发明领域

本发明涉及鉴定和获得能够在植物中改变逆境耐受性，特别是耐 寒性的方法。本发明也涉及这样获得的分离的核酸。本发明此外涉及 获得具有改变的逆境耐受性的植物以及通过本发明的方法获得的植 物。本发明还涉及具有改变的对寒冷逆境的耐受性的酵母菌株。

背景

环境逆境状况，例如太阳能、水或养分的短缺或过量、高盐度和 污染(例如重金属污染)，可以对植物生长具有重要影响，并可以显 著地降低植物产量。渗透逆境-一种类型的环境逆境-可通过过量的 盐度、干旱、过热、寒冷或冻结的状况而诱导。

寒冷逆境可通过低于允许特定植物物种最适宜生长的范围的温度 诱导。各植物物种或品种具有生长速率最大的最适生长温度。越远离 此最适生长温度，对植物的逆境越大。许多植物物种，特别是来自热 带或亚热带的植物物种，对寒冷很敏感。例如，已经估计如果全世界 的平均温度下降仅仅在0.5到1.0℃之间，全世界的水稻产量将减少 40％(Salisbury和Ross，Plant Physiology.4thed.Wadsworth Publishing Company，Belmont，CA，1992)。然而来自温带的植物在 经历适应低的但不冻结的温度的过程后，具有使它们的新陈代谢适应 并于冻结温度存活的能力，该过程称为寒冷顺应。例如非顺应黑麦一 般无法存活于低于-5℃的温度，但在寒冷顺应之后，它可以经受低 到-30℃的温度。寒冷顺应的过程涉及许多基因表达的改变。植物的 经受寒冷的能力可能不同，这可导致周期性的但是并非显著的植物生 产力的损失。因此，通过评估低于任意给定植物的通常生长温度的温 度的风险而确定农作物或园艺植物可以种植的区域。

在寒冷顺应期间最显著的变化包括生长的缩减或停止、组织水含 量的减少(Levitt；Responses of Plants to Environmental Stresses， Vol.1.2nd edn.Academic Press.New York，NY 980)，短暂的 脱落酸(ABA)水平的增加(Chen等，Plant Physiology 71，362-365， 1983)，膜脂组成的改变(Lynch和Steponkus，Plant Physiology 83， 761-767，1987；Uemur a和Steponkus，Plant Physiology 104，479 -496，1994)，诸如脯氨酸、甜菜碱、多元醇和可溶性糖等相容渗透 物的聚积以及抗氧化剂水平的增高(Koster和Lynch，Plant Physiology 98，108-113，1992；Kishitani等，Plant，Cell and Environment 17，89-95，1994；Murelli等，Physiologia Plantarum 94，87-931995；Nomura等，Euphytica 83，247-250， 1995；Drffling等，Plant Molecular Biology 23，221-225， 1997；Tao等，Cryobiology 37，38-45，1998)。

已知鉴定和分离在寒冷逆境期间差异表达的基因或蛋白的多种方 法。例如，作图技术可以确定涉及寒冷耐受性的基因的染色体位点(Pan 等，Theoretical and Applied Genetics 89，900-910，1994；Galiba 等，Theoretical and Applied Genetics 90，1174-1179，1995)。 另一种方法涉及突变分析，其中分离并表征具有改变的耐寒性反应的 突变体。例如，eskimol，赋予顺应的野生型植物提高的2℃冷冻耐受 性，是从筛查了组成型冷冻耐受突变体的800000个乙基甲基磺酸酯 (EMS)诱变的鼠耳芥属株系的集合中分离出来的(Xin和Browse， PNAS 95，7799-7804，1998)。相反，筛查了植物株系中在寒冷顺 应方面有缺陷的突变体(Warren等人，Plant Physiology 111，1011- 1019，1996；Knight等，Plant Cell 8，489-503，1996)。采用 诱变和报告基因活化的组合分离了cos-、los-和hos-突变体(分别为 组成性、低和高表达渗透反应性基因)(Ishitani等，Plant Cell 9， 1935-1949，1997；Ishitani等，Plant Cell 10，1151-1161，1998； Lee等，Plant Journal 17，301-308，1999)。作图和突变分析策 略的一个缺点是它们并非直接导致编码寒冷诱导基因的核酸的分离。 另一种策略采用cDNA文库的差异筛选和相关技术，在过去已经从不同 的植物物种产生了若干寒冷诱导基因(综述，Xin和Browse，Plant， Cell and environment 23，893-902，2000)。许多这些基因具有 已知的功能并可以分组为涉及干旱逆境、信号传导通路、或与热休克 蛋白、分子伴侣、“抗冷冻蛋白”或调控蛋白相关。一些基因在寒冷 逆境期间高度表达，通常称为COR(COld调控)基因(Tomashow，Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50，571 -599，1999)。

用于设计改造耐寒植物的策略包括诸如甘露醇(US6,416,985)、 脯氨酸(US6,239,332)、海藻糖(US6,323,001)或甘氨酸-甜菜碱 (Hayashi等，Plant Journal 12，133-142，1997；US6,281,411) 等渗透保护物质的聚积。其它的方法涉及对控制逆境反应的信号传导 通路的操作(WO 01/77355)，包括转录因子的应用(WO 01/77311，US 6,417,428，WO 02/44389，US5,891,859)。另外已经采用多种基因 提高耐寒性。例子为COR组的成员(COR15a：US5,296,462，US 5,356,816)、细胞周期相关基因(WO 01/77354)、蛋白激酶相关蛋白 (WO 01/77356)、LEA样蛋白CAP85(US5,837,545)以及磷脂结合蛋 白(WO 02/00697)的应用。然而植物中导致寒冷顺应的信号传导通路以 及赋予对寒冷逆境抗性的基因的身份仍然在很大程度上不为人知。

酵母已经被用来筛选赋予对盐逆境抗性的植物基因。例如，盐敏 感的酵母菌株(JM26)先前已经用来自盐逆境的甜菜的cDNA文库转化， 并用于筛选具有提高的耐盐性的克隆(WO 02/52012)。该转化酵母细 胞丰富培养基(YPD)上或在加入甲硫氨酸和亮氨酸的合成培养基(SD) 上生长，补充了0.15M NaCl或20mM LiCl。与非转化酵母菌株相比， 在选择培养基上显示出更好生长的推定的阳性克隆被分离并作进一步 表征。

然而，以前没有用过利用酵母来鉴定涉及寒冷逆境的植物基因。 Jesus Ferreira等最近在单倍体酵母中的研究(2001)采用转座子诱 变鉴定了10个不同的对耐寒性有反应的酵母基因，其突变导致生长在 15℃停止。所鉴定的基因包括编码谷氨酸合酶(YDL171C)、GTP结合蛋 白(YML121W)、GSK-3Ser/Thr蛋白激酶(YNL307C)以及TFIID组分 (YLR399C)的基因。先前描述了其中3个基因对寒冷有反应(YLR399C， YML121W，YNL307C)，且其中4个分离的基因还涉及对盐逆境的抗性。

发明概述

本发明提供了一种在植物中筛选涉及逆境反应的核酸的新方法， 该方法涉及在二倍体酵母中筛选涉及改变对温度逆境的耐受性/抗性 的植物基因。本发明也提供了通过该筛选鉴定的新的植物基因和这些 基因编码的多肽。也提供了生产具有改变的对环境逆境状况的耐受性 或抗性的植物的方法，包括将上述的基因引入植物。也提供了对环境 逆境状况具有改变的耐受性或抗性的植物，该植物用本发明的基因转 化。

发明详述

根据本发明的第一个具体实施方式，提供了一种鉴定能够在植物 或酵母中改变对寒冷逆境状态的耐受性或抗性的核酸的筛选方法，该 方法包括下列步骤：

(i)提供来自生物体的编码序列的cDNA文库；

(ii)将这些编码序列以可表达的形式引入野生型酵母细胞中；

(iii)使(ii)的酵母细胞在寒冷逆境的条件下生长；

(iv)识别转基因的酵母细胞和野生型酵母细胞之间的差异，优 选识别生长速率的差异；

(v)从与野生型酵母细胞不同的转基因的酵母细胞分离核酸。

野生型酵母细胞优选为野生型二倍体酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母细胞，更优选野生型酿酒酵母W303酵母细胞。此 外优选生物体是植物，该植物优选是盐处理的植物，更优选盐处理的 盐生植物或其一部分，最优选盐处理的甜菜(Beta vulgaris)或其 一部分。

利用酵母细胞鉴定涉及盐或渗透逆境的基因在现有技术中是已知 的。酵母是一种检测赋予对渗透压或盐逆境的耐受性的基因的良好模 型生物体，因为已知允许互补的合适的突变体。WO 02/052012教导了 一种筛选方法，其中用分离自盐逆境甜菜的cDNA转化突变的对盐敏感 的酵母菌株。该方法导致鉴定了可以有助于提高植物对盐、干旱或渗 透逆境的耐受性的基因。这里，第一次把酵母用于涉及寒冷逆境应用 的植物cDNA文库筛选。与WO 02/052012中导致盐敏感的突变由引入 的植物cDNA互补相反，本发明中采用野生型酵母代替突变体；野生型 酵母是二倍体，以避免会最终导致酵母宿主的耐寒性的隐性染色体突 变的任何效应。本发明表明，由于没有适宜的冷敏感突变体存在，用 来自盐逆境的植物的cDNA转化的野生型酵母细胞可用于分离能够赋 予植物对寒冷逆境的耐受性的基因。

术语″耐受性″和″抗性″这里可以互换使用。

筛选方法的第一步涉及提供来自任何生物体的编码序列的cDNA 文库，例如植物动物或真菌。根据本发明的优选特征，该cDNA文库由 植物制成，优选是盐处理的植物，更优选盐处理的盐生植物或其一部 分，更优选盐处理的甜菜植物或其一部分，最优选盐处理的甜菜植物 的叶子。甜菜(sugar beet，Beta vulgaris)，一种相对盐生的农作 物，提供了耐寒性基因的潜在良好来源。尽管本发明通过利用甜菜 cDNA文库进行举例说明，应当理解其它的盐生植物可以同样地为该目 的服务。cDNA文库的制备是现有技术中已知的常规技术，cDNA文库优 选包括该植物细胞的基本上全部mRNA的拷贝。有利的是，单单编码序 列就足够。

筛选方法的第二步涉及将编码序列引入酵母细胞。酵母转化方法， 例如电穿孔或用醋酸锂处理，以及在酵母中包括pYES等酵母载体中表 达基因的方法是现有技术中已知的(例如参见Current Protocols in Molecular Biology，Unit 13(Ausubel等，1994)以及Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Guthrie和Fink，1991))。为了 检测对逆境条件的耐受性或抗性的目的，可以方便地采用一些已知方 法的任意一种将编码序列引入酵母细胞并在其中表达。根据本发明的 一个优选特征，采用了一种基于λ噬菌体的载体，更优选用λPG15在酵 母中引入和表达编码序列。噬菌体λPG15包括可切除的表达质粒 pYPGE15，其可以直接用于大肠杆菌和酵母互补(Brunelli和Pall， Yeast 9，1309-1318，1993)。质粒cDNA文库可以采用cre-lox重 组酶系统从λPG15中回收(Brunelli和Pall，Yeast 9，1309-1318， 1993)。酵母细胞优选为酿酒酵母，更优选为二倍体野生型株系W303， 以及它的甘油磷酸脱氢酶缺陷的二倍体突变株(gpd1)。酵母株系W303 具有MATa/MATα、ADE2/ade2、CAN1/can1-100、CYH2/cyh2、 his3-11，15/his3-11，15、LEU1/leu1-c、LEU2/leu2-3，112、trp1-1： URA3：trp1-3′D/trp1-1、ura3-1/ura3-1基因型，并源自亲本株系 W303-1A和W303-1B(Primig等，Nat.Genet.26，415-423，2000)。 W303gpd1突变株出乎意料地比W303野生型株系更加耐寒(参见图1)。 为了这一原因，在筛选中采用野生型株系，而gpd1突变株作为对比 的标准。因此预期赋予耐寒性的核酸将提高野生型酵母细胞的生长至 与gpd1突变株相当或更好的水平。

有利的是，gpd1基因能够用于提高酵母的耐寒性，例如面包酵母。 已知酵母对寒冷逆境敏感。冷冻逆境特别对酵母作为酵素的质量具有 负面影响。已经突变或改造使甘油磷酸脱氢酶(gpd1)基因灭活(使 用本领域已知的技术)的酵母细胞惊人地比野生型酵母对寒冷和/或冷 冻逆境更为耐受。这个特性可对例如烘焙或酿造工业有益。因而本发 明也提供了一种提高酵母细胞的耐寒性的方法，包括在酵母中下调编 码甘油磷酸脱氢酶的核酸的表达和/或抑制甘油磷酸脱氢酶的活性。而 且本发明通过下调其表达而提供了gpd1基因在改变酵母的逆境耐受 性中的应用。这样获得的逆境耐受酵母细胞可以以纯化形式(例如酵 素)或以组合物(例如生面团)应用。

该筛选的第三步涉及使酵母细胞在逆境条件下生长。将用盐逆境 甜菜的cDNA转化的酵母细胞铺于适宜的培养基上并在寒冷逆境下生 长。选择10℃的温度，因为这个温度仍然允许酵母菌株的最低限度生 长，但所属领域的技术人员可以选择低于最适生长温度的任何其它温 度。在特定一段时间后，选择能在这些寒冷条件下生长的菌落，通过 将该转基因细胞再次在寒冷逆境条件下生长而重复测试它们的耐寒 性。有利的是，来自盐处理植物的cDNA也可以是寻找能赋予针对其它 逆境的耐受性的基因的适宜基础。这可以简单地通过将在上述步骤 (iii)中的酵母细胞在由寻找的基因类型确定的逆境条件下生长而实 现。例如，为了鉴定赋予对热逆境的耐受性的基因，使该酵母细胞在 热条件下生长。根据本发明的优选特征，逆境优选是寒冷逆境。然后 确定是否逆境耐受性来源于该转基因，而不是源自宿主基因组的突变。 为此，从转基因的耐寒酵母克隆去除包括该转基因的质粒，并验证耐 寒性是否也随之消失；第二，从转基因耐寒酵母克隆中分离包括该转 基因的质粒，并再引入非转基因的酵母菌株，然后将新转化的酵母菌 株的耐寒性与非转化的酵母菌株对比。

该筛选方法的第四步是识别生长快的酵母细胞。基于它们在逆境 状态下比未用这样的核酸转化的酵母细胞生长更快的能力识别用赋予 逆境抗性的植物核酸转化的酵母细胞，但是也可以用其它的选择标准， 这取决于施加的逆境的类型。

最后，在筛选方法的最后步骤中，从酵母宿主中分离赋予逆境耐 受性的核酸并进行表征。从酵母中分离核酸和对这些核酸测序的方法 对本领域技术人员是已知的。

本发明也包括上述的筛选方法用于鉴定编码能够赋予植物细胞或 酵母细胞寒冷逆境耐受性的蛋白质的核酸的应用。

如上所述的筛选方法获得了若干编码提高酵母菌株的寒冷逆境耐 受性的蛋白质的核酸，这里命名为CRYO基因和CRYO蛋白。这些核酸 编码的蛋白质全部与液泡或质膜的小泡运输有关。对逆境的反应需要 新陈代谢的适应，包括蛋白及其他组分在不同的细胞器之间，特别在 高尔基氏体和液泡之间，但也在质膜和液泡之间的运输。植物液泡执 行不同的功能，取决于它们所在的细胞类型。它们在细胞生长或功能 中扮演重要角色，作为蛋白质、离子、次级代谢产物和新陈代谢的废 物的存储细胞器。在这最后一方面，液泡也类似于溶酶体。它们含有 降解损坏的或多余的细胞材料的水解酶。对环境条件变化或对逆境的 适应不仅涉及新的细胞组分的合成而且涉及细胞材料的降解。这些降 解过程需要经由内体等膜结合小泡广泛运输材料，同样水解酶也经由 内体传递给液泡。

CRYO4(SEQ ID NO 8)是与At1g72160具同源性的蛋白，后者是 鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中的胞质因子；且其另外与酵母 SEC14(＝YMR079W)具有显著的同源性。该酵母蛋白是一种胞质磷脂酰 肌醇/磷脂酰胆碱转运蛋白，对于从高尔基复合体转运分泌蛋白和蛋 白分泌是需要的(Bankaitis等，(1990) Nature 347，561-562)。在 酵母中，它作为外周膜蛋白与高尔基复合体相关，在磷脂代谢和小泡 运输之间形成联系(Li等，(2000)Mol.Biol.Cell 11，1989-2005)。 在体外它催化磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在膜之间转运，对生存和分泌 是必需的(Tschopp等，(1984)J.Bacteriol 160，966-970)。

CRYO5(SEQ ID NO 10)是一种有RING结构域的蛋白质。RING- 结构域蛋白已知涉及诸如转录和翻译调控的生物过程和靶向的蛋白水 解。RING结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，是一种40到60个氨 基酸长度的C3HC4型锌指结构域。多种有RING指结构域的蛋白显示与 E2遍在蛋白-缀合酶结合(Ubc′s)结合(Freemont(2000)Curr Biol. 10，R84-87)。上述结构域Zf-RING指与在酵母CLASS E液泡分选蛋 白质VPS27中发现的不同。然而，可能有一些保守功能，因为VPS27 也与遍在蛋白化过程和蛋白质转换相关联，存在于CRIO5中的Zf-RING 指结构域通常发现于也涉及遍在蛋白化和蛋白酶体蛋白质降解的蛋白 中。

本发明的其它蛋白属于E类液泡运输突变体组。酵母中的某些突 变体已知为“E类”突变体(Jones等，In：Yeast III，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p363-470，1997)，不能将蛋白正确分 选到液泡。显微分析揭示这些突变株含有大的异常内体结构(Raymond 等，Molecular Biology of the Cell 3，1389，1992)，其中充满了 正常转运到液泡的蛋白。

CRYO1、CRYO2和CRYO3都具有SNF7结构域(Pfam PF03357/ IPR005024；Pfam数据库，Bateman等，(2004)Nucleic Acids Research Database Issue 32，D138-D141)。这3种蛋白在结构上属 于CHMP蛋白家族(Howard等，(2001)J.Cell Sci.114，2395-2404)。 CRYO1(SEQ ID NO 2)和CRYO2(SEQ ID NO 4)彼此是同种型。CRYO1 和它的植物同源物尚未进行功能表征，但它们与酵母SNF7(＝DID1 ＝VPS32＝YLR025W)相关。SNF7突变体属于E类液泡运输突变体组 (Jones等，In：Yeast III，Cold Spring Harbor Laboratory Press， p363-470，1997)。SNF7突变体聚积了与液泡截然不同的显著细胞 器，含有大量通常存在于液泡中的酶，例如水解酶CpY，PrA & PrB。 该蛋白涉及对葡萄糖限制反应的SUC2的去阻抑。SNF7突变体表现出 转化酶去阻抑的降低，蜜三糖的生长缺陷，对葡萄糖的温度敏感生长， 以及纯合子二倍体的孢子形成缺陷。SNF7糖相关表型可以是由于改变 的葡萄糖传感器的转换。这些和其它数据表明从高尔基复合体和从质 膜向液泡的蛋白转运受到了干扰。SNF7与vps20和mos10形成了卷曲 螺旋形成蛋白家族。所述蛋白涉及同一运输步骤，内体到液泡的运输， 但可能参与不同的运输物特异性事件(Kranz等，2001)。

SEQ ID NO 6(CRYO3)是酵母DID2(＝FT11＝YKR035W-A)的植物同 源物，另一E类液泡运输蛋白的成员。DID2与SNF7相关；它具有类 似的结构特征，它可以具有相当的功能，可能属于酵母中同样的蛋白 复合物(Amerik等，Molecular Biology of the Cell，11，3365-3380， 2000)。有报道说人的直向同源物CHMP1涉及膜运输并定位于早期内 体(Howard等，2001)。CHMP1也定位于核基质，因此影响染色质结构 和细胞周期进程，并进一步与PcG蛋白Polycomblike(Pcl)相互作 用(Stauffer等，2001 J Cell Sci.114，2383-93)。

除了改变对寒冷逆境的耐受性，这些蛋白还可涉及蛋白转运和分 选(CRYO1[SEQ ID NO 1/2]、CRYO2[SEQ ID NO 3/4]、CRYO3[SEQ ID NO 5/6]和CRYO4[SEQ ID NO 7/8])、液泡形成、发育或机能(CRYO1， CRYO2，CRYO3)、涉及转录和翻译(CRYO3，CRYO5)、涉及膜流动性 (CRYO4)和蛋白质转换(CRYO5)。

由本发明的筛选方法鉴定的核酸编码的蛋白迄今为止是未知的， 因此，本发明也提供了分离的CRYO蛋白，

(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的序列；

(b)含有具有至少下列序列同一性的序列

i.与SEQ ID NO 2给出的全长序列具有76％，或80％，优选 90％，更优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；

ii.与SEQ ID NO4给出的全长序列具有55％或60％、70％、 80％，优选90％更优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；

iii.与SEQ ID NO 6给出的全长序列具有90.5％或90.6％、 90.7％、90.8％、90.9％，优选91％、92％、93％、94％，更优选 95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；

iv.与SEQ ID NO 8给出的全长序列具有50％，或60％、70％、 80％，优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；

v.与SEQ ID NO 10给出的全长序列具有50％或60％、70％、 80％优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任一项，含有以相应的天然或非天然改变 的氨基酸进行的置换；

本发明的CRYO基因是编码上面定义的CRYO蛋白的任意核酸。

蛋白的“同源物”包括相对于未修饰的目的蛋白具有氨基酸置换、 缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，且具有与它们衍生自 的未修饰蛋白类似的生物学和功能活性。为生产这种同源物，蛋白质 的氨基酸可以被其他具有类似性质(例如类似的疏水性、亲水性、抗 原性、形成或打破α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的氨基酸替 换。现有技术中熟知保守置换表(例如参见Creighton(1984) Proteins，W.H.Freeman and Company)。对于CRYO4或CRYO5，可用 于本发明的方法的同源物与未修饰蛋白具有至少50％序列同一性或相 似性(功能同一性)，或与未修饰蛋白具有至少60％序列同一性或相似 性，或与未修饰蛋白具有至少70％序列同一性或相似性。通常CRYO4 或CRYO5的同源物与未修饰蛋白具有至少80％序列同一性或相似性， 优选至少85％序列同一性或相似性，进一步优选至少90％序列同一性或 相似性，最优选与未修饰蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。对 CRYO2，可用于本发明的方法的同源物与未修饰蛋白具有至少55％序列 同一性或相似性(功能同一性)，或与未修饰蛋白具有至少60％序列同 一性或相似性，或与未修饰蛋白具有至少70％序列同一性或相似性。 通常CRYO2的同源物与未修饰蛋白具有至少80％序列同一性或相似性， 优选至少85％序列同一性或相似性，进一步优选至少90％序列同一性或 相似性，最优选与未修饰蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。对 CRYO1，可用于本发明的方法的同源物与未修饰蛋白具有至少76％序列 同一性或相似性(功能同一性)，通常CRYO1的同源物与未修饰蛋白具 有至少80％序列同一性或相似性，优选至少85％序列同一性或相似性， 进一步优选至少90％序列同一性或相似性，最优选与未修饰蛋白具有 至少95％序列同一性或相似性。对CRYO3，可用于本发明的方法的同源 物与未修饰蛋白具有至少90.5％序列同一性或相似性(功能同一性)， 通常CRYO3的同源物与未修饰蛋白具有至少91％序列同一性或相似性， 优选至少92％序列同一性或相似性，进一步优选至少93％序列同一性或 相似性，最优选与未修饰蛋白具有至少95％序列同一性或相似性。而 且本发明的CRYO蛋白的同源物能够在上述的测定中增加酵母的寒冷 逆境耐受性。

两种特殊形式的同源-直向同源(orthologous)和共生同源 (paralogous)是用来描述基因的祖先遗传关系的进化概念。术语“共 生同源”涉及物种的基因组内的基因重复复制，导致共生同源基因。 术语“直向同源”涉及由祖先遗传关系所致在不同生物体中的同源基 因。这里采用的术语“同源物”也包括了可用于本发明方法的蛋白的 共生同源物和直向同源物。

其它植物物种中的直向同源物可以通过进行所谓的交互blast搜 索而找到。这可以通过涉及用感兴趣的序列(SEQ ID NO 1到10的任 意一个)对任意的序列数据库的第一轮blast进行，例如公众可获得的 NCBI数据库，可以在：http：//www.nebi.nlm.nih.gov找到。如果搜 寻在水稻中的直向同源物，将目标序列对例如在NCBI中可获得的 Oryza sativa Nipponbare 28,469全长cDNA克隆进行blast。当从 核苷酸开始时可以采用BLASTn，当从蛋白开始时，可以采用TBLASTX， 采用标准的缺省值。blast结果可以进行过滤。过滤结果或未过滤结 果的全长序列再与目标序列进行反向blast(第二次blast)。然后对比 第一次和第二次blast的结果。真正的直向同源物为那些与查询序列 再次匹配的序列。在大家族的情形下，采用ClustalW和邻近结合方法 构建种系发生树状结构，以有助于显示分类。

同源蛋白可以被分组为“蛋白家族”，一个蛋白家族可通过功能 和序列相似性分析而定义，例如Clustal W。Clustal W程序可以产 生感兴趣蛋白的同源性蛋白的邻近关系树并给出了它们的结构和遗传 关系的良好的概括。

CRYO1、CRYO2或CRY3蛋白含有SNF7结构域且可以认为是与人 CHMP1和酵母SNF7同样的蛋白家族的成员。SNF7结构域(Pfam PF03357) 发生于真核细胞中涉及蛋白分选和从内体到液泡/溶酶体转运的一组 蛋白质。在Interpro数据库中，SNF7家族描述为真核蛋白的一个家 族，其被不同地描述为假设蛋白、发育蛋白或与酵母SNF7相关。该家 族含有人CHMP1。CHMP1(染色质修饰蛋白(CHromatin Modifying Protein)；带电荷多泡体蛋白(CHarged Multivesicular body Protein))由PRSM1基因的可变(alternative)可读框编码，在复杂 和简单真核生物中都是保守的。CHMP1含有预测的双向核定位信号， 以独特的形式分布于所有检测的细胞系的细胞质和细胞核基质中。人 CHMP1强烈参与多泡体形成。多泡体是充满小泡的内体，将蛋白靶向 到溶酶体内。免疫细胞化学和生物化学分级分离将CHMP1定位至早期 内体，且CHMP1与SKD1/VPS4发生物理相互作用，后者是一种高度保 守的直接与在酵母中多泡体分选关联的蛋白。与突变SKD1蛋白的作用 类似，人CHMP1融合衍生物的过表达扩张了内体区室，并破坏了一些 内体标记的正常分布。在酿酒酵母中的遗传研究进一步支持CHMP1在 小泡运输中的保守作用。删除CHMP1的出芽酵母同源物CHM1，导致羧 肽酶S和Y分选缺陷，且产生异常的、多层片的小泡前区室。该表型 将CHM1分类为E类小泡蛋白分选基因的成员。在该CHMP家族中，可 以发现其它的CHMP蛋白，例如酵母蛋白Chm1p、Chm2p、Vps24p、Chm5p 和Chm6p，或人蛋白AF281064、AF042384、AF151842、AF19226、 AF161483、AF132968和AW965590(Howard等，2001)。所有这些蛋 白组成了具有类似的大小和电荷分布(碱性N末端和酸性C末端)和遍 及完整蛋白序列的序列保守的结构相关蛋白家族(Howard等，2001)。 该结构保守也表明了功能保守：CHM基因产物涉及羧肽酶Y的正确分 选，且可在如Howard等人(2001)所描述的脉冲追踪试验中测定。

CRYO4属于与酵母SEC14同样的家族。CRYO4含有一个SMART数 据库定义的SEC14结构域(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95，5857-5864；Letunic等(2004)Nucleic Acids Res 32， D142-D144)：SEC14结构域发现于酿酒酵母磷脂酰胆碱转移蛋白 (Sec14p)的同源物和RhoGAPs、RhoGEFs和RasGAP、神经纤维瘤蛋白 (NF1)中。也有报道说它是一种脂结合结构域。Db1的SEC14结构域已 知与G蛋白β/Y亚单位结合。在Interpro数据库中也描述了该结构 域(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)(IPR001251)， 其中含有该结构域的蛋白被分组为多种视黄醛/视网膜结合蛋白的家 族，可以是动物中视觉周期的功能组分。细胞视黄醛-结合蛋白(CRALBP) 携带11-顺式视黄醇或11-顺式-视黄醛作为内源性配体，并可以作为 底物携带蛋白调节这些类维生素A与视觉循环酶的相互作用。多结构 域蛋白Trio与LAR跨膜酪氨酸磷酸酶结合，含有一个蛋白激酶结构域， 且具有单独分开的rac-特异性和rho-特异性鸟嘌呤核苷交换因子结 构域。Trio是一种多功能蛋白，整合和扩增涉及协同肌动蛋白重塑的 信号，对细胞迁移和生长是必需的。该家族的其它成员为转移蛋白， 包括可以作为RAC1效应器而发挥功能的鸟嘌呤核苷酸交换因子，从高 尔基复合体转运分泌蛋白所需的磷脂酰肌醇/磷脂酰胆碱转移蛋白以 及提高分离的膜之间的配体转移的α维生素E转移蛋白。可用于本发 明的同源物包括SEC14结构域，且表现出脂质转移活性(Jouannic等， Eur.J.Biochem.258，402-410(1998)描述了一种合适的测定分析)， 包括例如鼠耳芥蛋白At1g72160、At4g09160、At1g22530、At1g72150、 At3g51670、At1g30690、水稻蛋白BAB86220和AY107978编码的玉米 蛋白。

CRYO5在蛋白的羧基末端部分包括RING型锌指结构域，另外还有 一个跨越SEQ ID NO 10的氨基酸(从)15到305的保守序列，对应于 Pfam-B-23829结构域(该结构域推测与C3HC4型Zn-指结构域相结合)， 以及从AA425到473的序列，对应于Pfam-B-2377。与该Pfam-B-2377 结构域相应的CRYO5序列含有在其它同源植物蛋白中也发现的保守氨 基酸序列，且包括序列HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG，其中各种不 同的同源物之间可以发生少于7处错配。CRYO5的植物同源物组成了 一类新的蛋白(CRYO5样蛋白)，其特征在于在蛋白的N末端一半存在 富含丝氨酸的区域，包括上述的保守序列特征(signature)的酸性区 域以及RING指结构域。例示性同源物包括序列NP_196626、NP_974832、 NP_568462.2和AK066069编码的蛋白。

属于这些家族和/或含有一个或多个这些结构域的同源蛋白可以 有利地用于本发明的方法中，以赋予植物细胞或酵母非生物逆境耐受 性，特别是耐寒性。

当最佳地对比时，如果两个序列中的氨基酸残基或核苷酸的序列 分别是一样的，两个多肽或核酸被称为是“同一的”。在两个(或多 个)多肽或核酸之间的序列对比通常通过在“对比窗口”中进行2个 序列的对比来识别和对比局部区域的序列相似性。这里所采用的“对 比窗口”指至少约20个连续位点的片段，通常为大约50到大约200， 更通常为大约100到大约150，在将两个序列最佳排列后，可以将序 列与同样数目的连续位点的参考序列进行对比。用于对比的序列的最 佳排列可以通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl. Math.2，482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性对比算法(J.Mol. Biol.48 443，1970)，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc. Nat.Acad.Sci.85，2444，1988)，这些算法的计算机化实施方案 (Wisconsin遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和 TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison， WI)或通过观察来进行。当采用Needleman-Wunsch算法时，采用10 或11的缺口开放罚分，0.5或1的缺口延伸罚分，如果可能，将全长 序列相互对比。

术语“衍生物”指与SFQ ID NO 2、4、6、8或10所示的天然存 在形式的蛋白的氨基酸相比，可以含有天然或非天然存在的氨基酸残 基的置换、缺失或添加的肽，寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生 物”包括其中氨基酸残基被相应的天然或非天然改变的氨基酸置换的 蛋白。蛋白的“衍生物”包括与天然存在形式多肽的氨基酸相比，可 以含有天然存在的改变的(诸如糖基化、酰基化、肉豆蔻酰化或磷酸 化的)或非天然存在的氨基酸残基(例如生物素化氨基酸，或CNBr处理后改变的氨基酸)的肽、寡肽，多肽，蛋白和酶。蛋白的“衍生 物”也包括携带翻译后修饰的蛋白。与其来源的氨基酸相比，衍生物 也可以包括一个或多个非氨基酸取代基，例如，与氨基酸共价或非共 价结合的报道分子或其它配体，例如结合的促进其检测的报道分子， 以及相对于天然存在蛋白的氨基酸而言非天然存在的氨基酸残基。蛋 白质的“置换变异体”指那些氨基酸序列中至少一个残基被去除且一 个不同的残基插入其位置的变异体。氨基酸置换通常为单个残基，但 可以根据位于多肽的功能限制而成簇；插入通常以大约1-10个氨基 酸残基的数量级，而缺失在大约1-20个残基的范围。氨基酸置换优 选包括保守氨基酸置换。蛋白质的“插入变异体”为那些所述蛋白质 的预先确定的位置引入了一个或多个氨基酸残基的蛋白质。插入可以 包括氨基末端和/或羧基末端的融合以及序列内单个或多个氨基酸的 插入。通常在氨基酸序列内的插入比氨基-或羧基-末端融合小，为 大约1到10个残基的数量级。氨基-或羧基-末端融合蛋白或肽的例 子包括在酵母双杂交系统中采用的转录活化剂的结合结构域或活化结 构域、噬菌体外壳蛋白，(组氨酸)6-标签，谷胱甘肽S转移酶标签， 蛋白A，麦芽糖结合蛋白，双氢叶酸还原酶，标签●100表位，c-myc 表位，FLAG-表位，lacZ，CMP(钙调蛋白结合肽)，HA表位，蛋白C 表位和VSV表位。蛋白的“功能片段”或“缺失变异体”的特征在于 从蛋白质中除去一个或多个氨基酸，而剩余的片段仍然保留了未修饰 蛋白的生物活性，例如在实施例2和3中详述的分析中赋予酵母对寒 冷逆境的能力。这种蛋白的“功能片段”包括蛋白的至少15个连续的 氨基酸残基，对于功能片段最小的大小为提供该序列与被截短的原始 序列至少可比的功能和/或活性的足够长度的序列，而最大的大小不 是关键。通常截短的氨基酸在大约5到大约60个氨基酸的长度。“免 疫学活性”指分子或其特异性片段，如特异性表位或半抗原，其由抗 体识别(即，结合)。可以采用Geysen等人描述的肽扫描技术(Chem Biol. 3，679-688，1996)确定特异性表位。功能片段也可以包括含有对本发 明的蛋白特异性的表位的那些片段。

CRYO蛋白的衍生物、功能片段、置换、缺失或插入变异体优选具 有与未修饰蛋白至少同样或更好的功能活性，如增加酵母的耐寒性的 能力。可以用例如上述的筛选方法或对相关蛋白描述的方法来检测功 能活性。

蛋白的氨基酸变异体可以容易地用现有技术中已知的肽合成技术 制成，例如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作。现有技术中熟知 操作DNA序列来产生蛋白的置换、插入或缺失变异体的方法。例如， 在DNA中预先确定的位点产生置换突变的技术为本领域技术人员熟 知，包括M13诱变，T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)， QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介导的定 点诱变或其它定点诱变方案。

本发明的另一实施方式提供了可通过本发明的筛选方法获得的核 酸，该核酸可以用于改变植物和/或酵母中的逆境耐受性或抗性。根 据本发明的筛选方法鉴定了迄今未知的几种核酸。因此本发明也提供 了编码上述蛋白的分离的核酸，其互补序列或一部分。

术语“核酸”、“核苷酸序列”、“基因”、“多核苷酸”和“核 酸分子”这里可互换使用，指以任意长度的多聚形式的核糖核苷酸或 脱氧核糖核苷酸或两者的组合。该术语也包括双链和单链DNA和RNA。 也包括已知的核苷酸修饰例如甲基化、环化和“加帽”以及用诸如肌 苷的类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸。该术语也包括肽核酸 (PNA)。

本发明的核酸可以有利地用重组或合成方法制成，如PCR克隆机 制。通常这里定义的这类技术在现有技术中是已知的，如Sambrook 等人所描述的(Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)。 也可以通过技术文献中描述的已知技术合成多核苷酸，例如参见 Caruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47，411-418 (1982)，以及Adams等，J.Am.Chem.Soc.105，661(1983)。然 后可以通过合成互补链和在合适的条件下将链一起退火，或通过用合 适的引物序列采用DNA聚合酶加入互补链，而获得双链DNA片段。

编码蛋白的核苷酸序列(基因、编码序列、可读框或ORF)是以可 表达形式存在时(即当编码序列或ORF位于合适的控制序列或调控序 列的控制下时)可以转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。编 码序列或ORF由5′翻译起始密码子和3′翻译终止密码子为界。编码序 列或ORF可以包括但是并不限于RNA、mRNA、cDNA、重组核苷酸序列， 合成制造的核苷酸序列或基因组DNA。编码序列或ORF可以被间插核 酸中断。

“可表达形式”表示分离的核酸分子为适于转录为mRNA和/或翻 译而产生蛋白的形式，无论组成性地或在细胞内或细胞外信号诱导之 后，例如环境刺激或逆境(有丝分裂原、缺氧、低氧、温度、盐、光、 脱水等)或化合物，如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，或例 如抗生素(四环素、氨苄西林、利福平、卡那霉素)、激素(例如赤霉素、 植物激素、细胞分裂素、糖皮质激素、油菜素类固醇、乙烯、脱落酸 等)，激素类似物(吲哚乙酸(IAA)，2，4-D等)、金属(锌、铜、铁等)， 或地塞米松等。如本领域技术人员所知的，功能蛋白的表达还可能需 要一种或多种翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或一种 或多种蛋白-蛋白相互作用，等等。所有这些过程都包括在术语“可 表达形式”的范围内。

基本上编码同一蛋白但分离自不同来源的基因和编码序列可以由 实质上不同的核酸组成。相反地，实质上不同的核酸可以设计实现基 本上相同蛋白的表达。这些核酸是例如给定基因的不同等位基因的存 在或遗传密码子的简并性或密码子使用的差异的结果。优选密码子使 用的不同在http：//www.kazusa.or.jp/codon中给予说明。等位基因 变异体进一步定义为包括单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态 性(INDEL，具有通常小于100bp的大小)。在多数有机体的自然发生 的多态种系中，SNP和INDEL组成了最大一组的序列变异体。另外或 可选地，在特定常规育种程序中，例如在标志物辅助育种中，有时要 求通过对植物进行诱变处理向植物中引入等位基因变异。一种合适的 诱导突变的方法为EMS诱变。接着通过例如PCR的方法来鉴定等位基 因变异体，之后为选择步骤，来选择讨论序列的优异等位基因变异体， 该变异体可以产生生长特性的改变。选择通常通过监测含有目的序列 的不同等位基因变异体(例如SFQ ID NO 1，3，5，7或9)的植物 的生长性能来进行。监测生长表现可以在温室或田野中进行。另外任 选的步骤包括将其中识别了优异等位基因变异体的植物与另一植物杂 交，这可以被用于例如将感兴趣表型特征组合起来。根据本发明的另 一方面，在育种程序中可以利用能够调节编码CRYO蛋白(例如SEQ ID NO 2，4，6，8或10)的核酸的表达的核苷酸序列。例如，在该程序 中，识别一种DNA标志物，该标志物可以与能调节植物中感兴趣蛋白 (例如SEQ ID NO 2，4，6，8或10)的活性的基因(该基因可以为编 码感兴趣蛋白的基因或其它能够影响感兴趣蛋白的活性的基因)遗传 连锁。接着，该DNA标志物可用于育种程序来选择具有改变的生长特 性的植物。现在可利用许多技术识别SNP和/或INDEL。

作为SEQ ID NO 1，3，5，7或9的任一个编码的CRYO蛋白的核 酸的可变剪接变异体的核酸也在本发明的范围内。这里应用的术语“可 变剪接变异体”包括编码CRYO蛋白的核酸的变异体，其中任选地对特 定信号起反应，选择的内含子和/或外显子被切除、替代或加入。现有 技术中已知确定基因的基因组序列中的内含子和外显子位置的方法。 剪接变异体均源自一个同样的前体-mRNA，剪接发生在基因转录后但 在mRNA翻译前，且通常以组织特异性或瞬时的方式调节(例如，使得 mRNA具有组织特异性表达，例如参见Burge等，(1999).Splicing of precursors to mRNAs by the spliceosomes.The RNA World II， Gesteland，Cech和Atkins，eds.(Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，pp.525-560)。优选的变异体 为其中蛋白的生物活性保持不受影响的变异体，可以通过选择性地保 留蛋白的功能片段而实现。制造这种剪接变异体的方法在现有技术中 是已知的，例如通过RNAi(Celotto和Graveley(2002)RNA 8， 718-724)，用核酶，通过在基因中引入突变，通过改变剪接体或改变 信号转导通路诱导可变剪接。

本发明也包括能够与编码SEQ ID NO 2，4，6，8或10所示蛋白 的核酸杂交的核酸。这里采用的术语“杂交”是实质上同源的互补核 苷酸序列彼此相互退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即， 互补核酸都在溶液中。依赖于这一过程的分子生物学工具包括聚合酶 链式反应(PCR；以及所有以此为基础的方法)、差减杂交、随机引物延 伸、核酸酶S1作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示、 以及DNA序列确定。杂交过程的发生也可以其中一个互补核酸固定于 基质例如磁珠、琼脂糖凝胶珠或任何其它树脂。依赖于这一过程的分 子生物学工具包括分离多聚(A+)mRNA。此外，杂交过程的发生可以其 中一个互补核酸固定于固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜，或者 通过如光能无机照相固定于例如硅玻璃支持物(后者已知为核酸阵列 或微阵列或核酸芯片)。依赖于这一过程的分子生物学工具包括RNA 和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬菌斑杂交、原位杂交和微阵列杂 交。为了允许杂交的发生，核酸分子通常被加热或用化学方法变性从 而由双链熔解为两条单链和/或从单链核酸中去除发卡结构或其它二 级结构。例如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成的条件影响着杂交的严 格性。杂交的高度严格性条件包括高温和/或低盐浓度(包括NaCl和柠 檬酸三钠的盐)和/或杂交缓冲液中甲酰胺的存在和/或降低杂交缓冲 液中例如SDS(去污剂)的化合物的浓度和/或从杂交缓冲液中排除诸 如硫酸葡聚糖或聚乙二醇等化合物(提高分子拥挤度)。如Sambrook 等人(2001)分子克隆：实验室手册(3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中描述了常规的杂交条 件，但是熟练技术人员理解可以根据已知的或预期的核酸同源性和/ 或长度来设计多种不同的杂交条件。“严格杂交”的典型条件为例如 在60℃杂交，然后在2XSSC，0.1XSDS以及1XSSC，0.1XSDS中洗涤。

本发明的方法也可以有利地采用DNA或核酸的部分来实施，所述 部分编码保留了CRYO活性的多肽，即与编码SEQ ID NO：2、4、6、8 或10所示的蛋白的核酸相似的生物学功能。DNA序列的部分指从原始 (较大的)DNA分子来源或制备的DNA片段，当在植物中表达时，该 DNA部分产生具有改变的生长特性的植物。该部分可以包括许多基因， 含有或不含另外的调控元件，或可以只包括间隔序列等。

术语“序列的一部分”表示所指的原始序列的截短序列。截短的 核酸序列在长度上可以非常不同；最小的大小为提供与所指的原始序 列至少相当的功能和/或活性的足够大小的序列，而最大的大小并不 关键。在一些应用中，最大的大小通常不比提供原始序列的期望活性 和/或功能所需的大很多。通常，截短的核苷酸序列在大约15到大约 180个核苷酸的长度范围内。然而更有代表性的是，该序列的长度大 约150个核苷酸为最大，优选最大为大约180个核苷酸。通常期望选 择至少大约30，36或45个核苷酸的序列，直至最大为大约60或75 个核苷酸。

本发明定义的DNA序列也可以被间插序列中断，“间插序列”表 示破坏打断感兴趣DNA序列中的编码序列或破坏打断含有感兴趣DNA 序列的DNA序列的表达形式的任意核酸。去除间插序列可恢复编码序 列或所述的表达形式。间插序列的例子包括内含子和可动DNA序列， 例如转座子。“可动DNA序列”表示可以作为重组事件的结果而移动 的任意DNA序列。

本发明也涉及包括本发明的核酸的重组遗传构建体。遗传构建体 有助于将上述的核苷酸序列在植物细胞、组织或器官中引入和/或表 达和/或维持。该遗传构建体优选包括

(i)分离的编码植物蛋白的核酸，所述植物蛋白

(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的序列；

(b)含有与SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的全长序列具有至 少50％或60％、70％、80％，优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或 99％序列同一性；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任意一项，含有以相应的天然或非天然改变 的氨基酸进行的置换；

(ii)与(i)的核酸可操作性地连接的调控元件，该调控元件为植物 和/或酵母可表达启动子；以及任选地

(iii)转录终止序列。

该核酸构建体可以为表达载体，其中核酸可操作性地与一个或多 个允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的调控序列连接。该载体可 以购买得到，适合于转化入植物并适合感兴趣基因在转化细胞中的表 达。

有利的是，任何可通过本发明的筛选方法获得的核酸均可以用于 该构建体；优选采用以上(a)到(d)的任一项定义的核酸。

这里采用的术语“可操作性地连接”指在调控元件和感兴趣基因 之间的功能性连接，从而使调控元件能够起始感兴趣基因的转录。

这里采用的术语“植物可表达启动子”指能够在植物细胞中驱动 转录的启动子。这不仅包括植物来源的任意启动子，例如转录的DNA 序列的天然启动子，也包括能够在植物中指导转录的非植物来源的任 意启动子。该启动子也可以是人工或合成启动子。术语“植物可表达 启动子”包括但不仅限于组成型、诱导型、器官-、组织-或细胞- 特异性和/或发育调控的启动子。术语“调控元件”、“调控序列”、 “控制序列”和“启动子”这里可互换使用，在广义上下文的情形下， 指能够实现它们所连接的序列的表达的调控核酸。

方便地，可以采用任意类型的启动子驱动植物中编码CRYO蛋白的 核酸的表达。更具体地说，组成型启动子可以是但并不仅限于以下之 一：35S启动子(Odell等，Nature 313，482-493，1985)，35S’3 启动子(Hull和Howell，Virology 86，482-493，1987)，Ti质粒 的胭脂氨酸合酶基因的启动子(“PNOS”)(Herrera-Estrella，Nature 303，209-213，1983)或章鱼氨酸合酶基因的启动子(“POCS”，De Greve等，J.Mol.Appl.Genet.1，499-511，1982)。很清楚可 以采用其它的组成型启动子获得类似的效果。可以采用分生组织特异 性启动子，例如rnr(核糖核苷酸还原酶)、cdc2a启动子和cyc07启动 子实现在植物所有生长部分中的表达，由此增加细胞增殖，从而提高 产量或生物量。如果需要的结果为影响种子的特性，例如储藏能力、 种子大小、种子数目、生物量等，那么可以选择种子特异性启动子， 例如p2S2、pPROLAMIN、pOLEOSIN。为了增加萌芽时的生长可以选择 糊粉特异性启动子，从而增加糖转运到胚芽。如果预期的结果是改变 开花器官的数目，可以采用花序特异性启动子，例如pLEAFY。为生产 雄性不结果植物，需要花粉囊特异性启动子。为了影响例如花瓣大小 等花的结构，可以选择花瓣特异性启动子。如果需要的结果是改变特 定器官的生长和/或发育特征，则对启动子的选择取决于要改变的器 官。例如，采用根特异性启动子将导致根部增加的生长和/或增加的 生物量或产量和/或根部的表型改变。当根本身是需要的最终产品时 (这类作物包括甜菜、萝卜、胡萝卜和马铃薯)，这会特别重要。可 以采用果实特异性启动子改变例如果实的外皮强度或增加果实的大 小。可以采用绿色组织特异性启动子增加叶子大小。可以采用细胞壁 特异性启动子增加细胞壁的硬度，从而提高对病原微生物的抗性。可 以采用花粉囊特异性的启动子生产雄性不结果植物。可以采用脉管特 异性启动子增加从叶子到种子的转运。可以采用结节特异性启动子增 加植物的固氮能力，从而增加植物的营养水平。可以采用逆境诱导型 启动子在逆境条件期间驱动核酸表达以增加膜完整性。逆境诱导型启 动子，例如水逆境诱导的启动子WSI18，干旱逆境诱导的Trg-31启动 子，ABA相关启动子rab21或在特定逆境条件下如温度逆境(寒冷、 冰冻、热)或渗透逆境或干旱逆境或氧化逆境或生物逆境下诱导的任 意其它启动子均可以用于驱动CRYO基因的表达。

如果需要的结果是影响植物在不利条件下的耐寒性，那么可以选 择寒冷诱导型启动子，例如prd29、pws18或pcor15。

类似地，术语“酵母可表达启动子”指能够在酵母细胞中驱动转 录的启动子，包括天然酵母启动子以及其它能在酵母细胞中驱动表达 的启动子序列。在酵母中表达的合适的启动子为现有技术中已知例如 参见Current Protocols in Molecular Biology，13单元(Ausubel 等，1994)以及Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Guthrie和Fink，1991)。

本发明的重组基因构建体可以包括来自其它基因的另外调控序列 或其它序列。其中包括来自经典真核基因组基因的转录调控序列(包括 精确转录起始所需要的TATA框，具有或不具有CCAAT框序列)以及另 外的调控元件(即，上游活化序列，增强子和静默子)，其对发育和/ 或外部刺激起反应或以组织特异性的方式改变基因的表达。一种经典 的原核基因的转录调控序列也包括在内，在该情形下它可以包括一个 -35框序列和/或-10框转录调控序列。调控元件也包含赋予、活化或 增强细胞、组织或器官中核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。

在引入植物的构建体中可以任选地采用一个或多个终止子序列。 术语“终止子”包括一个在转录单位末端的控制序列，其为DNA序列， 它发出初级转录本的3’端加工处理和聚腺苷酸化和转录终止的信号。 其它调控元件可以包括转录和翻译增强子。本领域技术人员已知适合 用于本发明的终止子和增强子序列。

另外，可以构建和采用重组核酸，以将本发明的核酸的基因产物 靶向到植物细胞内特定的细胞内区室，或将蛋白定向到细胞外环境。 这通常可以通过将编码转运或信号肽的DNA序列与重组核酸可操作性 连接起来而得到。

本发明的遗传构建体可以进一步包括复制起点序列，它是在特定 细胞类型中保持和/或复制所需的，例如细菌细胞，当遗传构建体需 要在细胞中作为游离型遗传元件(如，质粒或粘粒分子)保持的时候。 优选的复制起点包括但并不限于f1-ori和colE1复制起点。

该遗传构建体可以任选地包括选择标志基因，这里采用的术语“选 择标志基因”包括赋予细胞一种表型的任意基因，它在该细胞中表达 以协助识别和/或选择用本发明的遗传构建体或其衍生物转染或转化 的细胞。合适的标志物可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标志物， 含有重组DNA的细胞因此能够在可杀死未转化细胞的抗生素或除草剂 浓度存在下存活。选择标志基因的例子包括bar基因，其提供对除草 剂Basta的抗性；氨苄西林抗性基因(Ampr)，四环素抗性基因(Tcr)， 细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)，膦丝菌素抗性基因，新霉素磷酸转移 酶基因(nptII)，潮霉素抗性基因，以及氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基 因。视觉标志物，如绿色荧光蛋白(GFP，Haseloff等，Nature 334， 585-591，1997)，β-葡糖醛酸酶(GUS)以及荧光素酶也可以用作选择 标记。

根据另一具体实施方式，本发明涉及编码本发明的蛋白的核酸或 这种蛋白作为选择标志基因在植物或其它生物体中的应用。本发明更 优选涉及编码上述的CRYO蛋白的基因作为选择标志基因的应用，通过 用诸如亚适生长温度等逆境条件处理进行选择。

可通过这里描述的筛选方法获得的核酸编码相对于野生型酵母在 逆境条件下支持酵母更快生长的蛋白，由于这些核酸来源于植物，因 此很可能在引入植物中后这些核酸表达的调节也可以支持植物在逆境 条件下相较于野生型植物更快的生长。因此本发明提供了一种增加植 物的非生物逆境耐受性的方法，包括在这些植物中引入遗传修饰以及 在这些植物中选择编码下列蛋白的核酸序列的经调节的表达的步骤：

(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的序列；

(b)含有与SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的全长序列具有至 少50％或60％、70％、80％，优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或 99％序列同一性的序列；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任一项，含有以相应的天然或非天然改变的 氨基酸进行的置换；

(e)含有(a)到(d)任一项的功能片段。

该蛋白优选增加酵母的寒冷逆境耐受性。同样，本发明提供了一 种增加酵母的逆境耐受性优选对寒冷逆境的耐受性的方法，包括调节 植物中编码CRYO蛋白的核酸序列的表达和/或调节CRYO蛋白的活性。

CRYO蛋白的同源蛋白也可以方便地用于本发明的方法，因此本发 明提供了一种增加植物的非生物逆境耐受性的方法，包括在这些植物 中引入遗传修饰以及在这些植物中选择编码选自以下组的蛋白的核酸 序列的经调节的表达的步骤：

(i)属于CHMP蛋白家族的蛋白

(ii)含有SEC14结构域和表现出脂质转移活性的蛋白

(iii)含有RING指结构域、富含丝氨酸的结构域以及含有特征 “HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性结构域的CRYO5样植物蛋 白，其中可以发生不多于6处置换。

这里采用的“增加的逆境耐受性”包括对于任何给定的逆境，植 物或酵母对该特定逆境的耐受性增加，无论这些植物或酵母是否对该 特定的逆境已经具有一定程度的耐受性，或无论该植物或酵母是否对 该逆境新赋予了耐受性。

该增加的耐受性优选是对温度逆境、渗透逆境、干旱逆境、盐逆 境或氧化逆境的至少一种，更优选寒冷逆境。

这里采用的术语“耐受性”和“抗性”包括对抗逆境的保护作用， 从由环境逆境条件导致的细胞代谢改变、降低的细胞生长和/或细胞 死亡的延迟到实质上完全抑制。有利的是，通过本发明的方法获得的 转基因植物或酵母对环境逆境条件具有耐受性或抗性。

这里采用的术语“环境逆境”包括诸如干旱逆境(水、脱水)、渗 透逆境、盐逆境、温度逆境(由于例如热或霜冻等)的逆境因素。包括 “寒冷逆境”、“急剧冷却逆境”、“冷冻逆境”或“热逆境”的“温 度逆境”是由低于或高于特定生物体的最适生长温度而诱发的逆境。 最适生长温度范围可以容易地确定或为本领域技术人员已知。“渗透 逆境”为细胞、组织、器官或整株植物的失水、缩减的细胞膨胀或缩 减的水含量相关或诱导的任意逆境。“干旱逆境”指细胞、组织、器 官或生物体的剥夺水份或缩减水份供应诱导或相关的任意逆境。术语 “盐逆境”指通常与盐或离子浓度升高相关或尤其诱导的任意逆境， 导致细胞的细胞内或细胞外环境的渗透势的紊乱。“氧化逆境”发生 在寒冷逆境与强光结合的情况，臭氧逆境的情况，病原体感染或受伤 后坏死的情况，衰老和由于应用某些除草剂(如莠去津或百草枯)的情 况。

根据本发明的一个优选特征，逆境为寒冷逆境。方便地，检测酵 母细胞中对环境条件的耐受性或抗性的结果给与了对插入的编码序列 或基因诱导植物对环境逆境的耐受性或抗性的能力的可靠的衡量指 标。分离的核酸赋予植物对环境逆境的耐受性或抗性的能力可以根据 现有技术中已知的方法检测，例如，参见Physical Stresses in Plants： Genes and Their Products for Tolerance，S.Grillo(编者)，A. Leone(编者)(1996年6月)，Springer Verlag；ISBN：3540613471； Handbook of Plant and Crop Stress，Mohammad Peassarakli(Editor)， Marcel Dekker，ISBN：0824789873；The Physiology of Plants Under Stress；Abiotic Factors，Erik T.Nilsen，David  M.Orcutt (Contributor)，Eric T.Nilsen.2nd版(1996年10月)，John Wiley & Sons，ISBN：047131526；Drought，Salt，Cold and Heat Stress： Molecular Responses in Higher Plants(Biotechnology Intelligence Unit))，Kazuo Shinozaki(编者)，Kazuko Yamaguchi- Shinozaki(编者)(1999)。RG Landes Co，ISBN：1570595631；Plants Under Stress：Biochemistry，Physiology and Ecology and Their Application to Plant Improvement(Society for Experimental Biology Seminar Serie)，Hamlyn G.Jones，T.J.Flowers，M.B. Jones(编者).(1989年9月).Cambridge Univ.Pr.(Short)，ISBN： 0521344239；Plant Adaptation to Environmental Stress，Leslie Fowden，Terry Mansfield，John Stoddart(编者)(1993年10月) Chapman & Hall；ISBN：0412490005；或附加的例子。对酵母也存 在类似的方法，例如，参见The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiaw，Pringle，Jones，Broach and Strathern，Cols Spring Harbor laboratory press，1992(New York)；Guide to yeast Genetics and Mollecular and Cell Biology (Methods in enzymology的350和351卷)(Guthrie和Finf编)， Academic Press(2002)San Diego；Yeast Gene Analysis(Brown 和Tuite)(微生物学方法26卷)Academic press(San Diego)；Yeast Stress Responses(编者Hohmann和Mager)Springer Verlag， Heidelberg 1997。

本发明的方法包括植物或植物细胞的遗传修饰。术语“遗传修饰” 指与野生型细胞相比通过人工干预在细胞的遗传内容方面的改变，包 括遗传工程、育种或诱变等技术。遗传内容的改变包括基因组的修饰， 并包括植物细胞染色体以及游离体中遗传材料的添加、缺失和置换。 该术语也包括向植物细胞中加入染色体外信息。遗传修饰优选导致核 酸的经调节的表达。本发明的方法也包括后继的选择步骤，这期间选 择具有需要的特性的植物。选择步骤可以基于检测改变的生长特性的 存在或缺乏，或基于检测与引入的感兴趣核酸相关联的选择或筛选标 志基因的存在或缺乏。

调节(增强或降低)编码CRYO蛋白的核酸的表达或调节CRYO蛋 白本身包括特定的细胞或组织中基因表达改变或基因产物即多肽水平 改变，所述基因或基因产物影响CRYO基因表达或蛋白活性。

通过本发明的筛选方法获得的核酸具有改变植物或酵母对寒冷逆 境的耐受性的能力。也可以通过直接向植物或酵母施用上述核酸编码 的蛋白而获得该效果。

调节编码CRYO蛋白的核酸的表达和/或调节CRYO蛋白本身的水平 和/或活性优选通过重组方法实现。这种重组方法可以包括直接或间接 途径来调节核酸的表达和/或调节蛋白的活性。

例如，间接的方法可以包括向植物中引入能够调节目的蛋白(CRYO 蛋白)的活性和/或目的基因(编码CRYO的基因)表达的核酸。CRYO 基因或CRYO蛋白可以是野生型，即天然的或内源性的核酸或多肽。或 者，它可以是来自相同或其它物种的核酸，该基因作为转基因引入， 例如通过转化。通过精密的人工操作，该转基因在组成和/或基因组 环境方面可以从其天然形式被充分地改变。调节CRYO蛋白的活性和/ 或CRYO基因表达的间接方法还包括抑制或刺激驱动天然基因或转基 因表达的调控序列，可以将这类调控序列引入植物。

一个直接和更优选的方法包括向植物或酵母中引入编码上述的蛋 白或其功能片段的核酸。该核酸可以通过例如转化引入。该核酸可以 来自(无论直接或间接(如果随后改变))任何来源，只要该序列在植物 或酵母中表达时导致CRYO核酸/基因表达的调节或CRYO蛋白活性的 调节。

核酸优选分离自盐生植物，更优选来自甜菜。最优选能够调节植 物中CRYO基因的表达或CRYO蛋白的活性的核酸为SEQ ID NO 1，3， 5，7，9所示的核酸或其同源物、衍生物或功能片段，或为编码SEQ ID NO 2，4，6，8或10所示的蛋白或其同源物、衍生物或功能片段的核 酸。

然而，应当清楚本发明的应用并非仅限于SEQ ID NO 1，3，5，7， 9所示的核酸的应用，也不仅限于编码SEQ ID NO 2，4，6，8或10 的蛋白的核酸，而其它编码SED ID NO 1到10的同源物、衍生物或功 能片段的核酸均可应用于本发明的方法中。本发明的方法可以方便地 用于赋予植物或其部分或酵母对环境逆境条件的耐受性或抗性。

调节核酸/基因的活性可以通过抑制或刺激驱动天然基因或转基 因表达的控制序列来达到，例如，可以将调控序列引入植物或酵母。 “核酸”或“蛋白”可以是野生型，即天然的或内源性的核酸或多肽。 或者，它可以是来自相同或其它物种的异源核酸，该基因作为转基因 引入，例如通过转化。通过精密的人工操作，该转基因的组成和/或 基因组环境可以由其天然形式被充分地改变。调节基因表达也包括基 因的转录物水平的改变，其能够足够诱导一定的表型效应。

根据本发明的一个优选特征，设想核酸的表达增强或提高。现有 技术中已经有许多文件记载了获得提高或增加的基因表达或基因产物 的方法，包括例如强启动子驱动的过表达，转录增强子或翻译增强子 的应用。

然而，下调核酸的表达也可以在植物或酵母中产生改变的逆境耐 受性。方便地，具有改变的逆境耐受性的植物可以通过以有义或反义 方向表达编码CRYO蛋白的核酸而获得。下调技术在现有技术中是已知 的，在酵母中下调表达的类似或其它方法在现有技术中也是已知的(例 如，用弥补宿主菌株的代谢缺陷的基因或用来自细菌的赋予对抗生素 卡那霉素或遗传霉素的抗性的基因来中断ORF)。

本发明的另一具体实施方式提供了含有编码CRYO蛋白的核酸分 子的宿主细胞，优选的宿主细胞为植物细胞或酵母。除了植物细胞， 本发明的多肽也可以在原核或真核生物工程细胞中通过重组表达来生 产，例如细菌、真菌或动物细胞。合适的表达体系为本领域技术人员 已知。

本发明延伸至对非生物逆境优选寒冷逆境有耐受性的植物或酵 母，该植物或酵母具有与相应的野生型植物或酵母相比升高水平的上 述蛋白。因此本发明还包括可通过本发明的方法获得的植物。本发明 因此提供可通过本发明的方法获得的植物，该植物具有增加的逆境耐 受性，且该植物具有改变的CRYO蛋白活性和/或改变的编码CRYO蛋 白的核酸的表达。特别是本发明提供了对非生物逆境优选寒冷逆境具 有增加的耐受性的植物，该植物具有编码选自下组的蛋白或其功能片 段的核酸的增加表达：

(i)属于CHMP蛋白家族的蛋白；

(ii)含有SEC14结构域和表现出脂质转移活性的蛋白；

(iii)含有RING指结构域、富含丝氨酸的结构域以及含有特征 “HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性结构域的CRYO5样植物蛋 白，其中可以发生不多于6处置换；

该增加的耐受性为相对于相应的野生型植物而言。

另外本发明提供了对非生物逆境优选寒冷逆境具有增加的耐受性 的植物，当与相应的野生型植物相比时，该植物具有核酸的增加表达， 所述核酸编码以下蛋白：

(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的序列；

(b)含有与SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的全长序列具有至 少50％或60％、70％、80％，优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或 99％序列同一性的序列；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任一项，含有以相应的天然或非天然改变的 氨基酸进行的置换；

(e)含有(a)到(d)任一项的功能片段。

本发明也涉及一种生产转基因植物、植物细胞或植物组织的方法， 包括向植物、植物细胞或植物组织中引入可表达形式的本发明的核酸 分子或以上定义的遗传构建体。因此，根据本发明的另一具体实施方 式，提供了一种生产相对于相应的野生型植物具有改变的逆境耐受性 的转基因植物的方法，该方法包括：

(i)向植物细胞中引入编码CRYO蛋白或CRYO蛋白家族成员或其 功能片段的核酸；以及

(ii)从所述的植物细胞再生和/或培植成熟植物。

优选逆境为寒冷逆境、盐逆境、渗透逆境、干旱逆境或氧化逆境 的至少一种，逆境更优选为寒冷逆境。

本发明延伸至通过这里描述的任意方法所获得的任意植物细胞、 植物或植物部分或者酵母细胞，和所有的植物部分，包括植物的可收 获部分、种子和繁殖体。本发明也包括含有用本发明的核酸转化的植 物细胞的植物或其一部分。本发明进一步延伸至包括由任意的前述方 法产生的初级转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一 的要求为后代表现出与通过本发明的方法在亲本中所产生的同样的基 因型和/或表型特征。

这里采用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先和后代、植 物部分、植物细胞、组织和器官。术语“植物”因此也包括悬浮培养 物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶子、花、果实、种子、根茎、 鳞茎、根(包括块茎)、茎干枝条(包括茎培养)、配偶体、孢子体、 花粉以及小孢子。本发明的方法中特别有用的植物包括所有属于 Viridiplantae超家族的植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包 括，饲料或草料豆类、装饰植物、食品农作物、树木、或灌木，从包 括下列植物的列表中选择：爵床科(Acanthaceae)、槭树科 (Aceraceae)、菖蒲科(Acoraceae)、铁线蕨科(Adiantaceae)、 龙舌兰科(Agavaceae)、番杏科(Aizoaceae)、泽泻科(Alismataceae)、 葱科(Alliaceae)、芦荟科(Aloeaceae)、六出花科 (Alstroemeriaceae)、苋科(Amaranthaceae)、石蒜科 (Amaryllidaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、密穗蕨科 (Anemiaceae)、观音座莲科(Angiopteridaceae)、番荔枝科 (Annonaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、水蕹科 (Aponogetonaceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、天南星科(Araceae)、 五加科(Araliaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、槟榔科 (Arecaceae)、马兜铃科(Aristolochiaceae)、天门冬科 (Asparagaceae)、铁角蕨科(Aspleniaceae)、芳香草科 (Asteliaceae)、菊科(Asteraceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、落 葵科(Basellaceae)、Bataceae、秋海棠科(Begoniaceae)、小檗科 (Berberidaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫葳科(Bignoniaceae)、 红木科(Bixaceae)、乌毛蕨科(Blechnaceae)、木棉科(Bombacaceae)、 紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)：葱芥(Alliaria petiolata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、Arabispetiolaris、 Arabispumila、南芥属(Arabis sp.)、团扇荠(Berteroa incana)、 Biscutella laevigata、Brassicajunceae、甘蓝类型(Brassica napus)、甘蓝型油菜(Brassica napus var.Napus)、黑芥(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、Brassica oleracea var. gongylo、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、草甸碎米荠(Cardamine pratensis)、岩荠(Cochlearia officinalis)、Dentaria laciniata、 Descurainia pinnata、Draba asprella、Draba verna、葶苈(Draba)、 Erysimum asperum、Erysimum asperum、Erysimum capitatum、 Lepidiumflayum、北美独行菜(Lepidium virginicum)、Lesquerella argyraea、Lesquerella densiflora、Lesquerella  rubicundula、 Lesquerella sp.、香雪球(Lobularia maritima)、缎花(Lunaria annua)、Lunaria rediviva、Neobeckia aquatica、Nerisyrenia camporum、Physaria chambersii、萝卜(Raphanus sativus)、白 芥子(Sinapis alba)、Stanleya pinnata、Streptanthus cordatus、 菥冥(Thlaspi arvense)、圆叶遏蓝菜(Thlaspi rotundifolium)、 凤梨科(Bromeliaceae)、醉鱼草科(Buddlejaceae)、橄榄科 (Burseraceae)、黄杨科(Buxaceae)、莼菜科(Cabombaceae)、 仙人掌科(Cactaceae)、苏木科(Caesalpiniaceae)、水马齿科 (Callitrichaceae)、裂果草科(Calochortaceae)、头花草科 (Calyceraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、大麻科(Cannabaceae)、 美人蕉科(Cannaceae)、山柑科(Capparaceae)、忍冬科 (Caprifoliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、石竹科 (Caryophyllaceae)、木麻黄科(Casuarinaceae)、卫矛科 (Celastraceae)、藜科(Chenopodiaceae)、半日花科(Cistaceae)、 藤黄科(Clusiaceae)、叶柄花科(Cneoraceae)、弯子木科 (Cochlospermaceae)、使君子科(Combretaceae)、鸭跖草科 (Commelinaceae)、铃兰科(Convallariaceae)、旋花科 (Convolvulaceae)、山茱萸科(Comaceae)、榛科(Corylaceae)、景天 科(Crassulaceae)、燧体木科(Crossosomataceae)、葫芦科 (Cucurbitaceae)、火把树科(Cunoniaceae)、柏科(Cupressaceae)、 兔丝子科(Cuscutaceae)、桫椤科(Cyatheaceae)、苏铁科 (Cycadaceae)、莎草科(Cyperaceae)、翅萼树科(Cyrillaceae)、碗 蕨科(Dennstaedtiaceae)、蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)、刺戟科 (Didiereaceae)、五桠果科(Dilleniaceae)、薯蓣科 (Dioscoreaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、龙脑香科 (Dipterocarpaceae)、茅膏菜科(Droseraceae)、鳞毛蕨科 (Dryopteridaceae)、柿树科(Ebenaceae)、厚壳树科(Ehretiaceae)、 胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜英科(Elaeocarpaceae)、沟繁缕科 (Elatinaceae)、岩高兰科(Empetraceae)、尖苞树科(Epacridaceae)、 麻黄科(Ephedraceae)、木贼科(Equisetaceae)、杜鹃花科 (Ericaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、赤苞藤科 (Erythroxylaceae)、鼠刺科(Escalloniaceae)、大戟科 (Euphorbiaceae)、澳番荔枝科(Eupomatiaceae)、豆科(Fabaceae)、 壳斗科(Fagaceae)、大风子科(Flacourtiaceae)、刺树科 (Fouquieriaceae)、瓣鳞花科(Frankeniaceae)、紫堇科 (Fumariaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、 苦苣苔科(Gesneriaceae)、银杏科(Ginkgoaceae)、球花科 (Globulariaceae)、草海桐科(Goodeniaceae)、茶薼子科 (Grossulariaceae)、洋二仙草科(Gunneraceae)、血皮草科 (Haemodoraceae)、喜盐草科(Haloragaceae)、金缕梅科 (Hamamelidaceae)、蝎尾蕉科(Heliconiaceae)、七叶树科 (Hippocastanaceae)、风信子科(Hyacinthaceae)、绣球花科 (Hydrangeaceae)、田基麻科(Hydrophyllaceae)、金丝桃科 (Hypericaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、水韭科(Isoetaceae)、胡桃 科(Juglandaceae)、灯心草科(Juncaceae)、旱白花菜科 (Koeberliniaceae)、刺球果科(Krameriaceae)、唇形科(Lamiaceae)、 樟科(Lauraceae)、玉蕊科(Lecythidaceae)、浮萍科(Lemnaceae)、 狸藻科(Lentibulariaceae)、百合科(Liliaceae)、沼花科 (Limnanthaceae)、沼鳖科(Limnocharitaceae)、亚麻科(Linaceae)、 刺莲花科刺莲花科(Loasaceae)、山梗菜科(Lobeliaceae)、马钱科 (Loganiaceae)、Lomandraceae、藤蕨科(Lomariopsidaceae)、桑寄 生科(Loranthaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、千屈菜科 (Lythraceae)、木兰科(Magnoliaceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)、 锦葵科(Malvaceae)、竹芋科(Marantaceae)、蜜囊花科 (Marcgraviaceae)、苹科(Marsileaceae)、角胡麻科(Martyniaceae)、 花水藓科(Mayacaceae)、黑药花科(Melanthiaceae)、野牡丹科 (Melastomataceae)、楝科(Meliaceae)、蜜花科(Melianthaceae)、 防己科(Menispermaceae)、睡菜科(Menyanthaceae)、含羞草科 (Mimosaceae)、檬立木科(Monimiaceae)、水晶兰科(Monotropaceae)、 桑科(Moraceae)、芭蕉科(Musaceae)、苦槛蓝科(Myoporaceae)、杨 梅科(Myricaceae)、肉豆蔻科(Myristicaceae)、紫金牛科 (Myrsinaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、莲科(Nelumbonaceae)、紫 茉莉科(Nyctaginaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、蓝果树科 (Nyssaceae)、金莲木科(Ochnaceae)、柳叶菜科(Oenotheraceae)、 木犀科(Oleaceae)、方枝树科(Oliniaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、 瓶尔小草科(Ophioglossaceae)、兰科(Orchidaceae)、列当科 (Orobanchaceae)、紫萁科(Osmundaceae)、酢浆草科(Oxalidaceae)、 芍药科(Paeoniaceae)、露兜树科(Pandanaceae)、罂粟科 (Papaveraceae)、西番莲科(Passifloraceae)、胡麻科 (Pedaliaceae)、田葱科(Philydraceae)、新西兰麻科(Phormiaceae)、 商陆科(Phytolaccaceae)、松科(Pinaceae)、胡椒科(Piperaceae)、 海桐花科(Pittosporaceae)、车前科(plantaginaceae)、悬铃木科 (Platanaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、禾本科(Poaceae)、罗 汉松科(Podocarpaceae)、桃儿七科(Podophyllaceae)、花葱科 (Polemoniaceae)、远志科(Polygalaceae)、蓼科(Polygonaceae)、 水龙骨科(Polypodiaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、马齿苋科 (PoRTulacaceae)、报春花科(Primulaceae)、山龙眼科(Proteaceae)、 凤尾蕨科(PteRIdaceae)、安石榴科(Punicaceae)、鹿蹄草科 (Pyrolaceae)、大花草科(Rafflesiaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、 木樨草科(Resedaceae)、帚灯草科(Restionaceae)、鼠李科 (Rhamnaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、假 叶树科(Ruscaceae)、芸香科(Rutaceae)、杨柳科(Salicaceae)、 刺茉莉科(Salviniaceae)、檀香科(Santalaceae)、无患子科 (Sapindaceae)、山榄科(Sapotaceae)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、 三白草科(Saururaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄参科 (Scrophulariaceae)、卷柏科(Selaginellaceae)、苦木科 (Simaroubaceae)、菝葜科(Smilacaceae)、茄科(Solanaceae)、 黑三棱科(Sparganiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、旅人蕉科 (Strelitziaceae)、安息香科(Styracaceae)、箭根薯科 (Taccaceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、 杉科(Taxodiaceae)、山茶科(Theaceae)、金星蕨科 (Thelypteridaceae)、瑞香科(Thymelaeaceae)、椴树科 (Tiliaceae)、菱科(Trapaceae)、孔药花科(Tremandraceae)、 延龄草科(Trilliaceae)、昆栏树科(Trochodendraceae)、旱金 莲科(Tropaeolaceae)、有叶花科(Tumeraceae)、香蒲科(Typhaceae)、 榆科(Ulmaceae)、荨麻科(Urticaceae)、败酱科(Valerianaceae)、 马鞭草科(Verbenaceae)、绿菊科(Veronicaceae)、堇菜科 (Violaceae)、槲寄生科(Viscaceae)、葡萄科(Vitaceae)、百 岁叶科(Welwitschiaceae)、林仙科(Winteraceae)、刺叶树科 (Xanthorrhoeaceae)、Xerophyllaceae、黄眼草科(Xyridaceae)、 泽米科(Zamiaceae)、姜科(Zingiberacea)和蒺藜科 (Zygophyllaceae)。根据本发明的一个优选特征，植物为单子叶或 双子叶植物，例如选自水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、向日葵、油 菜、苜蓿、粟、油菜籽和棉花的农作物。也不排除另外的物种，例如 苋属(amaranth)，朝鲜蓟、芦笋、椰菜、芽甘蓝、甘蓝、胡萝卜、花 椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、含油种 子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、甜菜、甘蔗、番茄、南瓜和茶、树木 和藻类等。更有利的是，通过本发明的方法获得的植物使农作物在逆 境条件下，优选在寒冷逆境条件下以提高的产量、生长、发育和繁殖 力生长。本发明也使作物能够在原本不可能生长的地区生长。

感兴趣基因优选通过转化引入植物。这里涉及的术语“转化”包 括将外源性多核苷酸转移到宿主细胞中，而不考虑用来转移的方法。 多核苷酸可以被瞬时或稳定引入宿主细胞并可以保持非整合，例如， 作为质粒，或可选地，它可以整合入宿主基因组。获得的转化植物细 胞可以用于以本领域技术人员已知的方式再生转化植物。目前植物物 种的转化是一种相当常规的技术，可以方便地采用几种转化方法中的 任意一种来将感兴趣基因引入合适的祖先细胞。转化方法包括运用脂 质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接向植物中注射DNA、 粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微注射。方法可以选自钙/聚乙 二醇方法用于原生质体(Krens等，Nature 296，72-74，1982； Negrutiu I.等，Plant Mol.Biol.8，363-373，1987)；原生质 体的电穿孔(Shillito等，Bio/Technol.3，1099-1102，1985)； 向植物材料微注射(Crossway等，Mol.Gen.Genet.202，179-185， 1986)；DNA或RNA-包被粒子轰击(Klein等，Nature 327，70 1987) 用(非整合)病毒等感染等等，农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化 (Cheng等，1997-WO 97/48814；Hansen1998-WO 98/54961；Hiei 等，1994-WO 94/00977；Hiei等，1998-WO 98/17813；Rikiishi 等，1999-WO 99/04618；Saito等，1995-WO 95/06722)，包括 “flower dip”转化法(Bechtold和Pelletier，Methods Mol.Biol. 82，259-266，1998；Trieu等，Plant J.22，531-541，2000)。

通常转化后，选择植物细胞或细胞组中一个或多个标志物的存在， 该标志物由与感兴趣基因共转移的植物可表达基因编码，接着转化材 料再生为完整的植株。采用现有技术已知的方法，整个生物体可以从 单个转化或转染细胞再生。可以采用本发明的遗传构建体转化能够后 继克隆繁殖(通过器官发生或胚胎形成)的植物组织，且由其再生整 株植物。选择的特定组织取决于对于要转化的特定物种可利用且最适 的克隆繁殖体系而不同。例示性的组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、 胚轴、雌配子体、愈伤组织、现有分生组织(例如，顶点分生组织、叶 腋芽和根部分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和胚轴 分生组织)。

DNA转移和再生后，可以运用例如Southern分析等评估推定转化 植物中感兴趣基因的存在、拷贝数和/或基因组结构构成，可选地或 附加地，新引入的DNA的表达水平可以用Northern和/或Western 分析采取，两种技术都为本领域普通技术人员所熟知。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或传统 育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花受精产生纯合子 的第二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典培育技术繁殖。

产生的转化生物体可以采取多种形式，例如它们可以是转化细胞 和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞都被转化含有表 达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如，在植物中，将转化的根茎 嫁接到未转化的幼芽上)。

本发明也提供了生产与相应的野生型酵母细胞相比具有对非生物 逆境改变的耐受性的转基因酵母细胞的方法，该方法包括向酵母细胞 中引入上述的编码CRYO蛋白的核酸。本发明特别提供了一种生产相对 于相应的野生型酵母对非生物逆境优选寒冷逆境具有增加的耐受性的 转基因酵母的方法，该方法包括向酵母细胞中引入编码选自下组的蛋 白或其功能片段的核酸：

(i)属于CHMP蛋白家族的蛋白；

(ii)含有SEC14结构域和表现出脂质转移活性的蛋白；

(iii)含有RING指结构域、富含丝氨酸的结构域以及含有特征 “HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性结构域的CRYO5样植物蛋 白，其中可以发生不多于6处置换。

另外，本发明提供了一种生产与相应的野生型酵母相比具有对非 生物逆境优选对寒冷逆境增加的耐受性的转基因酵母的方法，该方法 包括向酵母细胞中引入编码以下蛋白或其功能片段的核酸：

(a)含有SEQ ID NO 2，4，6，8或10给出的序列；

(b)含有与SEQ ID NO 2，4，6，8或10给出的全长序列具有至 少50％或60％，70％，80％，优选90％，更优选95％，96％，97％，98％或 99％序列同一性的序列；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任一项，含有以相应的天然或非天然改变的 氨基酸进行的置换；

(e)含有(a)到(d)任一项的功能片段。

另外本发明提供了通过本发明的方法获得的转基因酵母细胞。优 选地，具有编码上述蛋白或其功能片段的核酸的增加表达的该转基因 酵母细胞，当与相应的野生型酵母细胞相比时，对非生物逆境优选寒 冷逆境具有耐受性。

本发明也涉及编码上述CRYO蛋白的核酸或CRYO蛋白本身在改变 植物或其部分或植物细胞的逆境耐受性中的应用。本发明揭示了SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 10所示序列涉及导致逆境耐受性的重要过程， 如具有改变的逆境耐受性的植物所例证的，该植物已经用编码上述的 CRYO蛋白的核酸序列转化。类似地，本发明也涉及编码CRYO蛋白的 核酸或CRYO蛋白本身在改变酵母的逆境耐受性中的应用。该逆境优选 为温度逆境、渗透逆境、干旱逆境、盐逆境或氧化逆境的至少一种。

本发明也包括了CRYO蛋白的同源物的应用，因此本发明涉及一种 蛋白或其活性片段，或编码该蛋白或其活性片段的核酸在改变植物或 其部分或植物细胞的逆境耐受性中的应用，该蛋白选自

(i)属于CHMP蛋白家族的蛋白；

(ii)含有SEC14结构域和表现出脂质转移活性的蛋白；

(iii)含有RING指结构域、富含丝氨酸的结构域以及含有特征 “HDQHRDMRLDIDNMSYEELLALEERIG”的酸性结构域的CRYO5样植物蛋 白，其中可以发生不多于6处置换。

该逆境优选为温度逆境、渗透逆境、干旱逆境、盐逆境或氧化逆 境的至少一种。

本发明也包括了CRYO蛋白的同源物的应用，因此本发明涉及一种 蛋白或编码该蛋白的核酸的应用，该蛋白

(a)含有SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的序列；

(b)含有与SEQ ID NO 2、4、6、8或10给出的全长序列具有至 少50％或60％、70％、80％优选90％，更优选95％、96％、97％、98％或99％ 序列同一性的序列；

(c)含有(a)的置换变异体或插入变异体；

(d)根据(a)到(c)的任一项，含有以相应的天然或非天然改变的 氨基酸进行的置换；

(e)含有(a)到(d)任一项的功能片段。

而且，本发明的转基因植物表现出对寒冷逆境条件的耐受性的特 征可以与赋予植物寒冷逆境耐受性的其它方法结合，例如，甘露醇、 脯氨酸、甘氨酸-甜菜碱、水-通道蛋白等渗透保护剂的应用。因此， 本发明的赋予植物对环境逆境条件的耐受性的方法可以与已知的包括 引入多种逆境耐受性基因的方法结合。这些方法的结合在增强对环境 逆境的耐受性或抗性方面可以具有加合和/或协同效应。

本发明的生产对逆境具有增强的耐受性的植物的方法也可以与其 它感兴趣特性相结合，例如：

(i)除草剂耐性(DE-A 3701623；Stalker，Science 242(1988)， 419)，

(ii)昆虫抗性(Vaek，Plant Cell 5(1987)，159-169)，

(iii)病毒抗性(Powell，Science 232(1986)，738-743；Pappu， World Journal of Microbiology & Biotechnology 11(1995)， 426-437；Lawson，Phytopathology 86(1996)56 suppl.)，

(iv)臭氧抗性(Van Camp，Biotechnol.12(1994)，165-168)，

(v)改善水果的保藏性能(Oeller，Science 254(1991)， 437-439)，

(vi)改进淀粉组成和/或产量(Stark，Science 242(1992)， 419；Visser，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296)，

(vii)改变脂质组成(Voelker，Science 257(1992)，72-74)，

(viii)(生物)聚合物的生产(Poirer，Science 256(1992)， 520-523)，

(ix)花颜色的改变，例如，通过操纵花青素和类黄酮的生物合 成途径(Meyer，Nature 330(1987)，667-678，WO90/12084)，

(x)对细菌、昆虫和真菌的抗性(Duering，Molecular Breeding 2(1996)，297-305；Strittmatter，Bio/Technology 13(1995)， 1085-1089；Estruch，Nature Biotechnology 15(1997)，137-141)，

(xi)生物碱和/或强心苷组成的改变，

(xii)诱导维持雄性和/或雌性生育力(EP-A1 0 412 006；EP-A1 0 223 399；WO93/25695)；

(xiii)花序/花的更长的寿命，以及

(xiv)除温度逆境以外的非生物逆境抗性。

附图说明：

本发明将参考下列附图进行例示说明：

图1：野生型(wt)酵母菌株与gpd1突变体对比的寒冷敏感性。酵 母细胞在YPD(上行)或在SD培养基(下行)上于30℃(对照，左栏)、 10℃(中栏)或15℃(右上)生长。与gpd1株系相比，WT株系表现出 降低的生长。

图2：用CRYO1、CRYO2、CRYO3、CRYO4或CRYO5基因转化的野生 型酵母菌株与用空载体(pYPGE@)转化的wt酵母菌株相比的耐寒性。(a) 用CRYO1、CRYO2或CRYO3基因转化的酵母细胞在10℃生长10天或用 CRYO4基因转化的酵母细胞生长14天后增加的生长。(b)用CRYO5基 因转化的酵母细胞与用空载体(pYPGE)转化的野生型酵母相比增加的 生长。左侧两图为在YPD培养基或SD培养基上在30℃生长的对照。 右侧两图表示在YPD培养基或SD培养基上于10℃生长的同样的酵母 菌株的生长。

图3：来自甜菜的CRYO1和CRYO2序列以及它们在鼠耳芥和酵母 中的同源物之间的序列比对。At＝鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)， Bv＝甜菜(Beta vulgaris)以及Sc＝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

图4：CRYO3序列以及来自多种生物体的同源蛋白之间的序列比 对，表现出不同物种之间的高度保守。At＝鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)；Bv＝甜菜(Beta vulgaris)；Mm＝小鼠(Mus musculus)； Hs＝智人(Homo sapiens)；Sp＝粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

图5：用CRYO1和CRYO2探针对甜菜基因组DNA进行Southern 印迹。采用的酶为BamHI，HindIII和EcoRI。

图6：a)用CRYO2探针的Northern印迹。显示了用250mM NaCl处理甜菜植物后的不同时间点(以小时计)。采用α3-微管蛋白作为对 照。b)用CRYO2探针的Northern印迹。显示了用100μM ABA处理 甜菜植物后的不同时间点(以小时计)。采用α3-微管蛋白作为对照。

图7：野生型酵母(上行)和用CRYO5基因转化的酵母(下行)在 YPD(左图)和补充了1mM叔丁基过氧化氢的YPD(右图)上的生长。

实施例

除非在实施例中另外说明，所有的重组DNA技术根据Sambrook 等人在(2001)分子克隆：实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版 社，NY或第1和2卷的Ausubel等人(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA中所描述的标准操作 程序进行。植物分子工作的标准材料和方法在Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK 联合出版。

实施例1：盐逆境诱导的甜菜cDNA文库的构建：

将甜菜种子(Beta vulgaris cv.Dita)播种在含有沙子和蛭石 (1∶1w/w)的混合物的罐中。将植物在温室条件下生长(8h 20℃，16h 25℃，采用辅助光照以保证最小12h的光周期)。将植物周期性地用 营养液(2.4g/l Ca(NO3)2·4H2O，1g/l KNO3，1g/l MgSO4·7H2O，0.3g/l KH2PO4，5.6mg/l Fequelate(Kelantren，Bayer)，1.1mg/l ZnSO4·7H2O， 3.3mg/l MnO4·H2O，0.3mg/l CuSO4·5H2O，3.8mg/l H3BO3，0.18mg/l (NH4)6Mo7·4H2O)灌溉。为构建cDNA文库，在收获前将3周大小的植物 用200mM NaCl灌溉24h。

以从盐处理的甜菜植物的叶子制备的poly(A)+RNA合成定向 cDNA(cDNA合成试剂盒，Stratagene)。将cDNA连接到噬菌体λPG15 载体中，并用Gigapack III gold packaging extract(Stratagene) 包装。采用cre-lox重组酶系统从λPG15中回收质粒cDNA文库 (Brunelli和Pall，1993)。

实施例2：筛选测定的建立：

本工作中采用的酵母菌株为野生型二倍体菌株W303/W303 (can1-100，his 3-11，15，leu2-3，112，trp1-1，ura3-1，GAL+)(WT)以 及甘油磷酸脱氢酶缺陷的突变体(gpd1)。构建了来自2个gpd1突变 菌株(YRA111(W303-1A mat a gpd1∷TRP1)以及YRA114(W303-1A gpd1∷TRP1 matα))的二倍体菌株。采用了二倍体菌株，因为这些菌 株防止可能导致对寒冷逆境的耐受性的隐性染色体突变的分离。菌株 生长在YPD培养基(2％葡萄糖、2％蛋白胨以及1％的酵母提取物)上或 在SD培养基(2％葡萄糖、不含氨基酸的0.7％酵母氮基(Difco)，50mM MES[2-(N-吗啉代)-乙磺酸]，用Tris调至pH5.5，以及需要的氨基 酸、嘌呤和嘧啶)上。

在第一步中，将WT二倍体菌株对寒冷的敏感性与gpd1突变菌株 相比较。假定甘油的产生可能是对寒冷逆境的反应。在寒冷逆境条件 下监测生长。使酵母菌株生长直至稳定期，将20μl的1/10，1/100 和1/1000稀释的培养物点在YPD和SD培养基上，在15或10℃的温 度下保持10到14天，在30℃下2天作为对照。10℃为测定的允许 WT菌株生长的最低温度。令人惊讶的是，gpd1株系表现出耐寒，而 野生型对寒冷敏感(图1)。这使得可以采用WT株系筛选可以赋予耐寒 性的基因，而gpd1株系可以作为对比研究的标准耐寒酵母株系。

在第二步中，确定了转化的最佳条件。最后最佳的方案为：用30 μl饱和的WT细胞预培养物接种300ml YPD培养基。使培养物过夜生 长，直到 ${\mathrm{OD}}_{660}\cong 0.8,$ 并以2000rpm离心。随后将细胞用水和AcLiTE溶 液(0.1M醋酸锂，10mM Tris-HCl pH7.6以及1mM EDTA(乙二胺四 乙酸，二钠盐))洗涤。然后，将细胞沉淀重悬在2ml的AcLiTE溶液 中，边摇动边在30℃孵育15分钟，之后加入200μl的ssDNA(10 mg/ml)。将细胞悬浮液在Eppendorf管中分为110μl等份，并加入 200ng的cDNA文库。采用Gietz等的热休克转化(Nucleic Acids Res. 20，1425，1992)：简要地说，向每一等份试样加入500μl的 PEG-AcLiTE溶液(含有40％w/w的PEG(聚乙二醇)4000的AcLiTE溶 液)。混合后，将等份试样在30℃下孵育30分钟，之后在42℃孵育 20分钟，然后收获细胞并在200μl的1M山梨醇中重悬。将两个等 份试样铺在含SD琼脂和除色氨酸(gpd1突变的标记物)和尿嘧啶(质 粒的标记物)外所有必需的添加剂的14cm Petri培养皿中。为了定量 转化的效率，4个55μl等份试样与原始的细胞沉淀分开，并用0，10， 50和100ng cDNA文库接种。然后采用同样的转化方案，最后细胞在 100μl山梨醇中重悬，并铺于含有同样的SD培养基的7cm Petri培 养皿中。平均产率为每ng cDNA大约60个菌落。另外观察到用经冷冻 的感受态细胞转化或以一次大规模反应而不是多次小规模反应转化显 著降低了转化的产率。

实施例3：分离CRYO基因：

采用在pYPGE15中构建的cDNA文库用LiCl法转化酵母WT株系 W303(Nucleic Acids Res.20，1425，1992)。通过尿嘧啶原养型在 含亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上选择转化体。转化后3天Petri培养皿 中出现了菌落。在无菌水中收获菌落并通过铺板不同的稀释度而定量 细胞的数目。平均而言将比从转化平板回收的细胞浓度高10倍的细胞 铺于YPD和SD培养基。接着将平板置于10℃的培养箱中，选择8天 后能够生长的菌落。然后再次检查在第一轮中分离的菌落的耐受性， 弃除那些不呈现显著耐受性的菌落。从剩余的菌落，通过在极限培养 基中选择而除去质粒，以分析该耐受性是否取决于该质粒。作为最后 的确认，从能通过先前的控制的菌落中回收质粒，将其转化入野生型 株系，再次进行具有耐受性的克隆的选择。获得的结果列于表1：

表1：在YPD或SD培养基上耐寒酵母转化体选择的筛选操作概述。

将再次确认的阳性克隆测序，显示它们编码不同的基因，其中有 命名为CRYO1，CRYO2，CRYO3，CRYO4和CRYO5(对于冷-耐受)的基 因，表2中给出了概括：

表2： 克隆   独立的分离 具有最高程度的同源性的蛋白： CRYO1     8 未知功能的鼠耳芥(At)蛋白。来自酵母的DID1(SNF7)。 CRYO2     2 未知功能的At蛋白。CRYO1的同种型。 CRYO3     4 未知功能的At蛋白。来自酵母的DID2。 CRYO4     1 酵母SEC14 CRYO5     1 环指结构域蛋白

当转移到酵母中时，编码CRYO1到CRYO5蛋白的基因赋予寒冷逆 境耐受性(图2)。

发现CRYO1与酵母DID1蛋白具有同源性，且经对同源性数据的进 一步分析，显示其与鼠耳芥推定蛋白gi/15233464和gi/15224854具 有显著的同源性(＜90％)(如图3所示)。根据本发明，这些推定的鼠耳 芥蛋白被分别命名为AtCRYO1和AtCRYO2。

CRYO3在鼠耳芥中也是保守的，具有3种推定的蛋白，在数据库 中标注为At1g73030，At1g17730和At4g17680，享有大于90％的同源 性。根据本发明，这些推定的鼠耳芥蛋白被分别命名为AtCRYO3， AtCRYO3.2和AtCRYO3.3。CRYO3在人和小鼠中也是保守的，如在图4 堆积中所示。

实施例4：Southern印迹揭示了甜菜中多于一种同种型

为了确定甜菜基因组中CRYO1和CRYO2的存在并估计该植物物 种中编码血红蛋白的基因的数目，进行了Southern印迹分析。从3 周大小的甜菜叶子中制备基因组DNA(Rogers SO和Bendich AJ， Extraction of total cellular DNA from plants，algae and fungi (Eds)Plant molecular biology manual，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands，1994)。用BamHI，HindIII 或EcoRI消化5mg的DNA，在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，并印迹到尼 龙膜滤器上(Hybond N+，Amersham Life Science)。将膜滤器与对 CRYO1和CRYO2的32P标记探针杂交。在高度严格条件下进行杂交和 洗涤(65℃)(Church GM和Gilbert W.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81，1991-1995，1984)。在所有泳道中一些杂交片段的存在，与用于 消化基因组DNA的限制性内切酶无关，表明基因组中有一些同种型， 特别是对于CRYO2(图5)。

实施例5：在甜菜中CRYO2未被NaCl和ABA诱导

为了研究CRYO2是否也参与甜菜植物对盐逆境的反应，采用 northern印迹分析分析了对暴露于NaCl不同时间起反应的CRYO2 mRNA的聚积。按照Davis等的描述(Basic methods in Molecular Biology.Elsevier.Amsterdam pp.143-1461986)，从对照、250mM Na+或100mM ABA处理的甜菜叶子中分离总RNA，在含有2.2％甲醛 的1％琼脂糖凝胶中分离30mg的总RNA，并印迹到尼龙膜滤器上 (Hybond N，Amersham Life Science)。采用上述的探针进行杂交。 CRYO2特异性探针显示了相应于CRYO2 cDNA大小的仅一个条带。在 65℃，将滤器用4XSSC缓冲液(0.6M NaCl，0.06M柠檬酸三钠，用 HCl调至pH7)，0.1％SDS洗涤两次，5分钟，用0.4XSSC，0.1％SDS 洗涤2次，5分钟。将同样的滤器与含有鼠耳芥α3微管蛋白基因 (Ludwig等，PNAS84，5833-5837，1987)的1.9kb EcoRI片段再次 杂交。如图6a所示，经NaCl处理CRYO2mRNA并没有随时间而聚积， 同样，也没有观察到在ABA处理3小时后CRYO2的诱导(图6b)。

实施例6：CRYO5也给与对氧化逆境的耐受性

将W303pYPGECRYO5和wt酵母(对照)的稀释系列铺于含有1mM 叔丁基过氧化氢(t-BOOH)的YPD培养基上，并在2和4天后检测对氧 化逆境的耐受性。

具有CRYO5的酵母克隆有强t-BOOH耐受表型，且该表型具有很高 的可重复性：在1mM t-BOOH的浓度下，对照酵母细胞根本不生长， 而过表达CRYO5的酵母细胞生长(图7)。

强表型的定义基于drop测试实验。制备不同稀释度的饱和培养物 (1∶10，1∶100，1∶1000)，使其在选择培养基(含1mM t-BOOH的YPD) 上生长。“强表型”为那些以所有测定的稀释度都生长良好的克隆。 “无强表型”表示该克隆以所有稀释度均不生长。表达空质粒的对照 细胞在选择培养基中完全不生长。

实施例7：耐寒植物的构建：

采用标准技术，用在组成型或诱导型启动子控制下的可表达形式 的至少一种CRYO基因转化植物。

实施例8：检测耐寒植物：

使植物经受寒冷逆境足够长的时间段来检测转化植物。当与同样 的未转化植物株系相比时，转化株系表现出在逆境条件期间更好的生 长和/或在逆境条件后更好的恢复和/或更高的产量(生物量和/或 可收获部分)。