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SAM1基因在增强植物抗高盐耐受中的应用

阅读:1027发布:2020-08-29

专利汇可以提供SAM1基因在增强植物抗高盐耐受中的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了拟南芥基因SAM1在增强 植物 对高盐耐受中的应用,其是通过基因工程的方法在植物中过表达基因SAM1。通过对基因SAM1在模式植物拟南芥中分子 生物 学机理的研究,发现过表达基因SAM1的植株对高盐具有强的耐受性,在高盐培养基具有高的萌发率以及存活率。通过转基因的手段把该基因导入 农作物 势必会增强其在逆境中的抗性,进而提高作物产量及品质。,下面是SAM1基因在增强植物抗高盐耐受中的应用专利的具体信息内容。

1.基因SAM1在增强植物对高盐耐受中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,基因SAM1序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述植物为拟南芥。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的高盐耐受是植物生长发育过程的对外界条件盐度在200mM NaCl耐受。
5.一种培育耐盐性转基因植物品种的方法,其特征在于,将SAM1基因插入真核细胞表达载体,得到重组表达载体,将该重组表达载体转化到目的植物的细胞中,外源诱导剂诱导基因表达,筛选得到对高盐耐受增强的植株。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的真核表达载体为pER8。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的转化方法为农杆菌介导法。
8.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的外源诱导剂为β-雌激素
9.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述目的植物为拟南芥。

说明书全文

SAM1基因在增强植物抗高盐耐受中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域,具体地,涉及一种拟南芥基因SAM1的应用,尤其涉及SAM1在植物抗高盐胁迫中的应用,同时还涉及SAM1基因在培育抗高盐胁迫转基因植物品种方面的应用。

背景技术

[0002] 植物在生长发育过程中要受到许多外界环境条件和内部生理状况的影响,包括许多胁迫条件如高盐等。高盐胁迫是我国农作物生产面临的重大问题之一。高盐胁迫在细胞以及个体平上扰乱了水电势平衡以及离子分布,导致细胞内的分子受损,从而导致植物生长停滞以至于死亡。盐胁迫所导致的农作物产量的降低成为制约我国农业发展的一个重要因素。乙烯是一个关键的胁迫信号分子,许多逆境生态,包括洪水,干旱,高温或低温,金属和盐等非生物逆境及病虫害侵染等,都能诱发乙烯的大量增加,胁迫一旦解除,随即恢复正常水平,因此乙烯常被称为胁迫激素。植物体在胁迫条件下自身能通过相应特定基因的表达来适应这种胁迫条件。并且植物激素如乙烯等参与了这些基因的表达调控。同样植物激素乙烯处理亦可诱导以上基因表达,从而促进植物对环境的适应。
[0003] 几乎所有的植物组织都能产生乙烯,但大多数情况下浓度都很低。Yang和Hoffman通过一系列精巧的实验阐明了乙烯的合成途径。乙烯衍生自甲硫酸,它的产生过程分为以下几个步骤:(1)甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(Sadometsynthetase,SAMS)催化下变成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是植物体内主要的甲基供体,用做许多生化合成途径的底物,例如乙烯合成途径和精胺/亚精胺合成途径等。(2)SAM在ACC合酶(ACC synthase,ACS)的催化下产生氨基环丙烷羧(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)和5’-甲硫腺苷(MTA)。ACC合酶是整个乙烯合成途径中的关键酶和限速酶。ACC用于产生乙烯;MTA则通过甲硫氨酸循环变回甲硫氨酸。(3)ACC在ACC化酶(ACC oxidase,ACO)催化下产生乙烯。
[0004] 早在上世纪80年代,就有研究发现外源施加10mM ACC(1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid,乙烯合成前体)能够减轻100mM NaCl对莴苣种子萌发的抑制作用。我们研究发现乙烯生物合成的一个上游基因S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE-1(SAM1,AT1G02500)在增强植物对高盐的耐受性中具有重要作用。通过农杆菌介导的方法构建的诱导性过表达SAM1的转基因植物(SAM1OE)对高盐胁迫具有很强的耐受性。与野生型相比,表现为在高盐(200mM NaCl)培养基上具有高的萌发率(约25%)与存活率(约80%)。另外,诱导性过表达SAM1不影响植物的正常生长发育。此项研究进一步阐述了乙烯在增强植物抗盐胁迫中的重要作用以及通过转基因增强乙烯的合成从而培育新的作物品种提供了新思路。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因SAM1在增强植物对高盐耐受性方面的应用,以拓宽基因SAM1的应用范围。
[0006] 本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因SAM1在培育抗高盐胁迫转基因植物方面的应用。
[0007] 为了实现上述目的,本发明的技术方案采用了一种诱导性超表达拟南芥基因SAM1在植物抗高盐胁迫方面的应用。
[0008] 所述的基因为SAM1,其核苷酸序列如Seq ID No:1。在GenBank中的编号为AT1G02500,CDS的长度为1 182bp。把SAM1的全长CDS克隆到一个诱导性植物表达载体上,获得了转基因植物。并且分析了转基因植物对高盐胁迫的耐受性,实验表明,过表达SAM1的植株大大增强了对高盐胁迫的耐受性。与野生型相比,表现为在高盐(200mM NaCl)培养基上具有高的萌发率(约25%)与存活率(约80%)。另外,诱导性过表达SAM1不影响植物的正常生长发育。SAM1功能的分析为获得高盐耐受性的植物新品种提供了理论和方法的基础
[0009] 本发明过表达SAM1基因能够增强植物对高盐胁迫的耐受性,因此能够作为外源基因参与培育具有高盐胁迫耐受性的转基因植物,具有潜在的应用价值,适于推广应用。本发明为通过基因工程手段增强作物对高盐胁迫的抗性以及培育抗盐性提高的植物品种提供了新的思路。附图说明
[0010] 图1为pER8载体图谱。该载体融合了一个诱导性启动子,外源施加β-雌激素(β-estradiol)可以诱导基因表达。具有多个限制性酶切位点:XhoI、AscI、ApaI、PacI和SpeI。在大肠杆菌和农杆菌中具有壮观霉素抗性,而在植物中具有潮霉素抗性。
[0011] 图2为挑选的阳性克隆经测序鉴定的结果(部分序列),与SAM1的CDS一致。
[0012] 图3为Col-0野生型以及SAM1转基因植物不同的植株(#4、#9和#10)分别在添加β-雌激素以及添加/不添加200mM NaCl的培养基上培养4天的结果。转基因植株大大提高了对高盐胁迫的耐受性,表现为转基因植株仍为绿色。
[0013] 图4为Col-0野生型以及SAM1转基因植物不同的植株(#4、#9和#10)分别在添加β-雌激素以及添加/不添加200mM NaCl的培养基上培养5天、6天及7天后的存活率。过表达SAM1显著提高了植物在高盐胁迫情况下的存活率。
[0014] 图5为Col-0野生型以及SAM1转基因植物不同的植株(#1、#4、#6、#9和#10)分别在添加β-雌激素以及200mM NaCl的培养基上培养10天后的萌发率。过表达SAM1显著提高了植物在高盐胁迫情况下的萌发率。

具体实施方式

[0015] 以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0016] 以下实施例中使用的各种突变体均购自ABRC,各种药品试剂,如无特殊说明均购自Sigma公司。
[0017] 实施例1 构建诱导性过表达SAM1的克隆
[0018] 以野生型拟南芥Col-0的cDNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增得到SAM1的CDS。 引 物 为:正 向 引 物 F:5’-cg CTCGAGATGGAGACTTTTCTATTCAC-3’,R:5’-gc GGGCCCTTAAGCTTGAGGTTTGTCCC-3’,下划线分别为XhoI和ApaI限制性内切酶位点,cg和gc为保护基。PCR引物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小,然后胶回收。把回收产物和pRE8载体(图1)分别用XhoI和ApaI双酶切,然后经胶回收。用T4连接酶在16℃连接过夜,连接产物经70℃15分钟灭活后通过热激的方法转到大肠杆菌,在壮观霉素的LB培养基上筛选阳性克隆,并经过测序鉴定(图2)。
[0019] 实施例2 过表达SAM1增强了植物对高盐的耐受性
[0020] 构建β-雌激素诱导表达SAM1的克隆,转化到野生型拟南芥Col-0中。将转基因纯合体种子播种在MS培养基上,放置在人工培养箱内培养(温度为22℃,湿度为60%,16小时光照/8小时黑暗的长日照),在光(用白炽灯作为光源进行光照,连续作用光强度为-2 -1200μmol·m s )下生长5天后转移幼苗到添加了β-雌激素(10μM)的MS培养基以及β-雌激素(10μM)和200mM NaCl的MS培养基上,光下培养5天后观察表型,并在第5、6、
7天统计存活率。在添加β-雌激素诱导但培养在MS培养基上的植株生长状态良好;而培养在添加了β-雌激素并且含有200mM NaCl培养基上的植株,与野生型Col-0相比,诱导SAM1基因表达的植物存活率高(图4)并大部分为绿色(图3)。以上结果说明过表达SAM1可以增强植株对高盐的耐受性。
[0021] 构建转基因植物pER8:SAM1的方法为:
[0022] 1.PCR扩增目标片段SAM1基因编码区,通过核酸内切酶酶切目标片段和质粒pER8(Jianru Zuo 等,An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants,The Plant Journal,2000,由中国科学院遗传所左建儒实验室惠赠)产生黏性末端,将片段和质粒用连接酶连接,通过测序鉴定得到质粒pER8:SAM1。
[0023] 2.取2μl质粒加入100μl农杆菌C58中,2200V电击后迅速加入500-800μl LB培养基,28℃ 220rpm培养1.5h,均匀涂在40μg/ml壮观霉素LB培养基上,28℃倒置培养1-2天;
[0024] 3.接种单个菌落于5ml LB培养基(利福平50μg/ml+壮观霉素40μg/ml;也可以只加转基因抗性),28℃ 220rpm培养过夜;
[0025] 4.以1∶100扩大培养于400mL(根据植物数量调整)含适当抗生素的LB中,继续摇培5-8h左右至生长密度为OD600值1.0-1.2;
[0026] 5.室温,4000g,离心10min,收集菌体;
[0027] 6.用转化介质(5%蔗糖,2.033g/L MgCl2)悬浮菌体;Silwet L-77(200μL/L)对菌液有伤害,应在转化植物前加入;
[0028] 7.将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中,将刚刚开花的拟南芥倒置其上,使得整个花序都浸入转化介质中(莲座基部的花序可用枪浇淋),30s~120s;
[0029] 8.取出拟南芥,将其侧卧放在干净的塑料托盘上,并用薄膜覆盖避光保湿24h;
[0030] 9.将拟南芥扶起,光下培养,约3-4周后长果完全枯黄、欲开裂时,即可收获种子;
[0031] 10.用50μg/ml潮霉素的MS培养基筛选转基因植物。
[0032] 实施例3 过表达SAM1提高了植株在高盐培养基上的萌发率
[0033] 把pER8-SAM1转基因植株(#1、#4、#6、#9和#10)播种在含有10μM β-雌激素和200mM NaCl的MS培养基上,在4℃暗处放置4天,让所有的种子充分吸涨以便萌发一致。然后在22℃光下培养5天,观察萌发率。结果如图5所示,野生型对照Col-0几乎都没有萌发,而转基因植株的不同植株#1、#4、#6、#9、#10萌发率都在25%以上。表明过表达SAM1大大增强了植株在高盐培养基上的萌发率。
[0034] 综上所述,在模式植物拟南芥中的研究表明,过表达基因SAM1能增强植物对高盐胁迫的耐受性,这为通过基因工程手段增强作物对高盐胁迫的抗性提供了新的思路。
[0035] 虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
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