技术领域：本发明属于植物品种改良的生物技术，具体说是利用动物钙调 磷酸酶基因遗传转化水稻来提高水稻抗逆性的方法。

背景技术：水稻是世界上近一半人口的主要粮食，水稻的生长和产量主要 受低温、干旱和高盐等不利环境的影响。在我国受干旱、高盐侵害的稻田约占 栽培面积的1/5，而且有日趋严重的趋势。因此，尽快培育出具有广泛抗逆性的 高产、优质水稻新品种对于我国的农业发展具有深远意义。现有植物品种改良 常采用两种方法，一种是传统杂交育种，一种是转基因技术。传统杂交育种方 法存在以下不足：(1)传统杂交育种中基因转移一般只能在生物物种内个体间 进行，基因来源有一定限制；(2)传统杂交育种是对整个基因组进行操作，引 起的变异较大，可预见性较差；(3)传统杂交育种一般历时较长，传统育种方 法培育出一种新品种需要7到8年的时间，而利用基因工程技术培育新品种所 需时间是原来的一半。转基因技术培育新品种的方法具有以下优点：(1)转基 因技术所转移的基因不受生物体间亲缘关系的限制，动物、植物、微生物的基 因可以相互转移；(2)转基因技术是对某个基因进行操作，可准确预知其后代 表现；(3)转基因技术大大缩短了选育的时间和工作量。所以，采用转基因技 术培育水稻新品种越来越受到普遍重视。目前研究结果表明将单独的某个功能 基因转移到植物中，对植物抗逆性的提高很有限；如果将胁迫信号转导通路中 的某个组成成分遗传转化到植物中，通过调节胁迫信号能够更有效地提高植物 抗逆性。植物在逆境胁迫下，细胞质Ca2+浓度迅速升高，并通过一系列的钙信 号引起植物对逆境的适应性。钙调磷酸酶是钙信号通路上的一个重要组成成分， 在动物中，它参与动物细胞的多种功能；在酵母中，钙调磷酸酶能介导酵母的 抗盐性；在植物中至今还未发现和分离到钙调磷酸酶及其基因，但植物中很可 能存在类似的磷酸酶信号途径。

发明内容：本发明研制了一种利用动物钙调磷酸酶基因转化水稻提高其耐 盐耐寒性方法，利用该方法可以显著提高水稻对高盐、低温的适应性，而对其 重要的农艺性状没有不利影响。本发明的方法有以下具体步骤：第一步：以小 鼠钙调磷酸酶催化亚基基因(genebank：J05479)为模板，通过PCR方法获得去 除C-末端自我抑制区的小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因，PCR反应所用的引物 是：p270：5′gcgccggtgc ggtcggggtg tgca 3′；P271：5′gacactctca ctctcttctc gt 3′；第二步：采用质粒pCAMBIA1300构建植物表达载体。在本 发明中，所构建的植物表达载体携带小鼠的去除C-末端自我抑制区的钙调磷 酸酶催化亚基基因，该植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中；第三步： 采用农杆菌介导法将该钙调磷酸酶催化亚基基因遗传转化到水稻中，并得到了 T0和T1代转基因水稻种子；第四步：当代(T0)转基因水稻叶片DNA提取 和Southern blotting分子杂交鉴定，T1代转基因水稻幼苗叶片RNA提取和 Northern blotting分子杂交鉴定，以及T1代转基因水稻幼苗叶片可溶性总蛋白 的提取和钙调磷酸酶活性分析；第五步：T1代转基因水稻幼苗抗盐、抗寒性分 析；第六步：对水稻耐盐相关基因OsCDPK7和rab16A的表达进行分析。

本发明的结果：

一、以小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因(genebank：J05479)为模板，通过PCR 方法获得去除C-端自我抑制区的小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因，PCR反应所 用的引物是：

p270：5′gcgccggtgc ggtcggggtg tgca 3′

P271：5′gacactctca ctctcttctc tg 3′

二、去除了C-端自我抑制区的小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因克隆到 pCAMBIA1300载体上并转化到农杆菌EHA105中。

三、采用农杆菌介导法将该钙调磷酸酶催化亚基基因导入水稻秀水04中。

四、Southern blotting分子杂交的实验结果表明钙调磷酸酶催化亚基基因已 经整合到水稻基因组。分子杂交所用的探针通过PCR方法获得，PCR所用的 引物是：

5′gataatgatg ggaaacctcg tgtgg 3′

5′gcagatgttg agaacattga ccagc 3′

五、Northern blotting分子杂交的实验结果表明钙调磷酸酶催化亚基基因能 够在水稻中正常转录。分子杂交所用的探针通过PCR方法获得，PCR所用的 引物是：

5′gataatgatg ggaaacctcg tgtgg 3′

5′gcagatgttg agaacattga ccagc 3′

六、钙调磷 酸酶活性分析表明转基因能够在水稻细胞中合成有活性的酶。

七、抗逆性生理生化分析表明转基因水稻对高盐、低温的抗性明显提高。 抗盐性分析采用120mMNaCl处理12天，转基因水稻在高盐处理下生长较快， 根生长受盐的影响较对照的小，根长、根鲜重、根干重、Na+和K+含量分析表 明转基因水稻对盐的耐受性明显提高。抗寒分析采用4℃处理24小时，然后转 移到正常的生长条件继续生长，转基因水稻细胞膜受损程度轻于对照水稻，K+ 渗出量较少；转基因水稻低温处理后存活率高于对照水稻。见表1-表5：

表1，高盐对转基因植株和对照植株根生长的影响   0mMNaClcm)   120mMNaCl(cm)  Relative growth(％)   A5   A1   A10   WT：vector   8.22   7.40   8.08   8.07   7.30   6.15   7.88   6.07   88.8   83.1   97.5   75.2

表2，高盐对转基因植株和对照植株根鲜重的影响   0mMNaCl(mg)  120mMNaCl(mg)  reduction(％)   A5   A1   A10   WT：vector   97.2   100.58   103.92   88.78   83.27   81.75   78.17   60.73   14.3   18.7   24.8   31.6

表3，高盐对转基因植株和对照植株根干重的影响  0mMNaCl(mg)   120mMNaCl(mg)  Reduction(％)   A5   A1   A10   WT：vector   10.69   12.56   12.53   10.44   6.61   7.15   7.24   5.29   38.2   43.1   42.2   49.3

表4，低温对转基因植株和对照植株叶片K+渗出量的影响：   K+leakage(mg/g)   P value in F test   A5   A1   WT：vector   2.041   2.959   7.024   0.001773(极显著)   0.042453(显著)

表5，低温对转基因植株和对照植株存活率的影响：   Survival   total   ％   A5   A1   A10   WT：vector   9   8   9   6   9   9   9   9   100   88.9   100   66.7

八、盐胁迫相关基因OsCDPK7和rab16A4表达进行分析，Northern分析中 杂交探针通过PCR方法获得，分析OsCDPK7表达所用的PCR引物是：

P406：  5’-acatcgtcat ggagctctgc gcc-3’

P407：  5’-gagctacgta atatgggctt ccg-3’

分析rab16A表达所用的PCR引物是：

P404：5’-tctgaggatg atggaatggg agg-3’

P405：5’-gcagcttctc cttgatcttg tcc-3’

结果表明转基因水稻对多种逆境的抗性提高与转基因的表达直接相关。蛋 白激酶介导的磷酸化和磷酸酶介导的去磷酸化是植物逆境反应过程中十分重要 的信号途径，二者协调作用来调节植物的抗逆性反应。OsCDPK7和Rab16A是 水稻逆境反应过程激酶信号转导途径中的两个重要组成成员，Rab16A可能是 OsCDPK7的下游作用因子。在高盐胁迫下，本发明中的转基因水稻OsCDPK7 和rab16A两基因的表达模式与对照的没有明显差别，这表明虽然蛋白激酶信号 途径参与水稻抗逆性反应，但钙调磷酸酶转基因水稻抗逆性的提高很可能与激 酶途径不直接相关，而与钙调磷酸酶功能的发挥直接相关。本发明是将动物的 基因遗传转化重要的农作物水稻以提高水稻抗逆性的方法，利用该方法能够明 显提高转基因水稻的抗盐，抗低温等逆境的能力，为培育高产、抗逆和优质水 稻提供一种十分有效的方法。

附图说明：图1是携带钙调磷酸酶催化亚基基因的植物表达载体图；图2 是T0转基因水稻Southern Blotting分子杂交结果图，WT是非转基因水稻， A1～A11是转基因水稻；图3是T1转基因水稻Northern Blotting分子杂交结果， WT是非转基因水稻，A1、A5、A10是转基因水稻；图4是转基因水稻钙调 磷酸酶酶活性分析图，WT是非转基因水稻，A5、A10是转基因水稻；图5是 转基因水稻在盐胁迫下根生长以及根中Na+和K+含量图，A是转基因水稻在盐 胁迫下根生长图，B是转基因水稻在盐胁迫下根中Na+含量图，C是转基因水 稻在盐胁迫下根中K+含量图，WT，非转基因水稻，A5，A10，转基因水稻，

■非转基因水稻

■转基因水稻(A5)

□转基因水稻(A10)；

图6是转基因水稻耐盐性分析，WT是非转基因水稻，A5是转基因水稻； 图7是转基因水稻耐寒性分析，WT是非转基因水稻，A5是转基因水稻；图8 是在不同盐处理时间(0、1和8天)转基因水稻叶片rab16A和OsCDPK7基 因的表达图，WT是非转基因水稻，A1、A5、A10是转基因水稻；图9是在 不同盐处理时间(0、1和8天)转基因水稻茎rab16A和OsCDPK7基因的表 达图，WT是非转基因水稻，A1、A5、A10是转基因水稻；图10是在不同 盐处理时间(0、1和8天)转基因水稻根rab16A和OsCDPK7基因的表达图， WT是非转基因水稻，A1、A5、A10是转基因水稻。

具体实施方式：本实施方式是按如下步骤进行的：

第一步：以小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因(genebank：J05479)为模板，通过 PCR方法获得去除C-端自我抑制区的小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因，PCR反 应所用的引物是：

p270：5′gcgccggtgc ggtcggggtg tgca 3′

P271：5′gacactctca ctctcttctc tg 3′

该基因在细胞中能够组成型表达，基因表达产物具有持续的磷酸酶活性。

第二步：去除了C-端自我抑制区的小鼠钙调磷酸酶催化亚基基因克隆到 pCAMBIA1300载体的多克隆位点上，并采用冻融法将该植物表达载体转化到 农杆菌EHA105中。

第三步：采用农杆菌介导法将该钙调磷酸酶催化亚基基因遗传转化到水稻 秀水04中。方法是将携带该钙调磷酸酶催化亚基基因的农杆菌EHA105与成 熟种子诱导出来的愈伤组织共培养3天，然后转移到含有300mg/l羧苄和50mg/l 潮霉素的MS培养基上进行2次筛选，每次筛选14天。抗性愈伤组织在含有 3mg/L 6-BA 0.5mg/L NAA的MS上再生。再生植株在1/2MS培养基上再生出 根，至此得到完整的转基因植株。

第四步：对转基因植株进行Southern blotting、Northern blotting、磷酸酶活 性分析。(1)提取当代(T0)转基因水稻叶片DNA进行Southern blotting分子 杂交鉴定，结果表明转基因已经整合到水稻基因组中；(2)提取T1代转基因 水稻叶片RNA进行Northern blotting分子杂交鉴定，结果表明转基因在转基因 水稻中正常转录。Southern blotting和Northern blotting分子杂交中所用的探针 均是：

5′gataatgatg ggaaacctcg tgtgg 3′

5′gcagatgttg agaacattga ccagc 3′

(3)对T1代转基因植株叶片的钙调磷酸酶活性进行分析，结果表明转 基因植株的酶活性是对照的4～5倍。

第五步：动物钙调磷酸酶催化亚基基因转化水稻在水稻抗逆中的应用。利 用该方法得到的转基因水稻抗盐、抗寒性明显提高，其特征在于以下具体抗逆 性分析：

1)，抗盐性鉴定。采用120mM NaCl对16日龄的转基因水稻幼苗进行盐 处理，处理时间为12天，然后分析转基因植株和对照植株根的根长、根的鲜重 和干重(根于70℃烘干24小时后测量其干重)、Na+和K+含量。盐胁迫下转基 因水稻耐盐性提高，如在120mMNaCl盐胁迫下，转基因株系A5生长良好，根 生长速度和活力明显好于对照。转基因株系A5根相对生长达到88.8％，对照 的为75.2％；转基因植株A5根鲜重减少了14.3％，对照减少了31.6％；转基 因植株A5根干重减少了38.2％，对照减少了49.3％。而且，转基因水稻根中 Na+含量低于对照23.3％。

2)抗寒性鉴定。16日龄的转基因水稻幼苗和对照水稻幼苗经4℃处理24 小时，然后转移到正常条件下生长。转基因植株叶片细胞膜损伤程度明显低于 对照植株，如转基因水稻叶片的K+渗出量明显低于对照叶片K+渗出量，而且 达到差异极显著。低温处理后，水稻幼苗移到正常生长条件下，转基因植株存 活率为88.9～100％，对照植株存活率为66.7％。

第六步：耐盐相关基因分析。本发明的特征之一是对与水稻耐盐性相关的 激酶信号转导途径中的重要基因OsCDPK7和rab16A的表达进行Northern分 析。Northern分析中杂交探针通过PCR方法获得，分析OsCDPK7表达所用的 引物是：

P406：5’-acatcgtcat ggagctctgc gcc-3’

P407：5’-gagctacgta atatgggctt ccg-3’

分析rab16A表达所用的引物是：

P404：5’-tctgaggatg atggaatggg agg-3’

P405：5’-gcagcttctc cttgatcttg tcc-3’

对转基因水稻和对照幼苗进行不同时间盐处理，盐浓度为150mM NaCl， 处理0、1和8天，然后分析水稻耐盐相关基因OsCDPK7和rab16A的表达情 况。Northern blotting分子杂交结果表明转基因水稻和对照植株的OsCDPK7基 因表达没有明显变化，rab16A基因的表达模式也相似，这表明转基因水稻对多 种逆境的抗性提高与转基因的表达，即钙调磷酸酶信号转导途径直接相关。