1.葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列，其特征在于：根据拟南芥广谱抗病蛋白RPW8.2氨基酸序列，经过比对分析，设计特异引物，提取高抗白粉病的中国野生华东葡萄白河-35-1株系叶片RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板，用上述特异引物，克隆到中国野生华东葡萄RPW8.2的同源基因，命名为VpR8H-1,该基因gDNA全长3136bp，cDNA全长
2448bp，包含5个外显子，4个内含子，推导编码815个氨基酸，基于推导的氨基酸序列，预测VpR8H-1蛋白含有RPW8和NB-ARC结构域，位于N端，还含有1个LRR结构域，位于C端，其中位于N端的RPW8结构域含有拟南芥RPW8.2蛋白的关键氨基酸位点。
2.根据权利要求1所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列，其特征在于：葡萄抗白粉病基因VpR8H-1cDNA全长序列2448bp:
ATGGCTTTGG AGCTTGTTGG AGGGGCTGCG TTGGGAGCAG TGTTTGAGAA GTTGTTCGCGGCGGTTGAAG ATGCAAGGAC TAAGGCAACC AAGTTCTACT CCAGCCTCAA AAAACTCGAAGAGACACTCA AATCCATAAA TCCAAGTATC CTAGAGATGA AAAGGATGAA CGACCAGTTGGATCGTCCAA AGGAGGAAAT GGAGAAGTTG ATCCAAATCT TAAAAGATGG GGAGAAGCTAATCCACAAGT GCTCCAAGGT CTCTTGTCGC AACTACTTCA AGAAGTGGAG GTACGCCAATGAAATCGAGG CCTTGGAGGA CTCTCTTCGT AAAATTTTTC AGGTGGAATT GCAAGCCCAACTCAGTAGGA ACAACATGCA GATTCTGGTC CTGCTCAAAT CAAATAGATT CAGTTGGAGTAACAAAGGGG TTTCCGTTAA ATATGAAAGT TTGGGTTCCT GTGAGGCTAC TGATCCGCCGGCTTTTATGG TGGGACTAGA TGTGCCTCTC AAAGAATTGA AGAGGTGGCT GTTTACGGATGGGGAATCAA GGATTGTGGT GTCGGCTCCT GGAGGATGTG GGAAAACCAC TTTGGCTAAAAGGCTTTGTC ACGACCAACA AGTCAAGGAA TATTTTCAGC ACATTTTCTA TGTCACGGTGTCAAAAACAT TCAACCTAAT TGGCATCATC AAGAAACTAT TTTGGCATAG TGATGAACAAGTGCCGGGGT TTCAAAATGA GGAAGATGCA GTCAACCAAT TGGAACTAAT GCTGAAGAGGAAAGTAGAAT CTGGTCGTAT ACTGTTGGTC CTAGATGACG TTTGGTCTGG GTCGGAATCTTTCCTAACCA AGTTTAACTT CCAAATATCG GGATGCAAGG TTCTGATTAC ATCTAGAAATGAATTTCCAA AATTTGGTTC TACATATAAC TTGAAATTGT TGAGTGAAGA AGATGCCAAGACTCTTTTCC GTCACTCAGC AATCCCTGAG GATGGGAGTG GTTCTTCCAT GCCCGGTGAAGACCTTGTAA ATACGATAGT GAGGCGCTGC AAGGGATTTC CACTGGCCCT GGAAGTGGTTGGCAGATCGC TCCATGGGCA GCCTGTAGAG ATCTGGAGAA GCACACTGAT GAAATTATCTGAAGGTGAAT CCATTGTCAA TTCTGAAGAT GAGCTGCGTA ATTGTCTTCA GAGTAGCTTAGATGCCCTTG CTGACAAGGA TATTATGCTG AAGGAGTGTT TTATGGACTT GGGCTCATTTCCTGAAGACC AAAAAATCCC TGCCACTGCT CTTATAGATA TGTGGGCGGA ATTGCACAAACTAGATAAAG ACGGCATTTA TGCCGTTATC AACCTTCAGA ATCTCTGCTC TCAGAATCTGCTTAATCTTG TGGTCACAAG GAATGATGCA AATGAGATTG GTTGGTGCTA CAAGGATGCCTTTGTCATGC AGCATGATCT TCTCAGGGAT CTAGCCATTT ATCAGAGCAA CCAGGAGCCCATAGAAAAGA GGAAAAGACT AATCGTGGAC TTGACAGGAA ACAGACTCCC CGAGTGGTGGACTAAAGAAA ATCAGCCCCA ATTAAGTGCT CGTCTTGTGT CCATCTCCAC AGATGAAATGTTCTCCTCAA ACTGGTGCAA CATGCAACTT CCTGAAGCTG AGGCTCTAAT ACTGAACTTTAATCAGACAG AAAATAAATA CGAATTGCCA GAGTTCATGA AGCAAATGGA TAAACTGAAGGTTCTAGTAG TAACAAATTA TGGTTTCTGT GCTGCTGAAT TGACTAATTT TTCAGTACTTGGTTCCTTAT CCAATCTAAA GAGAATCAGG TTAGAGCAAG TTTCAATTCC AAGACTATGCAACACGAGTA TGGAATTGAA GAATCTGGAA AAGCTATCCT TAGTCATGTG TCATAAGATTGGTCAGGCTT TTGCAAGTAG TACCATCCAG ATCCCAGAAA TGTTACCAAA CCTTAGGGAAATCAACATTG ATTACTGTAA TGACTTGGTG GAATTACCAG AAGGGTTTTG TGACTTAGTCCAGCTGAATA AGCTGAGCAT CAGCAACTGC CATAAGCTGT CTGCACTGCC GGAAGGGATAGGGAAGCTTG CAAATCTGGA AGTGCTAAGG GTTAGTGCCT GTACATTGGT GTCAAAATTGCCAGACTCAA TGGGAAGCCT CCACAAGTTG AGCGTTCTTG ATATAACTGG TTGTTTACGAATAAGGAAAA TGCCGAAACA AATAGGGGAG TTGCGTGGTC TAAGAGAGCT CCACATGAGAAGGTGCCCAG GTTTGCGCGA GCTGCCACCA TCAGTGACGC TTCTCGTGGA TTTGGAGAGGGTAATCTGCG ATGAAGAGAC TGCCCAGCTG TGGGAATGTT ATACGCACTT GCTCCCCAATCTCACCCTAT CAGTGCCTGA AGAAATTATC AACTTGAATT GGCTTTAA。
3.根据权利要求1所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列，其特征在于：葡萄VpR8H-1基因克隆及序列分析如下：
a.总RNA提取及纯化
在2ml离心管中加入SDS提取缓冲液800μl，加入终浓度为3％β-巯基乙醇，充分混匀，取100mg白河-35-1葡萄叶片，放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨无块状物质后迅速移入有提取缓冲液的离心管中，涡旋混匀，冰浴20min，用氯仿:异戊醇为24:1抽提，加入1/3体积8M LiCl沉淀RNA，用75％乙醇洗涤沉淀两次，室温干燥10min，加入30μl DEPC-H2O溶解，电泳检测后测定OD值，纯化，取2μlRNA进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，取1μl检测RNA浓度后-80℃冻存备用；
b.cDNA合成
以提取、纯化得到总RNA为模板，参照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的使用方法进行葡萄cDNA第一链合成；
c.葡萄VpR8H-1基因cDNA序列扩增
根据目的核苷酸序列，用Vector NTI8.0软件设计引物，以白河-35-1葡萄叶片cDNA为模板，PCR扩增目的基因，上游引物：VvR82H-F2：5’ ATGCGAATACAGGTTCATTATGTC3’，下游引物：VvR82H-R3：5’ACGCGGACTTCAAGATGATAGTTTC3’，反应程序为：94℃2min，94℃30S，
50℃30S，72℃3min，30个循环，72℃10min，4℃10min，所得PCR产物稀释10倍，用作第二轮PCR，模板1μl，高保真LA酶；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用天根DNA纯化回收试剂盒对电泳得到的条带进行回收，将回收的PCR产物测浓度后与pMDl9-T载体连接，将已转化的感受态细胞挑取白色单克隆，在37℃恒温摇床180rpm培养16-18h，经菌液PCR鉴定为阳性的克隆，送上海生工生物技术有限公司进行测序，其核苷酸序列见序列表。
d.葡萄VpR8H-1基因序列分析
将克隆得到的VpR8H-1基因序列进行分析，该基因基因组DNA全长3136bp，cDNA全长
2448bp，包含5个外显子，4个内含子，推导编码815个氨基酸，基于推导的氨基酸序列，预测蛋白含有RPW8和NB-ARC结构域，位于N端，还含有1个LRR结构域，位于C端，其中位于N端的RPW8结构域含有拟南芥RPW8.2蛋白的关键氨基酸位点。
4.葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列的应用，其特征在于：将VpR8H-1开放阅读框序列克隆至植物表达载体，瞬时转化烟草，稳定转化拟南芥，接种白粉菌，验证其特异定位表达和抗病功能，另外，对中国野生葡萄白河-35-1株系接种白粉菌，进行激素和非生物胁迫处理，分析VpR8H-1基因对不同激素、生物和非生物逆境的响应模式。
5.根据权利要求4所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列的应用，其特征在于烟草瞬时表达VpR8H-1基因对白粉菌的反应：
a.VpR8H-1基因克隆
提取中国野生华东葡萄白河-35-1株系叶片RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板，PCR扩增目的基因，其上、下游引物中各引入BamH Ⅰ酶 切位点，上游引物：5’AAGGATCCATGCGAATACAGGTTCATTATGTC3’，下游引物：5’GGGGATCCACGCGGACTTCAAGATGATAGTTTC3’，PCR反应体系：DNA模板1μl,高保真LA酶,上、下游引物各1μl，反应程序为：94℃2min，
94℃30S，50℃30S，72℃3min，30个循环，72℃10min，4℃10min，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
b.植物表达载体构建
b.1目的基因DNA片段的回收，
目的基因DNA片段从琼脂糖凝胶上的回收用天根生化科技有限公司DNA回收试剂盒回收，操作按照试剂盒说明书进行；
b.2回收片段与克隆载体pGEM-T-easy的连接反应，
连接反应按照Promega公司pGEM-T-easy载体试剂盒说明书进行操作，连接反应体系如下：2×Rapid Ligation Buffer2.5μl，pGEM-T-easy Vector0.5μl，回收DNA片段
1.5μl，T4DNA Ligase0.5μl，总体积5μl，混匀反应物，短暂离心，4℃放置16-18h；
b.3转化和阳性克隆的鉴定，
大肠杆菌的转化方法按照北京天根公司TOP10使用说明进行；将已转化的感受态细胞挑取白色单克隆，在37℃恒温摇床180rpm,培养16-18h，经菌液PCR鉴定为阳性的克隆，送测序公司进行测序，将克隆得到的目的基因的引物两端加上设计好的酶切位点,重新扩增、连接、转化，提取质粒；
b.4重组质粒DNA的提取，
质粒DNA提取方法按照天根生化科技有限公司质粒少量提取试剂盒说明书进行；
b.5重组质粒的酶切鉴定，
对加上酶切位点后的质粒提取DNA，按照所加酶切位点经对应的酶切 后，连接到经BamH1单酶切后的植物表达载体，连接，转化，转入Top10，用抗生素平板筛选阳性克隆，然后进行质粒酶切，BamH1单酶切鉴定植物表达载体构建重组质粒，酶切鉴定体系如下：
2μl10×BamH1Buffer，1μlBamHI，5μl重组质粒，ddH2O13μl，混匀样品并瞬时离心后，于
37℃酶切3h，目的基因和表达载体进行酶切以后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，混匀样品并瞬时离心后，于37℃酶切4h，目的基因和表达载体进行酶切以后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，具体构建电泳图见附图2；
c.烟草瞬时转化VpR8H-1基因
c.1烟草准备
将本氏烟草种子播种于温室，播种基质为泥炭：珍珠岩：蛭石＝8:1:1，温度22±1℃，光照强度12000LX，相对湿度70-85％，待播种生长6周后，取健康、正常叶片用于后续检测；
c.2金弹制备及轰击转化
构建好植物表达载体后，取5μg构建好的重组质粒，按照Bio-RadPDS1000/He型基因枪的要求，制备轰击的金弹，在超净工作台内，利用Bio-Rad PDS1000/He型基因枪轰击生长
6周烟草幼嫩、健康叶片，将轰击过的烟草叶片插入MS固体培养基上，恢复培养2h后，接种白粉菌；
c.3荧光显微镜下观察烟草瞬时表达VpR8H-1基因对白粉菌的反应
接种白粉菌2d后，用染色剂碘化丙碇染色孢子和菌丝，在奥林巴斯BX51荧光显微镜下观察，孢子和菌丝发出红色荧光，VpR8H-1-YFP融合蛋白发出绿色荧光，VpR8H-1-YFP融合蛋白在烟草白粉菌孢子刺入位点特异定位表达。
6.根据权利要求4所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列的应用，其特征在于拟南芥稳定表达VpR8H-1基因对白粉菌的反应：
a.VpR8H-1基因克隆
提取中国野生华东葡萄白河-35-1株系叶片RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板，PCR扩增目的基因，其上、下游引物中各引入BamH Ⅰ酶切位点；反应程序为：94℃2min，
94℃30S，50℃30S，72℃3min，30个循环，72℃10min，4℃10min，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
b.植物表达载体构建
b.1目的基因DNA片段的回收
目的基因DNA片段从琼脂糖凝胶上的回收用天根生化科技有限公司DNA回收试剂盒回收，操作按照试剂盒说明书进行；
b.2回收片段与克隆载体pGEM-T-easy的连接反应
连接反应按照Promega公司pGEM-T-easy载体试剂盒说明书进行操作；
b.3转化和阳性克隆的鉴定
大肠杆菌的转化方法按照北京天根公司TOP10使用说明来进行，经菌液PCR鉴定为阳性的克隆，送测序公司进行测序，将克隆得到的目的基因的引物两端加上设计好的酶切位点其中植物表达载体BamH1，重新扩增、连接、转化，提取质粒；
b.4重组质粒DNA的提取
质粒DNA提取方法按照天根生化科技有限公司质粒少量提取试剂盒说明书进行；
b.5重组质粒的酶切鉴定
对加上酶切位点后的质粒提取DNA，按照所加酶切位点经对应的酶切后，连接到经BamH1单酶切后的植物表达载体，连接，转化，转入Top10，用抗生素平板筛选阳性克隆，然后进行BamH1单酶切鉴定植物表达载体，目的基因和表达载体进行酶切以后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；
c.拟南芥稳定转化VpR8H-1基因
c.1植物表达载体电击转化农杆菌
植物表达载体35S::VpR8H-1-YFP电击转化到农杆菌GV3101中，具体方法参照Eppendorf4308电击转化仪进行，转化后，在超净工作台中，用600ml冰预冷的LB液体培养基悬浮电击杯中的菌液，并转入1.5ml灭菌离心管中，28℃，180rpm复苏1h后，取100ml涂布于附加相应抗生素的LB平板上，平板倒置于28℃恒温培养箱，培养48h至单菌落出现；
c.2拟南芥的遗传转化
c.2.1选择拟南芥的最佳转化时期：拟南芥的大多数花蕾即将开放时就是转化效率最高的时期，即最佳转化时期；
c.2.2农杆菌菌液的准备：挑取新鲜单菌落接种于250ml含有卡那霉素、利福平和庆大霉素的液体LB培养基中，28℃200rpm振荡培养48h，直到OD600＝0.8-1.0，离心沉淀，倒去上清液，用50ml的5％的蔗糖溶液重悬菌体；
c.2.3蘸花之前，向准备好的农杆菌液中加0.025％的Silwet L-77，混匀，将拟南芥的花序蘸入菌液中20-30s；
c.2.4蘸花结束后，将拟南芥苗放在黑暗条件下，湿度80％，培养18-24h；
c.2.518-24h黑暗培养后，放回光照：黑暗＝16h：8h的长日照下生长；
c.3转基因种子筛选
拟南芥转化完成后，收到的种子为T0代转化种子，取拟南芥T0代转化种子装入灭菌的
1.5ml离心管中，加入lml70％乙醇灭菌lmin，吸弃70％乙醇后，加入lml15％NaClO灭菌
3min，吸弃NaClO后，用灭菌水冲洗3遍，然后用无菌移液器将种子移入含有卡那霉素的培养基上，使种子在培养基表面均匀分布，放在光照培养箱内培养，待筛选出转基因植株后，移 栽收种子，重复筛选3代，得到VpR8H-1拟南芥T3代转基因植株；
c.4荧光显微镜下观察拟南芥稳定表达VpR8H-1基因对白粉菌的反应
取温室播种4周、生长健康正常的T3代转化VpR8H-1基因的拟南芥，接种拟南芥白粉菌，接种后5d，用染色剂碘化丙碇染色孢子和菌丝，在奥林巴斯BX51荧光显微镜下观察，孢子和菌丝发出红色荧光，VpR8H-1-YFP融合蛋白发出绿色荧光，VpR8H-1-YFP融合蛋白在拟南芥白粉菌吸器处特异定位。
7.根据权利要求4所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列的应用，其特征在于VpR8H-1基因对葡萄白粉菌的响应：
a.葡萄材料的处理
给温室生长健康的中国野生华东葡萄白河-35-1植株用压片法接种白粉菌，接菌0，
24，48，72，96，120，144和168h后，剪取从顶端向下第3、第4片叶片，立刻放入液氮中，于-80℃保存；
b.葡萄叶片总RNA的提取
采用改进的SDS/酚法提取葡萄叶片的总RNA；
c.实时定量PCR
c.1实时定量PCR引物
所用引物如下：
目的基因VpR8H-1：上游引物QR8H-F1:5’AATCTTTCCACCTTCTTCCACCTT3’，下游引物QR8H-R1:5’TCATCCTACGCAACTCTTCTACCA3’；目的基因VpPR1：上游引物VpPR1QF1：
5’AATCTAGTGCATTCAGGTGGGC3’，下游引物VpPR1QR1：
5’CCATTGTCGCATTGAACCCT3’；目的基因VpNPR3：上游引物VpNPR3QF1：
5’GCAGGAAACAAACAAGGACAGGAT3’，下游引物VpNPR3QF1：
5’CAGCCATTGTTGGTGAAGAGATTG3’；内参基因18s:上游引物：18srRNA-F：
5’GTAACGGGTGACGGAGAATTAG3’，下游引物：18srRNA-R：
5’CCGTGTCAGGATTGGGTAAT3’；
c.2实时定量PCR试验流程
用 Takara 公 司 SYBRPremixExTaqII 实 时 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒，反 应体 系 为 25μl， 组 分 如 下：SYBR Premix ExTaqII2×12.5μl，QR8H-F11μl，QR8H-R11μl,cDNA1μl,ddH2O9.5μl,反应在BIO-RADCyclerIQ5荧光定量PCR仪上进行，反应程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火和延伸30s，40个循环，18S作为内参，每个处理三个生物学重复，每个时间点的荧光值有三个技术重复，取均值；
c.3实时定量PCR结果
VpR8H-1基因未接种葡萄白粉菌时，表达量比较低，接种后，表达量逐渐升高，48h达到最高峰，而后降低，168h仍为接种前近3倍；VpNPR3基因在接种前后变化不大；VpPR1未接种葡萄白粉菌时，表达量比较低，接种后120h内，表达量变化不大，144h达到最高峰，而后降低至未接种水平,此结果说明，VpR8H-1基因受葡萄白粉菌的诱导；
d.台盼蓝染色观察
对接菌0，24，48，72，96，120，144和168h后叶片进行台盼蓝染色，观察中国野生华东葡萄白河-35-1抗病情况，结果如图5-d,e,f所示，接种葡萄白粉菌1d后，孢子在中国野生华东葡萄叶片上刚刚萌发，接种葡萄白粉菌4d后，清晰可见菌丝在中国野生华东葡萄叶片上的生长,并伴随着大量的细胞坏死，表明葡萄具有抗病性。
8.根据权利要求4所述的葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列的应用，其特征在于VpR8H-1基因对激素分子及非生物胁迫的响应：
a.葡萄材料的处理
以温室生长的中国野生华东葡萄白河-35-1盆栽苗为材料，选取长势健康的白河-35-1葡萄幼苗，分别喷施0.1mMABA和0.1mMMeJA，分别在 0，0.5，2，4，12，24，48和72h后采集叶片，将温室生长健康的中国野生华东葡萄白河-35-1植株盆栽苗分别置于0℃、
42℃培养箱，处理后0，0.5，2，4，8，12，24和48h后采样，对以上处理材料分别剪取从顶端向下第3、第4片叶片，立刻放入液氮中，于-80℃保存；
b.葡萄叶片总RNA的提取
采用改进的SDS/酚法提取葡萄叶片的总RNA；
c.实时定量PCR
c.1实时定量PCR引物
所用引物如下：
目的基因VpR8H-1：上游引物QR8H-F1:5’AATCTTTCCACCTTCTTCCACCTT3’，下游引物QR8H-R1:5’TCATCCTACGCAACTCTTCTACCA3’，内参基因18s:上游引物：18srRNA-F：
5’GTAACGGGTGACGGAGAATTAG3’，下游引物：18srRNA-R：5’CCGTGTCAGGATTGGGTAAT3’；
c.2实时定量PCR试验流程
用 Takara 公 司 SYBRPremixExTaqII 实 时 荧 光 定 量 PCR 试 剂 盒，反 应体 系 为 25μl， 组 分 如 下：SYBRPremixExTaqII2×12.5μl，QR8H-F11μl，QR8H-R11μl,cDNA1μl,ddH2O9.5μl,反应在BIO-RADCyclerIQ5荧光定量PCR仪上进行，反应程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火和延伸30s，40个循环，18S作为内参，每个处理三个生物学重复，每个时间点的荧光值有三个技术重复，取均值；
c.3实时定量PCR结果
VpR8H-1基因对ABA反应很敏感，在处理后24h有非常明显的高峰，几乎是刚处理时的
3倍；VpR8H-1基因对MeJA比ABA更加敏感，处理后其表达持续上升，2h即为刚处理时的4倍，在处理后4h达到最高峰，为刚处理时的7倍；与高温处理相比，VpR8H-1基因对低温处理更加敏感，在 处理后4h达到最高峰，为刚处理时的4.7倍，处理后8h迅速下降，而高温处理后，其表达量一直缓慢上升，在处理后12h达到最高峰，几乎为刚处理时的3倍，此后迅速下降，这说明VpR8H-1对ABA、MeJA和高温、低温响应明显，其在应对ABA、MeJA激素处理和高温、低温胁迫方面发挥积极作用。