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与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因与应用

阅读：535发布：2020-05-13

专利汇可以提供与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因及其应用。本发明通过RT-PCR技术，从扁蓿豆中克隆分离到一个新的YnKn型脱水素蛋白及其编码基因MrY2K4，并用原核表达手段将MrY2K4基因编码区连接到大肠杆菌表达载体后，将该原核表达载体转入大肠杆菌表达菌株，用IPTG诱导后实现了MrY2K4蛋白在大肠杆菌中的过量表达，结果显示，MrY2K4蛋白过量表达在逆境胁迫下对大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方法可将该基因用于改良植物和微生物的抗盐和耐热性。，下面是与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白的氨基酸序列；或含2个以重复形式出现在脱水素蛋白的N-端的Y-片段[T/V]D[E/Q]YGNP和4个富含赖氨酸的K-片段EKKGIMDKIKEKLPG或其衍生物，且具有与SEQ ID NO：2氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因MrY2K4，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸而形成的具有相同功能活性的等位基因。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。
4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述基因或包含权利要求3所述重组表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包括包含权利要求2所述基因或包含权利要求3所述重组表达载体。
6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在提高植物或微生物抗性方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，抗性包括抗旱、抗盐、耐低温和耐热性。

说明书全文

与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因

与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因及其应用。

背景技术

[0002] 扁蓿豆Medicago ruthenica(L.)又名花苜蓿、扁豆子、野苜蓿等，为一年生或多年生豆科苜蓿属植物。扁蓿豆生态适应性广，在我国北方、西南地区以及西伯利亚、蒙古利亚均有分布，多生长于山坡草地处。经研究发现，扁蓿豆具有很强的抗寒性、耐盐性和抗旱性，是唯一可适应干旱、高原严寒及贫瘠土壤的豆科苜蓿属植物。

[0003] 晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA)最初在种子中发现，之后的研究显示其广泛分布于藻类、酵母、线虫、蓝细菌及高等植物的各个组织和器官中。大量的研究表明，LEA是高等植物在抵御干旱、低温和高盐等引起脱水的环境因素及脱落酸(ABA)诱导下表达最为明显的一类逆境应答蛋白。脱水素蛋白(Dehydrin，DHN)属于LEA II家族，是一类较早发现的LEA蛋白，含有明显的结构特征。脱水素蛋白含有至少一个的保守的富含赖氨酸的基序K-片段，有些通常还含有Y-片段和S-片段。基于Y，S，K片段出现的类型和数量不同，可将脱水素蛋白分为5个亚家族：YnSKn、SKn、Kn、YnKn、和KnS型。其中，YnKn型脱水素蛋白的特征是其N末端含有保守性的Y片段([T/V]D[E/Q]YGNP)，C末端有富含赖氨酸的K片段([E/K/R]KKG[I/L]MDKIKEKLPG)。

[0004] 目前还未见扁蓿豆中YnKn型的抗逆脱水素蛋白基因克隆和抗逆性功能鉴定的报道。因此，挖掘扁蓿豆中与非生物胁迫相关的优异YnKn型抗逆脱水素蛋白，探究MrY2K4基因在扁蓿豆响应逆境胁迫中的功能，可为解析扁蓿豆抗逆机理提供新的理论依据、并为培育抗旱、耐盐碱等逆境的高抗牧草新品种提供基因资源。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因及其应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

[0007] 一种与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白的氨基酸序列，或含2个以重复形式([T/V]D[E/Q]YGNP)出现在脱水素蛋白的N-端的Y-片段和4个富含赖氨酸的K-片段(EKKGIMDKIKEKLPG或其衍生物)且具有与SEQ ID NO：2氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。

[0008] 一种编码上述与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白的基因MrY2K4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸而形成的具有相同功能活性的等位基因。

[0009] 本发明还提供了包含与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白基因MrY2K4的重组表达载体，作为优选，将该扁蓿豆脱水素蛋白的编码基因MrY2K4开放读码框序列插入到大肠杆菌表达载体pET-30a(Novagen产品)BamH I和Sac I酶切位点之间，即得重组表达载体pET30a-MrY2K4。

[0010] 本发明还提供了一种含有与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白基因MrY2K4的重组菌，作为优选，将上述重组表达载体pET30a-MrY2K4转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中，即得重组菌，该重组菌在含有卡那霉素和氯霉素的液体培养基中经过培养，添加IPTG诱导后，产生所述基因编码的扁蓿豆脱水素蛋白。

[0011] 本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白的基因MrY2K4或包含上述所述的重组表达载体，作为优选，该宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌。

[0012] 本发明还提供了与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白或基因MrY2K4在提高植物或微生物抗性方面的用途，作为优选，抗性性能为抗旱、抗盐、耐低温、耐热性等。

[0013] 本发明提供的与扁蓿豆抗逆性相关的Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4及其编码基因及其应用，具有以下有益效果：

[0014] 通过RT-PCR技术，从扁蓿豆中克隆分离到一个新的YnKn型脱水素蛋白及其编码基因MrY2K4。该基因和蛋白可提高植物或微生物的抗旱性、抗盐性、耐低温、耐热性等，可用于植物抗性育种。附图说明

[0015] 图1为本发明扁蓿豆YnKn型脱水素蛋白基因MrY2K4的RT-PCR克隆产物电泳图谱。

[0016] 图2为本发明扁蓿豆脱水素蛋白MrY2K4和其它物种YnKn型脱水素蛋白氨基酸序列的比对分析结果。其中，Medicago sativa来自紫花苜蓿(AEV52288.1)；Medicago falcata来自黄花苜蓿(ABX80061.1)；Galega orientalis来自东方山羊草(ADT80777.1)；Vicia monanth来自山野豌豆(BAH70483.1)。2个蓝色实线框示保守的Y-片段，4个红色虚线框为保守的富含赖氨酸的K-片段。

[0017] 图3为本发明扁蓿豆脱水素蛋白MrY2K4和其它物种YnKn型脱水素蛋白构建的系统进化树。其中Medicago sativa来自紫花苜蓿(AEV52288.1)；Galega orientalis来自东方山羊草(ADT80777.1)；Rosa chinensis来自月季(PRQ47518.1)；Eriobotrya japonica来自枇杷(AGV21053.1)；Abrus precatorius来自沙梨(AKP55501.1)；Lactuca sativa来自莴苣(XP_023765539.1)；Triticum aestivum来自小麦(AAC14297.1)；Thinopyrum elongatum来自长穗偃麦草(AAC05921.1)。实心三角指示扁蓿豆Y2K4型脱水素蛋白MrY2K4。

[0018] 图4为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因在模拟脱水胁迫处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析结果。其中，Actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。

[0019] 图5为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因在模拟NaCl胁迫处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析结果。其中，Actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。

[0020] 图6为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因在低温处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析结果。其中，Actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。

[0021] 图7为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因在ABA处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析结果。其中，Actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。

[0022] 图8为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因在根、茎、叶和花中基因表达水平的半定量RT-PCR分析结果。其中，Actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。

[0023] 图9为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4基因的原核表达载体pET30a-MrY2K4的酶切鉴定图谱。其中“BamH I+Sac I”为BamH I和Sac I双酶切消化处理的pET30a-MrY2K4载体，“BamH I”为BamH I单酶切消化处理的pET30a-MrY2K4载体，“Sac I”为Sac I单酶切消化处理的pET30a-MrY2K4载体，“Plasmid”为未做酶切消化处理的pET30a-MrY2K4载体质粒。

[0024] 图10为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果。其中“1”为IPTG诱导前的总蛋白，“2”为IPTG诱导后的总蛋白，“3”为上清液中诱导表达的蛋白，“4”为沉淀中诱导表达的蛋白，“5”为分离纯化的目的蛋白。

[0025] 图11为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4在大肠杆菌中表达后对宿主菌的逆境胁迫保护效果的菌液滴板试验结果。其中BL/pET30a为含有pET30a(+)质粒的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌；BL/MrY2K4为含有pET30a-MrY2K4质粒的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌；LB+IPTG为Luria-Bertani(LB)固体培养基添加有0.5mmol/L IPTG；LB+IPTG+0.5M NaCl为LB固体培养基添加0.5mmol/L IPTG和0.5mol/L NaCl；LB+IPTG+0.5M KCl为LB固体培养基添加0.5mmol/L IPTG和0.5mol/L KCl；LB+IPTG(55℃，30min)为55℃热处理30min，LB固体培养基添加0.5mmol/L IPTG。

[0026] 图12为本发明与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白MrY2K4在大肠杆菌中表达后对宿主菌的逆境胁迫保护效果的菌落计数统计结果。其中BL/pET30a为含有pET30a(+)质粒的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌；BL/MrY2K4为含有pET30a-MrY2K4质粒的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌；NaCl(0.5M)和KCl(0.5M)为高盐胁迫、Heat(55℃，30min)为热胁迫。

具体实施方式

[0027] 本发明通过转录组学分析，表明扁蓿豆含有脱水素蛋白基因，再通过RT-PCR技术，从扁蓿豆中克隆分离到一个新的YnKn型脱水素蛋白及其编码基因MrY2K4。用原核表达手段将MrY2K4基因编码区连接到大肠杆菌表达载体后，将该原核表达载体转入大肠杆菌表达菌株，用IPTG诱导后实现了MrY2K4蛋白在大肠杆菌中的过量表达，结果显示，MrY2K4蛋白过量表达在逆境胁迫下对大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方法可将该基因用于改良植物和微生物的抗盐和耐热性。

[0028] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明。

[0029] 实施例1扁蓿豆脱水素蛋白MrY2K4基因的克隆

[0030] 1、扁蓿豆幼苗低温胁迫处理与转录组测序

[0031] (1)扁蓿豆低温胁迫处理

[0032] 将扁蓿豆种子用浓硫酸处理10min，期间不断用玻璃棒搅拌，然后用蒸馏水冲洗数次以去除硫酸。上述经过处理的种子置于铺有多层湿滤纸的培养皿内，在21℃、16h/8h光周期条件下发芽；3d后将发芽的幼苗移栽于蛭石：营养土(3:1)的混合基质中继续在上述条件下培养，每周用含1/2MS 营养液浇灌一次；3周后将幼苗转移至智能人工气候培养箱内，4℃低温处理24h，分别取低温处理前和处理24h后的整株幼苗，洗净根部基质，用吸水纸轻轻吸去残留水分后，置于液氮速冻，-80℃保存备用。

[0033] (2)转录组测序

[0034] 将低温处理前和处理后的幼苗，送深圳华大基因科技服务有限公司进行总RNA提取和转录组测序。

[0035] 2、引物设计

[0036] 根据转录组测序结果，设计扁蓿豆脱水素蛋白基因的PCR引物，具体如下：

[0037] P1：5’-ATCATAGCAATCTCTTTACACT-3’(SEQ ID NO：3)

[0038] P2：5’-TATCCATCATCATACACCTC-3’(SEQ ID NO：4)

[0039] 3、总RNA提取与cDNA第一链合成

[0040] 将上述低温胁迫处理的样品在液氮中迅速研磨成粉末后，用Trizol 试剂(Invitrogen产品)按照其说明书提取总RNA。总RNA用30μL DEPC-H2O溶解，用超微量紫外\可见分光光度计调整其浓度至250ng/μL。

[0041] 使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara产品试剂盒进行)cDNA第一链合成反应，具体操作按照其说明书进行。

[0042] 4、MrY2K4基因cDNA序列扩增：

[0043] PCR反应体系由10μL 2×PCR Buffer I、1.6μL dNTP、0.4μL P1(10μM)、0.4μL P2(10μM)、0.05μL LATMTaq DNA聚合酶(Takara产品)、0.05μL PyrobestTMDNA聚合酶(Takara产品)、2μL cDNA第一链合成产物组成，并用ddH2O(双蒸水)加至终体积为20μL。

[0044] 其中：2×PCR Buffer I为与LATMTaq DNA聚合酶配套缓冲液。

[0045] dNTP由dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dTTP(脱氧胸苷三磷酸)、dGTP(脱氧鸟苷三磷酸三钠)和dCTP(脱氧胞苷三磷酸)组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2.5mM。

[0046] PCR反应体系按下列程序进行：

[0047]

[0048] 反应结束后，用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶检测PCR产物，得到如图1所示的约1.1kb的条带，表明在扁蓿豆中含有与抗逆性相关的基因存在。

[0049] 5、PCR产物胶回收与加尾处理：

[0050] PCR产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工产品)回收后用 DNA聚合酶(Takara产品)进行3’端加尾处理。

[0051] 6、目的DNA片段与载体的连接：

[0052] (1)连接体系总量为10μL，由1μL 载体(Promega产品)、1μL T4 DNA连接酶、5μL 2×Rapid连接缓冲液和3μL目的DNA片段组成。其中连接酶和连接缓冲液为pGEM-T Easy载体自带。

[0053] (2)将10μL连接体系在4℃下连接过夜。

[0054] 7、转化：

[0055] (1)将10μL连接体系全部加入至100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后，冰浴30min。

[0056] (2)将步骤(1)所得的混合体系在42℃水浴中热激90s后，立刻置于冰浴中2min。

[0057] (3)在步骤(2)所得的混合体系中加入600μL LB液体培养基，于37℃下以200rpm的速率振荡40min，得到活化后的DH5α菌液。

[0058] (4)取200μL活化后的DH5α菌液，加入5μL IPTG和40uL X-gal混合均匀，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB(100μg/ml)平板培养基上涂板，倒置于37℃下培养12～16h，即得目的DNA片段菌落。

[0059] 8、阳性克隆的鉴定与测序：

[0060] (1)用灭菌牙签挑取LB平板培养基上长出的白色抗氨苄青霉素阳性单菌落，于另一含有Amp(100μg/ml)的LB平板培养基上划线，37℃扩大培养8～12h，得到单菌落。

[0061] (2)用牙签蘸取少量画线培养的单菌落，涂于灭菌的PCR管底部。

[0062] (3)PCR反应体系：

[0063] PCR反应体系由0.4μL P1(10μM)、0.4μL P2(10μM)、10μL Premix LA TaqTMDNA聚合酶(Takara产品)组成，并用ddH2O补终体积至20μl。

[0064] 其中Premix LA Taq是含有2倍浓度的DNA Polymerase、Buffer、dNTPMixture的混合物。

[0065] PCR反应体系按下列程序进行：

[0066]

[0067] 反应结束后，用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶检测，确定目的基因片段已经插入到pGEM-T Easy载体中。

[0068] (4)用牙签挑取步骤(3)鉴定获得的阳性单菌落到含有Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中，于37℃下以200rpm的速率震荡培养过夜。

[0069] (5)吸取700μL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，加入300μL 50％灭菌甘油，混匀，送上海生工生物工程有限公司测序。

[0070] 测序后获得扁蓿豆脱水素蛋白MrY2K4基因长1192bp和序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸全序列，包含有825bp的开放读码框、149bp的5’UTR区和218bp的3’UTR区；获得扁蓿豆脱水素蛋白MrY2K4的如序列表SEQ ID NO：2所示的274位氨基酸残基序列，其含2个Y-片段([T/V]D[E/Q]YGNP)和4个K-片段(EKKGIMDKIKEKLPG或其衍生物)，为Y2K4型脱水素蛋白。该蛋白分子量(Mw)为27.34kD，理论等电点(pI)为7.04，总平均疏水性指数Grand average ofhydropathicity(GRAVY)为-1.094，具有较高的亲水性。

[0071] 采用Pfam数据库(http://pfam.janelia.org)对MrY2K4编码的氨基酸序列的结构域进行搜索，发现MrY2K4蛋白属于LEA II蛋白家族，存在2个Y-片段(虚线框标出)和4个富含赖氨酸的K-片段(实线框标出)(图2)，为Y2K4型脱水素蛋白。

[0072] 在NCBI数据库中利用BLAST对MrY2K4编码蛋白质的氨基酸序列和其它物种YnKn型DHN蛋白的氨基酸序列比较(图2)，发现与Y2K4型紫花苜蓿(Medicago sativa)氨基酸序列一致性(identity)最高，为96％。

[0073] 对从NCBI下载的紫花苜蓿(Medicago sativa)、东方山羊草(Galega orientalis)和月季(Rosa chinensis)等8个YnKn型DHN蛋白氨基酸序列构建系统进化树(图3)发现，MrY2K4与豆科苜蓿属植物Y2K4蛋白的亲缘关系最近，蔷薇科不同物种聚为一组，禾本科聚为一组，显示出YnKn型DHN蛋白有种属特性。

[0074] 实施例2与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白基因MrY2K4的表达特性分析

[0075] 1、扁蓿豆幼苗非生物胁迫与ABA处理

[0076] (1)将扁蓿豆种子按实施例1中的方法经过浓硫酸处理、萌发、移栽生长至3周后，进行非生物胁迫和ABA处理，于不同处理时间点取整株幼苗，取样后液氮速冻，-80℃冰箱保存，以备提取总RNA。

[0077] (2)干旱处理：将幼苗从培养基质中移出，用蒸馏水洗净根部基质，用吸水纸吸去多余水分后，置于培养皿中，在室温下自然脱水，分别于0h、2h、4h、6h和8h，取整株幼苗。

[0078] (3)NaCl胁迫处理：每周用150mmol/L NaCl水溶液从花盆底部浇灌，至培养基质饱和，分别于处理0h、8h、10h、3d、7d和14d，取整株幼苗。

[0079] (4)低温处理：在智能人工气候培养箱内进行，设置温度为4℃，分别在0h、8h、10h、3d、7d和14d，取整株幼苗。

[0080] (5)ABA处理：将幼苗从培养基质中移出，用蒸馏水洗净根部基质，用吸水纸吸去残余水分后，置于铺有吸水纸的培养皿中，整株用含有0.05％Tween20(v/v)的100μmol/L脱落酸溶液(ABA)喷浇后，封盖以防植株自然脱水，分别于0h、0.5h、1h、3h、6h和12h，取整株幼苗。

[0081] 2、从经不同处理后的扁蓿豆组织中取样，然后进行液氮速冻，并提取其总RNA。

[0082] 3、MrY2K4基因转录的半定量RT-PCR分析

[0083] (1)将提取的总RNA按照实施例1中合成方法合成cDNA第一链，然后再进行PCR反应，PCR反应体系由1μL cDNA、0.4μL P1(10μM)、0.4μLP2(10μM)、10μL Premix LA TaqTMDNA聚合酶(Takara产品)组成，并用ddH2O补终体积至20μL。

[0084] 其中Premix LA Taq是含有2倍浓度的DNA Polymerase、Buffer、dNTPMixture的混合物，DNA Polymerase使用了适合长片断扩增、性能优良的TaKaRaLA Taq。

[0085] PCR反应体系按下列程序进行：

[0086]

[0087] 在进行MrY2K4基因扩增时，在相同反应体系和反应条件下，对扁蓿豆Actin基因扩增，作为内参基因，所用Actin引物序列如下：

[0088] MrActinF:5’-TGCTTCTAACTGAGGCTCCACT-3’(SEQ ID NO：5)

[0089] MrActinR：5’-AAAGGACTTCTGGGCAACG-3’(SEQ ID NO：6)

[0090] 扩增反应结束，直接吸取4μL PCR反应液，用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶检测。

[0091] (2)对经过不同非生物胁迫和ABA处理的扁蓿豆幼苗中MrY2K4基因转录的半定量RT-PCR检测，以Actin基因为对照，发现MrY2K4基因在扁蓿豆幼苗中为诱导型表达，表达水平受胁迫程度和ABA处理的影响(图4～7)。

[0092] (3)对扁蓿豆不同组织内的MrY2K4基因转录进行半定量RT-PCR检测，以Actin基因为对照，显示MrY2K4基因在扁蓿豆的根、茎、叶和花中为组成型表达，表达没有组织特异性(图8)。

[0093] 实施例3与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白基因MrY2K4的原核表达

[0094] 1、原核表达引物设计：

[0095] 根据测序结果设计引物P3和P4，用以扩增MrY2K4基因的编码区DNA序列，并分别在DNA序列5’-端和3’-端引入BamHⅠ和SacⅠ两个酶切位点(下划线)。

[0096] P3：5’-CGCGGATCCATGTCTCAATATCAACAAAGTCAT-3’(SEQ ID NO：7)

[0097] P4：5’-CTGGACCACGTACTAGACAGTAGGAGCTCGCG-3’(SEQ ID NO：8)

[0098] 2、用质粒小提试剂盒(上海生工产品)提取重组质粒和表达载体pET-30a(+)质粒(Novagen产品)。

[0099] 3、MrY2K4基因编码区序列PCR扩增与克隆：

[0100] PCR反应体系由25μL 2×LA Buffer I、4μL dNTP(25Mm)、1μL P3(10μM)、1μL P4(10μM)、0.14μL LATMTaq DNA聚合酶(Takara产品)、0.14μL PyrobestTMDNA聚合酶(Takara产品)、2μL含有MrY2K4基因的pGEM-T Easy重组质粒(稀释50倍)(Progema产品)组成，并用ddH2O加至终体积为50μL。

[0101] 其中dNTP由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2.5mM。

[0102] PCR反应体系按下列程序进行：

[0103]

[0104] 反应结束后，得到MrY2K4基因编码区的PCR产物。

[0105] 4、用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工产品)回收MrY2K4编码区PCR产物。

[0106] 5、MrY2K4编码区PCR产物用Ex DNA聚合酶(Takara产品)加尾处理后，连接到pGEM-T Easy载体(Progema产品)后进行测序确认。

[0107] 6、目的基因片段和表达载体pET-30a的双酶切：

[0108] 将含有MrY2K4编码区DNA序列的pGEM-T Easy载体(Progema产品)和原核表达载体pET-30a(Novagen产品)用BamHⅠ(NEB产品)和Sac I(NEB产品)进行双酶切，酶切产物用质量浓度为0.7％的琼脂糖凝胶分离，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和载体片段。

[0109] 7、连接与鉴定：

[0110] 将待插入片段的目的基因双酶切产物和pET-30a(+)的双酶切产物按摩尔数10：1的比例混合，加入T4 DNA连接酶(Promega产品)，在4℃下连接过夜。

[0111] 取5μL连接产物加入至50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行转化，采用卡那霉素(Kan)抗性筛选，长出的菌落直接用PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆摇菌，提取质粒，再用BamH I和SacⅠ进行单/双酶切鉴定(图9)。

[0112] 8、转化及蛋白质表达：

[0113] 将含有目的DNA片段的pET30a-MrY2K4质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen产品)感受态细胞，用卡那霉素(Kan+)和氯霉素(Chl)进行抗性筛选。挑取阳性克隆接种于含50μg/mL Kan+和34μg/mL Chl的LB液体培养基内。于37℃下以260rpm的速率摇菌，菌液摇过夜后，按1:100(v/v)转接到新鲜的LB培养基中培养2～3h至OD600达到0.6～0.8后，取出1mL菌液作为诱导前样，其余菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为100mg/mL，于37℃下以286rpm的速率诱导培养2h。诱导培养结束后，吸取1mL诱导表达的菌液作为诱导后样。

[0114] 9、表达蛋白的分离纯化：

[0115] 其余诱导后的菌液以4℃，12000rpm离心20min，弃上清液，菌体沉淀用15mL含10mM Imidazole(咪唑)(pH7.4)和PBS缓冲液(pH7.4)[(20mMNa2HPO4，0.5M NaCl)]在冰上轻柔悬浮彻底，超声15min完全破碎诱导后菌体细胞。4℃，12000r/min离心20min，小心吸取1mL上清作为上清样，其余上清冰上备用。菌体沉淀用15mL pH7.4含10mM Imidazole和PBS缓冲液在冰上悬浮，取1mL为沉淀样。备用的上清用Ni2+负载的金属螯合亲和层析柱(Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow)(GE Healthcare产品)来纯化分离目的蛋白。分别以pH7.4 PBS+10mM～500mM Imidazole溶液进行梯度洗脱目的蛋白，得到纯化样品。

[0116] 诱导前样、诱导后样、上清样、沉淀样、纯化样品内加入2×SDS-PAGE上样缓冲液(2×SDS-PAGE上样缓冲液:100mmol/L Tris pH6.8,4％(w/v)SDS,0.2％(w/v)溴酚蓝，20％(v/v)甘油，2％(v/v)β-巯基乙醇)，100℃水浴10min后，冷却至室温，再以12000rpm的速率离心10min，取10μL上清液进行15％SDS-PAGE电泳。如图10所示，经过IPTG诱导后，大肠杆菌培养物总蛋白中出现了目标蛋白质条带，用pH7.4 PBS+275mM Imidazole溶液成功洗脱纯化出目标蛋白(图10)，表明MrY2K4基因可在大肠杆菌中高效表达并具有一定的亲水性。

[0117] 实施例4与扁蓿豆抗逆性相关的脱水素蛋白在改良植物和微生物抗盐和耐热方面的应用

[0118] 1、菌液滴板试验：

[0119] 大肠杆菌培养和IPTG诱导条件如实施例3所述，当IPTG诱导的大肠杆菌菌液OD600至1.0左右时，用含有50mg/L的卡那霉素，34mg/L氯霉素和0.5mmol/L的IPTG的LB液体培养基稀释起始菌液10倍，从中取原菌液以及稀释后的菌液各10μL滴到含有50mg/L卡那霉素和0.5mmol/L IPTG的固体LB培养基上，37℃培养。盐胁迫试验中，培养3d后观察对照和处理的大肠杆菌生长情况；热胁迫试验中，培养16h后进行观察。

[0120] 2、菌落计数分析

[0121] 将IPTG诱导的培养物(OD600≈1.0)，用含有50mg/L卡那霉素、0.5mmol/LIPTG的新鲜LB液体培养基稀释10倍，取100μL均匀涂布于含有50mg/L的卡那霉素，34mg/L氯霉素和0.5mmol/L IPTG的固体LB平板上，37℃培养后进行菌落计数，计算大肠杆菌菌落存活率。如同定性分析试验，盐胁迫试验，培养3d；热胁迫试验，培养16h。

[0122] 高盐胁迫处理分别为在LB培养基中添加终浓度为0.5mol/L的NaCl和KCl。温度胁迫试验中，高温处理为将原菌液和稀释菌液置于55℃的水浴中温育30min。在上述试验中同时以含有pET-30a(+)BL21(DE3)pLysS菌株为对照。

[0123] 由图11和图12可知，MrY2K4表达能够明显提高大肠杆菌在上述胁迫条件下生长和存活能力。菌落计数结果显示，在0.5mol/L NaCl和KCl高盐胁迫下，MrY2K4表达菌株的存活率分别为25.46％和25.59％，而含有空载体pET-30a(+)的菌株存活率分别2.19％和3.63％；55℃高温处理后，MrY2K4表达菌的存活率为29.92％，空载体菌株存活率仅为7.96％(图12)。

[0124] 综上所述，MrY2K4蛋白过量表达在逆境胁迫下对大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方法可将该基因用于改良植物和微生物的抗盐和耐热性。

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