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通过使用ABC转运体序列来增加 植物生长和产量

阅读：578发布：2020-05-11

专利汇可以提供通过使用ABC转运体序列来增加植物生长和产量专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供用于改善植物生长的组合物和方法。也提供编码ABC转运体蛋白的多核苷酸、包含ABC转运体蛋白的多肽、用于表达感兴趣的基因的表达构建体，包含所述多核苷酸、多肽和表达构建体的植物，以及制备转基因植物的方法；所述感兴趣的基因的表达可以改善农艺性质，包括但不限于作物产量、生物胁迫和非生物胁迫耐受性、早期萌发势。，下面是通过使用ABC转运体序列来增加植物生长和产量专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于增加作物产量的方法，包括用至少一个ABC转运体蛋白编码序列转化植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。
3.一种植物，在其基因组中稳定地引入了与ABC转运体蛋白编码序列操作性连接、驱动植物中的表达的启动子，其中，所述启动子对于所述ABC转运体蛋白编码序列而言是异源的。
4.如权利要求3所述的植物，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。
5.一种转化的种子，其是权利要求3～4中任一项所述的植物的转化的种子。
6.如权利要求3或4所述的植物，其中，所述植物是单子叶植物。
7.如权利要求3或4所述的植物，其中，所述植物是双子叶植物。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列自发育调控启动子表达。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述发育调控启动子包含SEQ ID NO:3或5。
10.如权利要求3或4所述的植物，其中，驱动植物中的表达的所述启动子是发育调控启动子。
11.如权利要求10所述的植物，其中，所述发育调控启动子包含SEQ ID NO:3或5。
12.一种DNA构建体，以操作性连接的方式包括：
a.在植物细胞中起作用的启动子，以及
b.编码ABC转运体蛋白的核酸序列。
13.如权利要求12所述的DNA构建体，其中，所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。
14.如权利要求12或13所述的DNA构建体，其中，所述在植物细胞中起作用的启动子包含SEQ ID NO:3和5。
15.如权利要求12～14中任一项所述的DNA构建体，其中，所述启动子对于所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列而言是异源的。

说明书全文

通过使用ABC转运体序列来增加植物生长和产量

技术领域

[0001] 本发明涉及通过在植物中表达ABC转运体基因来增加植物生长和产量的组合物和方法。

背景技术

[0002] 世界人口的持续增长和农业上可用的可耕种土地的供应萎缩激励着人们研究开发具有更高的生物质和产量的植物。作物和园艺改良的常规手段是利用选择性育种技术来鉴定具有所需特性的植物。然而，这种选择性育种技术具有多种缺点，即，这些技术通常要耗费大量劳动力，且所得植物往往含有异源遗传组分，其不总是能从亲本植物带来所需的性状。分子生物学的发展提供了精确地改良植物种质的手段。植物的基因工程使得人们可以分离和操作遗传物质(通常为DNA或RNA的形式)，随后将该遗传物质导入植物中。这种技术能够产生出具有各种改良的经济、农艺或园艺性状的作物或植物。

[0003] 感兴趣的性状包括植物生物质和产量。产量一般定义为来自作物的经济价值的可测量产出。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于多种因素，例如器官的数量和尺寸、植物构筑型(例如枝条的数量)、种子生产、叶衰老等。根发育、养分摄取、胁迫耐受性、光合碳同化速率和早期萌发势也可以是决定产量的重要因素。因此，优化上述因素可以有助于增加作物产量。

[0004] 种子产量的增加是特别重要的性状，因为许多植物的种子对于人和动物的消费而言很重要。玉米、水稻、小麦、油菜(canola)和大豆等作物占人类总热量摄入的一半多，无论是通过直接消费种子本身或是通过消费建立在加工种子基础上的肉产品。它们也是糖、油及工业加工中所用的多种代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的养分来源)。种子的发育牵涉到许多基因，并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。尤其，胚乳对碳水化合物、油和蛋白质的代谢前体进行同化，并将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。植物生物质的增加对于苜蓿、青贮玉米和干草之类的饲料作物很重要。许多基因参与到有助于植物生长和发育的代谢途径中。调节植物中一个或多个这类基因的表达可产生相对于对照植物具有更好的生长和发育的植物，但往往也会产生相对于对照植物具有较差的生长和发育。因此，需要改善植物生长和发育的方法。

发明内容

[0005] 本申请提供用于调节植物中的基因表达的组合物和方法。该方法增加植物生长，带来更高的作物产量。该方法包括增加感兴趣的植物中至少一个ABC转运体基因的表达。本发明也包括构建体，该构建体包含与ABC转运体编码序列操作性连接、驱动植物细胞中的表达的启动子。组合物还包含具有增加的ABC转运体序列表达的植物、植物种子、植物器官、植物细胞及其它植物部分。本发明包括可用于增加植物中ABC转运体基因的表达的方法。该ABC转运体基因可以是天然序列，或者可以是对于感兴趣的植物而言是异源的序列。

[0006] 本发明的实施方式包括：

[0007] 1.一种用于增加作物产量的方法，包括用至少一个ABC转运体蛋白编码序列转化植物。

[0008] 2.实施方式1的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。

[0009] 3.实施方式1的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列编码与选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0010] 4.实施方式1的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列编码相对于选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列正值率、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0011] 5.一种植物，在其基因组中稳定地引入了与ABC转运体蛋白编码序列操作性连接、驱动植物中的表达的启动子，其中，所述启动子对于所述ABC转运体蛋白编码序列而言是异源的。

[0012] 6.实施方式5的植物，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。

[0013] 7.实施方式5的植物，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列编码与选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0014] 8.实施方式5的植物，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列编码相对于选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列正值率、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0015] 9.一种转化的种子，其是实施方式5～8中任一项的植物的转化的种子。

[0016] 10.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述植物是单子叶植物。

[0017] 11.实施方式10的植物，其中，所述植物来自玉米属、稻属、小麦属、高粱属、黑麦属、穇属、狗尾草属、甘蔗属、芒属、黍属、狼尾草属、大黍属、椰子属、凤梨属、芭蕉属、油棕属、燕麦属或大麦属。

[0018] 12.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述植物是双子叶植物。

[0019] 13.实施方式12的植物，其中，所述植物来自大豆属、芸薹属、苜蓿属、向日葵属、红花属、烟草属、茄属、棉属、番薯属、木薯属、咖啡属、柑橘属、可可属、山茶属、鳄梨属、榕属、番石榴属、杧果属、木犀榄属、番木瓜属、腰果属、澳洲坚果属、李属、甜菜属、杨属或桉属。

[0020] 14.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述植物相对于对照植物表现出生长增加。

[0021] 15.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述植物相对于对照植物表现出生物质产量增加。

[0022] 16.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述植物相对于对照植物表现出种子产量增加。

[0023] 17.实施方式1～4中任一项的方法，其中，所述ABC转运体蛋白编码序列自发育调控启动子表达。

[0024] 18.实施方式17的方法，其中，所述发育调控启动子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。

[0025] 19.实施方式1～18中任一项的方法，其还包括用至少一个其它蛋白编码序列转化植物。

[0026] 20.实施方式19的方法，其中，所述至少一个其它蛋白编码序列选自SEQ ID NO:7和9，或者编码与选自SEQ ID NO:8和10的序列具有至少90％相同性的蛋白质。

[0027] 21.实施方式19或20的方法，其中，所述至少一个其它蛋白编码序列编码选自SEQ ID NO:8和10的蛋白质。

[0028] 22.实施方式5～8中任一项的植物，其中，所述驱动植物中的表达的启动子是发育调控启动子。

[0029] 23.实施方式22的植物，其中，所述发育调控启动子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。

[0030] 24.实施方式5的植物，在其基因组中稳定地引入了与第二蛋白编码序列操作性连接、驱动植物中的表达的第二启动子，其中，所述第二启动子对于所述第二蛋白编码序列而言是异源的。

[0031] 25.实施方式24的植物，其中，所述第二蛋白编码序列选自SEQ ID NO:7和9，或者编码与选自SEQ ID NO:8和10的序列具有至少90％相同性的蛋白质。

[0032] 26.实施方式24或25的植物，其中，所述第二蛋白编码序列编码选自SEQ ID NO:8和10的蛋白质。

[0033] 27.一种DNA构建体，以操作性连接的方式包括：

[0034] a.在植物细胞中起作用的启动子，以及

[0035] b.编码ABC转运体蛋白的核酸序列。

[0036] 28.实施方式27的DNA构建体，其中，所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:1，或者编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质。

[0037] 29.实施方式27或28的DNA构建体，其中，所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列编码与选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0038] 30.实施方式27或28的DNA构建体，其中，所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列编码相对于选自SEQ ID NO:2和15-103的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列正值率、且具有ABC转运体功能的蛋白质。

[0039] 31.实施方式27或28的DNA构建体，其中，所述在植物细胞中起作用的启动子选自SEQ ID NO:3和5。

[0040] 32.实施方式27～31中任一项的DNA构建体，其中，所述启动子对于所述编码ABC转运体蛋白的核酸序列而言是异源的。

[0041] 33.一种用于增加作物产量的方法，包括调节植物中至少一个ABC转运体蛋白编码序列的表达。

[0042] 34.实施方式33的方法，其中，对表达的所述调节包括增加植物中至少一个ABC转运体蛋白编码序列的表达。

[0043] 35.实施方式34的方法，其中，对表达的所述增加包括增加所述植物中的天然ABC转运体序列的活性或增加所述植物中的天然ABC转运体蛋白编码序列的活性。

[0044] 36.实施方式5～8中任一项的植物，其中，驱动植物中的表达的所述启动子在叶组织中有活性。

[0045] 37.实施方式27～32中任一项的DNA构建体，其中，在植物细胞中起作用的所述启动子在叶组织中有活性。

具体实施方式

[0046] 本申请提供用于增加作物生物质和产量的组合物和方法。该方法包括增加感兴趣的植物中至少一个ABC转运体基因的表达。作物产量是一种极为复杂的性状，是由作物植物在其所有发育阶段中的生长以及分配给植物可收获部分的植物资源而产生的结果。在包括但不限于玉米和大豆的一些作物中，主要可收获部分可以包括种子，而其余生物质(例如叶和茎)用于次要应用。在包括但不限于甘蔗和紫花苜蓿的其它作物中，植物的主要可收获部分由植物的茎或整个地上部分组成。在包括但不限于马铃薯和胡萝卜的其它作物中，植物的主要可收获部分位于地下。不论作物植物的收获部分如何，可收获生物质的积累都是由植物的生长以及分配给植物的收获部分的光合固定碳而产生的结果。植物生长可以通过调节一个或多个植物基因的表达来控制。这种调节可以改变一条或多条代谢途径的功能，从而有助于植物生长和可收获生物质的积累。

[0047] 本发明的方法包括用于通过调节编码ABC转运体蛋白的一个或多个基因的表达来增加产量的植物生长控制。在一个优选实施方式中，相对于对照植物中的ABC转运体表达水平，将ABC转运体蛋白编码基因的表达上调，以使得ABC转运体表达相对于对照植物有所增加的植物中的可收获生物质增加。用于增加植物中的ABC转运体蛋白编码序列的活性或表达的任何方法都由本发明所涵盖。

[0048] 本发明的组合物包括构建体，该构建体包含与在植物细胞中起作用的启动子操作性连接的、SEQ ID NO:1所示的编码序列或编码选自SEQ ID NO:2和15-103的蛋白质的编码序列或其变体。"启动子"意在表示能够驱动植物或植物细胞中序列表达的DNA调控区。应认识到，在已经鉴定了本文公开的ABC转运体蛋白序列的情况下，例如通过BLAST搜索、PCR试验等来分离和鉴定其它ABC转运体蛋白序列和编码ABC转运体蛋白序列的核苷酸序列都在本领域的水平内。

[0049] 当本发明的编码序列组装在DNA构建体中以使得启动子操作性连接至感兴趣的编码序列时，其使得ABC转运体蛋白能够在用该DNA构建体稳定地转化的植物细胞中表达和积累。"操作性连接"意在表示两个或多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的启动子和感兴趣的异源核苷酸之间的操作性连接是允许感兴趣的异源核苷酸序列表达的功能性连接。操作性连接的元件可以毗连或不毗连。用于指代两个蛋白质编码区的接合时，操作性连接意指这些编码区位于同一阅读框内。盒可以额外含有欲共转化至植物中的至少一个其它基因。或者，可以在多个表达盒或DNA构建体中提供其它基因。表达盒可以额外含有选择性标记基因。

[0050] 通过该方式，在表达盒或表达构建体中和感兴趣的启动子序列(通常是异源启动子序列)一起提供编码本发明的ABC转运体蛋白的核苷酸序列，使其在感兴趣的植物中表达。"异源启动子序列"意在表示不是与ABC转运体蛋白编码核苷酸序列天然地操作性连接的序列。当ABC转运体蛋白编码核苷酸序列与启动子序列彼此异源时，ABC转运体蛋白编码核苷酸序列或异源启动子序列对于植物宿主而言可以是同源的、天然的、异源的或外来的。应认识到，启动子也可以驱动其同源或天然核苷酸序列的表达。在该情况下，转化的植物将具有表型变化。

[0051] 本发明的多核苷酸和氨基酸序列的片段和变体也可以通过在植物细胞中可操作的启动子来表达。"片段"意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。"变体"意在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸而言，变体包括：在5'和/或3'端具有缺失(即截短)的多核苷酸；在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点上具有一个或多个核苷酸的缺失和/或添加的多核苷酸；和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点上具有一个或多个核苷酸的取代的多核苷酸。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。一般来说，本发明的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，该序列相同性通过本文他处所述的序列比对程序和参数测得。本文所述的多核苷酸的片段和变体可编码保留ABC转运体功能的蛋白质。

[0052] "变体"氨基酸或蛋白质意在表示通过以下方式由天然氨基酸或蛋白质衍生的氨基酸或蛋白质：天然蛋白质N-末端和/或C-末端处的一个或多个氨基酸的缺失(所谓的截短)；天然蛋白质中的一个或多个内部位点上的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加；或者天然蛋白质中的一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的取代。本发明所涵盖的变体蛋白质具有生物活性，即，其继续具有天然蛋白质的所需生物活性，例如ATP的水解和无机离子的转运。天然多肽的生物活性变体与该天然序列的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性，该序列相同性通过本文所述的序列比对程序和参数测得。在一些实施方式中，变体多肽序列包含保守性氨基酸取代。将这种保守性氨基酸取代的数目与氨基酸相同性的数目之和除以感兴趣的序列中的氨基酸总数时，可以用来计算序列正值率(sequence positives)。序列正值率计算在NCBI BLAST服务器上进行，该NCBI BLAST服务器可以在万维网上通过
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi访问。本发明的蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质相差少至1～15个氨基酸残基、少至1～10个、如6～10个、少至5个、少至4个、3个、2个或者甚至1个氨基酸残基。

[0053] 氨基酸通常可分类为脂族、含羟基或含硫/硒、环状、芳族、碱性、酸性及其酰胺。不受到理论的限制，在一些情况下，对于变体蛋白质序列的产生来说，保守性氨基酸取代可以优于非保守性氨基酸取代，这是因为保守性取代相比于非保守性取代可以更容易地让变体蛋白质保留其生物活性。编码在序列中具有一个或多个氨基酸取代的多肽的多核苷酸落入本发明的范围内。下表1提供了属于各种类别的氨基酸的例子的列表。

[0054] 表1：氨基酸的类别

[0055] 氨基酸类别示例氨基酸脂族 Gly,Ala,Val,Leu,Ile
含羟基或含硫/硒 Ser,Cys,Thr,Met,Sec
环状 Pro
芳族 Phe,Tyr,Trp
碱性 His,Lys,Arg
酸性及其酰胺 Asp,Glu,Asn,Gln

[0056] 变体序列也可以通过现有的已测序基因组数据库的分析来鉴定。通过该方式，可鉴定相应序列并用于本发明的方法。

[0057] 比对序列的比较方法是本领域熟知的。因此，可采用数学算法确定任意两个序列的序列相同性百分数。这种数学算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的局部搜索比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的在Karlin和Altschul(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中经过改良的算法。

[0058] 这些数学算法的计算机实现可用于序列的比较以确定序列相同性。这类实施手段包括但不限于：PC/Gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的智慧遗传(Intelligenetics)公司)中的CLUSTAL；GCG威斯康辛遗传学软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)10版本(可获自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号克赛勒里公司(Accelrys Inc.))中的ALIGN程序(2.0版本)以及GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以用默认参数来进行。CLUSTAL程序已由Higgins等(1988)Gene 73:237-244(1988)；Higgins等(1989)CABIOS 5:151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)CABIOS 8:155-65；和Pearson等(1994)
Meth.Mol.Biol.24:307-331详细描述。ALIGN程序基于上述Myers和Miller(1988)的算法。
比较氨基酸序列时，可采用ALIGN程序以及PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、缺口罚分
4。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法。可利用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索(评分＝100，字长＝12)，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了进行缺口比对以用于比较目的，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述(在BLAST
2.0中)利用缺口BLAST。或者，可(在BLAST 2.0中)利用PSI-BLAST进行迭代搜索，其用来检测分子之间的远近关系。参见Altschul等(1997)同上。利用BLAST、缺口BLAST、PSI-BLAST时，可使用各程序(如核苷酸序列的BLASTN、蛋白质的BLASTX)的默认参数。参见www.ncbi.nlna.nih.gov。比对还可手工检查进行。

[0059] 这类基因和编码区可以进行密码子优化，以便在感兴趣的植物中表达。"密码子优化的基因"是具有设计成模拟宿主细胞的偏好密码子使用频率的密码子使用频率的基因。核酸分子可以整体或部分进行密码子优化。因为任何一个氨基酸(除甲硫氨酸和色氨酸外)都由多个密码子编码，所以可以改变核酸分子的序列而又不改变所编码的氨基酸。密码子优化是指当在核酸水平上有一个或多个密码子发生改变时，使得氨基酸不变，而特定宿主生物体中的表达增加。本领域技术人员会认识到，密码子表及提供各种生物体的偏好信息的其它参考物是本领域已知的(参见例如Zhang等(1991)Gene 105:61-72；Murray等(1989)Nucl.Acids Res.17:477-508)。例如在美国专利第6,015,891号及其中引用的参考文献、以及WO 2012/142,371及其中引用的参考文献中，提供了优化核苷酸序列以便在植物中表达的方法。

[0060] 本发明的核苷酸序列可以在重组多核苷酸中使用。“重组多核苷酸”包含在自然界中不会直接接合的两个或多个化学连接的核酸区段的组合。“直接接合”意指两个核酸区段紧邻并通过化学键彼此接合。在特定的实施方式中，重组多核苷酸包含感兴趣的多核苷酸或者其活性变体或片段，以使得另一化学连接的核酸区段位于感兴趣的多核苷酸的5’、3’或内部。或者，重组多核苷酸的化学连接的核酸区段可以通过序列的缺失来形成。另一化学连接的核酸区段或为了接合所连接的核酸区段而缺失的序列可以是任意长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个核苷酸。本文公开了用于制备这类重组多核苷酸的各种方法，包括例如通过化学合成或通过由基因工程技术来操作分离的多核苷酸区段。在特定的实施方式中，重组多核苷酸可以包含重组DNA序列或重组RNA序列。“重组多核苷酸的片段”包含在自然界中不会直接接合的两个或多个化学连接的氨基酸区段的至少一种组合。

[0061] “改变”或“调节”基因的表达水平意指基因的表达上调或下调。应认识到，在一些情况下，通过增加编码ABC转运体蛋白的一个或多个基因的表达水平、即上调表达来增加植物生长和产量。同样，在一些情况下，通过减少编码ABC转运体蛋白的一个或多个基因的表达水平、即下调表达来增加植物生长和产量。因此，本发明涵盖编码ABC转运体蛋白的一个或多个基因的上调或下调。另外，该方法包括在感兴趣的植物中上调编码ABC转运体蛋白的至少一个基因以及下调编码第二ABC转运体蛋白的至少一个基因。调节转基因植物中编码ABC转运体蛋白的至少一个基因的浓度和/或活性，意指该浓度和/或活性相对于未导入本发明序列的天然对照植物、植物部分或细胞增加或减少至少约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。

[0062] 应认识到，本发明的编码ABC转运体蛋白的基因的表达水平可以通过使用在植物细胞中起作用的一个或多个启动子来控制。感兴趣的ABC转运体蛋白编码基因的表达水平可以直接测定，例如通过检测植物中的ABC转运体基因转录物或所编码的蛋白质的水平来测定。这类检测的方法是本领域熟知的。例如，可以使用Northern印迹或定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)来检测转录物水平，而可以使用Western印迹、ELISA试验或酶试验来检测蛋白质水平。ABC转运体功能可以通过例如公知的ATP酶试验(Glavinas等2008Expert Opinion on Drug Metabolism&Toxicology 4:721-732)来检测。

[0063] “对象植物或植物细胞”是受到感兴趣的ABC转运体蛋白编码基因的影响而发生了遗传改变(如转化)的植物或植物细胞，或者是源自如此改变的植物或细胞并包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量对象植物或植物细胞的表型变化的参考点。因此，取决于本发明的方法，感兴趣的ABC转运体蛋白编码基因的表达水平高于或低于对照植物中的表达水平。

[0064] 对照植物或植物细胞可以包括例如：(a)野生型植物或细胞，即，基因型与用于在对象植物或细胞中产生遗传改变的起始材料相同；(b)基因型与起始材料相同、但用空构建体(即对感兴趣的性状没有已知的影响的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)对象植物或植物细胞的后代中为非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与对象植物或植物细胞相同、但未暴露在诱导感兴趣的基因表达的条件或刺激下的植物或植物细胞；或者(e)处于感兴趣的基因不表达的条件下的对象植物或植物细胞本身。

[0065] 尽管本发明用术语转化的植物来描述，但应认识到，本发明的转化的生物体也包括植物细胞、植物原生质体、来自可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛、以及在植物或植物部分中的完好植物细胞，例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等。谷物意在表示由商业种植者们为了物种的生长或再生产以外的目的而生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些部分包含导入的多核苷酸。

[0066] 为了下调感兴趣的ABC转运体蛋白编码基因的表达，可以构建反义构建体，该反义构建体与感兴趣的基因、尤其是编码感兴趣的ABC转运体蛋白的基因的序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补。反义核苷酸设计成与相应的mRNA杂交。可以进行反义序列的改良，只要该序列与相应的mRNA杂交并干扰其表达。通过该方式，可以使用与欲沉默的相应序列具有70％、较佳为80％、更佳为85％、90％、95％或更高的序列相同性的反义构建体。另外，可以使用反义核苷酸的一部分来干扰靶基因的表达。

[0067] 本发明的多核苷酸可用于从其它植物分离相应序列。通过该方式，可采用诸如PCR、杂交等方法，基于其相对于本文所示序列的序列同源性或相同性来鉴定这类序列。基于其相对于本文所示的完整序列或其变体和片段的序列相同性而分离的序列由本发明所涵盖。这类序列包括本公开序列的直系同源物的序列。"直系同源物"意在表示衍生自共同的祖先基因、并且作为物种形成的结果而存在于不同物种中的基因。存在于不同物种中的基因在其核苷酸序列和/或其编码的蛋白质序列共有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性时，被认为是直系同源物。直系同源物的功能通常在物种间高度保守。因此，具有转录活性或增强子活性、并且与本文所述序列共有至少75％的序列相同性的分离多核苷酸或其变体或片段由本发明所涵盖。

[0068] 变体序列可通过PCR来分离。设计PCR引物和PCR克隆的方法为本领域公知且公开于Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)。另见Innis等编著，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications《( PCR方案：方法和应用指南》)(美国学术出版社，纽约)；Innis和Gelfand编著，(1995)PCR Strategies(《PCR策略》)(美国学术出版社，纽约)；以及Innis和Gelfand编著，(1999)PCR Methods Manual(《PCR方法手册》)(美国学术出版社，纽约)。

[0069] 变体序列也可以通过现有的已测序基因组数据库的分析来鉴定。通过该方式，可鉴定编码ABC转运体蛋白的相应序列并用于本发明的方法。变体序列保留ABC转运体蛋白的生物活性(即ATP的水解和无机离子的转运)。本发明显示，出乎意料的是，ABC转运体蛋白过表达的某些新型表达策略可导致生物质和种子产量增加。

[0070] 表达盒在转录物的5'-3'方向上包含：转录和翻译起始区、编码本发明的ABC转运体蛋白的多核苷酸、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。

[0071] 多种启动子可用于实施本发明。编码本发明的ABC转运体蛋白的多核苷酸可以自具有组成型表达谱的启动子表达。组成型启动子包括CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)等。

[0072] 编码本发明的ABC转运体蛋白的本发明的多核苷酸可以由组织偏好性启动子表达。组织偏好性启动子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):
773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；
以及Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3):495-505。叶偏好性启动子也是本领域已知的。参见例如Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105:357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Gotor等(1993)Plant J.3:509-18；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；以及Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590。

[0073] 对于编码ABC转运体蛋白的多核苷酸的表达而言，发育调控启动子可能是理想的。这类启动子可以在特定的发育阶段显示出表达峰值。这类启动子已在本领域中描述，例如US 62/029,068；Gan和Amasino(1995)Science 270:1986-1988；Rinehart等(1996)Plant Physiol 112:1331-1341；Gray-Mitsumune等(1999)Plant Mol Biol 39:657-669；
Beaudoin和Rothstein(1997)Plant Mol Biol 33:835-846；Genschik等(1994)Gene 148:
195-202等。

[0074] 对于编码ABC转运体蛋白的多核苷酸的表达而言，在施加特定的生物胁迫和/或非生物胁迫后被诱导的启动子可能是理想的。这类启动子已在本领域中描述，例如Yi等(2010)Planta 232:743-754；Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki(1993)Mol Gen Genet 236:331-340；U.S.Patent No.7,674,952；Rerksiri等(2013)Sci World J 2013:Article ID 397401；Khurana等(2013)PLoS One 8:e54418；Tao等(2015)Plant Mol Biol Rep 33:
200-208等。

[0075] 对于编码ABC转运体蛋白的多核苷酸的表达而言，细胞偏好性启动子可能是理想的。这类启动子可以在特定的细胞种类、例如叶肉细胞或维管束鞘细胞中偏好性地驱动下游基因的表达。这类细胞偏好性启动子已在本领域中描述，例如Viret等(1994)Proc Natl Acad USA 91:8577-8581；美国专利第8,455,718号；美国专利第7,642,347号；Sattarzadeh等(2010)Plant Biotechnol J 8:112-125；Engelmann等(2008)Plant Physiol 146:1773-1785；Matsuoka等(1994)Plant J 6:311-319等。

[0076] 应认识到，相对于感兴趣的一个或多个基因的组成型表达，特定的非组成型表达谱可提供改善的植物表型。例如，许多植物基因是通过光照条件、施加特定胁迫、昼夜循环或植物的发育阶段来调节的。这些表达谱对于植物体中的基因或基因产物的功能而言可能是很重要的。可以用于提供所需表达谱的一种策略是使用含有顺式调节元件的合成启动子，其在植物中的所需时间和位置驱动所需的表达水平。可用于改变植物体中的基因表达的顺式调节元件已在科技文献(Vandepoele等(2009)Plant Physiol 150:535-546；Rushton等(2002)Plant Cell 14:749-762)中描述。顺式调节元件也可以用于改变启动子表达谱，如Venter(2007)Trends Plant Sci 12:118-124中所述。

[0077] 植物终止子是本领域已知的，包括可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒的植物终止子，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另见Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91:151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；以及Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

[0078] 如所示，编码本发明的ABC转运体蛋白的核苷酸可以用于表达盒中来转化感兴趣的植物。转化方案以及将多肽或多核苷酸序列导入植物中的方案可以变化，取决于作为转化靶标的植物或植物细胞的种类，即单子叶植物或双子叶植物。术语“进行转化”或“转化”是指用于将多肽或多核苷酸导入植物细胞中的任何方法。将多肽或多核苷酸导入植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4:320-334)、电穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利第5,563,055号和美国专利第5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:
2717-2722)、以及射弹粒子加速(参见例如美国专利第4,945,050号；美国专利第5,879,918号；美国专利第5,886,244号；以及美国专利第5,932,782号；Tomes等(1995)在Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods(《植物细胞、组织和器官培养：基础方法》)中，Gamborg和Phillips编著(施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林)；McCabe等(1988)Biotechnology 6:923-926)；以及Lec1转化(WO 00/28058)。另见Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等(1987)Particulate Science and Technology 5:27-37(洋葱)；Christou等(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；
McCabe等(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein等(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6:559-
563(玉米)；美国专利第5,240,855号；美国专利第5,322,783号；以及美国专利第5,324,646号；Klein等(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8:
833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(伦敦)311:763-764；美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；De Wet等(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues(《胚珠组织的实验操作》)中，Chapman等编著(朗文出版社(Longman)，纽约)，第197-209页(花粉)；
Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等(1992)
Theor.Appl.Genet.84:560-566(触须介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell 4:
1495-1505(电穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports 12:250-255及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology
14:745-750(玉米，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))；所有这些文献通过引用纳入本文。"稳定转化"意在表示导入植物中的核苷酸构建体整合至植物的基因组中，并能够由其后代遗传。

[0079] 经转化的细胞可根据常规方式生长成植物。参见例如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。通过该方式，本发明提供转化的种子(也称为“转基因种子”)，在其基因组中稳定地引入了本发明的多核苷酸，例如本发明的表达盒。

[0080] 本发明可以用于转化任何植物种类，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物种类的例子包括但不限于：玉米(Zea mays)、芸薹属(例如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))、尤其是用作菜籽油来源的油菜种类、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor)、红棕色高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、橡胶(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、油橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、油棕(Elaeis guineensis)、杨(Populus spp.)、桉(Eucalyptus spp.)、燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、蔬菜、观赏植物和针叶树。

[0081] 在一个实施方式中，使用含有在植物细胞中可操作的启动子的构建体来转化植物细胞，该启动子与编码本发明的ABC转运体蛋白的编码序列操作性连接。令转化的植物细胞再生，以生产转化的植物。这些用含有驱动本发明的ABC转运体蛋白编码多核苷酸表达的功能性启动子的构建体转化的植物被证明具有增加的植物产量，即增加的地上生物质和/或增加的可收获生物质和/或增加的种子产量。

[0082] 现已证明，ABC转运体的上调可增加植物产量，也可采用用于增加感兴趣的植物中的内源性ABC转运体序列表达的其它方法。植物基因组中存在的ABC转运体基因的表达可以通过在植物基因组中存在的ABC转运体基因的上游插入转录增强子来改变。该策略将允许ABC转运体基因的表达保持其正常发育状况，而又显示出升高的转录物水平。该策略将通过采用针对感兴趣的基因组序列设计的大范围核酸酶在感兴趣的ABC转运体基因的上游插入增强子元件而实现。或者，采用与针对感兴趣的基因组序列设计的导引RNA(gRNA)偶联的Cas9核酸内切酶、或与针对感兴趣的基因组序列设计的gRNA偶联的Cpf1核酸内切酶、或与针对感兴趣的基因组序列设计的gRNA偶联的Csm1核酸内切酶，在感兴趣的ABC转运体基因的上游插入增强子元件。或者，将与转录增强子元件融合的失活核酸内切酶(例如失活的Cas9、Cpf1或Csm1核酸内切酶)靶向感兴趣的ABC转运体基因的转录起始位点附近的基因组位置，从而调节所述感兴趣的ABC转运体基因的表达(Piatek等(2015)Plant Biotechnol J 13:578-589)。

[0083] ABC转运体蛋白编码基因表达的调节可以通过使用精确基因组编辑技术调节内源性序列的表达来实现。通过该方式，采用本领域已知的方法将核酸序列插入至编码ABC转运体的天然植物序列附近。这类方法包括但不限于：针对感兴趣的植物基因组序列设计的大范围核酸酶(D’Halluin等(2013)Plant Biotechnol J 11:933-941)；CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、TALENs及其它用于精确编辑基因组的技术(Feng等(2013)Cell Research 23:1229-1232，Podevin等(2013)Trends Biotechnology 31:375-383，Wei等(2013)J Gen Genomics 40:281-289，Zhang等(2013)WO 2013/026740，Zetsche等(2015)Cell 163:759-
771，美国临时专利申请62/295,325)；格氏嗜盐碱杆菌Argonaute蛋白介导的DNA插入(Gao等(2016)Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.3547)；Cre-lox位点特异性重组(Dale等(1995)Plant J 7:649-659；Lyznik等(2007)Transgenic Plant J 1:1-9；FLP-FRT重组(Li等(2009)Plant Physiol 151:1087-1095)；Bxb1介导的整合(Yau等(2011)Plant J 701:
147-166)；锌指蛋白介导的整合(Wright等(2005)Plant J 44:693-705)；Cai等(2009)Plant Mol Biol 69:699-709)；以及同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)Methods Mol Biol 701:51-65；Puchta(2002)Plant Mol Biol 48:173-182)。所述核酸序列的插入将用于实现过表达、减少表达和/或改变ABC转运体基因表达谱的所需效果。

[0084] 增强子包括在插入植物的基因组中时能够增强基因表达的任何分子。因此，增强子可被插入感兴趣的ABC转运体序列的基因组上游或下游区域以增强表达。增强子可以是顺式作用的，并且相对于欲增强其表达的基因可位于基因组中的任何位置。例如，增强子可以位于其增强表达的编码序列的约1Mbp、约100kbp、约50kbp、约30kbp、约20kbp、约10kbp、约5kbp、约3kbp或约1kbp范围内。增强子也可以位于其增强表达的基因的约1500bp范围内，或者可以直接毗邻其增强表达的基因的内含子或位于其增强表达的基因的内含子内。用于调节编码本发明的ABC转运体蛋白或同源物的内源基因表达的增强子包括经典的增强子元件，如CaMV 35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件、SV40增强子元件、以及增强基因表达的内含子介导增强子元件如玉米shrunken-1增强子元件(Clancy和Hannah(2002)Plant Physiol.130(2):918-29)。可以导入植物基因组中来调节表达的增强子的例子还包括PetE增强子(Chua等(2003)Plant Cell 15:11468-1479)或水稻α-淀粉酶增强子(Chen等(2002)J.Biol.Chem.277:13641-13649)或本领域已知的任何增强子(Chudalayandi(2011)Methods Mol.Biol.701:285-300)。在一些实施方式中，本发明包括亚结构域、片段或重复增强子元件(Benfrey等(1990)EMBO J 9:1677-1684)。

[0085] ABC转运体基因表达的改变也可以通过以不会改变DNA序列的方式修饰DNA来实现。这类变化可以包括修饰感兴趣的ABC转运体基因和/或围绕ABC转运体基因的DNA的染色质成分或结构。众所周知，这类染色质成分或结构的变化能影响基因转录(Hirschhorn等(1992)Genes and Dev 6:2288-2298；Narlikar等(2002)Cell 108:475-487)。这类变化也可以包括改变感兴趣的ABC转运体基因和/或围绕感兴趣的ABC转运体基因的DNA的甲基化状态。众所周知，这类DNA甲基化的变化能改变转录(Hsieh(1994)Mol Cell Biol 14:5487-5494)。已证明靶向表观基因组编辑以可预期方式影响基因的转录(Hilton等(2015)33:
510-517)。对本领域技术人员来说显而易见的是，为了实现改变ABC转运体基因表达谱的所需效果，可以对调节感兴趣的ABC转运体基因转录的DNA施加其它类似的改变(统称为“表观遗传学改变”)。

[0086] ABC转运体基因表达的改变也可以通过使用转座因子技术改变基因表达来实现。应理解，转座因子可改变邻近DNA的表达(McGinnis等(1983)Cell 34:75-84)。编码ABC转运体的基因表达的改变可以通过在感兴趣的ABC转运体基因的上游插入转座因子、导致所述基因的表达发生改变来实现。

[0087] ABC转运体基因表达的改变也可以通过对调节感兴趣的ABC转运体基因表达的一个或多个转录因子进行表达来实现。应理解，转录因子表达的改变可进而改变所述转录因子的靶基因的表达(Hiratsu等(2003)Plant J 34:733-739)。ABC转运体基因表达的改变也可以通过改变已知与感兴趣的ABC转运体基因相互作用的转录因子的表达来实现(例如OCL1；Javelle等(2010)Plant Physiol 154:273-286)。

[0088] ABC转运体基因表达的改变也可以通过在感兴趣的植物种类中编码天然ABC转运体的开放阅读框的上游插入启动子来实现。这将通过采用针对感兴趣的基因组序列设计的大范围核酸酶、在编码ABC转运体蛋白的开放阅读框的上游插入感兴趣的启动子来实现。该策略是众所周知的，并且先前已经证明在棉花基因组中的预定位置插入转基因(D’Halluin等(2013)Plant Biotechnol J 11:933-941)。对本领域技术人员来说显而易见的是，可以采用其它技术，通过在预定的基因组基因座处引起双链断裂并提供适合于插入的DNA模板，来实现在所述预定的基因组基因座处插入遗传元件的类似结果(例如CRISPR-Cas9、CRISPR-cpf1、CRISPR-Csm1、TALENs及其它用于精确编辑基因组的技术)。

[0089] 通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。本说明书中涉及的所有出版物和专利申请表明本发明涉及领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的出版物或专利申请具体和单独地通过引用纳入本文那样。

[0090] 虽然出于方便理解的目的，通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明，但可明显看出，某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。

[0091] 实验部分

[0092] 实施例1–ABC转运体植物转化载体的构建

[0093] 合成编码玉米ABC转运体蛋白的开放阅读框。该开放阅读框包含SEQ ID NO:1，编码SEQ ID NO:2的蛋白质序列。在编码序列的5’和3’端包括合适的限制性位点，以允许该DNA被克隆至含有适合于控制基因表达的遗传元件的植物转化载体中。各植物转化构建体中，ABC转运体开放阅读框位于植物启动子和5’非翻译区(5’UTR)的下游、3’UTR的上游。表2汇总了构建成含有ABC转运体开放阅读框的植物转化构建体。

[0094] 表2：ABC转运体植物转化构建体

[0095]

[0096] 除了表2所列的单基因ABC转运体植物转化构建体外，也构建了含有ABC转运体基因盒和连接的第二盒的多基因植物转化构建体。表3汇总了多基因ABC转运体植物转化构建体。

[0097] 表3：ABC转运体多基因植物转化构建体

[0098]

[0099] 除了表2和3所示的基因盒外，表2和3所列的各植物转化构建体还含有选择性标记盒，其适合于选择转化的植物细胞并在导入植物转化载体后使植物再生，如下所述。各转化载体构建在含有适合于在大肠杆菌和根癌农杆菌中保持质粒的序列的质粒中。验证表2和3所列的植物转化构建体含有所需序列，然后将它们转化至植物转化用的根癌农杆菌中。

[0100] 实施例2–狗尾草(Setaria viridis)的转化

[0101] 根据以上所述的方法(PCT/US2015/43989，通过引用纳入本文)，用携带ABC转运体植物转化载体的根癌农杆菌细胞转化狗尾草细胞。用相关植物转化载体转化狗尾草细胞，并再生狗尾草植物，然后进行PCR分析以确认狗尾草基因组中存在感兴趣的基因。表4汇总了用于转化狗尾草的转化构建体，以及经PCR验证的用各构建体转化而得的转基因植物的数量。

[0102] 表4：用ABC转运体植物转化载体转化狗尾草的汇总

[0103] 构建体 #植株131223 25
131220 31

[0104] 实施例3–玉米(Zea mays)的转化

[0105] 用携带132141构建体(表2)的根癌农杆菌细胞转化适合于在组织培养基中再生的玉米(Zea mays cv.B104)细胞。转化玉米细胞，并再生玉米植物，然后进行PCR分析以确认玉米基因组中存在感兴趣的基因。生产了45个转化的植株，并通过分子试验确认包含感兴趣的基因。

[0106] 实施例4–水稻(Oryza sativa)的转化

[0107] 用携带ABC转运体植物转化载体的根癌农杆菌细胞转化适合于在组织培养基中再生的水稻(Oryza sativa cv.Kitaake)细胞。用相关植物转化载体转化水稻细胞，并再生水稻植物，然后进行PCR分析以确认水稻基因组中存在感兴趣的基因。

[0108] 实施例5–转基因狗尾草的表征

[0109] 用ABC转运体植物转化载体转化狗尾草并再生，然后培养T0代植物至成熟，以生产T1代种子。携带感兴趣的ABC转运体基因盒的T1代狗尾草在温室中生长，以评估ABC转运体基因表达对植物生长、最终地上生物质和种子产量的影响。采用随机区组设计，用野生型狗尾草边行来消除分析中的边缘效应。空分离子植物在相同的环境条件下生长在转基因狗尾草植物边上。表5汇总了用携带ABC转运体基因盒的T1代狗尾草植物进行的实验中得到的生物质和种子产量测定的结果，作为转化的结果(实验S60和S68)。实验U16显示用通过所示T1植株的自花授粉生产的T2代狗尾草进行的实验的生物质和种子产量的结果。该表所示为用于转化的构建体，如表2所述，然后是从中收获了T1种子的T0植株数量。

[0110] 表5：采用T1代植物的狗尾草温室观察的汇总

[0111]

[0112] 表5中，地上生物质的干重以克数示于DW栏中。类似地，收获种子的干重以克数示于种子产量栏中。DW变化和种子变化栏分别所示为地上生物质和种子产量相对于来自131220构建体的空分离子的变化百分数。如该表所示，实验S68中经测试的所有五个131220植株相对于空分离子都具有增加的地上生物质积累，经测试的五个131220植株中有三个相对于空分离子具有增加的种子产量。实验S60中，经测试的五个131223植株中有一个相对于空分离子对照产生了增加的生物质和种子产量。实验U16中，测试了通过自花授粉生产的T2代植株的生物质产量和种子产量。这些测试中，植株14A相对于空分离子再一次显示出生物质产量的增加和种子产量的减少；植株19B显示出增加的生物质产量和种子产量；植株26相对于空分离子显示出增加的种子产量。

[0113] 实施例6–转基因玉米的表征

[0114] 用感兴趣的ABC转运体植物转化载体转化、并确认含有感兴趣的基因的T0代玉米植物在温室中生长至成熟。当T0植物进入繁殖期时，用合适的近交玉米品系对它们授粉，以产生杂交玉米种子。或者，除了T0代转基因玉米植物的授粉外，还用来自T0的花粉对一个或多个近交玉米品系授粉，以产生杂交玉米种子。将通过这些授粉而得的F1代杂交种子种植在田地里，设置为两行或四行的小块土地，用标准农艺实践培养。检测植物的基因型，以确定哪些植物含有、哪些植物不含有ABC转运体基因盒以及包含在ABC转运体植物转化载体中的其它任何相关基因盒(例如选择性标记基因盒)。玉米植物成熟后，收获种子。收集来自含有ABC转运体基因盒的植物的种子，同样也收集来自缺少ABC转运体基因盒的空分离子植物的种子。对种子称重，并计算含有ABC转运体基因盒的植物以及缺少ABC转运体基因盒的空分离子植物的种子产量。进行合适的统计学分析来确定含有ABC转运体基因盒的植物是否具有比缺少ABC转运体基因盒的植物更高的产量。

[0115] 或者，用感兴趣的ABC转运体植物转化载体转化、并确认含有感兴趣的基因的T0代玉米植物在温室中生长至成熟，然后自花授粉。将所得的T1种子种植在温室中，并培养T1植物。检测T1植物的基因型，以鉴定纯合子、杂合子和空分离子植物。用来自纯合子T1植物的花粉对一个或多个近交玉米品系授粉，以产生杂交玉米种子。也用来自空分离子植物的花粉对一个或多个近交玉米品系授粉，以产生杂交玉米种子。将所得的杂交种子种植在田地里，设置为两行或四行的小块土地，用标准农艺实践培养。玉米植物成熟后，收获种子。收集来自含有ABC转运体基因盒的植物的种子，同样也收集来自缺少ABC转运体基因盒的空分离子植物的种子。对种子称重，并计算含有ABC转运体基因盒的植物以及缺少ABC转运体基因盒的空分离子植物的种子产量。进行合适的统计学分析来确定含有ABC转运体基因盒的植物是否具有比缺少ABC转运体基因盒的植物更高的产量。

[0116] 实施例7–转基因水稻的表征

[0117] 用感兴趣的ABC转运体植物转化载体转化、并确认含有感兴趣的基因的T0代水稻植物在温室中生长至成熟，然后自花授粉。将所得的T1种子种植在温室中，并培养T1植物。检测T1植物的基因型，以鉴定纯合子、杂合子和空分离子植物。让来自各组的植物生长至成熟，并自花授粉以产生T2种子。将由该自花授粉得到的T2种子收获并称重，计算来自纯合子、杂合子和空分离子植物的种子产量。进行合适的统计学分析来确定含有ABC转运体基因盒的植物是否具有比缺少ABC转运体基因盒的植物更高的产量。

[0118] 由T0代植物的自花授粉得到的种子长成的T1代植物、或者由纯合子T1代植物的自花授粉得到的种子长成的T2代植物在田地里生长。对于T2代植物，对空分离子T1代植物也进行自花授粉，以产生T2代空植物作为阴性对照。用标准农艺实践培养这些植物，令其达到成熟。达到成熟后，让这些植物自花授粉。将由这些自花授粉得到的种子收获并称重，计算来自纯合子、杂合子和空分离子植物的种子产量。进行合适的统计学分析来确定含有ABC转运体基因盒的植物是否具有比缺少ABC转运体基因盒的植物更高的产量。

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