127826与番茄品种LA3579之间(多毛番茄x番茄的F1)产生。周缘嵌合体用实施例1所详述的方法产生，该嵌合体带有衍生自这2个F1杂交种的表皮(L1)以及衍生自番茄Moneymaker的L2和L3。

[0275] 随后，确定周缘嵌合体是否显示对Tu的抗性增加。进行叶盘生物测定。简言之，番茄品种Moneymaker(易感性对照)和周缘嵌合体的叶盘被置于6孔板内。各孔填充有6ml 1％技术琼脂(technical agar)。每基因型使用4块板。每基因型使用24个叶盘(直径为30mm)。将叶盘置于远轴面向上的琼脂顶部。在每个叶盘上放一只成虫。各孔用泡沫聚苯乙烯和网笼密封。板置于25℃,60％HR和16h/8h光暗方案的受控的人工气候室中。48h后，移出成虫并记录存活情况。同时，记录产卵。与易感性对照植物相反，周缘嵌合体显示对Tu的抗性提高(表4和图17)。

[0276] 表4：番茄(MM)、嵌合植物(A:来自Moneymaker的L2/L3和来自番茄x潘那利番茄的F1的L1；B:来自Moneymaker的L2/L3和来自番茄x多毛番茄的F1的L1)上，活着的与死亡数目以及死亡占总蓟马(棉红蜘蛛)的百分比。

[0277]

[0278] 实施例14

[0279] 灰霉(灰霉菌(Botrytis cinerea)；Bc)是番茄栽培中的严重有害生物。此真菌病原体导致地上部分的组织有灰霉，令番茄果实不适于销售。周缘嵌合体如实施例1所详述产生，该嵌合体带有衍生自多毛番茄品种PI127826与番茄品种LA3579杂交种F1的L1以及衍生自番茄Moneymaker的L2和L3。随后，确定嵌合植物是否显示对Bc的抗性增加。进行离体叶片测定。简言之，用3uL液滴的10E+6孢子/mL感染番茄Moneymaker(易感性对照)和周缘嵌合体的复叶。感染后3天测定平均病变直径(mm)。相较于易感性对照中的疾病进展，观察到周缘嵌合体的Bc病变直径显著减小(图18).

[0280] 实施例15

[0281] 晚疫病(致病疫霉(Phytophthora infestans)；Pi)是番茄栽培中的严重疾病。此卵菌病原体导致地上部分组织的疾病，对绿色组织以及番茄果实造成严重损害。针对Pi抗性增加，测试如实施例11所详述产生的周缘嵌合体。进行离体叶片测定。简言之，用3000孢子的Pi感染番茄Moneymaker(易感性对照)和周缘嵌合体的小叶。每小叶有2滴15μl。接种后4天和7天，测定平均疾病严重程度评分和平均病变直径(mm)。在第7天，测定显示Pi孢子形成的叶部分。见表5.

[0282] 表5：测定Pi在嵌合植物(A:来自Moneymaker的L2/L3和来自番茄x潘那利番茄的F1的L1)；B:来自Moneymaker的L2/L3和来自番茄x多毛番茄的F1的L1:C:来自Moneymaker的L2/L3和来自番茄x醋栗番茄的F1的L1)、供体植物和番茄(MM)小叶上导致的疾病严重程度。MM-Mock指示未感染的对照。

[0283]

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