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ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产量中的应用

阅读：151发布：2020-05-12

专利汇可以提供ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产量中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产量中的应用。ZmNAC89转录因子基因位于玉米7号染色体Bin7.05区域，受到NaCl、Na2CO3、ABA和PEG等胁迫后，其表达量显著升高。该基因全长2280bp，包括3个外显子和2个内含子；开放阅读框为1197bp，编码398个氨基酸，5′-UTR区为163bp，3′-UTR区为253bp；编码蛋白具有NAM蛋白保守结构域；启动子包含非生物逆境胁迫相关元件，属于胁迫诱导型启动子；转化ZmNAC89基因的玉米耐盐碱能力显著提高，盐碱条件下种植百粒重显著增加。本发明为通过转基因方法提高玉米耐盐碱能力，进而提高盐碱地玉米产量提供了有效的途径。，下面是ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产量中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.ZmNAC89转录因子基因在提高玉米耐盐碱性中的应用。
2.ZmNAC89转录因子基因在提高盐碱地玉米产量中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的ZmNAC89转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种获得耐盐碱转基因玉米的方法，其特征在于，包括将克隆有ZmNAC89转录因子基因的载体转化玉米外植体的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的转化采用农杆菌转化法。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的克隆有ZmNAC89转录因子基因的载体为克隆有ZmNAC89转录因子基因的pT-35S-Hsp质粒，命名为pT-ZmNAC89。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的外植体为玉米幼胚。
8.如权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：取授粉9-13d的玉米果穗，用75％酒精消毒5min，更换新的75％酒精消毒15min，用手术刀尖端挑出1-3mm的幼胚；用含有pT-ZmNAC89质粒的农杆菌菌液侵染5min，侵染结束后用无菌滤纸吸净幼胚上多余的菌液，然后放在共培养培养基表面，19℃暗培养3d；之后将幼胚转移到恢复培养基上，在28℃的暗培养7d；再将幼胚转移至含1.5mg/L双丙氨磷筛选培养基上培养2周，长势较好的愈伤组织移至新的筛选培养基，双丙氨膦增加到3mg/L；将胚性抗性愈伤组织移至分化培养基上暗培养2周，移至光照条件下进行芽的分化；形成完整植株时移接至生根培养基生根壮苗；植株长至4-6cm根系充分发育时，将转化苗用清水洗掉培养基后移栽到花盆中，花盆下部为土壤，上部为6-8cm厚的蛭石，放在培养室中26℃/22℃(白天/晚上)16h光照，8h黑暗；2-3周后转化苗长至三叶期，喷施除草剂草丁膦进行筛选，浓度为1‰w/w，经过筛选后将存活的植株移栽到温室中，提取叶片总DNA，PCR检测，阳性植株严格套袋自交，收获种子。

说明书全文

ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产

量中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及ZmNAC89转录因子基因的克隆及其在提高玉米耐盐碱性和产量中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 转录因子是一类参与真核细胞转录调控的、存在于不同动植物体内的蛋白分子，能够与转录起始位点上游特异作用元件结合从而调控目标基因的时空表达，激活或抑制转录过程。当植物在生长发育过程中受到如干旱、高盐、低温、病原菌等各种生物和非生物逆境胁迫时，通过信号传导途径，诱导转录因子与顺式作用元件特异结合，从而激活RNA聚合酶II复合物，诱导植物抗性基因的转录和表达，通过基因产物改变植物对环境的适应。植物中存在着大量的转录因子，如模式植物拟南芥中含有2500个转录因子。与逆境胁迫相关的转录因子主要有 MYB、bZIP、WRKY、DREB和NAC等；其中，NAC转录因子是植物中特有的，具有多种生物功能的转录因子。在干旱、高盐等非生物逆境胁迫信号调控网络中， NAC转录因子发挥着重要作用。

[0003] NAC转录因子的命名是根据NAM、ATAF1/2和CUC2三个基因的首字母缩写而成。Souer等(1996年)从矮牵牛(Petunia hybrida)中克隆第一个NAC转录因子基因NAM(No Apical Meristem)，与茎尖分生组织的发育有关；随后，Aida 等(1997年)在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现了与NAM结构类似的ATAF1/2 和CUC2转录因子基因。虽然NAM、ATAF1/2和CUC2三个基因的功能不同，但 N-末端氨基酸序列高度保守，即为NAC结构域。

[0004] NAC转录因子的经典结构是由高度保守的N-末端NAC结构域(由150个氨基酸残基组成)与多样的C-末端转录激活调控域组成。N-末端NAC结构域进一步划分为A、B、C、D、E五个亚结构域；A、C、D亚结构域高度保守，其中A 亚结构域与功能二聚体的形成有关，C、D亚结构域中包含核定位信号，与启动子特异组件结合有关；B和E亚结构域保守性不强，可能与NAC转录因子功能多样性有关。C-末端的转录激活调控域高度发散，富含Thr、Glu、Ser、Pro等氨基酸；存在较多简单序列，结构不稳定，易发生蛋白互作。除此之外，部分NAC 转录因子具有其它结构。通过基因组分析发现，至少有13个拟南芥与6个水稻 NAC家族基因在C-末端含有一个α-螺旋结构的跨膜结构域，基因功能与细胞内膜形成有关；在苔藓(Physcomitrella patens)和卷柏属(Selaginella moellendorffii) 植物中发现，NAC蛋白只编码NAC结构域；JENSEN等(2010年)通过系统发育分析表明，有5个NAC转录因子基因在拟南芥的花序与果实中共表达编码两个重复串联的NAC结构域；拟南芥中的SOG1基因在NAC结构域前编码一个 N-末端扩展区，拟南芥NAC家族中的7个成员N-末端扩展区由大约40个氨基酸残基和一对保守的半胱氨酸残基组成；VOZ蛋白的N-端是转录激活调控域，而C-端是NAC结构域，中间由DNA结合位点锌指蛋白连接。

[0005] NAC转录因子存在于众多植物中，全基因组测序发现，模式植物水稻(Oryza sative)和拟南芥中分别有151和117个NAC转录因子基因；白杨(Populus trichocarpa)中有163个，葡萄(Vitis vinifera)中有79个；大豆(Glycine max L.) 和烟草(Nicotiana tabacum)中均有152个NAC转录因子。玉米NAC转录因子基因不均衡地分布在玉米10条染色体上，参与植物的生长发育、抗逆性、衰老及渗透胁迫等生物进程。张进艳等(2014年)将从PlantTFDB数据库中搜索到的 177个玉米NAC转录因子基因进行多重序列比对，同18个水稻、拟南芥中的同源NAC转录因子基因进行系统进化分析，将177个玉米NAC转录因子基因分为 2大类共5个亚族(NAC-I、NAC-II、NAC-Ⅲ、NAC-Ⅳ和NAC-Ⅴ)。其中， NAC-I亚族成员可能参与玉米生长发育；NAC-Ⅳ亚族可能与逆境胁迫相关。 PENG等(2015年)利用Blast search工具在玉米全基因组中搜索到148个NAC 转录因子基因，命名为ZmNAC1–ZmNAC148，通过系统进化分析，将其分为12 组(a-l)，染色体定位结果表明，玉米中148个NAC转录因子基因无规则地分布在10条染色体上。周佳婧等(2017年)通过生物信息学的方法将190个玉米NAC 转录因子基因分成13个亚族，并进行功能预测，发现有29个可能参与玉米的生长发育，27个可能与抗逆相关，6个可能参与玉米的衰老和胁迫渗透]。

[0006] 目前，已克隆出一些玉米NAC转录因子基因，部分基因的表达模式、生物功能和调控机制已得到了初步验证，如ZmNAC1、ZmNAC99及ZmSNAC1基因，均受干旱、高盐、低温及ABA信号的诱导表达，可能在植物抗逆中发挥重要作用。拟南芥中的OST1基因通过调控气孔关闭应对干旱胁迫，玉米中OST1的同源基因ZmOST1在拟南芥ost1突变体中异位表达，可以修复气孔关闭表型响应干旱胁迫；ZmNAC1基因结合ZmOST1基因的ABA盒子，在ABA激活SnRK2s过程中高度保守，负向调控PP2C磷酸酶结合位点。在水分胁迫下过表达ZmNAC111 基因能够增强转基因玉米在苗期的耐旱性，提高水分利用效率，并诱导干旱响应基因表达上调；通过全基因组关联分析发现，82bp的微型反向重复转座元件 (MITE)插入到该基因的启动子中，通过RNA介导DNA甲基化及H3K9二甲基化作用的途径，抑制基因的表达。Zhu等(2016年)发现ZmNAC基因通过调节ABA诱导的NAPDH 氧化酶基因的表达，参与调节玉米叶片原生质体中H2O2的产生，同时影响抗氧化防护酶基因的表达和酶活性，参与ABA诱导的抗氧化防护依赖于玉米Ca2+/CaM依赖蛋白激酶ZmCCaMK基因，具有磷酸化作用。过表达ZmNAC基因通过依赖或部分依赖于ABA信号转导途径显著增强转基因烟草的耐旱性及耐盐性。在拟南芥中过表达与玉米干旱胁迫相关的ZmNAC55基因能够增强幼苗对ABA的敏感性，提高植株的耐旱性，并正向调控12个与干旱响应相关基因DREB2A、RD29A、RD29B、LEA14、RD26、RD17、PP2CA、ZAT10、 RAB18、ANAC019、NCED3和RD20的表达。王敏等(2013年)从玉米自交系B73 中克隆得到膜结合NAC转录因子ZmNTL1基因，正向调控拟南芥Zn转运体ZAT 基因，调节Zn平衡，过表达该基因能提高转基因拟南芥对干旱及盐胁迫的耐受性。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一在于提供一种新型的玉米耐盐碱相关转录因子基因。

[0008] 本发明的目的之二在于提供所述的转录因子基因在提高玉米耐盐碱性中的应用。

[0009] 本发明的目的之三在于提供所述的转录因子基因在提高盐碱地玉米产量中的应用。

[0010] 本发明的目的之四在于提供一种获得耐盐碱转基因玉米的方法。

[0011] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

[0012] 本发明提出了ZmNAC89转录因子基因在提高玉米耐盐碱性中的应用。

[0013] 进一步的，本发明还提出了ZmNAC89转录因子基因在提高盐碱地玉米产量中的应用。

[0014] 其中，优选的，所述的ZmNAC89转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

[0015] ZmNAC89转录因子基因位于玉米7号染色体Bin7.05区域，受到NaCl、 Na2CO3、ABA和PEG等胁迫后，其表达量显著升高。基因全长2280bp，包括3 个外显子和2个内含子；开放阅读框为1197bp，编码398个氨基酸，5′-UTR区为163bp，3′-UTR区为253bp；编码蛋白具有NAM蛋白保守结构域；启动子包含非生物逆境胁迫相关元件，属于胁迫诱导型启动子；转化ZmNAC89基因的玉米盐碱能力显著提高。

[0016] 更进一步的，本发明还提出了一种获得耐盐碱转基因玉米的方法，包括将克隆有ZmNAC89转录因子基因的载体转化玉米外植体的步骤。

[0017] 其中，优选的，所述的转化采用农杆菌转化法。

[0018] 其中，优选的，所述的克隆有ZmNAC89转录因子基因的载体为pT-35S-Hsp 质粒，命名为pT-ZmNAC89。

[0019] 其中，优选的，所述的外植体为玉米幼胚。

[0020] 其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：取授粉9-13d的玉米果穗，用 75％酒精消毒5min，更换新的75％酒精消毒15min，用手术刀尖端挑出1-3mm 的幼胚；用含有pT-ZmNAC89质粒的农杆菌菌液侵染5min，侵染结束后用无菌滤纸吸净幼胚上多余的菌液，然后放在共培养培养基表面，19℃暗培养3d；之后将幼胚转移到恢复培养基上，在28℃的暗培养7d；再将幼胚转移至含1.5mg/L 双丙氨磷筛选培养基上培养2周，长势较好的愈伤组织移至新的筛选培养基，双丙氨膦增加到3mg/L；将胚性抗性愈伤组织移至分化培养基上暗培养2周，移至光照条件下进行芽的分化；形成完整植株时移接至生根培养基生根壮苗；植株长至
4-6cm根系充分发育时，将转化苗用清水洗掉培养基后移栽到花盆中，花盆下部为土壤，上部为6-8cm厚的蛭石，放在培养室中26℃/22℃(白天/晚上)16 h光照，8h黑暗；2-3周后转化苗长至三叶期，喷施除草剂草丁膦进行筛选，浓度为1‰w/w，经过筛选后将存活的植株移栽到温室中，提取叶片总DNA，PCR 检测，阳性植株严格套袋自交，收获种子。

[0021] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：

[0022] 本发明提出了一种能够提高玉米耐盐碱能力的新型转录因子基因，通过转基因方法提高玉米耐盐碱能力，进而为提高盐碱地玉米产量提供了有效的途径。附图说明

[0023] 图1为Fgenesh预测基因结果；

[0024] 图2为NaCl胁迫处理下ZmNAC89基因在叶片与根部的表达量；

[0025] 图3为Na2CO3胁迫处理下ZmNAC89基因在叶片与根部的表达量；

[0026] 图4为ZmNAC89基因测序结果比对；

[0027] 图5为植物表达载体pT-ZmNAC89物理图谱；

[0028] 图6为T0代转基因株系ZmNAC89基因检测；

[0029] 注：M：DNA Marker(DL 2000)；W：空白对照；P：阳性对照；N：阴性对照；1-38：转基因植株；

[0030] 图7为部分T0代转基因株系Bar基因试纸条检测；

[0031] 注：C01：非转基因株系；1-17：转基因植株。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

[0033] 实施例1.玉米抗逆相关转录因子基因ZmNAC89基因的生物信息学分析

[0034] 项目组前期研究中，以耐盐碱玉米自交系K10为试材，采用二代高通量测序 RNA-Seq方法进行盐碱胁迫应答转录组分析，发现1个差异表达基因具有NAC转录因子的特征，位于玉米7号染色体。依据Voitsik等(2013年)报道中的命名方式，这个基因命名为ZmNAC89。ZmNAC89基因在MaizeGDB数据库中的检索号是 GRMZM2G430849，在NCBI数据库中的检索号是XM_008653325.1。以MaizeGDB 数据库中玉米自交系B73 RefGen_v 2的全基因组序列为参考，截取MaizeGDB中该参考序列(Chr7:173514759..173517298)前后各3000bp (Chr7:
173511759..173520298)共8540bp的核苷酸序列作为研究对象，以Monocot plants作为参照，利用在线预测软件FGENESH对该8540bp核苷酸序列进行基因预测。利用相关数据库及生物学软件对ZmNAC89基因进行分析，主要内容如下：

[0035] (1)在线使用ORF Finder确定ZmNAC89基因ORF位置及编码蛋白产物大小；

[0036] (2)CD-search搜索ZmNAC89蛋白保守结构域；

[0037] (3)Protparam分析ZmNAC89蛋白的基本理化性质；

[0038] (4)Clustal W软件进行ZmNAC89蛋白同源比对，MEGA 5.0软件构建系统进化树；

[0039] (5)PSORT进行亚细胞定位预测；

[0040] (6)PlantCARE分析ZmNAC89基因侧翼序列顺式作用元件。

[0041] 1.基因的结构

[0042] 截取MaizeGDB数据库中玉米自交系B73中ZmNAC89基因参考序列 (Chr7:173514759..173517298)前后各3000bp(Chr7:173511759..173520298)共8540bp的核苷酸序列作为研究对象，利用在线预测软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行分析，获得1个完整的基因结构。该基因位于负链上，全长2280bp，转录起始于5534bp，终止于3255bp，具有典型的加尾信号。包含两个内含子，三个外显子，其中外显子1全长669bp(3417bp-4085bp)，外显子2全长315bp (4713bp-5027bp)，外显子3全长201bp(5123bp-5323bp)，如图1。

[0043] 2.基因编码的氨基酸序列分析

[0044] 利用ORF Finder软件分析ZmNAC89基因的开放阅读框，该基因包含一个1197 bp的完整开放阅读框，编码398个氨基酸，起始于141bp，终止于1337bp，5′-UTR 区为211bp，3′-UTR区为162bp。

[0045] 3.基因编码蛋白保守结构域分析

[0046] 利用NCBI中的CD-search搜索ZmNAC89基因编码蛋白的保守结构域。结果表明，ZmNAC89蛋白在N-端具有一个保守的NAM蛋白结构域，位于22aa-148aa。NAM蛋白属于NAC蛋白家族成员，在植物生长发育过程中起调节作用，其结构高度保守，矮牵牛的NAM突变体不能形成茎的顶端分生组织，且通过研究发现 NAM基因在花分生组织的器官原基的配置中具有重要作用，分析结果进一步证明了ZmNAC89蛋白是一个典型的NAC家族蛋白。

[0047] 4.基因编码蛋白理化性质分析

[0048] 采用ExPASy Protparam对ZmNAC89蛋白进行基本的理化性质的预测和分析 (见表1)。结果表明：蛋白共包含398个氨基酸残基，相对分子量为41.8484kD，等电点9.19，为碱性蛋白；一共5911个原子，包括C(1786)、H(2967)、N(619)、 O(532)和S(7)，理论半衰期30h，不稳定参数63.76，是不稳定蛋白，带正电荷氨基酸(Arg、Lys)56个，带负电荷氨基酸(Asp、Glu)51个。DNA Tool 6.0 软件分析了ZmNAC89蛋白的氨基酸组成，结果显示，其中包含中性疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸，含量分别为43.9％、37.8％、
12.8％、 18.6％。说明该基因编码蛋白为具有一定疏水能力不稳定的碱性蛋白。

[0049] 表1 ZmNAC89蛋白的氨基酸组成

[0050]

[0051] 4.蛋白序列比对

[0052] NAC转录因子由高度保守的N-末端结构域和高度分化的C-末端调控域组成，N-末端区域包含5个亚结构域(A、B、C、D、E)，为全面分析玉米耐盐碱基因ZmNAC89编码蛋白的结构特征，本研究根据NCBI网站上公布的基因组数据，选择了水稻、拟南芥、大豆、大麦及小麦等不同植物中的31条NAC蛋白(见表2)，利用Clustal W软件进行同源序列比对。比对结果显示，ZmNAC89蛋白包含一个典型的NAC保守结构域，与31种NAC蛋白在N-末端结构域具有相同的5个亚保守结构域(A、B、C、D、E)；ZmNAC89蛋白与拟南芥AtNAP蛋白同源性最高，AtNAP蛋白属于NAC转录因子家族成员，在盐胁迫应答机制中具有重要作用，并与叶片衰老有关。

[0053] 表2用于序列比对的NAC转录因子类蛋白

[0054]

[0055]

[0056] 5.亚细胞定位预测.

[0057] 进入Psort数据库对ZmNAC89基因编码蛋白进行亚细胞定位预测(见表3)。结果显示，该蛋白最可能定位于细胞核上，可信度为0.98，在线粒体基质和叶绿体类囊膜上也有分布，但可信度较低。

[0058] 表3 ZmNAC89蛋白亚细胞定位预测

[0059]

[0060] 6.ZmNAC89基因侧翼序列分析

[0061] 利用P1antCARE软件分析ZmNAC89基因起始密码子上游约1500bp的侧翼序列。结果发现，ZmNAC89启动子中具有CAAT-box和TATA-box等核心元件，还具有许多与生物及非生物胁迫相关的元件，如：与低温胁迫相关的LTR元件，调控ABA反应的ABRE元件，干旱胁迫诱导的MYB转录因子结合位点以及厌氧诱导调控元件ARE等。与生物胁迫相关的顺式调控元件包括参与水杨酸反应的TCA元件，参与乙烯反应的ERE元件，参与生长素调控的TGA-element元件等。通过序列分析推测，该启动子可能是一个胁迫诱导型启动子。

[0062] 实施例2玉米ZmNAC89基因的时空表达分析

[0063] 将耐盐碱玉米自交系K10种子先后经75％乙醇、次氯酸钠和无菌水消毒处理后，37℃水浴5h，将其种植在装有石英砂的发芽盒中，每盒种植5株，定期浇水，置于温室中培养(27℃，光照)。待玉米幼苗长至三叶一心期时，分别置于含有15mM Na2CO3、150mM NaCl的1/2Hoagland 营养液中进行胁迫处理，胁迫处理0h，1h，3h，6h，9h，12h，24h，2d，4d等时间后，分别取5株植株地上部分和地下部分，混合提取RNA，-80℃保存。每个处理3次重复，每次重复
30株。采用Trizol法提取植物总RNA，反转录合成cDNA。Real-time PCR 方法分析分析ZmNAC89基因的表达水平。

[0064] 1.NaCl胁迫处理下的基因表达情况

[0065] 3叶期玉米幼苗未进行胁迫处理时，ZmNAC89基因在叶片和根部均有表达，表达量较低且无显著差异；经NaCl胁迫处理后，两种组织中该基因的表达均呈现先升高后降低的趋势，峰值出现的时间点不同，叶片中在胁迫处理3h时基因表达量达到峰值，根中则在胁迫处理后24h时达到峰值，根部的表达量显著高于叶片(见图2)；同一组织不同取样点比较分析可见，胁迫处理后1h、3h、6h 和9h基因在叶片的表达量显著高于其他时间点，在根部则是处理后12h和24h 基因表达量显著高于其他时间点；胁迫后9h之前基因在叶片表达量显著高于根部，之后根部表达量上升，显著高于叶片。

[0066] 2 Na2CO3胁迫处理下的基因表达情况

[0067] 3叶期玉米幼苗未进行胁迫处理时，ZmNAC89基因在叶片和根部均有表达，表达量较低且无显著差异；经Na2CO3胁迫处理后，两种组织中该基因的表达均呈现先升高后降低的趋势，峰值出现的时间点不同，叶片中在胁迫处理3h时基因表达量达到峰值，根中则在胁迫处理24h时达到峰值，根部的表达量显著高于叶片(见图3)；同一组织不同取样点比较分析可见，胁迫处理后3h基因在叶片的表达量显著高于其他时间点，在根部则是处理后6h、9h、12h、24h和2d基因表达量显著高于其他时间点；胁迫后3h之前基因在叶片表达量显著高于根部，之后则根部表达量上升，显著高于叶片。

[0068] 实施例3玉米ZmNAC89基因全长cDNA克隆

[0069] 用含有150mM NaCl的1/2Hoagland营养液处理生长至三叶一心期的玉米幼苗3h后，提取RNA,反转录获得cDNA。

[0070] 以ORF Finder预测获得的玉米耐盐碱相关NAC转录因子ZmNAC89基因 ORF全长序列为模板设计带有EcoR I酶切位点的引物，扩增该基因全长ORF序列，引物序列为[0071] ORF-EcoR I-F：CGAATTCATGTGCCCCCAACAAAGT；

[0072] ORF-EcoR I-R：GGAATTCTCAGCAGCAGCGCAGGCG。

[0073] 以cDNA为模板，ORF-EcoR I-F和ORF-EcoR I-R为引物，扩增ZmNAC89 基因包含完整ORF的序列。浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将特异条带进行凝胶回收、纯化、TA克隆至T载体pEASY-T1，蓝白筛选转化子、提取转化子质粒DNA作为模板，通过酶切和质粒PCR鉴定阳性转化子，选择鉴定正确的阳性转化子命名为pEASY-T1-ZmNAC89，送生物公司进行测序，ZmNAC89-K10基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0074] 电泳检测扩增产物大小与目的基因片段一致，约为1.2kb。将克隆的ZmNAC89 基因测序结果与B73基因序列进行比对，ZmNAC89-K10基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)与B73相比99.58％序列相同，出现5个碱基突变(C/G、A/G、T/C、 G/C、C/G)，导致4个氨基酸改变(Arg/Gly、Thr/Ala、Cys/Arg、Ala/Gly)，根据氨基酸类型分析，4种氨基酸的改变整体上没有影响ZmNAC89蛋白的氨基酸组成，如图4。结合课题组前期耐盐碱性鉴定结果，玉米自交系B73属于中耐盐碱自交系，K10属于高耐盐碱自交系，这5个SNP与耐盐碱能力的相关性，需进一步试验加以验证。

[0075] 实施例4 ZmNAC89基因对玉米的遗传转化

[0076] 1.植物双元表达载体的构建

[0077] 经Eco RI进行单酶切克隆载体pEASY-T1-ZmNAC89质粒和植物表达载体 pT-35S-Hsp质粒，片段纯化后在T4 DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化E.coli Trans1-T1，构建重组质粒pT-ZmNAC89(如图5)。测序证实插入的ZmNAC89开放阅读框无突变，表明真核表达载体构建成功。

[0078] 2.ZmNAC89基因对玉米的遗传转化

[0079] 取授粉9-13d的玉米果穗，用75％酒精消毒5min，更换新的75％酒精消毒 15min，用手术刀尖端挑出1-3mm的幼胚；用含有pT-ZmNAC89质粒的农杆菌菌液侵染5min，侵染结束后用无菌滤纸吸净幼胚上多余的菌液，然后放在共培养培养基表面，19℃暗培养3d；之后将幼胚转移到恢复培养基上，在28℃的暗培养 7d；再将幼胚转移至含1.5mg/L双丙氨磷筛选培养基上培养2周，长势较好的愈伤组织移至新的筛选培养基，双丙氨膦增加到3mg/L；将胚性抗性愈伤组织移至分化培养基上暗培养2周，移至光照条件下进行芽的分化；形成完整植株时移接至生根培养基生根壮苗；植株长至4-6cm根系充分发育时，将转化苗用清水洗掉培养基后移栽到花盆中，花盆下部为土壤，上部为6-8cm厚的蛭石，放在培养室中26℃/22℃(白天/晚上)16h光照，8h黑暗；2-3周后转化苗长至三叶期，喷施除草剂草丁膦进行筛选，浓度为1‰w/w，经过筛选后将存活的植株移栽到温室中，提取叶片总DNA，PCR检测，阳性植株严格套袋自交，收获种子。

[0080] 遗传转化所用基本培养基见表4，附加不同激素和添加物，121℃灭菌20min。

[0081] 表4培养基配方

[0082]

[0083] 以转基因植株叶片总DNA为模板，以高温高压灭菌后ddH2O为空白对照，以同一品种非转基因植株DNA为阴性对照，以pT-ZmNAC89重组质粒DNA为阳性对照，进行PCR扩增。

[0084] pT-ZmNAC89引物序列：Primer I:5’-ATCTTTCTTTCTTCTTTTTGTGGGT-3'

[0085] Primer II:5’-TTTATTTCTCATTTATTCATCGCCG-3'

[0086] Bar基因引物序列：Primer I:5’-CCATCGTCAACCACTACATCG-3’

[0087] Primer II:5’-AGCTGCCAGAAACCCACGT-3’

[0088] PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果利用凝胶成像仪记录。结果如图6所示。

[0089] 用Bar基因试纸条对38个T0代PCR检测阳性的转基因株系进行翻译水平检测，部分结果如图7所示，试纸条上的质控线出现，说明试纸条有效，测试线清晰可见，说明Bar基因在转基因玉米后代株系中成功翻译成蛋白质。结果显示，有21个转基因株系Bar基因试纸条检测呈阳性，阳性植株严格自交加代繁殖。

[0090] 实施例4转ZmNAC89基因基玉米后代的耐盐碱性功能分析

[0091] 采用室内培养皿纸上发芽法，挑选籽粒饱满一致的种子用5％次氯酸钠浸泡 15min消毒后，用含有160mmol/L的NaCl、25mmol/LNa2CO3溶液室温浸种6h，置于培养皿中，进行不同胁迫处理。每皿20粒种子，以非转基因种子作为阴性对照，每个处理三次重复。处理
4d时，测定种子发芽势；处理7d时，测定种子发芽率、根长、芽长、鲜重及干重等指标。

[0092] 1.转基因株系耐盐性功能分析

[0093] 利用SPSS20.0中的Duncan分析法对NaCl胁迫处理下各株系间发芽势、发芽率、根长、芽长鲜重以及干重等性状进行多重比较，结果如表5所示，NaCl胁迫处理对各株系发芽势及发芽率影响较大。综合NaCl胁迫处理下各转基因株系的指标可以看出，转基因株系的平均发芽势、发芽率、根长、芽长、鲜重以及干重比非转基因株系的表现好，其中转基因株系DNAC89-C-3、DNAC89-C-5以及 DNAC89-C-25的发芽势(分别为61.20％、55.95％、66.67％)、发芽率(分别为 64.71％、57.43％、69.24％)、根长(分别为2.22cm、2.32cm、2.42cm)、芽长 (分别为1.76cm、1.72cm、1.78cm)、鲜重(分别为0.43g、0.43g、0.43g)以及干重(分别为0.18g、0.17g、0.17g)比其他转基因株系的表现好。

[0094] 表5盐胁迫下萌发期相关性状调查结果

[0095]

[0096]

[0097] 2.转基因株系耐Na2CO3功能分析

[0098] 利用SPSS20.0中的Duncan分析法对Na2CO3胁迫处理下各株系间发芽势、发芽率、根长、芽长鲜重以及干重等性状进行多重比较，结果如表6所示。综合 Na2CO3胁迫处理下，各转基因株系的指标可以得出，转基因株系的平均发芽势、发芽率、根长、芽长、鲜重以及干重比非转基因株系的表现好，其中转基因株系 DNAC89-C-3、DNAC89-C-5以及DNAC89-C-25的发芽势(分别为65.81％、61.07％、73.36％)、发芽率(分别为74.01％、69.86％、83.13％)、根长(分别为2.42cm、2.23cm、1.98cm)、芽长(分别为2.65cm、2.66cm、2.76cm)、鲜重 (分别为0.55g、0.56g、0.58g)以及干重(分别为0.27g、0.26g、0.26g)比其他转基因株系的表现好。

[0099] 表6碱胁迫下萌发期相关性状调查结果

[0100]

[0101]

[0102] 实施例5转ZmNAC89基因基玉米后代的产量相关农艺性状分析

[0103] 将转基因后代株系及其受体对照自交系播种在人工盐碱池(pH值8.6)中，行距60cm，株距20cm，每行10株，每个材料5行种植，待植株长至抽穗散粉后，严格套袋自交，收获后进行考种测量穗行数、行粒数、百粒重等产量相关性状指标。

[0104] 采用Excel 2013进行初步整理试验数据，使用统计分析软件SAS 9.1进行单因素方差分析(见表7)。结果表明，与非转基因受体对照相比，大部分转基因株系的穗长和百粒重均显著增加，表明ZmNAC89基因的过表达，可以提高转基因株系在盐碱地的产量。

[0105] 表7转ZmNAC89基因株系盐碱池产量相关性状分析

[0106]

[0107]

[0108] 上述研究结果表明，转化ZmNAC89基因的玉米盐碱能力显著提高，在盐碱条件下种植显著提高产量。本发明为通过转基因方法提高了玉米耐盐碱能力，进而为提高盐碱地玉米产量提供了有效的途径。

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