下述
实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中的百分含量如无特别说明,均为
质量百分含量。
本发明中所使用的术语“PHA”是指由微生物合成的聚羟基脂肪酸酯,其结构通式如 式(I)所示,包括的PHA分子式例如聚羟基丁酸(PHB)、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸的 共聚物PHBV、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物PHBHHx以及中长链单体如3-羟基己 酸HHx到3-羟基十二酸3-HDD的单聚物或共聚物,。
本发明中所使用的术语“PHA合成途径的相关基因”是指,在PHA合成途径中,参 与了PHA整个合成过程的各种相关合成酶和调控蛋白所对应的基因;例如PHA合酶基因 phaC,3-羟酰基-酰基转移蛋白辅酶A转运酶基因phaG,(R)-烯酰基-水合酶基因 phaJ基因等。
本发明中所使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的 生存能力,比如较高或较低的
温度,较高或较低的pH,较高或较低的渗透压,较高的反 馈抑制,有毒物质的存在等。
本发明中所使用的术语“微生物”包括细菌、古细菌、真菌(例如酵母)等。
本发明中所使用的术语“发酵产物”是指一切通过微生物发酵或转化而得到的产品, 比如有机酸、酒精、其他醇类、抗生素、氨基酸、维生素等。
实施例1、在兽疫链球菌中表达Wautersia eutropha的phbCAB基因影响乳酸及透 明质酸产量
菌种:兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920
1)在标准的聚合酶链式反应条件下,以pBHR68质粒(Spiekermann P,Rehm BHA, Kalscheuer R,Baumeister D,Steinbüchel A.A sensitive,viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds.Arch Microbiol 1999, 171:73-80)为模板,用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC和 GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT扩增出phbCAB基因,然后经过HindIII和ClaI酶 切处理后,插入到质粒pEU308(Eichenbaum Z.and Federle MJ.Use of the lactococcal nisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria:comparison of induction level and promoter strength.Appl.Environ.Microbiol.1998,64: 2763-2769)的Spac启动子下限制性内切酶HindIII和ClaI的识别位点间,获得质粒 pEUHB。然后通过SphI酶切将质粒上的LacI基因
切除,使phbCAB基因的表达不需要IPTG 诱导,得到质粒pEUHBNOI。
2)制备兽疫链球菌的感受态细胞,并将质粒pEUHBNOI用电转化方法转入兽疫链球 菌中。
感受态细胞的制备:
将兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920在含有 THYB(Todd-Hewitt broth)(从OXOID购买)36.4g/L和酵母
浸出物0.5%的培养基中培 养12h;然后将其接种到50mL新鲜的THYB培养基中,接种后D530不超过0.05,培养 到OD530=0.25即可;并在培养结束前半小时加入透明质酸酶0.4mg/mL;
4℃,8000g,离心10分钟,弃上清,用20mL 0.5mmol/L
蔗糖溶液重悬细胞;
4℃,8000g,离心10分钟,弃上清,用1mL 0.5mmol/L蔗糖溶液重悬细胞,再离 心,弃上清;将细胞重悬在250μL含有10%甘油的0.5mmol/L蔗糖溶液中,按使用体 积分装到Eppendorf管中;迅速置于-80℃保存。
兽疫链球菌的电转化
在200μL感受态细胞中加入500-5000ng质粒pEUHBNOI,
冰浴10分钟;将混合体 系转移到2mm电激杯中电激,
电压设为2.5kv;
用1mL冰冷的THYB将混合体系转移到10mLTHYB中,冰浴30-60分钟;然后37℃ 静置培养1小时;接着在14℃,6000g,离心10分钟,菌体用1mL THYB重悬并涂于抗 性平板上进行转化子的筛选,得到重组兽疫链球菌(含有pEUHBNOI的兽疫链球菌 (Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920)。
3)重组兽疫链球菌的发酵
种子培养基成分为蔗糖:20g/L,酵母粉:10g/L,
牛肉膏:10g/L,MgSO4·7H2O: 2g/L,MnSO4·4H2O:0.1g/L,KH2PO4:2g/L,微量元素液:1mL/l,种子缓冲液:40mL/l。 发酵培养基成分为酵母粉:20g/L,Na2HPO4·12H2O:6.2g/L,MgSO4·7H2O:2g/L,K2SO4: 1.3g/L,FeSO4·7H2O:5mg/L,微量元素液:2.5mL/l,蔗糖:70g/L。其中微量元素 液含CaCl2:2g/L,MnSO4·4H2O:24mg/L,ZnCl2:46mg/L,CuSO4·5H2O:19mg/L;种 子缓冲液含Na2HPO4·12H2O:36.76g/L,NaH2PO4·12H2O:15.98g/L,NaHCO3:12.5g/L。
用接种环分别挑取平板上的兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920 和重组菌菌种,分别接入装有150mL种子培养基的500mL三角瓶中,于200rpm的摇 床上培养14-16小时,培养温度设为37℃;然后按10%(体积比)的接种量将种子接 入
发酵罐(7.5升发酵罐(NBS Bioflo 3000,NJ,USA)中装液量3升)中。发酵罐控制温 度37℃,pH值7.0,通气量5L/min。初始搅拌速度200rpm,当溶氧降到0时升高转速 到500rpm,溶氧再次降到0时转速调为650rpm,并维持到发酵结束,兽疫链球菌 (Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920发酵14小时,重组菌发酵16小时。分 别测定发酵培养基中的透明质酸和乳酸的含量。结果表明兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920发酵14小时的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)和乳酸产 量分别为5.4g/L和65g/L。重组菌发酵14小时的透明质酸和乳酸产量为5.6g/L和 38g/L,乳酸产量下降42%;16小时的产量为7.3g/L和41g/L,透明质酸产量上升 34%,乳酸产量下降37%。乳酸合成是兽疫链球菌在缺氧条件下主要的获取细胞内氧 化力(NAD)的途径,因此细菌在发酵过程中产生大量的乳酸。而引入PHB合成途径为细 胞提供了一条外源的NAD再生途径,从而可以降低乳酸途径的压力,使乳酸合成大大减 少,乳酸的大量减少,使更多的的碳源能够流向别的代谢途径,从而使透明质酸产量也 得到一定提高。
其中,透明质酸含量测定采用Bitter-Muir氏法(Bitter T.,Muri HM.A modified uronic acid carbazol reaction.Anal.Biochem.1962,4:330-334),发酵液的测量 样品制备方法如下:a)取1mL发酵液准确稀释到4mL,6000转离心10分钟;b)取1mL 上清加入到4mL无水乙醇中,振荡,6000转离心5分钟;c)弃去上清,加入2mL 0.2mmol/L NaCl,放置,间或振荡,直至最终溶解;d)加入4mL无水乙醇,振荡,6000转离心5 分钟;e)弃去上清,沉淀用2mL去离子水溶解作为HA测定的样品。乳酸盐浓度的测定: 采用HPLC(SpectroSYSTEM P2000,Thermo Separation Products,USA)法。折光检测器, 离子交换柱Aminex HPX-87H,300mm×7.8mm,流动相为0.005mmol/L
硫酸溶液,流速0.50 mL/min。检测前,取0.2mL发酵样品,准确稀释到4mL,10000rpm/min离心5分钟, 去上清,0.45μm滤
膜过滤后作为色谱的样品。
实施例2、在光滑球拟酵母中表达phbCAB基因影响丙酮酸产量
菌种:光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019
培养基:斜面和种子培养基(L):葡萄糖20g/L,蛋白胨10g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,琼脂20g/L(斜面用),pH 5.5。
发酵培养基:葡萄糖80g/L,蛋白胨15g/L(含氮量12%),KH2PO4 5g/L,KCl 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.18g/L,烟酸4mg/L,
盐酸硫胺素20μg/L,盐酸吡哆醇100μg/L, 生物素10μg/L,核黄素50μg/L,pH5.0。
将质粒pBHR68用BamHI和EcoRI酶切处理后,将获得的5.2kb的
片段插入到质粒 pPIC9K(购于Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的识别位点间,获得质粒pPICHB。这个 质粒以电转化的方法转入到光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019中获得 重组菌(含有pPICHB的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019)进行发 酵实验。
分别取斜面培养的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019和重组菌 分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、200rpm下培养12小时后,以 10%(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,温度30℃,通气量2L/min, 搅拌转速700rpm,用5mol/L KOH控制pH为5.0。当残糖降至4%时,按一定速率流加 400g/L的葡萄糖液进行流加培养,发酵时间48小时。
取2mL发酵液在8000g离心5分钟后,上清用乳酸脱氢酶法测定丙酮酸含量 (Lamperecht W,Heinz F.In:Methods of enzymatic analysis,ed.Bergmeyer,H.U.VCH, Weinheim,1984,6:pp570-577)。细胞用去离子水洗两次后
真空冰干。结果表明重组菌 的丙酮酸产量为68g/L,比光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019的52 g/L提高了约31%。糖酵解产生丙酮酸的途径是消耗NAD的,丙酮酸在细胞内被代谢掉 则是合成NAD的过程。因此细胞内大量积累丙酮酸需要一个高氧化力的环境。phbCAB基 因的引入,能够为细胞提供氧化力,从而提高了丙酮酸的产量。
实施例3、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响麦角固醇产量
菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338(中国科学院微生物所 菌种中心保藏号)
斜面,种子培养基以及发酵培养基为:葡萄糖40g/L,蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L, 琼脂20g/L(斜面用),pH 5.5。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338 和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、200rpm下培养12 小时后,以10%(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,温度30℃,通气 量2L/min,溶氧自动控制在15%,控制pH为5.5。发酵10小时后每隔6小时补料一次, 加入40g葡萄糖,重组菌培养基中加入遗传霉素0.2g/L。发酵30小时后,终止发酵。 麦角固醇含量的测定参照文献(许旭萍,李惠珍,佘晨兴,谢华玲,林志军。麦角固醇 产生菌Torullopsis famata优化发酵条件的研究。生物学杂志,2002,19:15-17)。
测定结果表明重组菌的麦角固醇含量为1.2%,比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IFFI 01338的0.9%提高了33%。有研究表明,麦角固醇的合成具有氧 代谢的特征,有氧条件有利于其合成。因此,phbCAB基因的引入,为细胞提供了更多的 氧化力,从而促进了细胞内麦角固醇的合成。
实施例4、在酿酒酵母中表达phbCAB基因提高酵母菌的抗逆能力
菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063和 重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、200rpm下培养12小时 后,以10%(v/v)接种量接入新培养基。培养基成分为:葡萄糖40g/L,蛋白胨20g/L,酵 母粉10g/L,琼脂20g/L(斜面用),pH5.5。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063和重组菌的种子在接入新培养基之前,各分为三组,一组在48℃放置1小时,一组 在-80℃放置48小时,另一组不做处理。然后将种子分别接入新培养基后,测定其生长 曲线。计算未经处理的种子与经过处理的种子延滞期时间之差。结果表明重组菌的种子 经
过冷或
热处理后,其活性并未受到大幅降低,即延滞期时间与未经处理的种子相差不 大。而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063的种子活性经过冷或热处理 后受到较大的影响。经
过热处理后,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063 的时间差为7小时,重组菌时间差为1小时,两个相差6小时。即是说积累PHA的细胞 具有更好的恶劣环境耐受性,具有更强的生命力。这对于酿酒工业有重要的意义,由于 发酵过程中酵母死亡会影响发酵,同时带来不适的口味,因此强壮的菌株有着更好的应 用前景。
实施例5、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB影响肌苷的生物合成
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。
种子培养基成分为葡萄糖20g/L,酵母粉15g/L,蛋白胨10g/L,玉米液7g/L,
氯化钠2.5g/L,尿素2g/L,pH值7.0。发酵培养基成分为葡萄糖140g/L,玉米液16 g/L,酵母粉16g/L,尿素9g/L,硫酸铵16g/L,七水
硫酸镁4g/L,
磷酸氢二
钾5g/L, 碳酸
钙20g/L。
按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 19162)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重 组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在32℃、200rpm下培养12小时后, 以5%(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,自动控制温度35℃,pH6.5, 搅拌速度600rpm,通气量1L/min,到肌苷产量不再增加停止发酵,发酵时间68小时。 肌苷含量用HPLC测定,流动相为0.5%
磷酸氢二钾,流速1.2mL/min,色谱柱为Hypersil ODS C18反相柱,检测
波长为254nm。HPLC测定结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162的苷产量为19g/L,重组菌的产量为24g/L,提高了26%。在 细胞内代谢途径中,为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP,同时从 6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制,因 此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说,肌苷合成是一个需要 大量氧化力的生化代谢过程,高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。phbCAB 基因的引入,正能实现这一要求,因此能够显著的提高肌苷的产量。
实施例6、在嗜碱芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响弹性蛋白酶产量
菌种:嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B(Takagi H,Tsai YC,Nakamori S,Yamasaki M.Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase from Alkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition.Biosci Biotech Biochem,1995,59:1591-1592)
种子培养基成分为葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉5g/L,磷酸氢二钾1g/L, 七水硫酸镁0.2g/L,氯化钠5g/L,碳酸钠10g/L。发酵培养基成分为葡萄糖20g/L, 豆饼粉5g/L,酵母粉2.5g/L,磷酸氢二钾0.75g/L,七水硫酸镁0.2g/L,氯化钠 20g/L,碳酸钠10g/L。
将实施例1中获得的pEUHB以电转化的方法转入到嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)Ya-B中获得重组菌(含有pEUHB的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus) Ya-B)进行发酵实验。获得重组菌进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus) Ya-B和重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在37℃、250rpm下培养 12小时后,以1%(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶),37℃,250rpm 培养48小时,停止发酵。将发酵液8000g离心十分钟,收集上清,用硫酸铵分级盐析 (30%-65%
饱和度),沉淀溶于0.05mol/l pH9.0
硼酸缓冲液中,得到粗酶液。1mL 粗酶液中与20mg地衣红-弹性蛋白中分别加入1mL 0.05mol/L pH9.0硼酸缓冲液于 55℃水浴保温一小时,不时振荡。分别以2mL 0.7mol/L pH6.0磷酸缓冲液终止反应, 8000g离心10分钟,上清于590nm测吸光度值。20mg地衣红-弹性蛋白完全
水解后, 590nm处光吸收值的一半为10个酶活力单位。
经过48小时发酵培养后,重组菌的酶活198U/mL比嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)176U/mLYa-B高12.5%,重组菌具有更高的弹性蛋白酶产量。研究表明, 高溶氧有利于弹性蛋白酶的合成,其合成是一个需要氧化力的过程。phbCAB基因的引入, 正好能够为细胞提供更多的氧化力,这是有利于弹性蛋白酶的合成的。
实施例7、在红酵母中表达phbCAB基因影响类胡萝卜素产量
菌种:红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353(印度国家工业微生物菌种保 存中心)
斜面培养基成分为:葡萄糖35g/L,麦芽提取物3g/L,酵母粉2g/L,KH2PO4 3g/L, K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,琼脂20g/L,pH6.0。
液体培养基为:葡萄糖25g/L,酵母粉10g/L,KH2PO4 2g/L,K2HPO4 2g/L,pH6.0。
将实施例2中获得的pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353中获得重组菌(含有pPICHB的红酵母(Rhodotorula glutinis) NCIM 3353)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353和重组菌 分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在28℃、240rpm下培养18小时后,以5 %(v/v)接种量接入新鲜液体培养基(100mL/500mL锥形瓶),28℃,240rpm培养72小 时。发酵液3000rpm离心十分钟收集菌体,用去离子水洗两次后冰干称重。每克菌体加 5mL 3mol/L HCl,室温下浸泡1小时,在沸水浴中煮4分钟,迅速冷却,3000g离心 十五分钟,弃去上清,沉淀用去离子水洗两次后加3mL丙酮,室温下振荡三十分钟,再 3000g离心二十分钟,上清即为类胡萝卜素提取液,将提取液稀释后,测475nm处吸光 度值,按下式计算胡萝卜素含量:胡萝卜素含量(μg/g菌体)=A475×V×D/0.16w。A475 为胡萝卜素吸光度值,V为提取所用
溶剂量(mL),D为样品稀释倍数,w为菌体量(g),0.16 为胡萝卜素的摩尔
消光系数。
结果表明红酵母(Rhodotorula glutinis)NCIM 3353的类胡萝卜素含量为76μg/g, 而重组菌的含量为92μg/g,提高了21%。高氧化力环境有利于类胡萝卜素的合成。phbCAB 基因的导入,能够为细胞提供氧化力,从而促进类胡萝卜素的合成。
实施例8、在谷氨酸棒杆菌种表达phbCAB影响谷氨酰胺合成
菌种:谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032。
种子培养基及发酵成分为:一水葡萄糖50g/L,(NH4)2SO4 7.5g/L,NaCl 2 g/L,CH3COONa·2H2O 3g/L,CaCl2·2H2O 0.1g/L,K2HPO4·3H2O 8g/L,KH2PO4 2g/L,尿素5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,盐溶液10mL/l,生物素6μg/L,维生素B1 1mg/L,卡那霉素 20mg/L。其中盐溶液为:MnSO4·7H2O 20mg,Na2B4O7·10H2O 2mg,(NH4)5MO7O24·4H2O 1 mg,FeCl2·6H2O 20mg,ZnSO4·7H2O 5mg,CuSO4·5H2O 2mg,FeSO4·7H2O 250mg,溶于50 mL 1mol/L HCl中。
将实施例1中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中获得重组菌(含有pEUHB的谷氨酸棒杆 菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032和重组菌,分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、200rpm下培 养12小时后,以5%(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,自动控制温度 30℃,pH 6.5,搅拌速度600rpm,通气量1L/min,发酵48小时,停止发酵,测定发酵液 中谷氨酰胺含量。谷氨酰胺的测定用新华3号
滤纸在室温下用不饱和法展开,展开剂用体 积比为5∶2的正丙醇和浓
氨水的
混合液,上行法展开。称取谷氨酰胺标准品,配成1%, 1.5%,2%,2.5%,3%等不同质量浓度的溶液,每种溶液点样1μL,发酵液离心取上清点 样1μL。展析完成后
风干滤纸,用0.5g/L茚三酮丙酮溶液显色,105℃烘干5分钟,滤纸 上出现紫红色氨基酸斑点,剪下氨基酸斑点,用洗脱液(体积比为2∶38的0.1g/L CuSO4·5H2O和75%乙醇的混合液)洗脱30分钟,然后在520nm处测光吸收,从标准曲线上求得发酵液 中谷氨酰胺含量。结果表明谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 的谷氨酰胺产量为11g/L,重组菌产量为14g/L,提高约27%。phbCAB基因的引入,能 够减少丙酮酸向乳酸的代谢,促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A,而谷氨酰胺的前体正是三羧 酸循环的中间产物,这样能够为谷氨酰胺的合成提供更多的前体,因此产量得到提高。
实施例9、在乳酸发酵短杆菌中表达phbCAB影响赖氨酸产量
菌种:乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269。
斜面培养基成分为:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,琼脂2%,pH7.2-7.4。
种子培养基成分为:葡萄糖2%,KH2PO4 0.1%,(NH4)2SO4 1%,MgSO4·7H2O 0.04 %,FeSO4·7H2O 1mg/L,MnSO4·H2O 0.8mg/L,生物素5μg/L,VB1 20mg/L,豆饼 水解液5%,pH 7.0。
发酵培养基成分为:葡萄糖14%,KH2PO4 0.1%,(NH4)2SO4 4%,MgSO4·7H2O 0.04 %,FeSO4·7H2O 1mg/L,MnSO4·H2O 0.8mg/L,生物素5μg/L,维生素B1 20mg/L, 豆饼水解液5%,碳酸钙2%,pH 7.0。
将实施例1中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到乳酸发酵短杆菌 (Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269中获得重组菌(含有pEUHB的乳酸发酵 短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 31269和重组菌,接种于一级种子培养基中,500mL摇瓶装液量30mL,于摇床上30 ℃,110rpm,培养12小时。接种2mL一级种子于30mL二级种子培养基中,于摇床上30 ℃,110rpm,培养10-12小时。然后取1mL二级种子接种于发酵培养基,500mL摇瓶装 液量20mL,30℃,110rpm,培养72小时。赖氨酸含量用茚三酮比色法测量:发酵液经 3500g离心15分钟,取上清0.1mL稀释到100mL,取1mL稀释液加入到4mL茚三酮
试剂(取 水合茚三酮1.0g,加入乙二醇甲醚75mL,另取1.34g CuCl2·2H2O加入pH1.3
柠檬酸缓 冲液25mL中,混合两种溶液后,再加蒸馏水100mL,得到茚三酮溶液)中,沸水浴加热 20分钟,快速冷却后测定478nm处吸光度值。根据标准曲线测定赖氨酸含量。
结果表明乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 31269赖氨酸 产量为53g/L,而重组菌的产量为58g/L,约有10%的提高。在合成代谢中,赖氨酸的 前体物质草酰乙酸有三条途径合成,但都与丙酮酸和NADP/NADPH的代谢有关,因此phbCAB 基因的导入能对赖氨酸的产量产生影响。
实施例10、在大肠杆菌中表达phbCAB基因影响苯丙氨酸产量
菌种:大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882。
种子培养基成分为:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,葡萄糖2%,pH7.5。
发酵培养基成分为:Na2HPO4·12H2O:20g/L,柠檬酸钠6g/L,谷氨酸钠0.4g/L, 酪氨酸0.6g/L,葡萄糖20g/L。
补料培养基:CaCl2·2H2O 0.6g/L,酪氨酸500mg/L,葡萄糖500g/L,MgSO4·7H2O1g/L,维生素B1 500mg/L,氨水28%。
将pBHR68质粒以电转化的方法转入到大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882中 获得重组菌(含有pBHR68的大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882和重组菌, 分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在37℃、200rpm下培养12小时后,以5 %(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,自动控制温度38.5℃,pH 7.0, 溶氧20%,通过补料控制葡萄糖浓度在1.5%,发酵时间48小时。苯丙氨酸含量测定方 法如下:取2μL发酵液上清点样于滤纸上,置于层析液中单向上行展析16小时,烘干后 以茚三酮
喷涂显色,以标准氨基酸为对照,剪下层析后的着色斑点,置于65%的乙醇溶 液中脱色2小时,测定520nm下光吸收,氨基酸量=标准氨基
酸溶液浓度×被测发酵液光
密度/标准氨基酸溶液光密度。
结果表明大肠杆菌(Escherichia.coli)ATCC 31882发酵得到苯丙氨酸浓度为8.2 g/L,而重组菌产物浓度为10.6g/L,提高了29%。对于大肠杆菌的氨基酸合成,如果 用全局的代谢调控能够取得较好的效果。而phbCAB基因的引入,一个有效的调控是能增 强磷酸戊糖途径,有利于氨基酸的合成。
实施例11、在荧光假单胞菌中表达phbCAB基因影响葡萄糖酸产量
菌种:荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55
斜面培养基成分为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,琼脂2%,pH7.0。
种子培养基成分为:葡萄糖2%,玉米浆1%,尿素0.2%,KH2PO4 0.2%, MgSO4·7H2O 0.05%,pH7.0。
发酵培养基成分为:淀粉水解糖14%,玉米浆1.5%,轻质碳酸钙4%,pH 6.7。
将质粒pBHR68经过HindIII和BamHI酶切处理后,插入到质粒pBBR1MCS2(Kovach ME,Elzer PH,Hill DS,Robertson GT,Farris MA,Roop RM,Peterson KM.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene.1995,166:175-176)的HindIII和BamHI的识 别位点间,获得质粒pBBRHB。这个质粒以电转化的方法转入到荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55中获得重组菌(含有pBBRHB的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和 重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、230rpm下培养16小时 后,以10%(v/v)接种量接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL,在30℃、230rpm下 培养72小时。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法测定:发酵液中酮基葡萄糖酸含量= 25℃下发酵液旋光度绝对值/0.88。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1005的发酵液中酮基葡萄糖酸含量为 13.4g/L,重组菌的产量为16g/L,提高了大约19%,phbCAB基因的导入,有利于提高 菌的的耐受力,生长得更好,从而得到更高的转化率。
实施例12、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响α-淀粉酶合成
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556。
种子培养基成分为(300mL):葡萄糖1g,牛肉膏1g,蛋白胨1g,NaCl 1g, KH2PO4 1g,淀粉1g,pH 7.0。
发酵培养基成分为(200mL):牛肉膏1g,蛋白胨1g,NaCl 1g,KH2PO4 1g,NaH2PO4 1g,淀粉3g。
将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)ATCC 21556中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556和重 组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在32℃、200rpm下培养12小时后, 以10%(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶),32℃,200rpm培养72小时, 测定α-淀粉酶酶活力。酶活力测定:取5mL发酵液,4000g离心15分钟,取上清与5-乙 缩
醛-麦芽庚糖-对-硝基苯反应,酶活力单位定义为:37℃,1分钟分解1μmol淀粉为葡 萄糖即为1个酶活单位。
结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 21556的发酵液中酶活为67U/L, 而重组菌酶活为76U/L。重组菌的发酵液中有更高的淀粉酶活力,这可能是因为phbCAB 基因导致细胞内的代谢途径发生变化,使其倾向于有利于细胞生长的方向,提高了细胞 利用淀粉作为碳源的能力,即是增加了细胞的淀粉酶产率。
实施例13、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响酒精产量
菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063)进行发酵实验。
固体培养基配制:量取5Bx
麦汁200mL放入500mL烧杯中,在
沸腾状态下加入4g琼 脂,不断搅拌直至完全融化,分装于试管中高压灭菌,然后放斜面;液体培养基配制: 量取5Bx麦汁110mL装入250mL三角瓶中,调pH4.8-5.0,然后高压灭菌;发酵培养基配 制:称淀粉300g倒入1200mL 40℃温水中,搅拌均匀,加入0.2%
氯化钙,调节pH6.0-6.2, 称取
液化酶1g,于90℃-93℃温度下液化30分钟,直至加入碘液不变色,液化结束后将 其迅速冷却到58℃-60℃,并调pH值为4.4-4.6,加入1mL
糖化酶(十万单位)进行糖化, 在淀粉水解液的糖度在23Bx时停止,加入2%的玉米浆,并煮沸1小时,冷却过滤,然后 调pH到4.8-5.0,灭菌待用。发酵时按10%(v/v)的接种量接入到发酵培养基中,30℃保 温发酵72小时。乙醇浓度用高效液相色谱测量:发酵液8000g离心十分钟,取上清过滤 后作为样品;色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱,流动相为98%的浓硫 酸∶H2O(体积比为0.5∶1000),流速1mL/min。
结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 2063发酵液乙醇浓度为15%, 而重组酵母的乙醇浓度为20%,提高了33%,phbCAB基因的引入,不仅可以改变细胞内 的代谢流,而且PHA的合成能够提高重组酵母对高乙醇环境的耐受性,从而提高了乙醇的 产量。
实施例14、在克鲁斯假丝酵母中表达phbCAB基因影响甘油产量
菌种:克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196。
斜面培养基成分为:葡萄糖50g/L,酵母膏20g/L,碳酸钙5g/L,琼脂20g/L。
种子培养基成分为:葡萄糖200g/L,尿素2g/L,玉米浆7g/L。
发酵培养基成分为:葡萄糖200g/L,尿素2g/L,玉米浆6g/L。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到克鲁斯假丝酵母 (Candida krusei)ACCC 2196中获得重组菌(含有pPICHB的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196和重组 菌分别接种到种子培养基(40mL/500mL锥形瓶),在30℃、230rpm下培养12小时后,以 10%(v/v)接种量接入发酵培养基,7.5L发酵罐装液量3L,自动控制pH5.5,温度30℃, 通气量0.5L/min,搅拌转速450rpm,残糖接近0时停止发酵,测定发酵液中甘油含量。 发酵液中甘油含量用高效液相色谱检测:发酵液8000g离心十分钟,取上清过滤后作为 样品;色谱柱为Beckman公司L2 Spherogel配合基交换柱,流动相为98%的浓硫酸∶H2O(体 积比为0.5∶1000),流速1mL/min。
结果表明克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)ACCC 2196最终甘油浓度为62g/L, 而重组菌为75g/L,提高了21%。在发酵过程中,有相当部分的碳源会流向乙醇合成, 这降低了甘油的得率。乙醇途径是为细胞提供氧化力的一条途径,phbCAB基因得引入, 能够降低乙醇途径的压力,促进糖酵解,使更多的碳源流向甘油合成,增加了甘油的得 率。
实施例15、在热带假丝酵母中表达phbCAB基因影响十二碳二元酸的合成
菌种:热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248(任刚,陈远童,十二碳二 元酸的发酵研究,生物工程学报,2000,16:198-202)。
斜面培养基成分为:10Bx的
麦芽汁,1.5%琼脂粉。
种子培养基成分为:酵母膏5g,玉米浆3g,蔗糖5g,KH2PO4 8g,加水定容至1L 灭菌,接种时再加入尿素0.3%,重腊5%。
发酵培养基为:酵母膏2g,玉米浆1g,蔗糖2g,KH2PO4 8g,NaCl 1g,加水 定容至100mL灭菌,接种时再加正十二烷20%,尿素0.12%,重腊3.3%,pH 7.3。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母 (Candida tropicalis)UH22248中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248)进行发酵实验。
将斜面培养48小时的热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248和重组菌分别 接种到种子培养基中(100mL/500mL摇瓶),在30℃、180rpm下培养48小时后,接种3mL 到100mL发酵培养基中,30℃、180rpm培养4天,发酵结束。取15ml发酵液,用6mol/L HCl调pH值到3.0,加入120mL乙醚,摇动100次,放置30分钟,然后倒出40mL乙醚提取 液,
通风橱中风干得到白色固体,然后将其用95%的中性热乙醇溶解,加入一滴酚酞, 用标准NaOH溶液滴定,记录所用的NaOH,计算十二碳二元酸产量。
结果表明重组菌(十二碳二元酸产量为92g/L)显示出了
比热带假丝酵母(Candida tropicalis)UH22248(十二碳二元酸产量为78g/L)更高的十二碳二元酸产量,发酵液 比较粘稠,细胞处于一种低溶氧水平的环境,phbCAB基因的引入能够在这种条件下为细 胞提供氧化力,同时其可能也对脂肪酸氧化途径有抑制作用,从而增加了发酵液中的二 元酸产量。
实施例16、在热带假丝酵母中表达phbCAB基因影响十五碳二元酸的合成
菌种:热带假丝酵母(Candida tropicalis)T25-14(陈远童,郝秀珍,庞月川,十 五碳二元酸的发酵研究,微生物学报,1995,35:433-437)。
斜面培养基成分为:10Bx的麦芽汁,1.5%琼脂粉。
种子培养基成分为:酵母膏5g/L,玉米浆3g/L,蔗糖5g/L,KH2PO4 8g/L配好 灭菌,接种时再加入尿素0.3%,重腊5%。
发酵培养基为:酵母膏2g/L,玉米浆1g/L,蔗糖1g/L,KH2PO4 8g/L,NaCl 1g/L 加水定容至100mL灭菌,接种时再加正十五烷20%,尿素0.12%,pH 7.5。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母 (Candida tropicalis)T25-14中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(Candida tropicalis)T25-14)进行发酵实验。
将斜面培养48小时的热带假丝酵母(Candida tropicalis)T25-14和重组菌的种子分 别接种到种子培养基中(50mL/500mL摇瓶),在30℃、220rpm下培养48小时后,5%(v/v) 接种量接种到发酵培养基中(50mL/500mL摇瓶),30℃、220rpm培养72小时。取15ml发酵 液,用6mol/l HCl调pH值到3.0,加入120ml乙醚混匀,放置直到分层,除去水层,放出 乙醚提取液,通风橱中风干得到白色固体,然后将其用95%的中性热乙醇溶解,加入一 滴酚酞,用标准NaOH溶液滴定,记录所用的NaOH,计算二元酸产量。
结果表明热带假丝酵母(Candida tropicalis)T25-14的二元酸产量为36g/L,重组 菌为43g/L,提高了19%。重组菌发酵液比较粘稠,细胞处于一种低溶氧水平的环境, phbCAB基因的引入能够在这种条件下为细胞提供氧化力,同时其可能也对脂肪酸氧化途 径有抑制作用,从而增加了发酵液中的二元酸产量。
实施例17、在苏云金芽孢杆菌中表达phbCAB基因对芽孢形成的影响
菌种:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068。
将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)ACCC 10068中获得重组菌(含有pEUHB的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)ACCC 10068)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068 和重组菌,分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在25℃、220rpm下培养12 小时后,以1%(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶),25℃,220rpm发酵 36小时。培养基成分均为:牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,pH7.2。发酵后用血球计 数板计量孢子含量。
通过
显微镜观测可以看到,重组菌的菌体量(10.2*109个/ml)以及孢子数(1.5*109 个/ml)都高于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)ACCC 10068(菌体量9.1*109 个/ml,孢子数1.1*109个/ml)。发酵实验表明高溶氧是有利于孢子形成的。phbCAB基因 的引入,能够促进孢子形成。
实施例18、在枯草芽孢杆菌中表达phbCAB影响鸟苷合成
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220。
种子培养基成分为葡萄糖20g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨10g/L,玉米液10g/L, 氯化钠5g/L,尿素2g/L,
味精5g/L,pH 7.0-7.2。
发酵培养基成分为葡萄糖120g/L,豆饼水解液50g/L,酵母粉16g/L,硫酸铵15 g/L,七水硫酸镁4g/L,磷酸氢二钾2g/L,味精10g/L,碳酸钙2g/L,pH 7.0-7.2。
将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB通过乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)ATCC 19220中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220和重 组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在36℃、140rpm下培养10小时后, 以10%(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶),36℃、220rpm下培养60小 时,测定鸟苷含量。鸟苷含量用HPLC测定,流动相为0.5%磷酸氢二钾,流速1.2mL/min, 色谱柱为Hypersil ODS C18反相柱,检测波长为254nm。
结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19220鸟苷产量为16g/L,重 组菌的产量为20g/L,提高了25%。在细胞内代谢途径中,为鸟苷合成提供前体的单磷 酸己糖途径会消耗大量的NADP,高的NADP/NADPH水平能够有效的促进鸟苷的合成。phbCAB 基因的引入,正能实现这一要求,因此能够显著的提高鸟苷的产量。
实施例19、在酿酒酵母中表达phbCAB基因影响谷胱甘肽产量
菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186(Sakato K,Tanaka H.Advanced control of glutathione fermentation process.Biotechnol Bioeng,1992,40:904- 912)。
斜面培养基成分为:麦芽汁10g/L,酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,葡萄糖10g/L, 琼脂20g/L,pH 7.0-7.2。
种子培养基成分为:葡萄糖30g/L,酵母粉6g/L,磷酸氢二铵3g/L,硫酸镁0.8 g/L,磷酸氢二钾1g/L,磷酸二氢钾1g/L,pH 7.0-7.2。
发酵培养基为:葡萄糖70g/L,酵母粉15g/L,麦汁60g/L,磷酸氢二铵10g/L, 硫酸镁5g/L,蜜糖28g/L,玉米浆16g/L,磷酸氢二钾1g/L,磷酸二氢钾1g/L, ZnCl2 10mg/L,FeCl2 6mg/L,CuCl2 6mg/L,MnCl2 6mg/L,pH 7.0-7.2。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化转入到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)KY6186中获得重组菌(含有的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186和重组 菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、180rpm下培养24小时后,以 10%(v/v)接种量接入发酵培养基,7.5L发酵罐中装液量3L发酵,自动控制温度30℃, pH5.4,通气量2L/min,前两小时转速200rpm,之后每小时升高100rpm,直到600rpm, 维持到发酵结束,36小时停止发酵。取发酵得到的新鲜酵母用蒸馏水洗三次后,在40% 的乙醇中,30℃萃取2小时,3000g离心,取上清用ALLOXAN法(上海市医药化验所临床 生化检验(上册),上海,上海科学与技术出版社,1979)测定谷胱甘肽含量。
结果表明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)KY6186发酵液谷胱甘肽浓度为1.3 g/L,而重组菌的谷胱甘肽浓度为1.6g/L,提高了23%。研究表明乙醇合成的降低有利 于谷胱甘肽的合成,而乙醇合成是一个消耗还原力,获得氧化力的过程,phbCAB基因的 引入可以抑制乙醇的合成,提高谷胱甘肽产量。
实施例20、在球拟酵母中表达phbCAB基因对赤藓糖醇产量的影响
菌种:球拟酵母(ToruLopsis sp)B845(吴燕,杨晓伟,陆茂林,赤藓糖醇产生 菌B845的形态,生理特征,生物技术,2002,12:20-21)。
斜面培养基成分为:葡萄糖10%,酵母膏1%,脲0.1%,琼脂2%,pH 7.0-7.2。
种子和发酵培养基为:葡萄糖20%,酵母膏0.5%,脲0.1%,pH 7.0-7.2。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以电转化的方法转入到球拟酵母 (ToruLopsis sp)B845中获得重组菌(含有pPICHB的球拟酵母(ToruLopsis sp)B845) 进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的球拟酵母(ToruLopsis sp)B845和重组菌分别接种到 种子培养基(40mL/500mL锥形瓶),在30℃、180rpm下培养3天后,以5%(v/v)接种量 接入发酵培养基中(50mL/500mL锥形瓶),30℃、180rpm下培养3天,测定赤藓醇的产 量。赤藓糖醇产量用高碘酸氧化法测量(原野,应向贤,范光先,诸葛健,高碘酸氧化 法直接测定发酵液中赤藓糖醇,无
锡轻工大学学报,2000,19:72-75)。结果表明球拟 酵母(ToruLopsis sp)B845的赤藓糖醇产量为50g/L,重组菌为55g/L,提高在10% 左右,作为赤藓糖醇生产菌,需要有良好的耐高渗能力和代谢碳源能力,而phbCAB基因 的引入,导致胞内PHA的合成,是有利于提高上述能力的,因此对赤藓糖醇的合成也有一 定的促进作用。
实施例21、在短小芽孢杆菌中表达phbCAB基因影响D-核糖产量
菌种:短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095。
种子培养基成分为:葡萄糖20g/L,玉米浆26g/L,磷酸氢二钾0.03g/L,磷酸 二氢钾0.01g/L,pH 6.7。
发酵培养基成分为:葡萄糖180g/L,玉米浆28g/L,硫酸铵13g/L,硫酸锰0.05 g/L,pH 7.0。
将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)ATCC 31095中获得重组菌(含有pEUHB的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095和重组 菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在37℃、180rpm下培养18-20小时, 以10%(v/v)的接种量接入到发酵培养基中。7.5L发酵罐装液量3L,控制温度37℃, 通气量3L/min,搅拌速度650rpm,发酵72小时,测定发酵液中的D-核糖含量。D-核糖 用地衣酚法测量:发酵液5000g离心10分钟,上清用蒸馏水稀释,使核糖量控制在10-90 g/3mL范围内;取3mL稀释液,依次加入0.1%氯化
铁浓盐酸溶液3mL,0.1%地衣酚乙 醇溶液0.3mL,摇匀,沸水浴40分钟,
自来水冷却后在60分钟内测量670nm吸光度值, 通过标准曲线计算核糖浓度。结果表明短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)ATCC 31095 的核糖浓度为55g/L,而重组菌可以达到72g/L,上升了31%。细胞
内核糖的合成是通 过磷酸戊糖途径,这个途径消耗大量的细胞内氧化力,而通过增加溶氧满足细胞的代谢 需求会促进孢子的形成,这不利于通过细胞营养生长生产核糖,因此phbCAB基因的引入, 能从内源的途径为细胞提供一定的氧化力NADPH,从而有利于核糖的合成。
实施例22、在大肠杆菌中表达phbCAB提高细菌对重金属离子Hg2+的耐受性
菌种:大肠杆菌(Escherichia coli)JM109。
大肠杆菌(Escherichia coli)JM109的基本培养基为LB培养基(g/100mL):蛋 白胨1.0;酵母提取物0.5;NaCl 1.0,pH 7.0。
重组菌的基本培养基为:LB培养基中加入氨苄青霉素至终浓度60μg/mL。
将质粒pBHR68用电转化的方法转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109获得重组 菌(含有pBHR68的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109)。野生型E.coli JM109作 为对照。
将大肠杆菌(Escherichia coli)JM109和重组菌分别接入加入了1mg/L、2mg/L、 3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、8mg/L或10mg/L HgCl2的各自的基本培养基中,培 养条件为500mL三角瓶装液量100mL,37℃,200rpm,培养24小时,测定发酵液的 OD600。结果表明当Hg2+浓度为4mg/L时,重组菌的生长受到一定抑制,最大OD600从2.7降 到了1.9;当Hg2+浓度上升到10mg/L时,菌体生长几乎完全停止。实验还表明对于未经 外源基因转化的原始宿主菌E.coli JM109,在Hg2+浓度为2mg/L时就完全不能生长。PHB 基因的转入使细菌对汞的耐受力得到了增强。
在相同操作条件下两种菌体从2.5mg/L Hg2+浓度的模拟
废水中富集汞离子,重组菌 的最终富集量为5.1mg/g细胞干重,而原始E.coli JM109则仅为1.7mg/g细胞干重。 其中,细胞干重用冰干法测量。
实验表明加入PHB合成基因的重组菌与大肠杆菌(Escherichia coli)JM109相比对 于Hg2+的耐受程度有了较大的提高,在相同的条件下能够更好的在含有重金属离子的培养 基中生长。
实施例23、移动单胞菌中表达phbCAB提高细菌的对高酒精环境耐受性
菌种:移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。
种子培养基组分(g/L):葡萄糖100,蛋白胨10,酵母膏15,pH 6.0。
发酵培养基组分(g/L):葡萄糖150,蛋白胨25,酵母膏25,pH4.5或pH6.0。
发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram LO,Gomez PF,Lai X,Moniruzzaman M,Wood BE,Yomano LP and York SW.Metabolic engineering of bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998,58:204-214)
培养条件:
冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中,培养12小时后,以10%(v/v)的接种量分 别接入发酵培养基中,进行静止厌氧乙醇发酵。
发酵三角瓶250mL,装液量为100mL,发酵pH4.5(重组菌),温度35℃,发酵 时间48小时。移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286的发酵pH 4.5和6.0 作为对照。
实验表明,移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 4.5和6.0的乙 醇产量分别为21.1g/L和62.5g/L,重组菌在pH4.5的乙醇产量为59.2g/L,接近移动 假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在pH 6.0时的水平,表明phbCAB基因的转 入有效的提高了细菌的耐酸性,进一步优化发酵条件可以在较低的pH下实现乙醇的高效 生产。
实施例24、在移动假单胞菌中表达phbCAB提高细菌对葡萄糖的利用能力
菌种:移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。
种子培养基组分(g/L):蛋白胨10,酵母膏15,pH 6.0。
发酵培养基组分(g/L):蛋白胨25,酵母膏25,pH 6.0,葡萄糖。其中,葡萄糖 的浓度分别为120,150,160,180,210g/L梯度。
发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram LO,Gomez PF,Lai X,Moniruzzaman M,Wood BE,Yomano LP and York SW.Metabolic engineering of bacteria for ethanol production.Biotechnol.Bioeng.1998,58:204-214)
培养条件:
冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中,培养12小时后,以体积分数10%的接种量 分别接入发酵培养基中,进行静止厌氧乙醇发酵。
发酵三角瓶500mL,装液量为100mL,发酵pH 6.0,温度35℃,发酵时间48h。 分别在不同浓度的葡萄糖条件下培养移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286 和重组菌。
实验结果表明,移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286在葡萄糖浓度150 g/L时,乙醇的产量达到最大,为65g/L,而重组菌在葡萄糖浓度增加到210g/L时乙醇 的产量一直是上升趋势,最大为95g/L。PHB合成途径的导入使得细菌对于渗透压的抗 性增强,初糖浓度很高时依然保持良好的生长。移动假单胞菌(Zymomonas mobilis) NRRL B-4286的乙醇发酵过程有着比酵母更高的葡萄糖的利用率,但是当初始的葡萄糖浓 度达到一定程度后,乙醇产量反而下降。当转入PHB的合成基因后,发酵达到乙醇最大产 量的初糖浓度比移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286有了一定的提高。表 明phbCAB的转入有利于提高细菌对渗透压抵抗程度。
实施例25、在丁酸梭芽孢杆菌中表达phbCAB提高从甘油发酵制备1,3-丙二醇 (1,3-PDO)的生产
菌种:丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260。
将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到丁酸梭芽孢杆菌 (Clostridium butyricum)ATCC 8260中获得重组菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢杆菌 (Clostridium butyricum)ATCC 8260)进行发酵实验。
该发酵需厌氧培养,发酵培养基为:甘油6%,葡萄糖1%,玉米浆2%,(NH4)2SO4 0.2%。发酵温度为34℃,初始pH为6.5~7。
培养条件:
间歇发酵分为两步进行,首先将丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260 和重组菌分别接于装液量为100mL的150mL三角瓶中,在厌氧条件下,于36℃,100rpm, 培养15h,然后以10%(v/v)的接种量接入装液量为200mL的250mL三角瓶中,石 蜡液封,于34℃、150rpm、初始pH 6.8进行发酵。定期取样测定甘油残余量和1,3-PDO 的生成量。
发酵液中甘油和1,3-PDO的浓度用气相色谱法检测,色谱柱为大口径毛细管,0.5mm ×20m,柱温170℃、
气化室温度260℃,载气为氮气,流速50mL/min,采用内标 法(内标物质为1,62己二醇)定量。
产物分离:发酵液离心后,上清液用油浴蒸馏得到1,3-PDO产品。
菌体生长的生物量:用比色法检测(OD650nm)。
丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)ATCC 8260的1,3-丙二醇产量为15.7 g/L,而重组菌为20.4g/L。丁酸梭杆菌的生长pH在6~7.5之间,其以甘油为底物的 发酵代谢的副产物主要为丁酸和乙酸,因而在发酵过程中的酸度的上升将会严重影响菌 体生长,同时抑制1,3-PDO生成。由此可见要获得高产的1,3-PDO在发酵过程中须将pH 控制在6.5~7之间。如果将PHB的合成基因导入到细菌中,使得细菌对酸性条件的耐 受性增强,则可以在不用调节pH的条件下获得较高的1,3-PDO产量。
实施例26、芽孢杆菌中表达phbCAB提高细菌厌氧条件下的对原油的分解
菌种:芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23(李清心,康从宝,王浩,张长铠,芽孢杆菌 发酵条件的优化及其在室内条件下提高原油采收率的初步研究,工业微生物,2002,32: 28-31)。
重组菌的获得:将按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到芽 孢杆菌(Bacillus sp)L-23中获得重组菌(含有pEUHB的芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23) 进行发酵实验。
种子培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨2,Na2HPO4 4,KH2PO4 2,MgSO4 0.5,CaCl2 0. 005,pH7.2。
发酵培养基(g/L):葡萄糖30,(NH4)2SO4 15,Na2HPO4 2,KH2PO4 2,MgSO4 0.5, pH 7.2。
将芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23和重组菌菌种分别接入种子培养基中,培养12 小时后,以体积分数10%的接种量分别接入发酵培养基中,发酵三角瓶500mL,装液 量为100mL,温度35℃,发酵时间48小时。
发酵液中菌体浓度测定
取培养液经6000g离心30分钟后,用等量蒸馏水制成菌悬液,然后稀释,用722 型分光光度计于660nm处测定菌悬液的OD值,事先作好标准曲线,求得标准曲线的方 程,然后依此测得发酵液中菌体浓度。
原油降粘实验:将不同浓度的芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23或重组菌的发酵液, 加入到来源不同的原油中,45℃培养24h,用离心机离心脱水后,再用
粘度计测粘度的 变化,求出降粘率。对于来源不同的原油,细菌的降粘效果有所不同,可能是这些原油 的组成成分不同所致。原油中含有丰富的
烃类、胶质、
沥青质类等物质,从而使得原油 具有一定的粘度。细菌在原油中生长时可以利用原油中的成分作为其生长的碳源,因此, 对于其能降低原油粘度的原因分析有以下两种可能:一是通过对原油中烃类及其它物质 的降解使原油的粘度下降;二是微生物利用原油产生了一些代谢产物,这些产物的作用使 原油粘度下降。
通过野生菌(芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23)和转入PHB合成基因的重组菌的比 较可以看出,重组菌对于原油的降粘作用更为明显,以一种原油的结果为例,结果表明 重组菌在原油中的生长情况好于芽孢杆菌(Bacillus sp)L-23,因而对原油的降粘效 果更好。这是由于PHB合成基因的转入使得细菌对渗透压的抗性提高,能在原油中更好 的生长。
表1野生菌和重组菌的降粘效果比较 加入菌液占总体 积的百分比(%) 0 0.5 1 2 5 原油粘度 野生菌降粘率 (%) 210 0 204 2.8 196 6.7 183 12.8 151 28.1
原油粘度 重组菌降粘率 (%) 210 0 202 3.8 190 9.5 171 18.6 133 36.7
实施例27、在嗜酸乳杆菌中表达phbCAB提高细菌在酸性条件下的存活率
菌种:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671。
按照实施例1的方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671中获得重组菌(含有pEUHB的嗜酸乳杆菌 (Lac tobacillus acidophilus)ATCC 53671)进行发酵实验。
实验方法如下:
菌种传代培养基:12.8g
脱脂奶粉溶于100mL蒸馏水中,121℃灭菌15min。
计数培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,酵母膏0.6%,葡萄糖0.5%,琼脂1.8 %,pH6.8,121℃灭菌20min。
豆汁的制备:将大豆室温(20℃左右)浸泡48小时,使大豆充分溶涨,磨浆(水∶ 豆=3∶1),两层纱布过滤除去豆渣即得。115℃灭菌15min。
不同pH值豆汁的制备:以乳酸作为调节剂,将豆汁pH值分别调至4.0、4.5、5.0 或5.5。豆汁的自然pH值为6.5左右,配制是在磁力搅拌器上进行,用pH酸度计监测。
保存实验:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671和重组菌分别 于豆汁培养基(pH6.5)中培养48小时,然后取菌液分别添加至不同pH值(4.0、4.5、 5.0、5.5)的灭菌豆汁中,使活菌数目为1×107-108cfu/ml,置于4℃冰箱中保存10周, 检测活菌数目变化。其中,计数方法:根据样品中含菌量的不同,作10倍系列浓度稀释, 倒平板,37℃恒温培养72小时,计菌落数。存活率的计算:存活率=样品的活菌数目/样 品中起始活菌数目×100%。
结果表明嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 53671在不同的pH值的 豆汁中保存,存活率不同,pH 4.0下存活率最低(2%),pH 5.0最高(11%)。在pH 4.5-pH 5.5中保存,存活率变化不明显都在9%左右。10周保存实验的结果表明,pH 5.5下的存 活率(9%)仅高于pH 4.5(8.2%)下的不足一倍。从活菌数目上看,10周后pH 4.0下 活菌数目仍能维持在1×106cfu/ml以上水平,pH 4.5-5.5都在1×107cfu/ml以上水平。
重组菌的存活率在实验的几个pH(4.0、4.5、5.0、5.5)下变化不明显,都在20% 左右,活菌的数目较野生菌有明显的提高,10周保存实验的活菌数目均在1×107cfu/ml 以上水平。表明PHB的合成提高了细菌在酸性条件下的活菌数目。
重组的嗜酸乳杆菌在较低pH值(4.0、4.5)培养条件下具有较高的存活率和活菌数 目在生产上具有重要的意义:一方面可以提高存活率,使制剂具有较高的活菌数:另一 方面,较低的pH值环境可防止杂菌污染。
实施例28、从脂肪酸β-氧化途径合成PHA的相关基因在荧光假单胞菌中的表达影 响葡萄糖酸产量
菌种:荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55。
斜面培养基成分为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,琼脂2%,pH7.0。
种子培养基成分为:葡萄糖2%,玉米浆1%,尿素0.2%,KH2PO4 0.2%, MgSO4·7H2O 0.05%,pH7.0。
发酵培养基成分为:淀粉水解糖14%,玉米浆1.5%,轻质碳酸钙4%,pH 6.7。
在标准的聚合酶链式反应条件下,以质粒pEE32(Fukui T,Doi Y.Cloning and analysis of the poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)biosynthesis gene of Aeromonas caviae.J.Bacteriol.,1997,179:4821-4830)为模板,用引物 TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG扩增出phaCJ基因, 然后经过KpnI和HindIII酶切处理后,插入到质粒pBBR1MCS2的限制性内切酶KpnI和 HindIII的识别位点间,获得质粒pBBRCJ。pBBRCJ以电转化的方法转入到荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)AS 1.55中获得重组菌(含有pBBRCJ的荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)AS 1.55)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55和 重组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、230rpm下培养16小时 后,以10%(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL,在30℃、230rpm 下培养72小时,测定发酵液中酮基葡萄糖酸含量。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法 测定:发酵液中酮基葡萄糖酸含量=25℃下发酵液旋光度绝对值/0.88。
结果表明荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55的发酵液中酮基葡萄 糖酸含量为13.6g/L,重组菌的产量为15.8g/L,提高了大约16%,phaCJ基因的导入, 能够在细胞内积累PHA,有利于提高菌的的耐受力,生长得更好,从而得到更高的转化率。
实施例29、从脂肪酸从头合成途径合成PHA的相关基因在枯草芽孢杆菌中的表达影 响肌苷的生物合成
菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162。
种子培养基成分为葡萄糖20g/L,酵母粉15g/L,蛋白胨10g/L,玉米液7g/L,氯化 钠2.5g/L,尿素2g/L,pH值7.0。
发酵培养基成分为葡萄糖140g/L,玉米液16g/L,酵母粉16g/L,尿素9g/L,硫酸铵 16g/L,七水硫酸镁4g/L,磷酸氢二钾5g/L,碳酸钙20g/L,pH值7.0。
在标准的聚合酶链式反应条件下,以质粒pQH-CG(邱远征,聚羟基丁酸羟基己酸酯生 物合成途径的基因工程改造,清华大学,2005,博士论文。)为模板,用引物 ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG扩增出phaGC基因,然后经过 BamHI和BglII酶切处理后,插入到质粒pEU308的限制性内切酶BglII和BamHI的识别位点 间,获得质粒pEUGC。pEUGC以乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUGC的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC 19162)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162和重 组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在32℃、200rpm下培养12小时后, 以5%(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,自动控制温度35℃,pH 6.5, 搅拌速度600rpm,通气量1L/min,发酵时间68小时(肌苷产量不再增加),测定发酵液 中肌苷含量。肌苷含量用HPLC测定,流动相为0.5%磷酸氢二钾,流速1.2mL/min,色谱 柱为Hypersil ODS C18反相柱,检测波长为254nm。结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 19162的肌苷产量为19.7g/L,重组菌的产量为24.9g/L,提高了26.4 %。在细胞内代谢途径中,为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP,同 时从6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制, 因此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说,肌苷合成是一个需要 大量氧化力的生化代谢过程,高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。phaG C 基因的引入,能够促进脂肪酸的从头合成途径,提高细胞内的氧化力,因此能够显著的 提高肌苷的产量。
实施例30、在移动假单胞菌中表达phbCAB基因影响乙醇产量
菌种:移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286。
斜面培养基成分为:葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉15g/L,磷酸二氢钾 1g/L,硫酸铵1g/L,七水硫酸镁1g/L,NaCl 1g/L,琼脂15g/L,pH值7.0。
种子培养基成分为:葡萄糖100g/L,酵母粉15g/L,蛋白胨10g/L,pH值7.0。
发酵培养基成分为:葡萄糖200g/L,酵母粉15g/L,蛋白胨10g/L,pH值7.0。
将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌 (Zymomonas mobilis)NRRL B-4286)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)NRRL B-4286和重 组菌分别接种到种子培养基(50mL/500mL锥形瓶),在30℃、200rpm下培养16小时后, 以10%(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL,在30℃、200rpm 下培养72小时,测定发酵液中的乙醇含量。乙醇浓度用高效液相色谱测量:发酵液8000g 离心十分钟,取上清过滤后作为样品;色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱, 流动相为98%的浓硫酸∶H2O(体积比为0.5∶1000),流速1mL/min。
结果表明野生菌的发酵液乙醇浓度为14%,重组菌的乙醇浓度为18%,提高了28 %,phbCAB基因的引入,不仅可以改变细胞内的代谢流,而且PHA的合成能够提高细菌对 高乙醇环境的耐受性,从而提高了乙醇的产量。
序列表
<160>1
<210>1
<211>3884
<212>DNA
<213>Wautersia eutropha
<400>1
ataaagctta aggaggatgg cgaccggcaa aggcgcggca gcttccacgc aggaaggcaa 60
gtcccaacca ttcaaggtca cgccggggcc attcgatcca gccacatggc tggaatggtc 120
ccgccagtgg cagggcactg aaggcaacgg ccacgcggcc gcgtccggca ttccgggcct 180
ggatgcgctg gcaggcgtca agatcgcgcc ggcgcagctg ggtgatatcc agcagcgcta 240
catgaaggac ttctcagcgc tgtggcaggc catggccgag ggcaaggccg aggccaccgg 300
tccgctgcac gaccggcgct tcgccggcga cgcatggcgc accaacctcc catatcgctt 360
cgctgccgcg ttctacctgc tcaatgcgcg cgccttgacc gagctggccg atgccgtcga 420
ggccgatgcc aagacccgcc agcgcatccg cttcgcgatc tcgcaatggg tcgatgcgat 480
gtcgcccgcc aacttccttg ccaccaatcc cgaggcgcag cgcctgctga tcgagtcggg 540
cggcgaatcg ctgcgtgccg gcgtgcgcaa catgatggaa gacctgacac gcggcaagat 600
ctcgcagacc gacgagagcg cgtttgaggt cggccgcaat gtcgcggtga ccgaaggcgc 660
cgtggtcttc gagaacgagt acttccagct gttgcagtac aagccgctga ccgacaaggt 720
gcacgcgcgc ccgctgctga tggtgccgcc gtgcatcaac aagtactaca tcctggacct 780
gcagccggag agctcgctgg tgcgccatgt ggtggagcag ggacatacgg tgtttctggt 840
gtcgtggcgc aatccggacg ccagcatggc cggcagcacc tgggacgact acatcgagca 900
cgcggccatc cgcgccatcg aagtcgcgcg cgacatcagc ggccaggaca agatcaacgt 960
gctcggcttc tgcgtgggcg gcaccattgt ctcgaccgcg ctggcggtgc tggccgcgcg 1020
cggcgagcac ccggccgcca gcgtcacgct gctgaccacg ctgctggact ttgccgacac 1080
gggcatcctc gacgtctttg tcgacgaggg ccatgtgcag ttgcgcgagg ccacgctggg 1140
cggcggcgcc ggcgcgccgt gcgcgctgct gcgcggcctt gagctggcca ataccttctc 1200
gttcttgcgc ccgaacgacc tggtgtggaa ctacgtggtc gacaactacc tgaagggcaa 1260
cacgccggtg ccgttcgacc tgctgttctg gaacggcgac gccaccaacc tgccggggcc 1320
gtggtactgc tggtacctgc gccacaccta cctgcagaac gagctcaagg taccgggcaa 1380
gctgaccgtg tgcggcgtgc cggtggacct ggccagcatc gacgtgccga cctatatcta 1440
cggctcgcgc gaagaccata tcgtgccgtg gaccgcggcc tatgcctcga ccgcgctgct 1500
ggcgaacaag ctgcgcttcg tgctgggtgc gtcgggccat atcgccggtg tgatcaaccc 1560
gccggccaag aacaagcgca gccactggac taacgatgcg ctgccggagt cgccgcagca 1620
atggctggcc ggcgccatcg agcatcacgg cagctggtgg ccggactgga ccgcatggct 1680
ggccgggcag gccggcgcga aacgcgccgc gcccgccaac tatggcaatg cgcgctatcg 1740
cgcaatcgaa cccgcgcctg ggcgatacgt caaagccaag gcatgacgct tgcatgagtg 1800
ccggcgtgcg tcatgcacgg cgccggcagg cctgcaggtt ccctcccgtt tccattgaaa 1860
ggactacaca atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt 1920
tggcggctcg ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc 1980
gctggagcgc gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct 2040
gaccgccggt tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc 2100
gatggtgccg gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct 2160
ggccgccaac gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa 2220
catgagcgcc gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc 2280
caagctggtc gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat 2340
gggcatcacc gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga 2400
gttcgccgtc ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga 2460
agagatcgtc ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga 2520
cgagttcgtg cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga 2580
caaggccggc acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt 2640
ggtggtgatg tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa 2700
gagctatgcc aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc 2760
caagcgcgcc ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa 2820
cgaggccttt gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa 2880
ggtcaatgtg aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg 2940
tatcctggtg acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc 3000
gctgtgcatc ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aaggaagggg 3060
ttttccgggg ccgcgcgcgg ttggcgcgga cccggcgacg ataacgaagc caatcaagga 3120
gtggacatga ctcagcgcat tgcgtatgtg accggcggca tgggtggtat cggaaccgcc 3180
atttgccagc ggctggccaa ggatggcttt cgtgtggtgg ccggttgcgg ccccaactcg 3240
ccgcgccgcg aaaagtggct ggagcagcag aaggccctgg gcttcgattt cattgcctcg 3300
gaaggcaatg tggctgactg ggactcgacc aagaccgcat tcgacaaggt caagtccgag 3360
gtcggcgagg ttgatgtgct gatcaacaac gccggtatca cccgcgacgt ggtgttccgc 3420
aagatgaccc gcgccgactg ggatgcggtg atcgacacca acctgacctc gctgttcaac 3480
gtcaccaagc aggtgatcga cggcatggcc gaccgtggct ggggccgcat cgtcaacatc 3540
tcgtcggtga acgggcagaa gggccagttc ggccagacca actactccac cgccaaggcc 3600
ggcctgcatg gcttcaccat ggcactggcg caggaagtgg cgaccaaggg cgtgaccgtc 3660
aacacggtct ctccgggcta tatcgccacc gacatggtca aggcgatccg ccaggacgtg 3720
ctcgacaaga tcgtcgcgac gatcccggtc aagcgcctgg gcctgccgga agagatcgcc 3780
tcgatctgcg cctggttgtc gtcggaggag tccggtttct cgaccggcgc cgacttctcg 3840
ctcaacggcg gcctgcatat gggctgacct gccggatcga taac 3884