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提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用

阅读：679发布：2020-05-16

专利汇可以提供提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明利用Crispr/Cas9基因编辑技术对水稻转录因子OsEBP89基因进行编辑造成基因翻译提前终止，如SEQ ID NO.3/4/5，提高水稻抗非生物胁迫能力。OsEBP89功能缺失突变体能够在萌发期提高水稻耐淹能力，在芽期、苗期提高水稻的抗渗透能力，在孕穗期也显著提高植物的抗旱性。本发明所述表明水稻OsEBP89基因功能的缺失能够提高水稻对非生物逆境抗性，可应用于在植物抗逆育种，提高水稻的耐直播抗旱能力。，下面是提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于：所述OsEBP89基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于，对所述OsEBP89基因编码区进行基因编辑，产生插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsEBP89基因的突变体knEBP89基因，所述KnEBP89基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3/4/5所示。
3.根据权利要求2所述的提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于，所述OsEBP89基因翻译提前终止使OsEBP89基因丧失功能。
4.根据权利要求3所述的提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于，所述OsEBP89基因引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组中的应用是以OsEBP89基因诱导RNA的核苷酸序列为OsEBP89-sgRNA(5’-gagtaacgaccggccctgctgg-3’)。
5.根据权利要求4所述的提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于，所述的OsEBP89基因引导RNA靶点序列引物的核苷酸序列为：
OsEBP89-gRT+:5’-GAGTAACGACCGGCCCTGCgttttagagctagaaat-3’
OsEBP89-OsU6aT-:5’-GGGCCGGTCGTTACTCCggcagccaagccagca。
6.根据权利要求4所述的提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因，其特征在于：所述OsEBP89基因引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用包括：利用PCR扩增的方法构建权利要求3所述的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；
将所述sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；
将靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻抗旱基因OsEBP89突变体。
7.一种包含权利要求6所述的靶点序列CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下特征步骤：
a、以pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒为模板，在两个反应体系中分别进行第一轮PCR扩增：
gR-R和OsEBP89-U6aT-扩增OsU6a-靶点片段，U-F和OsEBP89-gRT+扩增gRNA-靶点片段；
b、PCR用U-GAL和Pgs-GAR引物扩增产生含靶点序列sgRNA表达盒，采取Gibson assembly方法组装sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9载体。
8.一种提高水稻非生物胁迫抗性的水稻OsEBP89基因的应用，其特征在于：所述的应用是提高水稻抗非生物胁迫能力，所述OsEBP89基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。

说明书全文

提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到一种水稻OsEBP89基因编辑及其应用。

背景技术

[0002] 日益增长的人口数量以及对于自然资源的开发和使用，使得环境压力越来越大，极端环境频繁发生，对于我国水稻生产、粮食安全是一个严峻的挑战。水稻整个生育期需水量约占农业用水的70％。因此降低水稻的需水量对于节约用水、保持资源的合理利用具有非常重要的意义，科学家利用遗传学、分子生物学方法挖掘抗旱相关基因，进一步通过育种手段培育节水抗旱稻以减少水稻用水量，是目前关于水稻应对干旱的重要解决途径。我国降水量分布不均匀，呈现南方多雨，北方气候干燥少雨。尽管近些年南方地区干旱频率几乎没有显著性增加，但是干旱的程度比以往更为剧烈。2000-2004年、2006、2010年南方地区出现大范围农业干旱，粮食产量大幅减少(周曙东etal.,2013)。对于降低干旱对水稻产量的损失，一方面合理利用农业用水，另一方面培育节水抗旱稻(Luo,2010)。此外，通过广泛挖掘基因资源，进一步丰富植物抗逆调控机制，为水稻抗逆提供基因资源。

[0003] ERF被广泛报道参与对干旱的应答，OsERF71在水稻中的过表达导致根系结构的改变，OsERF71基因的表达能够激活各种应激反应基因、细胞壁相关基因和木质素生物合成相关基因，引起水稻根系结构发生改变，如通气组织和径向根系的生长均有所增加，对于提高水稻的耐旱性有重要意义(Lee etal.,2016；Lee et al.,2017)。OsERF48，组Ib中的ERF成员，水稻根特异表达ROXOsERF48和整株组成型表达OXOsERF48，根长和根密度都显著增加；当用PEG模拟干旱处理时ROXOsERF48表现出的抗旱性显著优于OXOsERF48，此外，田间抗旱性数据表明，ROXOsERF48产量高于OXOsERF48转基因植株，Chip-seq数据显示，OsERF48能够激活OsCML16基因(非生物胁迫下一个关键的Ca2+信号)的表达(Jung et al.,2017)。OsLG3，ERF转录因子，主要通过清除由于干旱造成的ROS，正向调节水稻抗旱性，当抑制表达OsLG3后，植株对干旱胁迫表现出敏感表型(Xiong et al.,2018a)。小麦中过表达TaERF3基因，促进了脯氨酸的积累，同时叶绿素降解、H2O2的形成和气孔导度也受到抑制。进一步研究发现TaERF3通过特异地结合BG3(β-glucans 3)、Chit1(Chitinase 1)、RAB18(ras-related protein 18)、LEA3(Late embryogenesis abundant 3)、TIP2(Delta tonoplast intrinsic protein 2)、POX2(Peroxidase 2)和GST6(Glutathione S-Transferase 6)7个与逆境应答相关基因的启动子区GCC-box顺式作用元件提高作物抗旱性(Wei et al.,2014)。SIERF5受干旱、高盐、水淹以及低温等胁迫诱导，高盐、干旱胁迫下，过表达番茄植株通过增加相对含水量提高转基因植株对逆境的耐受性(Pan et al.,2012)。SlERF5的表达受高盐度、干旱、洪水、损伤和低温等非生物胁迫诱导。过表达SlERF5转基因植株相对含水量较野生型植株有所增加，使植株对干旱和盐胁迫具有较高的耐受性(Pan et al.,2012)。

[0004] 另外一类ERF转录因子在植物抗旱过程中扮演着负调节作用，如OsERF109过表达负调节乙烯在水稻体内的积累以及植株的抗旱性(Yu et al.,2017)。干旱胁迫下，OsDERF1基因抑制表达株系显著提高水稻苗期和分蘖期的抗旱性。OsERF3在水稻抗旱过程中也扮演着负调节作用，过表达OsERF3转基因植株在干旱胁迫下，存活率显著低于对照野生型并且发现乙烯合成相关基因发生下调。拟南芥中异源表达OsAP23基因的种子萌发实验显示，随着NaCl浓度的增加，过表达种子萌发率以及萌发速率显著低于野生型，同时不同浓度ABA对于过表达与野生型种子的萌发率没有显著影响，而萌发速率过表达之后显著低于野生型；苗期高盐处理，过表达植株表现出盐敏感表型，这些结果表明，OsAP23基因负调节植物盐胁迫(Zhuang et al.,2013)。相比较野生型植株，cbf2突变体对冷害、干旱以及高盐也表现出增强这些逆境的耐受性，暗示着CBF负调节植物对逆境的应答(Fernando et al.,2004)。

[0005] 上面已有研究说明ERF家族中基因在逆境胁迫中扮演的调控角色并不一致，尤其是起负调控作用机制仍不够明晰，本发明通过基因编辑技术对OsEBP89基因进行敲除，发现突变该基因后，能够增强水稻种子耐直播能力和全生育期的抗旱性，为应用于我国最重要的粮食作物水稻高产稳产育种具有重要意义。发明内容：

[0006] 本发明的目的是提供一种利用水稻基因OsEBP89通过人工编辑水稻基因组使产生提前终止密码，来培育水稻抗逆能力增强的方法。

[0007] 本发明分离和应用一种包含OsEBP89基因，该基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化，其中，OsEBP89基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明的优选实施方案是，所述OsEBP89基因编码区插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsEBP89基因的突变体knEBP89，所述的knEBP89的核苷酸序列如SEQ ID NO.3/4/5所示。

[0009] 另一方面，本发明公开了一种通过基因编辑的方式获得的水稻基因组中OsEBP89基因等位基因knEBP89基因的方法，其在于构建含有EBP89-sgRNA表达盒的CRISP/CAS9载体，利用水稻遗传转化在所述OsEBP89基因编码区产生插入或缺失的水稻突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3/4/5所示。OsEBP89基因翻译提前终止使得OsEBP89基因丧失功能。

[0010] 另一方面，OsEBP89基因引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组中的应用是以OsEBP89基因诱导RNA的核苷酸序列为OsEBP89-sgRNA(5’-gagtaacgaccggccctgctgg-3’)。

[0011] 所述OsEBP89基因引导RNA靶点序列引物的核苷酸序列为：

[0012] OsEBP89-gRT+:5’-GAGTAACGACCGGCCCTGCgttttagagctagaaat-3’，

[0013] OsEBP89-OsU6aT-:5’-GGGCCGGTCGTTACTCCggcagccaagccagca。

[0014] 另一方面，OsEBP89基因引导RNA靶点序列引物在编辑水稻基因组中的应用包括：利用PCR扩增的方法构建权利要求3所述的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

[0015] 将所述sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；

[0016] 将靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻抗旱基因OsEBP89突变体。

[0017] 还提供一种靶点序列CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，其制备方法包含以下特征步骤：

[0018] a、以pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒为模板，在两个反应体系中分别进行第一轮PCR扩增：gR-R和OsEBP89-U6aT-扩增OsU6a-靶点片段，U-F和OsEBP89-gRT+扩增gRNA-靶点片段；

[0019] b、PCR用U-GAL和Pgs-GAR引物扩增产生含靶点序列sgRNA表达盒，采取Gibson assembly方法组装sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9载体。

[0020] 另一方面，提高水稻非生物胁迫抗性的水稻OsEBP89基因的应用，所述应用是提高水稻抗非生物胁迫能力，所述OsEBP89基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。

[0021] 本发明公开了携带本发明OsEBP89基因的sgRNA片段表达载体可通过使用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体，直接DNA转化，农杆菌介导的侵染愈伤组织等常规生物技术方法导入植物细胞。

[0022] 包含本发明OsEBP89基因编辑表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H的转化宿主是水稻。

[0023] 本发明的有益效果是，通过水稻基因OsEBP89功能缺失突变体，具有在抗渗透胁迫和种子耐直播具有明显的作用，可应用于在水稻的生产便捷性和稳产性育种，为现代化水稻种植大小基础。附图说明

[0024] 图1为本发明的OsEBP89基因在各组织器官的表达模式；

[0025] 图2为本发明的OsEBP89基因在苗期PEG、冷、热、盐、淹水和外源ABA处理下的表达水平；

[0026] 图3为本发明的OsEBP89过表达和敲除载体的构建；

[0027] 图4为本发明的OsEBP89转基因过表达和敲除类型的鉴定；

[0028] A.OsEBP89转基因植株阳性鉴定。对T0代转基因材料，提取基因组DNA，扩增潮霉素片段。B.OsEBP89过表达株系的相对表达量分析。水稻OsActin1作为内参基因。C.根据敲除植株的sgRNA靶点获得的序列进行的多序列比对。

[0029] 图5为本发明的OsEBP89过表达和敲除植株的芽期甘露醇中的表型；

[0030] A1.转基因植株和WT在不含有或者含有200mm甘露醇的1/2MS培养基上的表型。A图上部分表示植株生长在1/2MS培养基上，下部分表示植株生长在含有200mm甘露醇培养基上。1/2MS培养基(B)和200mm甘露醇处理(C)下转基因植株和WT植株高度和根长。

[0031] 图6为本发明的OsEBP89过表达和敲除植株的苗期20％PEG6000胁迫条件下的表型；

[0032] 图7为本发明的OsEBP89过表达和敲除植株孕穗期耐旱性分析；

[0033] A.水分充足、干旱条件下，OsEBP89过表达(OE)、敲除系(KO)、野生型表型15d，恢复7d。B.离体叶片失水速率的测定。正常条件(C)和干旱胁迫(D)下结实率的统计。

[0034] 图8为本发明的OsEBP89过表达和敲除植株的孕穗期干旱胁迫条件下的生理指标；

[0035] 四叶期，在正常条件和20％PEG6000处理条件下，叶片H2O2(A)和MDA(B)含量测定。同时测量了脯氨酸(C)含量和SOD(D)活性。数据表示平均值±标准差(n＝12,*P<0.05,t-test；**P<0.01,t-test)。

具体实施方式

[0036] 下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0037] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0038] 实施例1：水稻基因OsEBP89在各组织器官的表达分析

[0039] (1)选取材料

[0040] 苗期：选取饱满的粳稻日本晴种子，蒸馏水清洗，2.5％NaClO消毒25min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时取新叶及根部位的材料进行分析；

[0041] 成株期：粳稻日本晴种植于水田，孕穗期取植株的叶片、叶鞘、根和穗进行分析。

[0042] (2)RNA提取与第一链cDNA合成

[0043] RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mlTRNzol-A+试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μl RNase-free ddH2O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

[0044] 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 2μL

[0045] Total RNA* 500ng

[0046] RNase Free ddH2O up to 10μL

[0047] 37℃反应15min，85℃反应5s，4℃保存。

[0048] (3)定量PCR分析

[0049] 基因表达的定量分析使用Takara公司的 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒和Bio-Rad CFX96定量PCR仪进行。根据OsEBP89全长cDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量前引物为Gf2:5’-CCGTTCTTCGCCTTCCTG-3’，基因定量反向引物Gr2:
5’-CGCCACTGCCATCATTCTC-3’，Actin F:5’-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，Actin R:5’-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’。20μl反应体系的配制：

[0050]

[0051] 反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设Dissociation Stage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及△CT值，利用2-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

[0052] 定量分析结果显示(图1)，该基因在植株的各组织中均有一定量表达，茎中表达量稍低，推测该基因不具有组织表达特异性。

[0053] 实施例2水稻基因OsEBP89在逆境胁迫下的表达分析

[0054] (1)逆境胁迫处理

[0055] 选取饱满的粳稻日本晴种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：20％PEG6000、200mM NaCl、4℃、42℃、完全水淹和100μM脱落酸(ABA)。分别在不同处理时间点进行取样，每个处理每个时间点取3片叶位相同的。

[0056] (2)RNA提取与第一链cDNA合成

[0057] 同实施例1。

[0058] (3)定量PCR分析

[0059] 同实施例1。

[0060] 定量分析结果显示(图2)，在4℃低温胁迫下，OsEBP89的表达水平在0.5、12、24h表达量较对照降低，其中0.5h达到最低约为处理前的0.4倍，在4h达到最高水平，约为对照1.1倍；42℃高温胁迫条件下，OsEBP89的表达水平呈现下降趋势，在2h时达到最低值，约为处理前的0.2倍；20％PEG处理条件下，OsEBP89表达丰度总体上呈现下调趋势，在0.5h降低后，在1h和2h又回到接近处理前水平，随后又继续降低，24h达到最低值，约为处理前的0.2倍；在完全淹水条件下，OsEBP89表达水平呈现上调趋势，其中在淹水24h后达到最大值；200mM NaCl处理后，在8h和12h表达水平有增加，而在24h表达水平达到最大值约为处理前的11倍；
H2O2处理条件下，表现出与低温胁迫类似的趋势，变化幅度有波动。上述结果表明，该基因的表达受PEG、高盐、低温、高温、水淹以及ABA的调节，因而该基因在逆境应答反应中可能发挥重要作用。

[0061] 实施例3 OsEBP89基因超表达和Crispr/Cas9敲除载体的构建以及遗传转化[0062] 根据Rice Anotation Project网站上公布的LOC_Os03g08460(OsEBP89)基因序列，设计引物，从粳稻品种日本晴cDNA扩增该目的基因片段、胶回收，进一步加载体接头继续扩增、胶回收，载体用相同BamHI和BstEII双酶切消化p1300-Ub载体、胶回收，通过同源重组反应将目的基因连入植物过表达载体p1300-Ub中，构建结果如图3A所示。

[0063] 对于利用Crispr/Cas9系统进行基因编辑的OsEBP89载体的构建，根据OsEBP89的基因组信息，结合华中农业大学CRISPR-P 2.0设计靶点。对目的基因组DNA进行sgRNA的选择，主要根据脱靶效率低、特异性好、位于外显子。最终将sgRNA：5’-gagtaacgaccggccctgc-3’作为靶点，然后利用华南农业大学刘耀光老师提供的Crispr/Cas9基因编辑系统的载体pYLsgRNA-OsU6a/LacZ和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(或者命名为pYLCRISPR/Cas9-MH)，前者主要用于扩增U6启动子和sgRNA盒，通过OverlapPCR将U6启动子和sgRNA盒融合在一起，后者载体主要为植物表达用，通过前者重叠后的启动子和sgRNA，植物表达载体利用BsaI酶切线性化，通过重组方式，将Ub和sgRNA整合到含有Cas9蛋白的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H编辑载体中，结果如图3B所示，具体详细操作步骤如下所示。

[0064] OsEBP89过表达载体构建：

[0065] (1)根据Rice Genome Annotation Project网站上公布的OsEBP89基因CDS序列设计带有重组接头的引物(OsEBP89-U6F/OsEBP89-U6R，引物见附表)，以日本晴cDNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增。

[0066] 反应体系(50μL)：

[0067]

[0068] 反应程序：

[0069] 95℃3min；95℃30s，56℃30s，30cycles；72℃1kb/min；72℃5min；10℃hold[0070] 琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段(凝胶回收方法见附录)。

[0071] (2)酶切线性化载体利用限制性内切酶消化载体，使得载体线性化，为后续重组反应提供线性化载体。

[0072] 反应体系：

[0073]

[0074] 37℃反应25min，电泳，凝胶回收目的片段。

[0075] (3)重组方法(In-fusion)构建体系及反应条件

[0076] 配制10μL重组体系：

[0077]

[0078] 反应条件：37℃反应30min

[0079] (4)转化大肠杆菌

[0080] a.将重组产物(3)加入到50μL感受态细胞中，冰上放置30min

[0081] b.42℃热激60s，然后冰上放置2min。

[0082] c.加入500μL空白LB液体培养基，37℃摇床200rpm培养1h

[0083] d.涂布到含有相应抗性(Kan+)的培养基上，倒置放入37℃培养箱中

[0084] (5)挑阳性克隆，利用载体引物测序U-F/U-R，引物见附表。

[0085] (6)将测序正确的克隆，提取质粒(质粒小提方法见附录)。

[0086] (7)将构建好的过表达载体转化到农杆菌GV3101，涂布于含有，Kan+、Rif+、Gm+的YEP培养皿。

[0087] OsEBP89敲除载体构建：

[0088] 关于敲除载体的构建，利用Crispr/Cas9基因编辑系统对目的基因进行编辑，具体操作方法参照文献Ma等(Ma et al.,2015)高效编辑单子叶植物基因组，具体操作如下：

[0089] (1)根据OsEBP89外显子基因组序列设计sgRNA靶点序列信息。在一系列sgRNA中，基于U6启动子对应的RNA聚合酶III，选择合适的转录识别位点G，因此选取NGG前面19个碱基理论上必须为G的sgRNA序列，其次尽可能将sgRNA覆盖在非翻译区或者外显子区域，尽可能减少脱靶效应，sgRNA的GC含量50％-70％，最终选择位于第二外显子上的sgRNA序列5’-gagtaacgaccggccctgc-3’。

[0090] (2)靶点sgRNA命名为KO-OsEBP89F，针对靶点sgRNA反向互补之后命名为KO-OsEBP89R，分别对引物的3’端加接头g RT#+、U#T#-，最终形成UF/KO-OsEBP89R(-)和KO-OsEBP89F(+)/gR-R两组引物，前者扩增启动子U6，后者扩增含有靶点的sgRNA以及完整的sgRNA盒。

[0091] 反应体系(50μL)：

[0092]

[0093] 反应程序：

[0094] 95℃3min；95℃30s，56℃30s，30cycles；72℃1kb/min；72℃5min；10℃hold[0095] 凝胶回收、分别命名为product1和product2

[0096] (3)通过重叠PCR，将U6启动子和sgRNA融合

[0097] 反应体系(50μL)：

[0098]

[0099] 当反应进入9个循环时，加入Pps和Pgs引物，继续反应

[0100] 反应程序：

[0101] 95℃3min；95℃30s，56℃30s，35cycles；72℃1kb/min；72℃5min；10℃hold[0102] 凝胶回收、命名为product KO-OsEBP89

[0103] (4)酶切载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，反应体系如下：

[0104]

[0105] 37℃反应30min，电泳，凝胶回收目的片段。

[0106] (5)通过重组反应，反应体系如下(10μL)：

[0107]

[0108] 反应条件：37℃反应30min

[0109] (6)转化大肠杆菌

[0110] (7)菌液PCR鉴定阳性克隆，送测序

[0111] (8)测序正确的含有靶点sgRNA的质粒进行提取。-20℃保存质粒。

[0112] 水稻遗传转化

[0113] (1)种子消毒

[0114] 成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用30％NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。

[0115] (2)继代培养

[0116] 经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。

[0117] (3)农杆菌的培养

[0118] 在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS 100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝
0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS＝acetosringone

[0119] (4)共培养

[0120] 将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS 100uM)上，28℃暗培养三天。

[0121] (5)洗菌

[0122] 共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。

[0123] (6)选择培养

[0124] 将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 50mg/L+Cef 250mg/L)上，再选择2周。

[0125] (7)分化培养

[0126] 将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+琼脂
4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。

[0127] (8)生根培养

[0128] 约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg 15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。

[0129] (9)转基因苗的移栽

[0130] 当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

[0131] 实施例4 T0代转基因植株鉴定

[0132] 通过农杆菌介导愈伤组织的转化方法获得转OsEBP89基因过表达和敲除植株，对过表达单株分别提取基因组DNA，利用PCR方法扩增标记基因Hpt，凝胶电泳检测扩增片段，部分结果如图4A所示，泳道L1为阴性对照，泳道L6、L7、L11为阴性单株，其余均为转基因阳性单株。

[0133] 取T0代转基因OsEBP89过表达植株叶片，提取总RNA并进行反转录，利用qRT-PCR方法分析不同单株目的基因的表达水平。结果如图4B所示，过表达植株目的基因的表达倍数比野生型对照发生显著上调，倍数从28到750，最终选取OE-2、OE-6表达倍数高的材料作为后续研究的对象。

[0134] Crispr/Cas9基因编辑技术获得的OsEBP89基因敲除单株的鉴定，则利用基因组DNA为模板，PCR扩增片段包含sgRNA约300bp，然后对扩增片段进行一代测序，确定34个单株的编辑类型，结果如图4C，T0代获得了3株纯合类型，分别为缺少一个碱基、缺少两个碱基以及增加一个碱基，25株杂合类型，以及6株WT状态。

[0135] 实施例5 OsEBP89过表达和敲除材料芽期渗透胁迫分析

[0136] 由于OsEBP89在干旱胁迫后，其表达水平总体呈现下降水平，为了研究OsEBP89基因在渗透胁迫应答过程中所发挥的作用，将过表达株系的种子放在含有50mg/L培养基上生长，敲除株系和野生型对照种子放在普通培养基上生长，挑取生长一致的种子，转移到含有200mM甘露醇的培养基上，10d后，对所有材料的株高、根长进行了统计。结果如图5所示，普通1/2MS培养基上的过表达(OE-2,OE-6)、敲除株系(KO-18,KO-23)的株高、根长与野生型WT没有显著差异；而含有200mM甘露醇的培养基上，敲除株系的株高显著高于过表达和野生型，过表达和野生型的株高之间差异不显著，根长也表现出一致的趋势。

[0137] 实施例6 OsEBP89过表达和敲除材料苗期渗透胁迫分析

[0138] 将过表达材料、敲除材料和野生型浸种、催芽，露白后播种于镂空的PCR板中，放入培养箱中，用水稻营养液进行培养至4周，然后利用含有20％PEG的水稻营养液进行处理，所有材料出现卷曲后，转入到正常营养液中生长3d，胁迫处理后转基因过表达材料与野生型材料叶片卷曲程度没有显著性变化，敲除材料较野生型生长较好，恢复生长以后，过表达材料与野生型表型差异仍然不显著，但是敲除材料的生长状态明显好于野生型，如图6A。恢复生长后，统计了过表达、敲除材料以及野生型的存活率和相对鲜重，结果显示，过表达(36.67％，40.33％)和野生型(31.13％)的存活率差异不显著，如图6B；而敲除材料的存活率分别达到了71.67％和76.33％。相对鲜重也做了统计，结果如图6C所示，处理后较处理前野生型的相对鲜重约为54％，过表达株系约为58％，敲除株系约为76％。转基因材料的存活率和相对鲜重表明，OsEBP89敲除材料能够显著提高水稻的耐渗透胁迫能力。

[0139] 实施例7 OsEBP89过表达和敲除材料成株期耐旱性迫分析

[0140] 水稻花期是其生长过程中最为敏感的时期，对逆境的抗性非常差，因此我们调查了OsEBP89转基因材料在成株期的耐旱性分析。实验用混合土壤，按照质量比沙子：土＝1:3，加入少量复合肥，混匀，装入到0.5m深垃圾桶中，放置到大棚中，使用时提前加满水直至饱和。水稻萌发后，经过PCR以及一代测序，鉴定其为阳性，敲除单株为纯合突变类型。然后移栽到垃圾桶中，水肥管理直至抽穗期，随后开始断水胁迫，直至水稻材料卷叶严重甚至枯死，然后复水生长。实验结果如图7A所示，上部分为干旱胁迫处理前转基因材料和野生型表现，转基因植株和对照在农艺形状上没有明显的差异，下部分为断水1周复水2d后的表现，过表达株系OE2和OE6卷曲枯死较野生型对照更为严重，而敲除株系KO-18和KO-23的叶片卷曲和枯死程度较对照轻，对干旱的相应显著优于过表达材料。取处理前叶片测量离体叶片失水速率，结果如图7B显示，过表达株系OE-6有较高的失水速率，而对照WT和敲除株系KO-
23的失水速率比较接近，均低于过表达株系。过表达、敲除和对照WT植株的结实率也做了统计，正常生长条件下的结实率维持在60％，没有显著性差异，如图7C所示；干旱胁迫以后，过表达株系的结实率仅有8％，而敲除株系结实率达到了16％，对照WT的结实率为12％，敲除株系的结实率显著高于野生型和过表达株系。以上结果均表明OsEBP89基因的敲除能够增强水稻的耐旱性，维持相对较低低的失水速率以及高的结实率。

[0141] 实施例8 OsEBP89基因的敲除对活性氧和脯氨酸的积累影响

[0142] 干旱和氧化胁迫通常都能够促使植物体内活性氧的积累，植物一般会合成抗氧化物质和渗透胁迫物质保护植物。H2O2是一类重要的氧化物质，MDA反映了细胞膜的受损伤程度。正常生长条件下，过氧化氢含量在敲除、过表达、对照WT中没有显著差异；20％PEG处理后，敲除株系中的过氧化氢含量极显著低于野生型和过表达株系，过表达株系中的过氧化氢含量总体上高于对照WT，如图8A所示。敲除株系、过表达和对照WT中的MDA含量表现出的趋势与过氧化氢一致，如图8B。暗示着渗透胁迫条件下，OsEBP89敲除材料能够降低氧化损伤。SOD，作为清除ROS的一类最为重要的抗氧化物酶类，在渗透胁迫处理前后也做了测定。结果如图8C，渗透胁迫前ROS的含量在所有材料中处于比较低的水平；利用利用20％PEG处理后，SOD含量均发生比较剧烈的增加，过表达株系和敲除株系的SOD含量均极显著高于对照WT。脯氨酸，作为渗透胁迫的一个关键生理指标，其含量也做了测定。结果如图8D，渗透胁迫处理后，所有材料中的脯氨酸水平均有所增加，敲除株系中的脯氨酸积累最多，其次是对照WT，二者均高于过表达株系。综合以上结果，OsEBP89通过渗透调节物质的积累以及提高对ROS的清除能力，维持细胞膜的完整性，最终提高水稻的耐渗透能力。

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提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用

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