为促进植物生长、植物和土壤健康、生物控制和生物修复而构建特定功能性微生物组的方法
阅读：1009发布：2020-05-12
专利汇可以提供为促进植物生长、植物和土壤健康、生物控制和生物修复而构建特定功能性微生物组的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种构建针对 植物 特定部位的功能性 微 生物 组的方法，以筛选、鉴定对植物和 土壤 具有有益特征微生物，并应用功能性微生物组、微生物或微生物群来改善在正常、逆境或受污染土地上种植的植物的生长和健康，改善土壤健康，去除或稳定有机和无机污染物，增强土壤微生物 生态系统 功能。，下面是为促进植物生长、植物和土壤健康、生物控制和生物修复而构建特定功能性微生物组的方法专利的具体信息内容。
1.一种构建包含具有一个或多个有益特征的微生物的功能性微生物组的方法，所述方法包括：
(a)从一个或多个农田采集一个或多个植物、根际或大田土壤样品；植物样品包括根、根茎、花芽、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶中的至少一个，或植物附着的土壤，(b)将一些微生物混合在液体培养液中，
(c)将培养基中的一些微生物扩繁，以富集到具有一个或多个特定有益特征的功能性微生物组，
(d)在固体选择培养基上挑选出具有理想特性的功能性微生物组，选择菌株以供测试。
2.如上述任何权利要求所述的方法，步骤(c)中确定的功能性微生物组可以通过一系列连续或平行的富集步骤，每个富集步骤都为相同或进一步的附加特征选择，以便所构建的功能性微生物组具有一个或多个期望特征。
3.如上述任何权利要求所述的方法，对分离株进行纯化，选择一个或多个具有一个或多个特定有益性状的微生物，或未对分离株进行纯化，选择具有期望性状的分离株。
4.如上述任何权利要求所述的方法，功能性微生物组的结构位点是特异性的。
5.如上述任何权利要求所述的方法，对植物的根、根茎、茎、花、种子、果实、茎和叶中的至少两个进行取样。
6.如上述任何权利要求所述的方法，功能性微生物组具有第一理想的特征。
7.如上述任何权利要求所述的方法，一个或多个连续富集步骤中，每一富集步骤选择一个进一步的附加特征，得到具有多个特征的功能微生物组。
8.如上述任何权利要求所述的方法，植物、根际或土壤样本是从最终将使用的土壤区域采集而来，进而构建的功能性微生物组。
9.如上述任何权利要求所述的方法，有益特征选自包含无机和有机磷酸盐和钾释放、重氮(固氮)活性、植物激素产生(吲哚-3-乙酸、细胞分裂素、赤霉素)、植物应激激素减少和植物根系中脱落酸水平的降低，降解有毒有机化合物的能力，隔离、积累、溶解或固定有毒重金属的能力，以及在高盐和干旱条件下生存和生长的能力。
10.如上述任何权利要求所述的方法，选择具有一个或多个特定性状的功能性微生物组，或者选择具有一个或多个性状的一个或多个非纯化微生物，或者选择具有一个或多个性状的一个或多个纯化微生物。
11.如上述任何权利要求所述的方法，所提取的具有特定性状的微生物组中的微生物选择性地富集在液体培养液中以构建功能性微生物组，其中富集步骤是从如下微生物组中富集选择的微生物，包括溶磷微生物、IAA产生微生物、ACC脱氨酶产生微生物、重氮微生物、脱落酸降解微生物、有机污染物降解微生物、重金属抗性微生物、耐盐微生物。
12.如上述任何权利要求所述的方法，有益性状的选择如下：
(a)从包括ACC脱氨酶活性、无机磷增溶、有机磷释放、吲哚-3-乙酸产生、脱落酸降解、重氮营养活性、胞外多糖产生的组中选择的植物生长促进性状；
(b)从原油、多环芳烃、膦酸盐除草剂、三嗪类除草剂、硝基芳烃、氯化芳烃、挥发性有机化合物、多氯联苯、二恶英/呋喃或氰化物组中选择的异种生物降解性状；
(c)从苯丙烯酸、2,4二乙酰氯丙醇和吩嗪组中选择的生物控制性状；
(d)从镉、铅、铬、镍、铜、锌、钴、汞和砷耐受性组中选择的重金属耐受性、增溶性或固定性状。
13.一种具有一种或多种性状的功能性微生物组，其性状通过上述权利要求中所述的方法鉴定，或通过上述权利要求中所述的方法鉴定或分离出一种或多种纯化微生物。
14.一种包含功能性微生物组或根据权利要求13所述的一种或多种微生物的组合物。
15.根据权利要求13所述的功能性微生物组，或根据权利要求13所述的一种或多种生物体，或根据权利要求14所述的组成，用于将有益性状应用于一种或多种植物，或用于土壤或生物修复。
为促进植物生长、植物和土壤健康、生物控制和生物修复而构
建特定功能性微生物组的方法
发明内容：
[0001] 本发明涉及一种构建功能性微生物组以及分离具有有益特征的植物和土壤微生物的方法，从而改善植物生长和健康、改善土壤健康、去除和/或稳定有机和无机污染物，以及增强土壤微生物生态系统功能。适用植物包括可在正常、紧张或边缘土地上种植的谷类、蔬菜、纤维、水果、观赏植物、花卉、草皮、生物能源、生物制药和植物修复植物等。
[0002] 背景：
[0003] 联合国粮食及农业组织(FAO)预测，到2050年，世界将需要多生产70％的粮食，以维持其人口增长。这一前所未有的对粮食的需求将需要每年增加2.7-4.9百万公顷的土地利用。这同样需要农业方面的创新，以从现有的生产性农业用地及受污染影响的可耕地中增加安全作物生产。
[0004] 近50年来，由于农业集约化生产和化肥的使用，65％的农业用地已经退化为盐碱化或贫瘠化土地。同时，由于工业的快速发展和缺乏足够的环境保护，全球已出现了大面积受到有机和无机污染物污染的农业土壤，特别是在发展中国家情况尤为严重。据估计，由于无节制的采矿活动和工业废水灌溉，中国有2000万公顷耕地(占农业总用地的五分之一)受到重金属的影响，这导致每年有1000多万吨粮食产量减少和1200万吨的粮食被重金属污染。而这些粮食可以养活4000万人口，并导致每年超过30亿美元的直接经济损失。有毒的重金属可以通过受污染的土壤进入食物链，并在人体内积累，从而对健康构成严重威胁。
[0005] 最大限度地提高生产力，保护在紧张和受污染的农业土地上生产的作物的食品安全，已成为到2050年可持续养活9亿人的关键目标。虽然在过去几十年来，通过施用化肥、杀虫剂和诸如作物基因改造(GM)等技术，作物产量有所增加，但施用此类化学品和转基因技术对环境和社会的影响已引起公众相当大的关注。
[0006] 在过去的十年里，微生物对人类、植物和环境健康的重要性和影响已经被认识到。低成本基因组和微生物组测序技术、蛋白质组学和代谢组学的出现，大大提高了有关微生物多样性和作用的遗传和功能信息的质量和数量。
[0007] 在过去，创新的天然植物促生长(PGP)微生物的应用已被证明可以提高作物产量和土壤肥力，保护作物免受病害，提高食品营养质量和改善食品安全。PGP的作用机理是多种多样的，许多PGP微生物可以产生包括植物激素如生长素和赤霉素在内的多种有益性状，并能促进关键营养素的获取，如通过固氮PGP性状形成氨、通过有机和矿物磷酸盐的增溶作用形成磷。缓解应激反应的能力是某些PGP微生物的一个重要特征，这些微生物具有氨基-环丙烷羧酸(ACC)脱氨酶，因为这降低了应激产生的乙烯水平，也可以影响植物内的其他运输途径，从而提高植物对食草动物害虫的抵抗力，以及对盐、干旱和重金属污染物的耐受性。某些PGP具有降解有机污染物、稳定无机污染、促进植物生长和保护食品安全的特性。然而，尽管PGP微生物具有潜力，但商业上的成功仅限于具有有限PGP特性的相对较小范围的物种，并且在不同的植物物种、气候和环境中应用时，其功效不一致。在过去的5年里，主要的农业生物技术公司已经认识到创新的必要性，以最大限度地发挥PGP微生物在示范农业中的革命性效益。精准农业不再是一个未来主义的概念。为了最大限度地发挥PGP微生物的植物产量潜力，微生物或微生物群落需要精确地适应在特定场地条件下生长的特定植物，这将需要一个高效的过程来丰富、分离和识别具有所需特定特性的微生物。然而，传统的鉴定具有多种有益特性的微生物和开发微生物产品的方法通常需要3-5年的时间，成本也较高。
[0008] 本发明公开了一种快速有效的方法，即构建功能性微生物组(CFM)，用于为特定植物和场所识别具有多种所需有益性状的大量微生物。所鉴定的微生物或微生物群可立即开发为一种社会产品，用于促进特定地点的目标植物的生长，从而迅速进入市场。这些已鉴定的微生物可以进一步开发，成为用于特定作物或特定地点的一种广泛应用。
[0009] 本发明所称“功能性微生物组”或“微生物群”，是指具有共同功能的个体微生物种或种系的微生物群落，或与植物表型特征或其他可测量的植物参数相关的微生物群。微生物群落或微生物群落中的微生物之间可能存在共生关系。
[0010] 发明目的：
[0011] 基于此，本发明的目的是提供一个构建功能性微生物组(CFM)的平台过程，以识别具有有益特性的微生物，用于促进植物生长、植物和土壤健康、生物控制和生物修复，同时将这些构建的功能性微生物组和具有有益特性的分离微生物广泛应用于植物和土壤。本发明的另一个目的是提供一个特定的、快速的和高效的过程来分离微生物，并生产一种包括一个或多个有益特性的理想微生物组合物，来应用于农业和生物治理。在农业生产中，本发明构建的微生物组、分离出的微生物及组成物可以促进植物生长，改善和保护植物健康，改善土壤条件，并能降解或固定生物治理中的有机和无机污染物。同时，利用它们来降解有机污染、或使重金属固定或溶解是本发明下一步的研究目标。本发明过程还为特定地点提供功能性微生物组、分离的微生物和组合物的生产(即定制)。另一个目标是提供一种快速、高通量、有效的方法，在2到4个月内生产特定地点的功能性微生物组或微生物组分，这比传统方法要快得多。另外，本发明的另一个目标是为目标植物或两种及两种以上位于特定地点的植物物种生产具有所需特性的微生物或微生物组。
[0012] 发明概要：
[0013] 综上所述，本发明提供了一种构建功能性微生物组的方法，所述微生物组包括具有一个或多个有益特征的微生物，所述有益特征包括：
[0015] (b)将样本内的任一微生物释放到液体培养基中；
[0016] (c)将存在于液体培养基中的所有微生物进行培养，以鉴定具有一个或多个特定有益特征的功能性微生物组；
[0017] (d)在固体选择培养基上涂上具有某种特性的功能性微生物组，并选择分离物进行检测。
[0018] 步骤(c)的功能性微生物组可以直接进入下一步，或者可以进行一系列连续或平行富集，每个富集步骤选择相同或另外的特征来构建具有一个或多个性状的功能性微生物组。
[0019] 无论是否对分离物进行纯化，都可以在固体选择培养基上测试分离物的其他有益特性。如果对分离物进行纯化，可以选择一种或多种具有一种或多种特定有益特性的微生物进行应用。如果分离物未被纯化，则可选择具有所需性状的分离物。如果对分离物进行纯化，可以选择具有一种或多种特定有益特性的一种或多种微生物。如果不纯化分离物，可以选择具有所需性状的分离菌。
[0020] 同样地，该方法还涉及纯化分离物和测试纯化后的微生物在固体选择培养基上的有益性状。最好选择一个或多个具有一个或多个特定有益特性的纯化微生物用于应用。
[0021] 功能性微生物组的构建最好是针对特定地点的。
[0022] 简单地说，微生物的有益特征包括促进植物生长和健康、食品安全和生物修复。
[0023] 采集的植物样品可能生长在非胁迫或胁迫土壤上(来自农业和非农业地区的受干旱、高盐分和/或有机和/或无机污染物影响的土壤)。所选植物可包括但不限于人类或动植物(如谷物、蔬菜或水果)、农业中使用的植物(如禾本科植物、豆类纤维作物)、生物燃料作物，杂草，树木或灌木等。块状土壤样品可以从相同的地点采集。植物和土壤样本最好是从最终会被使用的功能性微生物组、微生物或微生物群落的区域收集。
[0024] 最好至少对植物的根、根茎、茎、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶、植物附着的土壤或来自农业场地、潜在农业用地或非文化用地的土壤中的两种进行取样。最好至少对植物的根、根茎、茎、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶、植物附着的土壤或来自农业场地、潜在农业用地或非文化用地的块状土壤中的三种进行取样。最好至少对植物的根、根茎、茎、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶、植物附着的土壤或来自农业场地、潜在农业用地或非文化用地的块状土壤中的四种进行取样。最好至少对植物的根、根茎、茎、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶、植物附着的土壤或来自农业场地、潜在农业用地或非文化用地的块状土壤中的五种进行取样。最好对所有的植物的根、根茎、茎、花、种子、幼苗、果实、茎、插条或叶、植物附着的土壤或来自农业场地、潜在农业用地或非文化用地的块状土壤进行取样。从根际土壤、根际、叶面和茎中提取合适的样品。可对根际土壤或目标地点的大块土壤进行采样。
[0025] 在选择培养基(一种特性)上生长的微生物菌落被纯化或未纯化。最好不要对菌落进行纯化或分离，而是直接进行测试，以确定它们是否具有一个或多个其它有益性状。尽管不希望受到任何理论的束缚，但发明者认为，生长在固体选择培养基上的菌落可能由多个有机体组成，它们可能以合作或协同的状态存在，从而增强了它们发挥有益特性的能力。因此，在最初的选择过程中，将合作共生的生物体分离出来是不可取的。此外，还可以以高通量的方式选择和筛选10倍以上的菌落。在鉴定出具有一个或多个有益性状的未纯化微生物后，对这些微生物进行进一步纯化，并对纯化后的微生物进行检测，以确定其是否具有一个或多个有益性状。首先选择非纯化菌落的过程提高了形成最兼容的微生物群落的可能性(因为微生物在非纯化状态下共存)，然后使用纯化的微生物进行田间应用。这将增强微生物群落组成的后续选择。
[0026] 本文使用的微生物一词是广义的，包括细菌和古细菌以及真核生物和原生生物。
[0027] 选择合适的植物和土壤样本进行取样，并运送回实验室。
[0029] 均匀化的样品可以进行低速离心以去除固体植物组织。将澄清的上清液收集起来并高速离心以使释放的微生物细胞成团。最好去除上清液，并将成团的微生物重悬在缓冲液中。
[0030] 微生物细胞随后可在同一缓冲稀释液中洗涤、离心并重悬在缓冲稀释液中。
[0031] 提取出的微生物组的一小部分可储存起来供将来使用，并可用于16S rDNA的总DNA提取和元基因组分析。
[0032] 提取的微生物组中具有特定特征的微生物亚群最好选择性地在液体培养基中富集。
[0033] 理想的特征包括但不限于以下：
[0034] 无机和有机磷酸盐和钾释放；
[0035] 重氮(固氮)活性；
[0036] 植物激素生成(吲哚-3-乙酸、细胞分裂素、异丙氨酸)；
[0037] 植物应激激素降低(通过降解1-氨基-1-环丙烷羧酸盐(ACC)降低乙烯水平)，这是由于细菌酶ACC脱氨酶的作用和植物根系中脱落酸水平的降低导致的；
[0039] 对有毒重金属(包括铅(Pb)、镉(Cd)、砷(As)、硒(Se)、铬(Cr)、锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)、钴(Co)和汞(Hg)进行隔离、积累、溶解或固定的能力；
[0040] 在高盐环境中生存和生长的能力。
[0041] 本发明用于在特定的胁迫或非胁迫土壤条件下促进目标植物生长的一个实例如图1所示。
[0042] 构建磷酸盐增溶功能性微生物组：
[0043] 将提取的微生物组样品接种到含有磷酸三钙的解磷(NBRIP)培养基的无菌烧瓶中。将烧瓶在高速200rpm、10至30℃下摇3至10天，适宜的时间为7天。然后，将液体培养基离心以收集选定的微生物组，在缓冲液中洗涤，并在1/5体积缓冲液中重悬。适宜的缓冲液为生理盐水。
[0044] 该悬浮液的一部分可以接种到添加有磷酸三钙的解磷(NBRIP)培养基的新烧瓶中。烧瓶可再次以高速(200rpm)、在10至30℃(适宜温度为20℃)下摇3-10天，适宜时间为7天；这种浓缩的样品可以接种到含有磷酸三钙和溴酚蓝指示剂的NBRIP琼脂上，将这些琼脂培养板在10-30℃，适当为20℃下培养3到10天，适宜时间为5到7天。
[0045] 富集的功能性微生物组储存在-80℃下。从富集的微生物组中分离出的大量明显变色的菌落，收集并储存在-80℃下。
[0046] 构建产生IAA(碘乙酰苯胺)的功能性微生物组：
[0047] 将提取的微生物组样品接种到含有色胺-吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙腈的无菌无氮的Dworkin和Foster基本培养基的烧瓶中，摇匀培养。
[0048] 然后将液体培养基离心以收集所选微生物组，在无菌缓冲液中洗涤并重悬在缓冲液中。一直重复此过程。
[0049] 富集后的功能性微生物菌群保存于-80℃条件下。大的孤立菌群也可收集和储存在-80℃条件下。
[0050] 构建产生ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸酯)脱氨酶的功能性微生物组：
[0051] 将提取的微生物组样品接种于含有3mM的1-氨基-1-环丙烷-羧酸盐的无菌无氮的Dworkin和Foster基本培养基烧瓶中，摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。一直重复此过程。富集后的功能性微生物组储存在-80℃条件下。大型分离菌落也可收集和储存于-80℃条件下。
[0052] 构建重氮营养功能性微生物组：
[0053] 将提取的微生物组样品接种到无菌无氮的复合碳源培养基中，摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中洗涤并在缓冲液中重悬。富集后的功能性微生物菌群保存在-80℃条件下。大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0054] 构建脱落酸功能性微生物组：
[0055] 将提取的微生物组样品接种到含有脱落酸的无菌无碳的Dworkin和Foster基本培养基的烧瓶中，并摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。富集的功能性微生物组储存在-80℃条件下，大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0056] 构建有机污染物降解功能性微生物组：
[0057] 将提取的微生物组样本接种到添加有指定化合物的无氮、无碳或磷酸盐的Dworkin和Foster基本培养基的无菌烧瓶中，并摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。富集的功能性微生物组储存在-80℃条件下，大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0058] 构建重金属抗性功能性微生物组：
[0059] 将提取的微生物组样品接种到含有葡萄糖酸三酯培养基的无菌烧瓶中，并加入指定的重金属，摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。富集的功能性微生物组储存在-80℃条件下，大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0060] 构建耐盐功能性微生物组：
[0061] 将提取的微生物组样品接种到含有培养基的无菌烧瓶中，并加入0.6-3.8％的标准氯化钠溶液，摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。富集的功能性微生物组储存在-80℃条件下，大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0062] 构建耐碱性或酸性的功能性微生物组：
[0063] 将提取的微生物组样品接种到pH4和pH9的培养基的无菌烧瓶中进行耐酸和耐碱性微生物富集，并摇匀培养。然后对液体培养基进行离心以收集选定的微生物组，在无菌缓冲液中清洗并重悬在缓冲液中。富集的功能性微生物组储存在-80℃条件下，大的分离菌落也可收集并储存在-80℃条件下。
[0064] 分离株的鉴定：
[0066] 菌株的表征：
[0067] 从上述筛选过程中分离出的菌株可进行快速的高通量筛选分析，包括一系列表型和/或基因型分析，包括但不限于以下特征：
[0068] 较好的促进植物生长的性状包括：
[0069] ACC脱氨酶活性、无机磷酸盐增溶、有机磷酸盐释放、吲哚-3-乙酸、脱落酸降解、重氮营养活性、胞外多糖、2，4-二乙酰氯丙醇、吩嗪、苯乙酸、硝吡咯菌素和二甲基十六胺。
[0070] 较好的异种生物降解特性包括：
[0071] 石油化合物(汽油、柴油、原油、润滑油)、多环芳烃(萘、亚萘基、亚环烷、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、亚丁烯、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[ghi]亚丁烯和茚并[1，2，3-cd]芘)、六氯环己烷(林丹)，
[0072] 生物杀菌剂：包括硫磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、二嗪农、敌敌畏、磷酸盐、杀螟松、杀虫威、甲基吡啶磷、磷酸甘油、阿特拉津、西玛津、丙嗪和氰嗪)、(2-甲基-4-氯苯氧基乙酸(MCPA)、甲基氯苯氧基丙酸(甲氯丙酸)，2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)、3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)艾氏剂、氯丹、DDT、狄氏剂、六氯苯(HCB)、七氯、异狄氏剂和毒杀芬、苄唑酮、绿麦隆、氯氰菊酯、异丙隆、百草枯、五氯苯酚和2,4,5-三氯苯酚)硝基芳烃(包括2,4,6-三硝基甲苯、1,3,5-三硝基苯、2-硝基苯酚、3硝基苯酚、4-硝基苯酚，2,4-二硝基苯酚、2,5-二硝基苯基)、有机溶剂(乙酸丙酮、乙腈苯、1-丁醇，2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯苯)、二甲基乙二醇、二乙醚、二甘醇二甲醚(二甘醇，二甲醚)、1，2-二甲氧基乙烷(乙醚、二甲醚(DME)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、1，4-二氧杂环己烷、乙酸乙酯、乙醇、乙二醇、甘油、正庚烷、六甲基磷酰三胺(HMPA)、六甲基亚磷酰三胺(己烷甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、硝基甲烷、戊烷、石油醚(石油醚)、异丙醇、吡啶、四氢呋喃(THF)、甲苯、三乙基胺、o-二甲苯、m-二甲苯，p-二甲苯、三氯乙烯、正己烷、环己烷、苯、甲苯、乙苯)、二氧杂芑和呋喃、多氯联苯和腈基。
[0074] 苯乙酸，2,4-二乙酰基间苯三酚、吩嗪
[0075] 较好的重金属耐受性、溶解性或固定性包括:
[0076] 镉、铅、铬、镍、铜、锌、钴、汞、硒。
[0077] 细菌分离株可以通过16S rDNA全基因(～1500bp)的DNA测序和生物信息学分析来鉴定。用于进一步产品开发的细菌分离株可以选择任意合适的种类。选择细菌分离株的因素包括与人类、动物、植物或环境病原体的相关性，只有来自生物安全风险组l(非致病性组)的物种可以被选择用于进一步的产品开发。例如，细菌可选择但不限于以下菌种，Pseudomonas,Rhodococcus,Ralstonia,Alcaligenes,Streptomyces,Aeromonas,Rhizobia,Bradyrhizobium,Burkholderia,Achromobacter，Micrococcus,Bacillus,Azomonas,Derxia,Lignobacter,Rhodospirillum,Rhodo-pseudomonas,Herbaspillium,Acetobacter,Xanthobacter,Desulfovibrio,Clostridium,Actinomyces,Arthrobacter,Cladosporium,Staphylococcus,Acinetobacter,Xanthomonas,Sphingomonas,Enterobacter,Flavobacterium,Corynebacterium,Brevibacterium,Nocardia,Planococcus,Kocuria,Microbacterium,Paenibacillus,Ochronobacterium,Serratia,Stenothrophomonas Azospillium,cellulomonas,Gluconacetobacter,Beijerinckia,Lactobacillus and Delftia。
[0078] 构建功能性微生物组分:
[0079] 根据应用目标地点的应力条件，可以选择每个特定性状的1-1000株分离株作为构建功能性微生物组合成分的包含物。这一选择过程可以通过由实地田间试验的微生物组研究所产生的数据来决定，这些数据显示了自然植物/作物微生物组的群落结构。
[0080] 核心功能性微生物组组分可能包括：
[0081] ·1-1000ACC脱氨酶活性菌株；
[0082] ·1-1000吲哚-3-乙酸产生菌株；
[0083] ·1-1000磷酸盐增溶菌株；
[0084] ·1-1000重氮营养菌株；
[0085] ·1-1000脱落酸降解菌株；
[0086] ·1-1000吩嗪/2，4-DAPG产生菌或其组合。
[0087] 除以上核心成分外，还可根据特定地点应激源的性质添加特异性菌株。例如，如果该地点被某种特定的有机化合物污染，那么具有该化合物降解能力的1-1000株菌株将被加入该微生物组中。根据所使用的富集和选择方法的不同，该组合物中的所有菌株可能具有相同的一般特性(例如，所有菌株可能对特定的重金属都表现出抗性或耐盐性)以及它们自身菌株特定的PGP特征。
[0088] 温室植物生长试验：
[0089] 目标植物种类可包括任何植物物种和非作物物种。所选的每一个分离株可以单独培养，也可以混合在一起。然后，富集的功能性微生物组或选定的微生物或微生物组合可应用于温室内的试验植物或作物。本申请可采用液体接种、液体凝胶或固体凝胶(卡拉胶、海藻酸盐、聚丙烯酰胺、琼脂糖、纤维素、甲基纤维素、阿拉伯树胶等)等形式进行土壤淋洗或种衣剂涂布。植物可在尽可能接近目标地点的自然环境条件下(包括土壤条件、光照条件、湿度和温度条件)种植。植物生长参数是植物物种特有的，可能包括植物高度、总生物量、叶/茎/根生物量、叶面积指数、氮/磷水平、种子/果实产量等。
[0090] 本发明包括从特定地点提取和分离与单个植物(或植物的一部分)相关的微生物组，还涉及一种选择、丰富和分离表达一个或多个促进植物生长的性状或其他所需性状的植物和土壤微生物组的方法。本发明还包括一种创建组合物或联合体的过程，该组合物或联合体由这些分离物中的一个或多个组成，该分离物表现出特定的特性，用于农业粮食作物(谷类、蔬菜、水果)和非粮食作物(生物能源、纤维、药物)、园艺以及植物修复和生物修复应用中的植物。
[0091] 本发明所构建的功能性微生物组、所选微生物或微生物群特别适用于在胁迫土壤中种植的植物(同时也适用于非胁迫土壤)。这些胁迫条件包括但不限于以下条件，如干旱、涝渍、高盐度、低营养水平、重金属污染、有机污染物或植物病原体/害虫等。污染物可能是碳氢化合物，尤其是但不限于以下，如原油、石油或柴油、重润滑油、杀虫剂、除草剂、杀菌剂、挥发性有机化合物、多氯联苯、二氧芑/呋喃、氰化物或多环芳烃。污染物还可能包括重金属，特别是铅(Pb)、铬(Cr)、砷(As)、锌(Zn)、镉(Cd)、铜(Cu)、汞(Hg)和镍(Ni)，但不限于这些。
[0092] 本发明中，构建的微生物群或微生物联合体的组成包括表达以下一个或多个特征的细菌和/或真菌菌株；无机和/或有机磷酸盐和钾释放，固氮(重氮活性)能力，产生植物生长激素的能力(吲哚-3-乙酸、细胞分裂素、异丙氨酸)；降低植物应激激素水平的能力(通过细菌酶ACC脱氨酶的作用和植物根系中脱落酸水平的降低，来降解1-氨基-L-环丙烷羧酸(ACC)以降低乙烯水平)，产生作用的能力和2，3-丁二醇，能产生代谢产物来抑制植物病原体(病毒、细菌、原生动物或真菌)的生长和/或减少线虫或昆虫对植物的攻击，能够降解土壤中的有毒有机化合物，包括杀虫剂(杀虫剂、除草剂和杀菌剂)、矿物油、多环芳烃(PAH)、硝基芳香化合物，卤化和非卤化芳烃和脂肪类化合物，能够隔离、积累、溶解或固定有毒重金属(包括铅(Pb)、镉(Cd)、砷(Ar)、铬Cr)、锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)、钴(Co)和汞(Hg)，并且能够在高盐条件下生存和生长。
[0093] 本发明的一个优点是，在筛选过程中收集、浓缩和使用与植物或土壤相关的整个微生物群，以识别具有所需特征的微生物。这个过程最重要的优点是它是特定的，即对于一个特定的地点或作物，在该地点选择、构建和使用特定的功能性微生物组、微生物或微生物群落。通过从世界各地的多个地点构建多个特定地点的商业产品，结合所有地点的最理想的分离微生物，可以为一个或多个植物组成具有所需特征的微生物组。(图2,3)[0094] 附图的简要说明：
[0095] 图1为构建的功能性微生物组(CFM)分离过程示意图；一种用于在特定逆境或非逆境地点上促进目标植物生长的实施例；
[0096] 图2为通过结合每个地点的最佳微生物，为目标植物开发通用商业产品的示例-为目标植物提供特定的微生物；
[0097] 图3为在同一特定地点为多种植物开发通用商业产品的示例。
[0098] 本发明的详细说明：
[0099] 图1展示了本发明公开方法的概述。
[0100] 根据本发明的一个实施例，从植物材料中提取目标植物和土壤(逆境或非逆境)的全部微生物组(图1)。这关系到植物样品在无菌稀释剂中的均质化。这种稀释剂的目的是帮助从植物样品中释放微生物，并保护微生物免受pH值变化和均质后植物和土壤样品中可能释放的抗微生物化合物的影响。然后对均质混合物进行剧烈振动(每分钟30-200次振动)1-60分钟，以帮助将微生物释放到稀释剂中。通过低速离心(1000-6000rpm)来去除植物组织。
收集含有所有已释放微生物的上清液，并以高速(10000-20000rpm)重新离心，以聚集和收集微生物。将含有植物微生物组的离心细胞团收集起来，重悬在无菌生理盐水中。然后再次离心，以去除植物的营养物质和细胞物质，然后将细胞团重悬在无菌生理盐水中。再次重复该洗涤步骤。最后洗净的细胞团再悬浮在20mL含有20％甘油的生理盐水中，并充分混合。然后将提取出的1mL微生物组等份转移到20个1.5mL无菌试管中，盖上盖子，在-80℃下保存，直至需要时取出。土壤微生物组提取液制备方法同植物微生物组提取液制备方法相同，如上所述。
收集含有所有已释放微生物的上清液，并以高速(10000-20000rpm)重新离心，以聚集和收集微生物。将含有植物微生物组的离心细胞团收集起来，重悬在无菌生理盐水中。然后再次离心，以去除植物的营养物质和细胞物质，然后将细胞团重悬在无菌生理盐水中。再次重复该洗涤步骤。最后洗净的细胞团再悬浮在20mL含有20％甘油的生理盐水中，并充分混合。然后将提取出的1mL微生物组等份转移到20个1.5mL无菌试管中，盖上盖子，在-80℃下保存，直至需要时取出。土壤微生物组提取液制备方法同植物微生物组提取液制备方法相同，如上所述。
[0101] 所提取的微生物组经过选择和富集，其微生物分子具有特定的植物生长促进和/或生物控制，和/或重金属耐受性/固定化/增溶和/或降解有机污染物的能力和/或耐高盐能力。这种选择和富集可以在以下两个过程中进行，或在任何其他组合过程中进行。
[0102] 1)所提取的微生物组可接种到以下一种或多种培养基中：
[0103] (a)无氮化合碳培养基；
[0104] (b)添加色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙腈的无氮Dworkin和Foster培养基；
[0105] (c)添加1-氨基-1-环丙烷羧酸盐的无氮Dworkin和Foster培养基；
[0106] (d)解磷生长培养基；
[0107] (e)添加脱落酸的无碳Dworkin和Foster培养基；
[0108] (f)添加一种或多种铅、镉、镍、锌、铜、钴、汞的葡萄糖酸盐培养基；
[0109] (g)含6％氯化钠溶液的培养基；
[0110] (h)pH4或pH9的培养基；
[0111] (i)添加任何一种有机污染物的无碳Dworkin和Foster培养基；
[0112] (j)添加任何一种有机污染物的无氮Dworkin和Foster培养基；
[0113] (k)无磷解磷生长培养基；
[0114] 以上每种都可以添加任何有机污染物。
[0115] 这些经过初次选择和富集的培养物在0-200rpm转速及10-30℃下培养1-14天。经过培养后，通过高速离心收集所选择和富集的所有微生物菌群，在无菌生理盐水中洗涤两次，再悬浮在5mL无菌生理盐水中，其中1mL接种于另一种含有与初始培养基相同的烧瓶中。经过二次选择和富集的培养物在0-200rpm转速和10-30℃下培养1-14天。培养后，通过高速离心收集所选和富集细胞的整个菌群，在无菌生理盐水中洗涤两次，再重悬在5mL无菌生理盐水中。此选择过程可以在与初始培养基相同的培养基上再进行1-9轮富集。经过最后一轮富集后，将洗涤过的细胞团重悬在含有20％甘油的20mL生理盐水中，并充分混匀。然后将提取的1mL微生物组等份转移到20个无菌1.5mL试管中，加盖并在储存于-80℃下。1mL所选微生物组用于制备10-1-10-7的连续稀释液，这些稀释液的样品被涂在初次选择和二次选择的相同的培养基上，但需用琼脂固化，每个琼脂板在10-30℃下培养1-14天。培养后，检查培养皿中单个菌落的生长情况。
[0117] 2)将提取的菌种接种到以下任一培养基中：
[0118] (a)无氮复合碳培养基；
[0119] (b)添加色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙腈的无氮Dworkin和Foster培养基；或[0120] (c)添加1-氨基-L-环丙烷羧酸盐的无氮Dworkin和Foster培养基；或
[0121] (d)解磷生长培养基；或
[0122] (e)添加脱落酸的无碳Dworkin和Foster培养基；或
[0123] (f)添加一种或多种铅、镉、镍、锌、铜、钴、汞的葡萄糖酸盐培养基；或[0124] (g)含有6％氯化钠溶液的培养基；或
[0125] (h)添加任一有机污染物的无碳Dworkin和Foster培养基；或
[0126] (i)添加任一有机污染物的无氮Dworkin和Foster培养基；或
[0127] (j)添加任一有机污染物的无磷酸盐解磷生长培养基。
[0128] 该初次选择富集培养物在0-200rpm转速和10-30℃下培养1-14天，培养后，通过高速离心收集所选富集细胞的整个微生物组，在无菌生理盐水中洗涤两次，再悬浮于5mL无菌生理盐水中。这种初始富集培养物既可以在选择性固体培养基上进行分离，也可以在每轮中用不同的培养基进行1-9轮连续富集。培养基可以是：
[0129] (a)无氮复合碳培养基；或
[0130] (b)添加色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙腈的无氮Dworkin和Foster培养基；或[0131] (c)添加1-氨基-L-环丙烷羧酸盐的无氮Dworkin和Foster培养基；或
[0132] (d)解磷生长培养基：或
[0133] (e)添加脱落酸的无碳Dworkin和Foster培养基；或
[0134] (f)添加有一种或多种铅、镉、镍、锌、铜、钴、汞的葡萄糖酸盐培养基；或[0135] (g)含有6％氯化钠的培养基；或
[0136] (h)pH4或pH9的培养基；和/或
[0137] (i)添加任一有机污染物的无碳Dworkin和Foster培养基；或添加有任一有机污染物的无氮Dworkin和Foster培养基；或
[0138] (k)添加任一有机污染物的无磷酸盐解磷生长培养基。
[0139] 每种选择和富集的培养物在0-200rpm转速和10-30℃下培养1-14天。培养后，通过高速离心收集每一轮选择和富集细胞的整个微生物群，在无菌生理盐水中洗涤两次，再悬浮在5mL无菌生理盐水中。将洗涤过的颗粒重悬在含有20％甘油的20mL生理盐水中，并充分混合。提取1mL微生物组等份转移至20个无菌1.5mL试管中，加盖并储存于-80℃条件下。最-1 -7终选定的1mL功能性微生物组用于制备10 -10 的连续稀释液。这些稀释液的样品被涂在用于第三次选择所用的相同生长培养基上，但用琼脂固化。每个琼脂平板在10-30℃下培养
1-14天。培养后，检查平板是否有单个菌落生长。
1-14天。培养后，检查平板是否有单个菌落生长。
[0140] 使用高通量机器人菌落选择器，将每个菌落挑选并转移到含有营养肉汤的96微孔板中。微孔板在150rpm、20-30℃下培养24小时，选择在平板中生长良好的菌落进行储存和进一步表征。
[0141] 这些分离株将进行高通量筛选分析，以确定是否具有其他所需性状。筛选分析将确定是否具有以下性状，但并不局限于单个菌株：
[0142] ·ACC脱氨酶活性；
[0143] ·脱落酸降解；
[0144] ·磷酸盐增溶；
[0145] ·IAA量；
[0146] ·重氮营养活性；
[0148] ·重金属耐受性/溶解性/固定性。
[0149] 将上述一个或多个表现出较强活性的分离株纯化3-5次，并进行高通量筛选分析以确定所需特性。这些筛选分析将以以下性状为例，但不局限于单个菌株：
[0150] ·ACC脱氨酶活性；
[0151] ·脱落酸降解；
[0152] ·磷酸盐增溶；
[0153] ·IAA产量；
[0154] ·重氮营养活性；
[0155] ·有机污染物降解能力：挥发性有机化合物、多环芳烃、多氯联苯、原油、硝基芳烃、农药、氰化物；
[0156] ·重金属耐受性/溶解性/固定性。
[0157] 纯化后的分离株基于其16S rDNA全基因的测序和生物信息学分析鉴定，进行最低限度的革兰氏染色、内孢子染色和鉴定。
[0158] 富集的功能性微生物组、微生物或微生物群落可用于促进植物生长、植物和土壤健康、食品安全和生物修复。
[0159] 实例：
[0161] 虽然本发明已参照某些优选实施例进行了详细描述，但只是描述了本发明当前实施的最佳案例，因此本发明不限于这些实施例。鉴于本发明描述了当前实施的最佳模式，许多修改和变化将呈现给本领域技术人员，而不背离本发明的范围和精神。本发明属于权利要求书。
[0162] 实例1：构建特定地点的功能性微生物组，以筛选和鉴定对于在镉污染土壤上生长的水稻(Oryza sativa)具有有益性状的微生物
[0163] 镉污染耕地是我国面临的一个重大问题。它会影响水稻植株的生长，并通过水稻中镉的积累对食品安全构成威胁。希望应用本发明中特定地点功能性微生物组、微生物或微生物群落来提高水稻产量并减少水稻中镉的积累、保护食品安全和人类健康。
[0164] 从湖南省10个不同的稻田中采集水稻(Oryza sativa)植株和土壤样品，包括根际、根际土壤、叶际等完整植株，以包含具有多种有益性状的微生物。本过程的目的是从受影响农田的植物和土壤样品中提取、收集和储存尽可能多的微生物群。整个微生物群由来自植物不同部位的微生物组成，包括根际、根际土壤、叶际。来自受影响土地的土壤和植物样品被用作功能性微生物组的来源，用于选择和富集促进植物生长和耐重金属的微生物。
[0165] 步骤：从植物根部去除多余土壤，并保存起来以备将来分析使用。用无菌搅拌机将植株在含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液中匀浆，将均质植物样品转移到250mL离心管中，并在4℃腕式振荡器中摇10分钟。通过离心从样品中去除植物组织，并将上清液收集在离心管中。采用高速离心法采集上清液中的细菌细胞，将菌团清洗三次，然后重悬在无菌任氏液中。微生物也从大块土壤样本中采集。将1mL提取的微生物组保存在-80℃的90％甘油中，直到需要时取出。
[0166] 结果：构建了三种植物微生物组提取物，分别为MGSAMP005、MGSAMP006和MGSAMP008；构建了三种土壤微生物组提取物，分别为MGSAMPBS001.MGSAMPBS002和MGSAMP010。提取的微生物组保存在-80℃下。所有提取的微生物组都具有一个第一性状，以构建一个抗重金属功能性微生物组。随后，将抗重金属功能性微生物组与其他有益性状进行富集，构建具有多种性状的功能性微生物组，具体如下。
[0167] 构建抗重金属功能性微生物组─第一性状
[0168] 原理：大多数金属离子必须进入细菌细胞才能产生生理或毒性作用。许多二价金属阳离子(例如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+和Zn2+)的结构非常相似。此外，氧离子(如铬酸盐)的结构与硫酸盐相似，砷酸盐和磷酸盐也是如此。因此，要区分结构非常相似的金属离子，必须严格控制微生物的吸收系统。微生物利用由化学渗透梯度驱动的快速和非特异性的摄取系统横穿细菌胞质膜。这些吸收系统是结构性表达的，因此它们会导致重金属离子在微生物细胞内的积累。由于微生物细胞内高浓度的重金属离子具有极高的毒性，微生物会被迫产生金属离子稳态因子或抗金属因子。这些抗性因子编码的蛋白质在重金属污染环境中微生物生存的解毒机制中发挥重要作用。另一种摄取系统具有较高的底物特异性，反应速度较慢，通常以ATP水解作为能量源。相对于本质性表达的非特异性摄取系统，依赖于ATP的摄取系统是可诱导的。在细胞内，重金属离子的毒性可能通过将必需金属从其天然结2+
合点置换或配体相互作用产生的。重金属阳离子，特别是那些原子序数高的阳离子，如Hg 、Cd2+和Ag+，倾向于与SH基团结合。高磷酸盐含量的生长培养基可通过竞争摄取系统或与金属发生化学反应形成不溶性沉淀物，来干扰金属对细胞生理的毒性，从而降低金属的生物利用度。因此，本重金属富集试验使用低营养的三葡萄糖酸乙酯培养基。
合点置换或配体相互作用产生的。重金属阳离子，特别是那些原子序数高的阳离子，如Hg 、Cd2+和Ag+，倾向于与SH基团结合。高磷酸盐含量的生长培养基可通过竞争摄取系统或与金属发生化学反应形成不溶性沉淀物，来干扰金属对细胞生理的毒性，从而降低金属的生物利用度。因此，本重金属富集试验使用低营养的三葡萄糖酸乙酯培养基。
[0169] 方法：将各1ml的植物微生物菌种接种于添加有2mM Cd、Zn、Pb(CZL)的葡萄糖酸三乙酯培养基中。同时，将各1mL的土壤微生物菌种接种到相同的培养基中。培养基pH值在25℃下调整为6.5±0.2。浓缩液在27℃、100rpm转速下培养7天。培养后，转入250mL离心管中，在转速20000rpm、4℃下离心20min。取上清液，用无菌任氏液洗涤细胞团三次。最后一次洗涤后，将细胞团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等分试样，并储存在90％甘油中于-70℃下保存。保留1mL初始浓缩液，用于接种第二次浓缩液。将1mL的原始富集菌种接种于含CZL的新鲜葡萄糖酸三乙酯培养基中，并按上述方法培养。二次富集微生物组的收集和储存如上文所述，其中1mL的富集液被保留下来用于分离具有重金属耐受性的微生物。
[0170] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，然后用2mM CZL涂于葡萄糖酸三乙酯琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器对表现出大面积清除和明显变色的菌落进行筛选，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，平板在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0171] 构建产生ACC脱氨酶的功能性微生物组─第二性状
[0172] 原理：1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶通过隔离和裂解植物产生的ACC来促进植物生长，从而降低植物中的乙烯水平。乙烯水平的降低使植物更能抵抗各种各样的环境压力。已知只有不到10％的土壤或植物微生物具有ACC脱氨酶活性。本方法的目的是从具有ACC脱氨酶活性的植物微生物群落中选择或/和富集微生物。该方法的基本原理是：ACC脱氨酶分解ACC，生成酮丁酸和氨，这两种化合物可以被微生物用作碳和氮的来源。当生长在不含氮但添加ACC的培养基中时，只有那些具有ACC脱氨酶活性的微生物才能积极生长(尽管也可能存在具有替代脱氨酶的微生物)。
[0173] 方法：将1mL耐重金属植物功能性微生物菌种接种到以ACC盐酸为唯一氮源的DF培养基中。1mL的耐重金属土壤功能性微生物菌种接种到同一培养基中。将培养基的pH在25℃下调整为7.2±0.2。浓缩液在27℃和100rpm下培养7天。培养后，转移到250mL离心管中，在20000rpm、4℃下离心20分钟。取上清液，用无菌任氏液洗涤菌团三次。最后一次洗涤后，将菌团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等分试样，并储存在90％甘油中于-70℃下保存。保留1mL原始浓缩液，用于接种下一轮浓缩液。
[0174] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，然后用ACC涂于DF琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器对表现出大面积清除和明显变色的菌落进行筛选，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，平板在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0175] 构建产生吲哚-3-乙酸的功能性微生物组─第三性状
[0176] 原理：吲哚乙酸(IAA)是植物中最具生理活性的生长素之一。它刺激长根的产生，增加根毛和侧根数量，参与营养吸收，促进细胞伸长和调节细胞渗透潜能。IAA是植物生长促进菌(PGPB)等多种微生物产生的L-色氨酸代谢产物。PGPB中存在许多不同的IAA生物合成途径，一个细菌细胞也可能包含多个途径。此富集试验是基于这样一个事实，即在IAA的许多生产途径中，都有导致氨产生的途径，这种氨可以被微生物用作氮源。当生长在不含氮的培养基中，但在IAA通路中添加了各种中间产物时，只有那些具有积极表达IAA通路基因的微生物才能生长(尽管可能存在一些微生物，它们有可能释放氨或降解这些中间化合物的替代酶)。此富集试验中，三种IAA中间体，从三种不同的IAA生物合成途径中选择一种(或多种)来富集微生物。每一种化合物随后都被转化为IAA或IAA前体，并释放出氨。
[0177] 方法：将1mL重金属-ACC脱氨酶富集的植物功能性微生物菌种接种于以IAA中间体混合物为唯一氮源的DF生长培养基中。将1mL重金属-ACC脱氨酶富集的土壤功能性微生物菌种接种于同一培养基中。中间溶液由色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙腈组成。中间混合物在培养基中的最终浓度为4.5mM。在25℃下，培养基pH值调整为7.2±0.2。浓缩液在27℃和100rpm下培养7天。培养后，转移到250mL离心管中，以20000rpm、4℃离心20分钟。取上清液，用无菌任氏液洗涤三次细菌菌团。最后一次洗涤后，将细菌菌团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等份试样，并在储存在90％甘油中，并保存于-70℃下。保留1m此浓缩液，用于接种下一轮浓缩液。
[0178] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，然后用IAA中间体涂于DF琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器对表现出大面积清除和明显变色的菌落进行筛选，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，平板在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0179] 构建产生脱落酸的功能性微生物组─第四性状
[0180] 原理：植物激素脱落酸(ABA)是调节植物对胁迫适应的主要因子。脱落酸是在植物受到干旱和有毒化学物质等胁迫的根部产生的。它从根部通过蒸腾作用进入植物的叶子，在那里它与气孔保卫细胞上的受体结合，这导致保卫细胞失去牵引力或压力，导致气孔关闭和植物的蒸腾速率的降低。由于植物90％的水分吸收在蒸腾过程中丢失，这一过程使植物得以保持其水供应或减少对溶解性有毒污染物的吸收。然而，这也减少了对养分的吸收，从而限制了植物的生长。脱落酸还参与植物对其它胁迫的反应，如叶片脱落。根中脱落酸的减少已被证明能促进植物生长。此选择和富集试验是以脱落酸降解微生物作为唯一碳源的基础上进行的。当生长在无碳但添加有脱落酸的培养基中时，只有那些具有脱落酸降解活性表达基因的微生物才能生长。
[0181] 方法：将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA富集的植物功能性微生物菌种接种到添加10mg/ABA为唯一氮源的DF生长培养基中。将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA富集的土壤功能性微生物菌种接种于同一培养基中。浓缩液在27℃和100rpm下培养7天。培养后，转移到250mL离心管中，以20000rpm、4℃离心20分钟。取上清液，用无菌任氏液洗涤三次细菌菌团。最后一次洗涤后，将细菌菌团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等份试样，储存在90％甘油中，并保存于-70℃下。保留1mL此浓缩液，用于接种下一轮浓缩液。
[0182] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，然后用ABA接种到DF琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器选择菌落，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0183] 构建磷酸盐增溶功能性微生物组─第五性状
[0184] 原理：本过程的目的是筛选或富集提取的具有较强无机磷酸盐溶解能力的植物微生物群落。分析假设，在缺乏可溶性磷酸盐的情况下，只有那些具有溶解无机磷酸盐能力的微生物才能存活，并在生长培养基中得到富集。这些溶磷细菌的活性很可能将磷酸盐释放到培养基中，从而支持非溶磷细菌的生长。然而，与有效的增溶剂相比，它们的数量可能保持在较低水平。铁和铝化合物的存在，加上碱性pH值的存在，旨在限制被释放的磷酸盐在介质中保持可溶性的时间，从而减少非增溶剂的生长。
[0185] 方法：将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA-ABA富集的植物功能性微生物菌种接种到以磷酸三钙为唯一磷酸盐来源的解磷(NBRIP)生长培养基中。将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA富集的土壤功能性微生物菌种接种于同一培养基中。在25℃下，培养基pH值调整为8.0±0.2。浓缩液在27℃和100rpm下培养7天。培养后，转移到250mL离心管中，以20000rpm、4℃离心20分钟。取上清液，用无菌任氏液洗涤三次细菌菌团。最后一次洗涤后，将细菌菌团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等份试样，储存在90％甘油中，并保存于-70℃下。保留1mL此浓缩液，用于接种下一轮浓缩液。
[0186] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，然后用5mg/L溴酚蓝将其接种到NBRIP琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器选择菌落，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0187] 构建重氮营养功能性微生物组─第六性状
[0188] 原理：氮是植物生长发育的基本元素，也是植物生长的限制因素，它约占进入食物链的植物干物质总量的2％，然而，植物不能直接获得氮气，而氮气约占大气的80％。植物通过根部以铵和硝酸盐的形式吸收土壤中的有效氮。只有一些原核生物能够通过一种被称为生物固氮(BNF)的过程利用大气中的氮，即大气中的N2转化成植物可利用的NH3的一种形式。重氮营养菌是负责氮的细菌，它们对固氮酶进行编码，而酶复合体催化氮气转化为氨。本富集试验利用一种富含碳、不含氮的培养基，在缺氧条件下培养，以从植物微生物组提取物中选择并富集固氮微生物。
[0189] 方法：将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA-富磷富集的植物功能性微生物菌种接种到含5μg/mL生物素的复合碳源(CCM)生长培养基中。将1mL重金属-ACC脱氨酶-IAA-富磷富集的土壤功能性微生物菌种接种于同一培养基中。在25℃下，培养基pH值调整为7.2±0.2。浓缩液在密封容器中以27℃和100rpm培养7天。培养后，转移到250mL离心管中，以20000rpm、4℃离心20分钟。弃上清液，用无菌任氏液洗涤三次细菌团。最后一次洗涤后，将细菌菌团重悬在无菌任氏液中，分配成1mL的等份试样，储存在90％甘油中，并保存于-70℃下。
[0190] 将1mL浓缩的功能性微生物组连续稀释至10-6，并涂于CCM琼脂上。平板在20℃下培养5天。用Qpix菌落选择器选择菌落，并转移到含有营养肉汤的96微孔板中，在20℃下培养5天。检查平板的生长情况，并用Qpix菌落选择器创建一个包含了正在生长的培养皿的压缩库。将平板储存于90％甘油中，一式三份，并于-70℃下保存，直到需要时取出。
[0191] 结果
[0192] 从三种植物和三种土壤微生物群提取液中，构建功能微生物群，且每轮富集过程都有保存。共分离出1400种微生物，未经纯化，详见表1至表6。
[0193] 表1 MGSAMP005的细菌微生物群多重性状和重金属耐受性
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202] 表2 MGSAMP006的细菌微生物群多重性状和重金属耐受性
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214] 表3 MGSAMP008的细菌微生物群多重性状和重金属耐受性
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228] 表4 MGSAMPBS001的细菌微生物群多重性状和重金属耐受性
[0229]
[0230]
[0231]
[0232] 表5 MGSAMPBS002的细菌微生物群多重性状和重金属耐受性
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237] 表6 从MGSAMPBS010分离到的细菌微生物群的多重性状和重金属耐受性[0238]
[0239]
[0240]
[0241] 表7显示了每个样本中具有1、2、3、4或5个性状的分离株的百分比。
[0242] 表7 从每个检测点分离出的具有多种有益性状的菌株的百分比
[0243]
[0244]
[0245] 当通过CFM过程进行分离时，更容易分离出大量具有多种有益特征的微生物。这种高通量筛选过程短时间内捕获和筛选的菌株数量明显高于传统的筛选过程。结果表明，20％以上的植物微生物分离株具有5个性状。从土壤中分离出的微生物有三个性状。通过CFM过程，84％的土壤分离株具有两个或两个以上的性状。其中2000株可能具有多达5个有益特征，这表明该过程增加了成功分离出在环境中发挥重要作用的微生物的可能性。
[0246] 一个由478个对2mM CZL有耐受性的积极生长的微生物组成的菌种库被分离出来，并被储存起来进行进一步的测试。由184个溶磷微生物组成的菌种库被分离出并保存以备进一步测试。从富集的微生物组中分离出186个活跃生长的微生物。共分离出276株ACC降解菌。
[0247] 分离纯化和鉴定
[0248] 从最终富集的植物和土壤功能性微生物组中分离出478株微生物，从植物微生物群中分离出189株。通过其溶磷能力和额外的多重性状将这些植物微生物组分离株整合。为了确定每个分离株的MIC值(最低抑菌浓度)，用96孔板接种含有TG培养基的QTrays，并在27℃培养48小时。在QTrays上观察细菌生长情况，以确定MIC值。
[0249] 共有138株重金属耐受菌株能够溶解PO4，47.1％的分离株具有两个或两个以上的多重性状，共有51株重金属分离株不是PO4可溶性菌。通过将单个菌落连续接种到含2mM镉的LB培养基上，纯化出具有较高耐镉水平和多种性状的非PO4增溶菌株。在纯化后，我们检测了这些分离株的多重特性，并选择其中45株分离株进行16S rRNA鉴定(表8)。
[0250] 表8纯化的重金属耐受性菌株，16S鉴定，镉最低抑菌浓度，脲酶活性和多重性状[0251]
[0252]
[0253]
[0254] 尿素酶诱导微生物方解石沉淀能力的筛选
[0255] 对所选分离株产生尿素酶的能力进行了检测，筛选出稳定镉的潜在分离株。产生尿素酶的细菌能水解尿素。由于这种酶促反应，培养基的pH值将增加，产生碳酸盐，从而使培养基中的可溶性重金属离子矿化。选择45株菌株用酚红尿素琼脂平板培养。在30℃下培养，24小时和48小时后检查其生长和变色情况。从黄色到红色/深紫色的颜色变化表明碳酸盐是尿素水解的副产物。
[0256] 如表8所示，45个分离株中24个在24小时后产生尿素酶，45个分离株中44个在48小时培养后产生尿素酶。这些产生尿素酶的分离株具有稳定镉的潜在能力。
[0257] 细菌分离物对镉吸收的测定
[0258] 以实验室为基础的生物测定法测定了所选微生物对镉的吸收水平。将细菌菌株接种到含有50ppm镉的100ml lb肉汤中，并在28C下培养24小时。为了测定溶解的镉含量，细菌培养物在2000转/分，10℃下离心2小时。过滤上清液，用硝酸(最终浓度5.0％v/v)酸化，用原子吸收光谱法分析。以50ppm镉无菌肉汤为对照，采用原子吸收分光光度法进行酸化分析。上清液中镉含量越低，细菌的积累能力越强。
[0259] 如表9所示，对于所有被检测的分离株，上清液中溶解的cd水平都降低了。细菌分离株MBPL018和MBPLO24对镉的抑制能力最强，上清液中镉含量分别降低了4.5lppm和3.4lppm。
[0260] 表9：菌株的镉还原吸收水平-上清液中溶解的镉水平
[0261]
[0262] 细菌对水稻生长发育的影响
[0263] 研究了45株细菌分离株对水稻生长发育的影响，以及对水稻种子萌发和生物量的影响。
[0264] 细菌对水稻发芽的影响
[0265] 将水稻种子浸入培养24小时的菌液(细菌浓度为108CFU/ml)中浸种60分钟。在9cm培养皿中进行发芽试验，培养皿中含有20ml无菌水和12粒水稻种子。在每个培养皿中接种1ml 108CFU/ml菌液(最终细菌浓度10^6cfu/ml)。每种菌株三次重复。浸种后的种子放在LB培养基上作为对照。培养皿用封口膜密封，防止过度蒸发。种子在30℃黑暗中孵育4天后评估发芽率。
[0266] 对照组平均发芽率为63.89％(SE＝±2.27)。45个分离株中有8个显著提高了10％的发芽率。与对照组相比，所有菌株对种子萌发均无明显的抑制作用。
[0267] 细菌分离物对水稻苗期早期发育的影响
[0268] 在细菌分离株(106CFU/ml)存在下，幼苗发育7天时观察细菌分离株对幼苗早期发育的影响。在30℃、黑暗条件下孵育7天后，对种子进行拍照，并测定每个重复的种子的累积生物量。测定每个分离株各重复的平均生物量，并与对照组进行比较，以确定任何抑制或促进作用。
[0269] 生长7天后，在45株细菌中，有9株的生物量增加了16％。其余36株对水稻幼苗发育无明显的抑制作用。
[0270] 水稻自然镉污染土壤中对植物生长促进作用和镉稳定能力的测定
[0271] 为研究细菌对镉污染土壤中水稻植株和镉稳定能力的影响，将5天龄的水稻幼苗种植在从中国湖南取的镉污染土壤中。将1毫升由8个分离株组成的细菌组合(表10)接种到装有水稻幼苗的盆栽中。对照以1毫升的无菌水代替。在生长室中培养，收获20天龄的幼苗，测定其生物量。对植物进行烘干、匀浆消化，用原子吸收光谱法测定了细菌接种处理和对照中水稻根、叶中镉的含量。
[0272] 表10 用于水稻苗期稳定镉的菌种组合
[0273]
[0274] 细菌处理植株的平均苗长比对照植株长128.6％。此外，细菌处理植物的鲜重也有类似的增加，与对照幼苗相比，鲜重增加了123.3％。原子吸收光谱分析表明，未接种植物根、叶样品的镉含量(分别为0.222和0.248)明显高于未接种植物根、叶样品(分别为0.006和0.006)。将进行大规模的温室和田间试验，以优化微生物接种剂。
[0275] 水稻幼苗在细菌接种盆栽中的成活率为83％，对照盆栽中的成活率仅为33％。与对照相比，细菌联合接种水稻植株的鲜重增加了123.3％。细菌处理植株的平均苗长比对照植株长128.6％。原子吸收光谱分析表明，对照的水稻根、叶样品中镉含量分别为0.222和0.248，接种细菌的水稻根、叶样品中镉含量分别为0.006(SE＝±0.003)。本研究数据显示，水稻植株镉含量下降97％。
[0276] 以上结果证明，本发明即功能性微生物组构建技术能够在3-6个月内优化出微生物和微生物组合并对特定的植物针对特定地点进行多次有益试验。
[0277] 此外，本实施案例中所鉴定的微生物可用于构建微生物产品，以促进水稻植株生长，减少镉在籽粒中的积累，以保护食品安全。
[0278] 此外，研究结果还表明，微生物组合是在同一土壤中筛选到的微生物组合而成，微生物间有协同和促进作用，更有利于各自发挥出有益的作用。这些微生物组可为特定地点的土壤或条件类似的土壤开发出有效的产品。
[0279] 实施案例2：在田间试验中应用构建的功能性微生物组过程来鉴定能够促进玉米产量的微生物
[0280] 从我国北方玉米种植地采集土壤和植物样品。应用以下构建的功能性微生物群过程，从玉米植株中鉴定出两个具有多种有益性状的内生细菌菌株：
[0281] ·采集玉米植株样品、根际和大田土壤
[0282] ·将微生物释放到液体培养基中
[0283] ·在以IAA中间体混合物为唯一氮源的DF生长培养基中富集上述微生物培养物，以构建能够产生IAA的功能性微生物组。
[0284] ·在以盐酸ACC为唯一氮源的DF生长培养基中富集上述IAA产生微生物组，以构建ACC产生功能性微生物组。
[0285] ·在以添加10mg/LABA为唯一碳源的DF生长培养基中富集ACC产生功能性微生物组，构建ABA产生功能性微生物组。在以添加磷酸三钙为唯一磷酸盐来源的解磷(NBRIP)生长培养基中富集ABA产生功能性微生物组，以构建磷酸盐增溶功能性微生物组。
[0286] ·在含有5μg/ml生物素的复合碳源(CCM)生长培养基中富集ABA产生功能性微生物组，来构建重氮营养功能性微生物组。
[0287] ·从上述构建的具有多种有益特性的功能性微生物组中分离微生物菌落。
[0288] ·无需进一步分离，就可以从菌落中检测出一种或多种具有有益特性的微生物。
[0289] ·测试具有多种有益性状的纯化微生物。
[0290] 通过16S-RNA测序，筛选出了表现最佳的多性状微生物MB609和MB806，分别为假单胞菌和固氮螺菌，并对其在中国北方进行了田间试验。
[0292] 玉米种子用MB609(1x107/ml)和MB806(1x107/ml)的混合液进行包衣。包衣玉米种子和无包衣玉米种子均在10×7.5米的地块上播种，随机区组排列。每处理8个重复试验田。收获后，测量各处理的玉米产量，如表11所示。在化肥施用量为100％的条件下，CMF选择的微生物菌剂包衣种子产量提高10.53％。经微生物菌剂包衣处理的玉米，在降低30％和50％的施肥量的情况下比未经微生物菌剂包衣处理的100％施肥的产量高。
[0293] 表11 各处理玉米产量
[0294]
[0295] NR：不相关
[0296] 这一结果表明，本发明的方法能够获得促进植物生长，减少化肥施用的微生物，有利于环境和经济效益。
[0297] 实施例3：在盐渍土壤条件下应用特定的功能性微生物组降解有毒有机化合物并促进黑麦草生长
[0298] 从中国5个受原油影响的农田采集野生植物样品和散装土壤。土壤中总石油烃(TPH)的平均水平为2000ppm，由独立认可的实验室进行分析。平均盐含量为1.5％。以收集的土壤和植物样品作为构建功能微生物组和鉴定多功能微生物的来源。过程如下所示：
[0299] ·采集玉米植株样品、根际和块状土壤。
[0300] ·将存在于野生植物、根际和块状土壤中的微生物释放到液体培养基中。
[0301] ·在添加了原油提取物的Dworkin和Foster最低限量培养基中富集上述培养物，构建TPH降解功能性微生物组。随后，在相同的培养基中再进行2-5轮富集培养。
[0302] ·在以IAA中间体混合物为唯一氮源的DF生长培养基中富集上述TPH降解微生物培养物，构建产生IAA的功能性微生物组。
[0303] ·在以盐酸ACC为唯一氮源的DF生长培养基中富集上述IAA产生菌群，构建产生ACC的功能性微生物组。
[0304] ·在以添加10mg/LABA为唯一碳源的DF生长培养基中富集ACC功能性微生物组，构建产生ABA的功能性微生物组。在以磷酸三钙为唯一磷酸盐来源的解磷(NBRIP)生长培养基富集ABA产生的功能性微生物组，以构建磷酸盐增溶功能性微生物组。
[0305] ·在含有5μg/ml生物素的复合碳源(CCM)生长培养基中富集产生ABA的功能性微生物组，来构建重氮营养功能性微生物组。
[0306] ·将重氮营养功能性微生物组富集到添加了150mM氯化钠的营养肉汤中，构建耐盐功能性微生物组。
[0307] ·在添加了原油提取物的Dworkin和Foster最低限量培养基中富集上述培养物，以构建最终的TPH降解功能性微生物组。(适用于黑麦草盆栽)
[0308] ·从上述构建的具有多种有益性状的功能性微生物组中分离微生物菌落。
[0309] ·不需要进一步分离，就可以从菌落中检测出一种或多种具有有益特性的微生物。
[0310] ·测试具有多种有益性状的纯化微生物。
[0311] 采用16S rRNA测序法鉴定了42株具有多种性状的细菌，如表12所示。
[0312] 表12 分离微生物的鉴定
[0313]
[0314]
[0315] ID：基于RDPⅡ数据库中最接近16S rRNA序列的假定ID
[0316] 通过温室试验，研究了微生物和功能性微生物组对TPH的降解和促进黑麦草(Lolium perenne L.)生长的能力，对国内同一地点取得的20kg的TPH污染土壤，24小时风干，2mm筛筛除碎石和杂物，混合均匀。分装为20盆，每盆1kgTPH污染土壤。最后利用功能性微生物组和另外两个微生物组进行接种。微生物组1含有从同一TPH污染土壤中分离出的MB3C10、MBF3F10、MB3H10、MB3H02、MB4E09、MB4G07。微生物组2包含6种具有TPH降解和植物生长促进特性的微生物，分别是从Microgen Biotech微生物菌种库中筛选出的MB0113、MB0321、MB004、MBS001、MBS007、MBS129。5盆接种最终富集的TPH降解功能性微生物组，施用量为107/g土壤，每盆接种15粒黑麦草种子，种子用相同的功能性微生物组包衣；5盆接种从污染土壤中分离出的微生物组1，按107/g土壤施用量，每盆播种15粒黑麦草种子，种子用相同的微生物组包衣；5盆接种微生物组2，每盆播种15粒黑麦草种子，种子用相同的微生物组包衣；其余5盆用于对照，无需接种微生物，每盆种15粒黑麦草。在温室条件下(24℃下16小时，16℃下8小时)栽培12周，每周浇3次水。在试验结束时，测定不同盆栽条件下植物和土壤中TPH的浓度，结果如表13所示。黑麦草植株在对照盆栽中的生长受高盐和高TPH污染的影响。黑麦草植株地上部没有TPH的积累。与对照相比，加入土壤微生物的处理降解TPH的效果明显。黑麦草植株接种构建的功能性微生物组和两种微生物组合后，对其生长有显著促进作用，如表13所示，降解和促生效果依次为功能性微生物组>微生物组1>微生物组2。
[0317] 表13 微生物接种对黑麦草生长和土壤中TPH降解的影响
[0318]
[0319]
[0320] 这一结果表明，本发明的方法能够获得能促进黑麦草生长，同时降解污染土壤中的TPH的微生物组。
[0321] 此外，研究结果表明，从土壤中筛选获得的微生物组和功能性微生物组来修复同一土壤时表现非常好。微生物组可以为特定地点的土壤或类似的土壤条件开发出有效的产品。
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