一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用
阅读：945发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 主要涉及 生物 技术领域。本发明提供一种抗逆性相关蛋白及其编码基因、改良的抗逆性相关蛋白及其编码基因以及抗逆性相关蛋白及其编码基因在培育 植物 抗逆种中的应用。本发明提供的MsNTF2基因及重组MsNTF2基因在盐、甘露醇和ABA的诱导下表达的蛋白 定位 在细胞核、内质网和细胞膜上，可以提高植物抗旱性和 耐盐性 ；本发明的重组的抗逆性相关蛋白的DNA序列及所编码的蛋白相对于原始蛋白及其编码基因序列在抗逆性(尤其是抗旱性能和耐盐 碱 性能)上增强，为人工控制抗逆相关基因的表达提供了理论 基础 ，利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。，下面是一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用专利的具体信息内容。
1.一种编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列包括与如下a1)-a3)中的任一种DNA序列具有至少90％同源性的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列：
a1)编码区包括SEQ ID NO.2所示的DNA序列，且编码抗逆性相关蛋白的非自然存在的DNA序列；
a2)编码区包括重组DNA序列，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列经系列至少一种编辑方式编辑的序列：
a21)缺失一个或几个氨基酸残基的密码子；
a22)进行一个或几个碱基对的突变；
a23)增加一个或几个氨基酸残基的密码子；
a3)能与a1)或a2)的DNA序列杂交，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括：编码区包含SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所表示的序列的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述抗逆性包括抗旱性和/或耐盐性；所述抗旱性指对抗干旱胁迫的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力。
4.根据权利要求3所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述盐胁迫包括钠离子终浓度为150mmol/L～200mmol/L的逆境或等同逆境。
5.根据权利要求3所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述干旱胁迫包括与甘露醇终浓度为300mmol/L～500mmol/L的逆境相同或等同的逆境。
6.一种扩增权利要求1所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列中任意片段的引物。
7.一种抗逆性相关的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括由权利要求1所述的DNA序列所编码，并通过人工合成和/或生物表达得到的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的抗逆性相关的蛋白质，其特征在于，所述的抗逆性相关的蛋白质包括：包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列的蛋白质。
9.一种权利要求1所述的DNA序列在生物工程领域的应用，其特征在于，所述应用包括制备含有所述DNA序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.一种编码抗逆性相关蛋白的DNA序列在获得抗逆性增强的转基因植物中的应用；所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括权利要求1所述的DNA序列、包含SEQ ID NO.2所示的序列的DNA序列或包含能与SEQ ID NO.2所示的序列杂交且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
一种抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用
技术领域
背景技术
[0002] 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)别称为紫苜蓿、牧蓿等，豆科苜蓿属多年生草本植物，原产于小亚细亚、伊朗、外高加索一带，在中国为栽培植物，现在世界各国都有栽种，为优良饲料植物，可作绿肥，亦可入药。紫花苜蓿是世界上栽培最广泛的豆科牧草。紫花苜蓿富含优质膳食纤维、食用蛋白、多种维生素(包括维生素B、维生素C、维生素E等)、多种有益的矿物质以及皂苷、黄酮类、类胡萝卜素、酚醛酸等生物活性成分。苜蓿适应性广，喜欢温暖、半湿润的气候条件，苜蓿不宜种植在强酸、强碱土中，喜欢中性或偏碱性的土壤，以pH7～8为宜，含盐量小于0.3％，地下水位在1m以下。土壤pH为6以下时根瘤不能形成，pH为5以下时会因缺钙不能生长。可溶性盐分含量高于0.3％、氯离子超过0.03％，幼苗生长受到盐害。
[0003] 紫花苜蓿具有产量高、营养丰富、适应性强等特点。在我国，该牧草主要种植在西北、华北、东北等地区，种植面积约为133.33万hm2，已然成为支撑我国畜牧业发展的重要饲草(杨青川和孙彦，2011；全国苜蓿产业发展规划，2017)。然而，在上述地区，日益加剧的干旱和土地盐渍化状况已使紫花苜蓿的种植面积越来越少，对其产量构成了严重威胁(包爱科等，2011)。
[0004] 逆境(environmental stress)亦称为环境胁迫，对植物生存生长不利的各种环境因素的总称。对植物产生重要影响的逆境主要有水分亏缺(干旱)、低温、高温、高盐、碱、环境污染等理化逆境，和病虫杂草等生物逆境。
[0005] 干旱指某一地区长期无雨或高温少雨，使空气及土壤的水分缺乏。而干旱发生主要与偶发性或周期性的降水减少有关。干旱具有出现频率高、持续时间长、波及范围广等特点。干旱的频繁发生和长期持续，会给农业生产带来巨大的损失，还会造成水资源短缺、荒漠化加剧、沙尘暴频发等诸多生态和环境方面的不利影响。
[0006] 土壤盐分过多，会降低土壤溶液的水势，导致植物严重的生理干旱，使物质不能及时吸收、合成和运输。同时，高浓度的钠离子可置换细胞膜上结合的钙离子，膜功能也随之改变，细胞内外物质无选择进出。高盐土上生长的植物体内常积累过多的盐分，植物代谢过程受影响，如过多的氯离子会阻碍蛋白质的合成，促进毒害物质积累和叶绿体分解；一定浓度的钾离子抑制有机物干重和净光合率的产生以及根质膜ATP酶活性；钠离子浓度高时抑制大多数酶的活性，并且钠离子及氯离子含量过多还会抑制植物对钾、钙等离子的吸收。在盐分胁迫下，气孔保卫细胞内的淀粉形成过程受到妨碍，气孔不能关闭，植物很快缺水枯萎。盐胁迫还会导致自由基、羟自由基、过氧化氢和单线态氧等活性氧的产生，活性氧可使很多生物功能分子失去功能。
[0007] 在逆境胁迫下，植物为了应对逆境条件，会产生一系列的生理生化响应。植物在生理生化和代谢途径的层次响应干旱和盐，绝大多数响应可归因于基因表达水平的变化。植物对逆境的响应相当复杂，通过多个分支、互相平行、互相关联的网络模式进行逐级响应。简而言之，植物在感知并识别逆境信号后，将细胞表面的刺激信号传递给细胞内部，激活转录因子，进而调控下游胁迫响应基因的转录表达。从基因功能角度划分，这些响应可分为调节离子平衡和离子区隔化、渗透调节、抗氧化酶、钙相关蛋白和热激蛋白等。
[0008] 紫花苜蓿目前只有基因组草图，开展遗传学实验较困难。而畜牧业对人们的生活越来越重要，实际生产中将紫花苜蓿按照粮食的种植规模去种植又是不可能的，所以结合实际生产中畜牧业的发展对紫花苜蓿的需求以及紫花苜蓿的种植现状，通过研究和改进紫花苜蓿自身的抗逆性去攻克现有的难题变得十分紧迫和必要。
[0009] 同样的道理，在我国的西北、华北、东北等地区还生长着除紫花苜蓿以外的其它植物，比如其它种类的饲草、药用植物、观赏植物等，面对日益加剧的干旱和土地盐渍化，它们面临着与紫花苜蓿同样的生存问题。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于提供一种抗逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
[0011] 本发明的目的还在于提供一种改良的抗逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
[0012] 本发明通过以下技术方案实现：
[0013] 一种编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，包括与如下a1)-a3)中的任一种DNA序列具有至少90％的同源性，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列：
[0014] a1)编码区包括SEQ ID NO.2中所示的DNA序列的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；
[0015] a2)编码区包括重组DNA序列，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列经下列编辑方式中至少一种方式编辑的序列：
[0016] a21)缺失一个或几个氨基酸残基的密码子；
[0017] a22)进行一个或几个碱基对的突变；
[0018] a23)增加一个或几个氨基酸残基的密码子；
[0019] a3)能与a1)或a2)的DNA序列杂交，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
[0020] 进一步的，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括但不限于编码区包含SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所表示的序列的DNA序列。
[0021] 进一步的，上述a3)中所涉及的杂交操作的条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0022] 上述的DNA序列在生物工程领域的应用，所述应用包括制备含有所述DNA序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。
[0023] 上述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列在获得抗逆性增强的转基因植物中的应用。
[0024] 一种抗逆性相关的蛋白质，包括由上述的DNA序列编码，并通过人工合成和/或生物表达得到的蛋白质。
[0025] 进一步的，所述的蛋白质包括但不限于包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0027] 进一步的，所述盐胁迫具体包括钠离子终浓度为150mmol/L～200mmol/L的逆境或等同逆境。
[0028] 进一步的，所述干旱胁迫具体包括与Mannitol(甘露醇)终浓度为300mmol/L～500mmol/L的模拟逆境相同或等同的逆境。
[0029] 本发明还提供扩增上述DNA序列中任意片段的引物，所述引物包括如序列SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.15中任一所示的引物序列。
[0030] 一种获得抗逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：
[0032] 进一步的，所述转基因植物的制备方法中，所述的编码基因导入是通过重组表达载体导入实现的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入Gateway系统载体pEarleyGate 100的重组位点得到的。
[0033] 进一步的，上述任意所述的方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；优选的，所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0034] 一种获得抗逆性增强的转基因植物。
[0035] 上述植物抗逆性相关蛋白质及其编码基因在增强植物抗逆性中的应用，比如用于烟草、拟南芥、紫花苜蓿等。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 本发明首先实验验证，从紫花苜蓿中克隆得到编码MsNTF2的基因，在干旱、盐和ABA的诱导下表达增加，所编码的蛋白定位到细胞核、内质网和细胞膜上；并且本发明的DNA序列可以提高植物抗旱性和耐盐性，为人为控制抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性增强的植物育种工作中发挥重要的作用。
[0038] 本发明的重组的抗逆性相关蛋白的DNA序列及所编码的蛋白相对于原始蛋白及其编码基因序列在抗逆性(尤其是抗旱性能和耐盐碱性能)上显著增强，有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。附图说明
[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
[0040] 图1.同源性比对MsNTF2与14个物种的氨基酸序列。
[0041] 图2.Real-time PCR(实时荧光定量)分析MsNTF2基因受胁迫诱导表达情况；其中(A)图表为受500mmol/L甘露醇胁迫时MsNTF2表达情况；(B)图表为受150mmol/L钠离子胁迫时MsNTF2表达情况；(C)图表为受80μMABA胁迫时MsNTF2表达情况。
[0042] 图3.MsNTF2在烟草叶片中的亚细胞定位；其中3-1为GFP荧光图像；3-2为marker的荧光图像；3-3为明场图像；3-4为重合图像。
[0043] 图4.分子检测在转基因拟南芥中的目的基因。
[0044] 图5.转基因拟南芥和野生型抗旱性的对比结果图；其中5A为野生型和转基因株系在不同培养基中的萌芽情况对比；5B为野生型和转基因株系在不同培养基中的萌芽率；5C为野生型和转基因株系分别在不同培养基中的根长对比；5D为野生型和转基因株系分别在不同培养基中的根长(左)和鲜重(右)；5E为野生型和转基因株系在失水处理前、失水处理后和恢复供水后的生长情况对比；5F为野生型和转基因株系在干旱胁迫后的存活率对比。
[0045] 图6.转基因拟南芥和野生型耐盐性的对比结果图；其中6A为野生型和转基因株系分别在不同培养基中的萌芽情况对比；6B为野生型和转基因株系分别分别在不同培养基中的萌芽率；6C为野生型和转基因株系分别分别在不同培养基中的根长对比；6D为野生型和转基因株系分别分别在不同培养基中的根长(左)和鲜重(右)；6E为野生型和转基因株系分别在盐处理前和盐处理后的生长情况对比。
具体实施方式
[0047] 本发明提供一种编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，包括与如下a1)-a3)中的任一种DNA序列具有至少90％的同源性，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列：
[0048] a1)编码区包括SEQ ID NO.2所示的DNA序列，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；
[0049] a2)编码区包括重组DNA序列，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列经下列至少一种编辑方式编辑的序列：
[0050] a21)缺失一个或几个氨基酸残基的密码子；
[0051] a22)进行一个或几个碱基对的突变；
[0052] a23)增加一个或几个氨基酸残基的密码子；
[0053] a3)能与a1)或a2)的DNA序列杂交，且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
[0054] 在一些实施例中，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括但不限于编码区包含SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所表示的序列的DNA序列。
[0055] 在一些实施例中，上述a3)的杂交条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0056] 本发明还提供上述的DNA序列在生物工程领域的应用，所述应用包括制备含有所述DNA序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。
[0057] 其中，所述重组载体为将上述DNA序列插入表达载体，得到表达上述蛋白质的重组载体。所述重组载体可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组载体。所述植物表达载体类型既可以是Gateway系统的重组载体也可以是传统酶切载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。
[0058] 本发明还提供上述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列在获得抗逆性增强的转基因植物中的应用。
[0059] 本发明还提供一种抗逆性相关的蛋白质，包括由上述DNA序列编码，通过人工合成和/或生物表达得到的蛋白质。
[0060] 在一些实施例中，所述的抗逆性相关的蛋白质包括：包含SEQ ID NO.1(MsNTF2，DNA序列为SEQ ID NO.2)、SEQ ID NO.3(MsNTF2蛋白第一个氨基酸前插入23个氨基酸序列，即SEQ ID NO.3序列的第1至23个氨基酸序列；DNA序列为SEQ ID NO.16)、SEQ ID NO.4(MsNTF2蛋白第38位的氨基酸T序列氨基酸S序列取代；DNA序列为SEQ ID NO.17)、SEQ ID NO.5(MsNTF2蛋白第14-15两个氨基酸缺失，具体缺失序列为DS；DNA序列为SEQ ID NO.18)所示的氨基酸序列的蛋白质。上述例举的突变DNA序列的编码区均与SEQ ID NO.2所示的DNA序列有至少90％的同源性，为MsNTF2蛋白编码基因的高度同源序列，他们所编码的蛋白质均与MsNTF2蛋白有高度相似的抗逆性。
[0061] 在一些实施例中，所述抗逆性具体为抗旱性和耐盐性；所述抗旱性指对抗干旱胁迫的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力。
[0062] 在一些实施例中，所述盐胁迫具体包括钠离子终浓度为150mmol/L～200mmol/L的逆境或等同逆境；具体包括但不限于钠离子终浓度为150mmol/L、165mmol/L或200mmol/L等逆境。
[0063] 在一些实施例中，所述干旱胁迫具体包括与Mannitol(甘露醇)终浓度为300mmol/L～500mmol/L的模拟逆境相同或等同的逆境；具体包括但不限于与300mmol/L甘露醇、400mmol/L甘露醇、500mmol/L甘露醇或自然失水相同或等同的逆境。
[0064] 本发明还提供扩增上述a1)-a3)中的任一种DNA序列或其任意一部分片段的引物，包括但不限于如序列SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.15中任一所示的引物序列。
[0065] 本发明还提供一种获得抗逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：
[0066] 将上述任意一种所述的编码基因导入目的植物基因组中，获得转基因植物种子；将转基因植物种子人工培育或自然生长成植株。与目的植物相比，转基因植物的抗逆性增强。
[0067] 在一些实施例中，所述转基因植物的制备方法中，所述的编码基因导入是通过重组表达载体导入实现的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入Gateway系统载体pEarleyGate 100的重组位点得到的。
[0068] 在一些实施例中，上述获得抗逆性增强的转基因植物的方法中，所述的植物为拟南芥。
[0069] 本发明还提供一种获得抗逆性增强的转基因植物，所述的转基因植物包括上述a1)-a3)中的任一种DNA序列。
[0070] 本发明还包括植物抗逆性相关蛋白质及其编码基因在增强植物抗逆性中的应用。比如用于烟草、拟南芥等植物使其抗逆境能力增强等。
[0071] 下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0072] 本发明的实施方式中的抗逆性相关的蛋白质命名为MsNTF2，为含有NTF2-like保守功能域的核转运因子(NUCLEAR TRANSPORT FACTOR 2)的蛋白，来源于豆科苜蓿属紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，由177个氨基酸残基组成的蛋白质，功能未知。
[0073] 实施例1：克隆和测序MsNTF2基因
[0074] 包括以下步骤：
[0075] 本实例采用的实验材料为紫花苜蓿中苜1号。选取10粒健康饱满的种子，采用双层滤纸萌发法，25℃萌发5天至子叶展开，转至1/2MS水培营养液中，每两天换一次营养液。7天后，1/2MS营养液中添加氯化钠至氯化钠终浓度为150mmol/L，处理24小时，地上和地下分别快速取样，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0076] 采用Trizol法提取样品的RNA，并用cDNA合成反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。PCR扩增体系的总体积为50μl，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl，2.5mmol/L dNTP 4μl；引物(SEQ ID NO.6)MsNTF2-F(5’-3’)：atggatgctggaaaagagactag 1μl；(SEQ ID NO.7)MsNTF2-R(5’-3’)：tcaaacagttggatccttccc 1μl，ddH2O 32.5μl，Phusion DNA Polymerase0.5μl和cDNA 1μl；扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸15s；(5)2—4步骤循环32次；(6)72℃延伸5min；(7)16℃终止。得到一轮PCR产物。
[0077] 一轮PCR产物经1％琼脂糖中检测，回收长度为534bp的DNA片段，然后进行加A反应。反应体系总体积为50μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix 25μl和回收产物25μl。扩增条件为：(1)94℃变性5min；(2)72℃变性30min；(3)16℃终止。得到二轮PCR产物。
[0078] 将二轮PCR产物进行纯化，并连接pMD19-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将含pMD19-T-MsNTF2质粒的大肠杆菌涂于含Amp、IPTG和X-Gal的LB培养基上，37℃过夜培养，挑取3个阳性克隆菌斑，在含Amp的LB液体培养基中37℃过夜摇菌培养。菌液检测后与预计条带大小相符，送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明，扩增的PCR产物具有SEQ ID NO.2中的核苷酸序列，将其命名为MsNTF2基因，而该基因编码的蛋白命名为MsNTF2蛋白，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
[0079] MsNTF2蛋白在GeneBank上进行比对(图1)，与蒺藜苜蓿的XP_003591689.1同源性最高，但是目前还未见其他物种中报道其同源基因的功能。
[0080] 实施例2：实时荧光定量PCR分析MsNTF2的表达特性
[0081] 包括如下步骤：
[0082] 紫花苜蓿种子萌发和水培方法如同实施例1。12日龄的紫花苜蓿幼苗进行以下处理：
[0083] 干旱处理：1/2MS水培营养液中添加甘露醇至终浓度为500mmol/L，分别处理0，1，3，6，12和24小时。地上和地下分别取样，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0084] 盐处理：1/2MS水培营养液中添加氯化钠至终浓度为150mmol/L，分别处理0，1，3，6，12和24小时。地上和地下分别取样，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0085] ABA(植物激素脱落酸)处理：1/2MS水培营养液中添加ABA至终浓度为80μmol/L，分别处理0，1，3，6，12和24小时。地上和地下分别取样，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0086] 样品RNA提取和反转录cDNA方法如同实施例1。将cDNA稀释成50ng/μL。用(SEQ ID NO.8)qRTMsNTF2-F(5’-3’)：gaggactggtgggacaaaaaac和(SEQ ID NO.9)qRTMsNTF2-R(5’-3’)：ttggatccttcccgaacctc检测目的基因表达量，以MsACTIN-F(5’-3’)
actggaatggtgaaggctgg和MsACTIN-R(5’-3’)tgacaataccgtgctcaatgg作为内参。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，引物qRTMsNTF2-F 0.5μl，引物qRTMsNTF2-R 0.5μl，DNF buffer 2μl，ddH2O5μl和cDNA 2μl；扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)—(3)循环40次。qRT-PCR反应在ABI7500实时荧光定量PCR上进行，每个样品设置3个技术重复。
actggaatggtgaaggctgg和MsACTIN-R(5’-3’)tgacaataccgtgctcaatgg作为内参。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，引物qRTMsNTF2-F 0.5μl，引物qRTMsNTF2-R 0.5μl，DNF buffer 2μl，ddH2O5μl和cDNA 2μl；扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)—(3)循环40次。qRT-PCR反应在ABI7500实时荧光定量PCR上进行，每个样品设置3个技术重复。
[0087] 用2-ΔΔCt方法计算相对表达量：ΔΔCt＝(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Time x-(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Time 0；Time x表示逆境处理的1、3、6、12或24小时中的任意时间点，其中X的值为1、3、6、12或24。Time 0表示逆境处理0小时(对照组)。利用Origin 9软件进行做图。
[0088] 结果见图2，在紫花苜蓿的地上部分中MsNTF2基因仅受到Mannitol胁迫的诱导，但是在紫花苜蓿的地下部分MsNTF2基因均显著受到Mannitol、氯化钠和ABA的诱导。表明MsNTF2受逆境环境诱导，但是在植物地上和地下中受逆境诱导的程度不同，MsNTF2在地下部分对逆境环境更敏感。
[0089] 实施例3：MsNTF2亚细胞定位分析
[0090] 包括如下步骤：
[0091] 1.材料准备
[0092] 取适量本氏烟草种子置于离心管用蒸馏水浸泡2小时，移液器点播于土壤中，6至7周后植物即可作为转化受体。
[0093] 2.亚细胞载体的构建
[0094] 根据MsNTF2基因的序列设计引物MsNTF2-GFP-F和MsNTF2-GFP-R，引物5’端分别引入XhoI和SaI I酶切位点：
[0095] (SEQ ID NO.10)MsNTF2-GFP-F(5’-3’)：gcctcgagatggatgctggaaaagagactag[0096] (SEQ ID NO.11)MsNTF2-GFP-R(5’-3’)：gcgtcgactcaaacagttggatccttccc[0097] 以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsNTF2-GFP-F和MsNTF2-GFP-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μl，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl，2.5mmol/L dNTP 4μl引物MsNTF2-GFP-F 1μl；MsNTF2-GFP-R 1μl，ddH2O 32.5μl，Phusion DNA Polymerase 0.5μl和cDNA 1μl；扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸15s；(5)步骤(2)—(4)循环32次；(6)72℃延伸5min；(7)16℃终止。得到PCR扩增产物，并在1.5％琼脂糖胶上检测，确定产物大小约为550bp。
[0098] 将PCR扩增产物回收纯化，用限制性内切酶XhoI和SaI I酶切，并回收酶切后的PCR产物，得到大小为537bp的酶切产物；同时，用限制性内切酶XhoI和SaI I酶切PBI121-GFP表达载体，回收大小约为1.4kb的载体骨架。
[0099] 使用DNA连接酶(TaKaRa，货号：6022)将目的基因的酶切产物和PBI121-GFP表达载体的载体骨架4℃过夜连接。将连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并送测序。
[0100] 选取测序序列与MsNTF2的CDS序列完全一致的阳性克隆提质粒，并载体转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-MsNTF2-GFP，与50％甘油按1:1的体积比例混合后，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0101] 3.菌种活化
[0102] 从-80℃取出的重组农杆菌EHA105/pBI121-MsNTF-GFP置于冰上，吸取10μL接种于3mL LB(含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素)液体培养基中，28℃、200rpm培养24小时。
[0103] 将50μL小摇菌液转接到100ml LB(含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素)培养基中，28℃，200rpm培养16～20小时至OD600＝0.5～1。
[0104] 将大摇菌液4500g，4℃离心15min，收集菌体，使用MS重悬液重悬至OD600＝0.4～0.6，120rpm复苏2～3h，即可注射烟草叶片。
[0105] 4.注射法转化烟草叶片
[0106] 注射前给烟草浇充足的水，将烟草在日光灯下培养2～3h。吸取1mL菌体注射液从烟草叶背面注射进入叶片。注射完后，给烟草叶片喷水，置于25℃培养箱中暗培养(套黑色塑料袋)24h后正常培养(16h光照/8h黑暗)。
[0107] 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察目标蛋白表达情况(直接观察法)
[0108] 注射后2～3天，取侵染区一小片置于载玻片上，先在荧光显微镜下观察，若表达则用共聚焦显微镜拍照，以转ER-Maker(mCherry，RFP)的烟草作为参照。
[0109] 结果如图3所示，MsNTF2基因定位于细胞核，内质网和细胞膜上。
[0110] 实施例4：MsNTF2在提高拟南芥抗逆性中的应用
[0111] 包括如下步骤：
[0112] 一、转MsNTF2拟南芥的获得
[0113] 1.重组载体的构建
[0114] 1)MsNTF2基因的TOPO克隆
[0115] 使用pENTRTMDirectional Cloning Kits试剂盒(Invitrogen公司，货号：K2400-20)和Phusion高保真酶(Thermo Fisher Scientific公司，货号：F530-S)克隆基因。
根据MsNTF2基因的序列设计引物对(MsNTF2-GT-F和MsNTF2-GT-R)，上游引物5’端引入“CACC”PENTR/D-TOPO入门载体的识别位点：
根据MsNTF2基因的序列设计引物对(MsNTF2-GT-F和MsNTF2-GT-R)，上游引物5’端引入“CACC”PENTR/D-TOPO入门载体的识别位点：
[0116] (SEQ ID NO.12)MsNTF2-GT-F(5’-3’)：caccatggatgctggaaaagagactag
[0117] (SEQ ID NO.13)MsNTF2-GT-R(5’-3’)：tcaaacagttggatccttccc
[0118] PCR扩增体系的总体积为50μl，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl，2.5mmol/L dNTP 4μl引物MsNTF2-GT-F 1μl；MsNTF2-GT-R 1μl，ddH2O 32.5μl，Phusion DNA Polymerase 0.5μl和cDNA 1μl；扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸15s；(5)2—4步骤循环32次；(6)72℃延伸5min；(7)16℃终止。得到大小为534bp的PCR产物。
[0119] 2)TOPO连接
[0120] PCR产物纯化，并与PENTR/D-TOPO入门载体连接。将连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并送测序。
[0121] 3)LR连接
[0122] 选取测序序列与MsNTF2基因的CDS序列完全一致的阳性克隆提质粒。使用LRII Plus Enzyme Mix(Invitrogen公司，货号：11791-020)将入门载体质粒与pEarleyGate 100表达载体进行LR连接反应。将连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并提质粒。
[0123] 4)重组农杆菌获得
[0124] 用重组的pEarleyGate100-MsNTF2载体转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsNTF2，与50％甘油按1:1的体积比例混合后，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0125] 2.转MsNTF2拟南芥获得
[0126] 从-80℃取出重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsNTF2置于冰上，吸取10μL接种于3mL LB(含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素)液体培养基中，28℃、200rpm培养24小时。
[0127] 将2ml小摇菌液转接到200ml LB(含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素)培养基中，28℃，200rpm培养20-24小时至OD600＝1.2-2.0。
[0128] 将大摇菌液4500g，4℃离心15min，收集菌体，使用5％蔗糖重悬至OD600＝0.8的花浸泡缓冲液。
[0129] 将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)花序浸泡入侵染液中，侵染3-5秒；
[0130] 浸泡完毕后，取出花盆，用黑色塑料袋套住，24h后取下，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。
[0131] 收获T1代种子，草铵膦(PPT，10mg/mL)筛选阳性植株，传代，直至T3代获得纯合株系。
[0132] T2代表示T1代自交产生的种子及它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0133] 提取T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物对[(SEQ ID NO.14)35sF(5’-3’)：gcacaatcccactatccttc和(SEQ ID NO.15)MsNTF2-R(5’-3’)：tcaaacagttggatccttccc]，以及Bar引物对[Bar-F(5’-3’)：tgcaccatcgtcaaccacta和Bar-R(5’-3’)：acagcgaccacgctgttgaa]进行PCR扩增。目的基因引物对和Bar引物对的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH2O 6μl和植株DNA模板，50ng/μl，2μl；扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环38次；
(6)72℃延伸7min。结果如图4中的(A)所示，T3代18个纯合株系在534bp扩增出单一条带。
(6)72℃延伸7min。结果如图4中的(A)所示，T3代18个纯合株系在534bp扩增出单一条带。
[0134] 提取T3代再生植株的整个植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，用目的基因部分片段引物对qRTMsNTF2-F和qRTMsNTF2-R以AtACTIN-F(5’-3’)tgtgccaatctacgagggttt和AtACTIN-R(5’-3’)tttcccgctctgctgttgt作为内参，进行qRT-PCR扩增。PCR检测体系的总体积为20μl，其中包括2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，引物qRTMsNTF2-F 0.5μl，引物qRTMsNTF2-R 0.5μl，DNF buffer 2μl，ddH2O 5μl和cDNA 2μl；扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)—(3)循环40次。结果如图4中的(B)所示，MsNTF2在野生型中不表达，在纯合株系中都有不同程度的表达。挑选3个高表达的纯合株系进行后续的生理分析。
[0135] 二、转基因植物的抗逆性评价
[0136] 1.转基因植物的抗旱性评价
[0137] 1)干旱胁迫对萌发率的影响
[0138] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用10μL枪头均匀分点在MS培养基和含有300mmol/L甘露醇或400mmol/L甘露醇的MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7天，每天统计萌发率，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0139] 结果如图5中的5A和5B所示，在MS平板上，野生型和转基因株系萌发率和萌发速率基本一致；而在300mmol/L甘露醇或400mmol/L甘露醇平板上，MsNTF2转拟南芥株系的萌发率和萌发速率都明显大于野生型。
[0140] 2)干旱胁迫对根长和鲜重的影响
[0141] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用1mL枪头均匀铺在在MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7天，移至MS培养基和含有300mmol/L甘露醇或400mmol/L甘露醇的MS培养基上，12天后统计根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0142] 结果如图5中的5C和5D所示，在MS平板上，野生型和转基因株系根长和鲜重基本一致；而在300mmol/L甘露醇或400mmol/L甘露醇平板上，转基因株系的根长和鲜重都明显大于野生型。
[0143] 3)土壤干旱对存活率的影响
[0144] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用1mL枪头均匀铺在在MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养14天，移至土壤重量一致的小方盆中，正常培养14天后，方盆水浇至饱和，然后开始断水干旱处理，直至野生型萎蔫，然后复水一周，观察表型、统计存活率并拍照。
[0145] 结果如图5中的5E所示，干旱前，转基因株系和野生型生长状况基本一致；干旱后，转基因株系生长情况明显好于野生型；复水后，转基因株系的存活率也高于野生型(图5中的5F)。
[0146] 2.转基因植物的耐盐性评价
[0147] 1)盐胁迫对萌发率的影响
[0148] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用10μL枪头均匀分点在MS培养基和含有150mmol/L氯化钠或200mmol/L氯化钠的MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7天，每天统计萌发率，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0149] 结果如图6A和6B所示，在MS平板上，野生型和转基因株系萌发率和萌发速率基本一致；而在150mmol/L氯化钠或200mmol/L氯化钠平板上，转基因株系的萌发率和萌发速率都明显大于野生型。
[0150] 2)盐胁迫对根长和鲜重的影响
[0151] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用1mL枪头均匀铺在在MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养7天，移至MS培养基和含有150mmol/L氯化钠或200mmol/L氯化钠的MS培养基上，12天后统计根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0152] 结果如图6C和6D所示，在MS平板上，野生型和转基因株系根长和鲜重基本一致；而在150mmol/L氯化钠或200mmol/L氯化钠平板上，转基因株系的根长和鲜重都明显大于野生型。
[0153] 3)土壤盐胁迫对存活率的影响
[0154] 将T3代转MsNTF2拟南芥的3个代表性株系OE13、OE16、OE17和野生型WT各49粒种子经消毒处理后，用1mL枪头均匀铺在在MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3天后，移入22℃，16h光照-8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养14天，移至土壤重量一致的小方盆中。正常培养14天后开始盐处理，每个方盆浇100mL的50mmol/L氯化钠水溶液，氯化钠浓度每天增加50mmol/L，直至终浓度为200mmol/L，以此浓度处理20天，每三天浇一次。观察表型、统计存活率并拍照。
[0155] 结果如图6E所示，盐处理前，转基因株系和野生型生长状况基本一致；盐处理后，转基因株系生长情况明显好于野生型。
[0156] 本发明实施例仅以MsNTF2为例进行相信验证分析，而对于所例举的其他突变DNA序列(如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18)，由于他们的编码区均与SEQ ID NO.2所示的DNA序列有至少90％的同源性，作为MsNTF2的高度同源序列，他们所编码的蛋白质均与MsNTF2蛋白有高度相似的抗逆性，按照上述实施例1至实施例4的实验设计，可以得出相似的实验结果和相同的实验结论。
[0157] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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