一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法
阅读：194发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种提高胁迫条件下蛋白表达 水 平的方法，具体包括以下步骤：根据 生物 密码子敏感性，将高敏性的密码子替换成低敏性的密码子，使蛋白能在胁迫条件下仍维持高水平表达，并利用该策略将异丁醇生产途径中ilvC和ilvD基因进行了优化，以提高异丁醇的产量。本发明的方法验证了低敏感性密码子优化策略的可行性，为密码子优化提供了新策略，提高了逆境条件下蛋白的持续表达。，下面是一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法专利的具体信息内容。
1.一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、选择需要高效表达蛋白的基因序列；
步骤2、根据生物密码子敏感性，确定其最佳氨基酸对应的低敏性密码子，将目的蛋白基因序列中相应密码子全部替换成低敏性密码子，用人工合成基因的方法重新合成得到人工合成序列；
步骤3、将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到目标菌株中，用于荧光蛋白eGFP的表达；
或将步骤2获得的人工合成序列构建到发酵途径中，用于异丁醇发酵生产。
2.根据权利要求1所述的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述目标菌株包括大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到目标菌株中，用于荧光蛋白eGFP的表达具体包括：
将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到大肠杆菌里面进行培养，并通过PCR验证的方法进行测序；
将通过PCR验证得到的基因测序正确的相应菌株在M9的培养基中进行培养，测定其荧光值和OD600。
4.根据权利要求1所述的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述发酵途径包括表达alsS，ilvC和ilvD基因的pYP69和表达kivD和adhA基因的pYP65。
5.根据权利要求4所述的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述将步骤2获得的人工合成序列构建到发酵途径中具体包括：分别将pYP69和pYP65的ilvC基因和ilvD基因上编码异亮氨酸的密码子全部替换成AUA，获得基因序列Ile-AUA。
一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法
技术领域
背景技术
[0002] 在细胞工程和代谢工程中，提高蛋白的表达水平是获得高水平目标产物的最有效的方法。但在实际生产的过程中，细胞到达稳定期后蛋白的表达已达到最高值，并且，目标产物以及一些其他代谢产物的积累会使细胞处于胁迫环境(例如酸胁迫，高盐胁迫，高温胁迫等)中，导致蛋白质的表达量降低，不利于生产。因此，如何提高在胁迫环境下蛋白的表达水平已成为研究的重点。
[0003] 当核糖体翻译机制对某种氨基酸的需求超过其在合成代谢中的生物合成速率时(即细胞体内氨基酸饥饿时)，空载的相应tRNA异受体的群体将增加并且翻译过程将受到损害。因此，在饥饿条件下，氨基酸的从头合成速率可能成为翻译的限制因素。在这种情况下，如果采用的是高频密码子优化策略，而该高频密码子正好“稳健”性能比较差，即使其他同义密码子相应的tRNA负载水平很高也很难被利用，那么，蛋白质的合成将受到严重的抑制。“稳健”的异受体对其相应氨基酸供应的波动反应较小，即使在非最佳代谢条件下，甚至在相应氨基酸的细胞内浓度非常低时，例如由于饥饿或强制过表达，它们的负载水平也将保持不变，并且它们的密码子将被有效翻译。这种响应细胞体内氨基酸浓度发生变化的密码子相应tRNA的负载水平被称为密码子敏感性。
[0004] 目前，密码子优化是高效表达蛋白最常用的方法。在遗传密码中，mRNA上3个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子对应一种氨基酸。在生物体中有64种密码子，20种氨基酸，这就导致遗传密码的简并性，对应的编码同一种氨基酸的多个密码子被称为同义密码子。物种间同义密码子的使用频率并非一致，绝大多数生物倾向于只利用这些密码子中的一部分，即物种具有密码子偏好性。利用密码子的偏好性来进行密码子优化成为了提高蛋白表达水平最直接有效的方法，该方法根据各个生物密码子的偏好性来对基因的碱基序列进行改造，进而提高了蛋白的表达水平。但是，这种优化方法的缺点之一是完全忽略共翻译折叠动力学，从而将对蛋白质质量具有相当大的影响。尤其在胁迫环境下，该方法更会受到局限,并随着时间增长代谢产物的积累会造成蛋白表达水平的停滞，甚至降低。因此，如果能够找到一种在胁迫条件及发酵后期还能够使蛋白质稳定持续表达的方法，将促进目标产物的高效生产，为发酵工业开辟一条新道路。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，以解决现有技术中在斜坡环境下，蛋白表达水平的停滞，甚至降低的问题。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
[0007] 一种提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1、选择需要高效表达蛋白的基因序列；
[0009] 步骤2、根据生物密码子敏感性，确定其最佳氨基酸对应的低敏性密码子，将目的蛋白基因序列中相应密码子全部替换成低敏性密码子，用人工合成基因的方法重新合成得到人工合成序列；
[0010] 步骤3、将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到目标菌株中，用于荧光蛋白eGFP的表达；
[0011] 或将步骤2获得的人工合成序列构建到发酵途径中，用于异丁醇发酵生产。
[0012] 可选的：所述目标菌株包括大肠杆菌。
[0013] 可选的：所述将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到目标菌株中，用于荧光蛋白eGFP的表达具体包括：
[0014] 将步骤2获得的人工合成序列与载体进行连接，转到大肠杆菌里面进行培养，并通过PCR验证的方法进行测序；
[0015] 将通过PCR验证得到的基因测序正确的相应菌株在M9的培养基中进行培养，测定其荧光值和OD600。
[0016] 可选的：所述发酵途径包括pYP69和pYP65两个质粒。
[0017] 可选的：所述将步骤2获得的人工合成序列构建到发酵途径中具体包括：分别将pYP69和pYP65的ilvC基因和ilvD基因上编码异亮氨酸的密码子全部替换成AUA，获得基因序列Ile-AUA。
[0019] 图1为本发明的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法中密码子频率与敏感性的关系图；
[0020] 图2为本发明的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法中不同葡萄糖浓度下荧光强度与OD600的比值关系图；
[0021] 图3为本发明的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法中异丁醇代谢途径图；
[0022] 图4为本发明的提高胁迫条件下蛋白表达水平的方法中不同葡萄糖浓度下异丁醇发酵图；
具体实施方式
[0023] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0024] 实施例1
[0025] 用绿色荧光蛋白eGFP验证低敏性密码子优化策略的可行性：
[0026] 从图1，密码子频率与敏感性的关系图中可以看出，编码亮氨酸的密码子有6中，分别为UUG，UUA，CUC，CUG，CUU和CUA，将绿色荧光蛋白eGFP序列中编码亮氨酸的密码子全部替换成CUC和UUG，用人工合成基因的方法得到eGFP-CUC和eGFP-UUG序列。其中，CUC和UUG密码子的频率相近(分别为6.3和6.2)，但敏感度差异较大(分别为0.59和24.8)。
[0027] 利用全基因合成技术合成基因序列eGFP-CUC和eGFP-UUG。基因全合成体系为：5×TransStart FastPfuFly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物(10μM)预混液2μL，TransStart FastPfu Fly DNAPolymerase 1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸20s(30个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。将合成的基因序列eGFP-CUC和eGFP-UUG分别与pJET1.2/blunt Cloning Vector(Thermo Scientific)进行连接。连接体系：1.5μL基因片段，0.5μL平末端载体，0.5μLT4连接酶，1μL 10×T4连接酶Buffer,6.5μL蒸馏水，总体系10μL。将得到的pJET_eGFP-CUC和pJET_eGFP-UUG质粒，随后转入到XL10-Gold感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击60s，再冰浴2min，加入200uL SOC，37℃孵育45min，取全部液体涂于含氨苄霉素的平板上，37℃过夜。用PCR验证的方法进行验证并将验证正确的质粒进行测序(金维智测序公司)。
[0028] 将基因测序正确的相应菌株在M9的培养基(加入不同浓度的葡萄糖，分别为1.5g/L和2.0g/L)中，37℃条件下进行培养，测定其对数期荧光值和OD600，比较荧光值/OD600。如图2所示，其中，Codon为密码子；Sens为密码子敏感性；Usage为密码子频率，其结果显示，在
1.5g/L葡萄糖培养条件下，pJET_eGFP-CUC(即Leu-LS)荧光强度与OD600的比值为1090.02，pJET_eGFP-UUG(即Leu-HS)荧光强度与OD600的比值为361.80；在2.0g/L葡萄糖培养条件下，pJET_eGFP-CUC(即Leu-LS)荧光强度与OD600的比值为1484.18，pJET_eGFP-UUG(即Leu-HS)荧光强度与OD600的比值为759.80，上述实验结果均表明，用低敏性密码子进行优化后，eGFP蛋白水平较高。
1.5g/L葡萄糖培养条件下，pJET_eGFP-CUC(即Leu-LS)荧光强度与OD600的比值为1090.02，pJET_eGFP-UUG(即Leu-HS)荧光强度与OD600的比值为361.80；在2.0g/L葡萄糖培养条件下，pJET_eGFP-CUC(即Leu-LS)荧光强度与OD600的比值为1484.18，pJET_eGFP-UUG(即Leu-HS)荧光强度与OD600的比值为759.80，上述实验结果均表明，用低敏性密码子进行优化后，eGFP蛋白水平较高。
[0029] 培养基组成：M9培养基，1.5g/L葡萄糖或2.0g/L葡萄糖，1mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.1mM VB1。
[0030] 实施例2
[0031] 将低敏性密码子优化策略用于异丁醇实际生产发酵：
[0032] 通过实例1验证了低敏性密码子优化策略的可行性，在此基础上，利用该策略对异丁醇生产途径中ilvC和ilvD进行密码子优化并用于实际发酵生产。异丁醇发酵途径由2个质粒构成，分别为pYP69(表达AlsS，ilvC和ilvD基因)和pYP65(表达kivD和adhA基因)，如图3所示，本发明将ilvC和ilvD基因上编码异亮氨酸的密码子全部替换成AUA，基因序列为Ile-AUA，该密码子频率和敏感度分别为0.9和2,相比其他两个密码子(AUU为21.4,15.2；
AUC为36.7,15.2)均较低。
AUC为36.7,15.2)均较低。
[0033] 利用人工合成基因的方法得到上述基因序列Ile-AUA。基因全合成体系为：5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10μL，dNTP(2.5mM)4μL，引物(10μM)预混液2μL，TransStart FastPfu Fly DNAPolymerase 1μL,蒸馏水35μL，总体积为50μL。扩增条件为95℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸20s(30个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。将该序列与pYP69的骨架进行连接，得到pYP69_Ile-AUA。连接体系：1μL Ile-AUA片段，1.5μLpYP69骨架，7.5μL Gibson Mix，总体系10μL，50℃连接1h。随后转入到XL10-Gold感受态细胞中，冰浴30min，42℃热击60s，再冰浴2min，加入200μL SOC，37℃孵育45min，取全部液体涂于含氨苄霉素和卡那霉素的平板上，37℃过夜培养。用PCR验证的方法进行验证并将验证正确的质粒进行测序(金维智测序公司)。
[0034] 将pYP65和pYP69_Ile-AUA双质粒共同转入到JCL260菌株中作为实验组，同时，将原始的pYP65和pYP69双质粒也转到JCL260菌株中作为对照组。将上述得到的实验组和对照组菌株在不同培养基条件见下进行发酵培养。用GC测定异丁醇产量，如图4所示，其中A为以20g/L葡萄糖作为碳源条件下，异丁醇发酵结果，B为以40g/L葡萄糖作为碳源条件下，异丁醇发酵结果
[0035] 实验结果为，在以20g/L葡萄糖作为碳源条件下，实验组异丁醇的产量为2.90g/L(96h)，对照组异丁醇产量为2.30g/L(96h)，产量提高了26.09％；在以40g/L葡萄糖作为碳源条件下，实验组异丁醇的产量为4.16g/L(96h)，对照组异丁醇产量为2.64g/L(96h)，产量提高了57.57％，如图4所示。
[0036] 其中，发酵培养基组成：M9培养基，40g/L或20g/L葡萄糖，1mM MgSO4,0.1mM CaCl2,0.1mM VB1和0.1mM IPTG；
[0037] 其中，发酵培养条件：30℃，250rpm。
[0038] 异丁醇产量测定方法：Agilent 6890GC色谱仪，DB-FFAP毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm；Agilent Technologies)，进样量为0.2μl，并以1:50的分流比注入，使用正戊醇作为内标。进样器和检测器分别维持在250℃和280℃。初始温度保持在80℃，3min，之后以115℃min-1的梯度升温至230℃并保持1min。
[0039] 其中，内标法计算公式如下：
[0040] (Ci)样品＝(Ai/As)样品/(Ai/As)标品*(Ci)标品
[0041] C:物质浓度；A：峰面积；i：待测组分(异丁醇)；s：内标物(正戊醇)。
[0042] 以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
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