一种提高植物抗逆性的转录因子
阅读：48发布：2020-05-19
专利汇可以提供一种提高植物抗逆性的转录因子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 技术和 植物 学领域；具体涉及一种提高植物抗逆性的转录因子ScABI3，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，同源性不小于51%的其它序列；以及如SEQ ID NO.4所示的 氨 基酸序列，同源性不小于51%的其它序列。ScABI3基因具有明显提高植株抗逆境胁迫的功能。，下面是一种提高植物抗逆性的转录因子专利的具体信息内容。
一种提高植物抗逆性的转录因子
技术领域
背景技术
[0002] 脱落酸(abscisic acid,ABA)是维管束植物在水分胁迫下产生的应对逆境反应以及信号转导过程的一个关键植物激素，它能调控植物的蒸腾、耐干性、种子成熟以及休眠等过程，还能抑制侧根和花序形成。高等植物中ABA的生物合成主要通过C40间接途径由类胡萝卜素合成，包括玉米黄素环氧化酶(zeaxanthinepoxidase，ZEP)催化玉米黄素(zeaxanthin)转化为黄质素(violaxanthin)，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)再催化9-顺式-新黄素(9-cis-neoxanthin)产生黄氧素(xanthoxin)，黄氧素在短链醇脱氢酶(short-chain alcohol dehydrogenase)ABA2的作用下转化为脱落酸醛，最后，脱落酸醛在脱落酸醛氧化酶(abscisic aldehyde oxidase，AAO)的作用下生成ABA。研究证明ABA在蕨类植物和被子植物等维管束植物中具有非常保守的功能。
[0003] ABI3(abscisic acidinsensitive3)是植物特有的含B3(The Basic3-DNA Binding Domain，B3-DBD)结构域的转录因子，在ABA信号传导过程中位于关键环节，是调控种子成熟的关键因子，同时参与植物的组织分化、干旱忍耐、叶绿体降解、侧根发育等其他生物过程。ABA分子调控机制在维管植物中研究较多，但早期登陆的苔藓植物中，仅见ABI3调控小立碗藓植株体获得耐干性以及提高苔藓抗冻性的报道，认为ABA在苔藓脱水和干燥过程中起到了关键作用；而对于极端耐干藓类(dessication tolerance moss)ABA调控机制尚未见报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于：以极端耐干藓类齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)为材料，探究其内源ABA及相关基因在非生物胁迫下的表达，同时利用转录组数据，挖掘出一个ABA信号转导关键基因ScABI3，系统研究ScABI3基因在非生物胁迫下的基因表达模式及基因抗逆功能。
[0005] 本发明的技术方案：一、一种提高植物抗逆性的转录因子ScABI3，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，同源性不小于51％的其它序列；以及如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，同源性不小于51％的其它序列。
[0006] 进一步优选设计，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；以及如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0007] 二、用于扩增上述转录因子ScABI3的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2所示。
[0008] 本发明的有益效果：1.利用UPLC-MS法测定出齿肋赤藓存在内源ABA，且在干旱胁迫下含量明显发生变化。具体为：0h到2h内源ABA含量变化不显著，4h明显升高达到最高值，6h以后开始下降但仍然高于对照。首次实验证实了耐干藓类中的确存在内源ABA含量的动态变化。
[0009] 2.通过实时荧光定量PCR方法分析齿肋赤藓ABA合成及信号转导通路中关键基因在非生物胁迫下的基因表达模式。结果表明：ABA合成关键基因ZEP和NCED3，以及ABA信号转导基因ABI1、SnRK2和ABI3在干旱、复水、ABA、冷和盐胁迫下均发生变化，暗示ABA能够参与齿肋赤藓应对非生物胁迫的过程。
[0010] 3.基于齿肋赤藓转录组数据库所注释的ABI3 unigene片段信息，从齿肋赤藓中克隆获得一个ScABI3基因。该基因全长1695bp，编码564个氨基酸，具有保守的B1、B2和B3结构域，属于B3家族转录因子，其氨基酸序列与小立碗藓同源性为69％，玉米60％，拟南芥51％，油菜47％，辣椒45％。系统发育树聚类发现ScABI3属于苔藓植物支系，在进化上与被子植物相距较远，与小立碗藓PpABI3C蛋白亲缘关系最近。
[0011] 4.对所克隆的ScABI3基因特性进行研究，发现其编码的蛋白在细胞核有表达信号，说明ScABI3转录因子定位在细胞核中；通过不同片段截短实验证明ScABI3转录因子具有自激活活性，其激活区域位于C端518-564bp碱基内。构建齿肋赤藓cDNA文库，通过酵母双杂从文库中筛选到丝氨酸/苏氨酸激酶、亚硫酸盐还原酶黄素蛋白α组分和UDP-糖基转移酶3个可能与ScABI3互作的蛋白。
[0012] 5.将ScABI3基因遗传转化至拟南芥中验证其功能。结果表明：转ScABI3基因拟南芥在种子萌发、幼苗生长及成苗阶段均可显著增加抗盐、抗旱及减少ABA敏感性的能力，分析发现其抗非生物胁迫能力的提高是通过ROS相关清除酶类活性增加、渗调物质积累、光合作用增强以及叶片气孔大小调节而共同完成。此外，非生物胁迫下ScABI3基因能够诱导盐胁迫相关基因的表达，同时诱导AIP2基因表达，减少对ABA的敏感性。附图说明
[0013] 附图1为PCR扩增齿肋赤藓ABI3基因；其中M：DL2000分子量标准；1-3：PCR产物；附图2为ScABI3转基因拟南芥T3代表达量分析；附图3为非生物胁迫下转基因拟南芥的萌发能力；附图4为非生物胁迫下转基因拟南芥种子萌发率和子叶出现率；附图5为非生物胁迫下转基因拟南芥幼苗的抗逆分析；附图6为非生物胁迫下转基因拟南芥幼苗的鲜重和侧根数；附图7为非生物胁迫下转基因拟南芥植株的抗逆能力分析；附图8为非生物胁迫下转基因拟南芥成苗的鲜重和存活率；附图9为非胁迫处理下转基因拟南芥内源ABA含量。
具体实施方式
[0014] 实施例1、齿肋赤藓ABI3基因克隆与分析以古尔班通古特沙漠中广泛分布的极端耐干苔藓——齿肋赤藓为研究材料。
[0015] 实验材料植物材料：野外采集的齿肋赤藓完全复水后，选取配子体为材料。
[0016] 菌株与载体：大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物公司，pMD19-T克隆载体购自TaKaRa公司。
[0017] 药品和试剂：RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA公司，反转录试剂盒、Ex Taq高保真聚合酶购自TaKaRa公司，α-半乳糖苷酶显色底物购自Solarbio公司，引物由苏州金唯智公司合成，DNA测序由华大基因公司完成。
[0018] 溶液配制：氨苄青霉素(Ampicillin)：将粉末用ddH2O溶解，储存浓度为100mg/mL，抽滤灭菌，工作浓度为50mg/L，-20℃保存备用。
[0019] IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，粉末溶于ddH2O中，母液浓度为1M，过滤除菌后，-20℃保存。使用浓度为0.25μM。
[0020] X-α-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷，粉末溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，母液浓度为20mg/mL，过滤除菌后，-20℃避光保存。使用浓度为40μg/mL。
[0021] 培养基配制：LB培养基：蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0，121℃高压灭菌20min，常温保存。固体培养基加入琼脂12g/L。
[0022] 实验方法：总RNA提取与cDNA的合成。
[0023] ScABI3基因克隆引物设计：根据NCBI中已公布的拟南芥、玉米和小立碗藓ABI3基因序列，对齿肋赤藓转录组数据库进行本地Blast，去除冗余后筛选得到一个同源性较高的unigene序列，利用Primer5软件设计引物，对该序列进行PCR扩增。
[0024] 表1齿肋赤藓ABI3基因扩增引物序列引物名称 序列(5’-3’)
ScABI3-F AGCACTGGGAGGCTGATG
ScABI3-R CTGGCTGATTCTTGAACGAC
ScABI3基因克隆
采用高保真聚合酶，以cDNA为模板扩增ORF全长，反应体系如下：
组分 体积
10XEx Taq Buffer 5uL
Forward Primer(10uM) 1uL
Reverse Primer(10uM) 1μL
TaKaRa Ex Taq(5U/uL) 0.5μL
dNTP Mixture(10mM) 4μL
cDNA 1.5μL
ddH2O 37uL
Total 50uL
反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30℃；72℃延伸1min；35个循环；
72℃延伸5min；4℃，∞。
ScABI3-F AGCACTGGGAGGCTGATG
ScABI3-R CTGGCTGATTCTTGAACGAC
ScABI3基因克隆
采用高保真聚合酶，以cDNA为模板扩增ORF全长，反应体系如下：
组分 体积
10XEx Taq Buffer 5uL
Forward Primer(10uM) 1uL
Reverse Primer(10uM) 1μL
TaKaRa Ex Taq(5U/uL) 0.5μL
dNTP Mixture(10mM) 4μL
cDNA 1.5μL
ddH2O 37uL
Total 50uL
反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；56℃退火30℃；72℃延伸1min；35个循环；
72℃延伸5min；4℃，∞。
[0025] PCR产物回收PCR反应后用琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收PCR产物。具体步骤如下：
(1)切取琼脂糖凝胶中目的DNA条带，放入1.5mL离心管，称重；
(2)加入等体积的Binding Buffer(XP2)，50-60℃水浴7min，期间不断震荡，使胶彻底溶解；
(3)将上述溶液加入 DNA Mini Column中，室温10000g离心1min，弃废液；
(4)在吸附柱中加入300uL Binding Buffer(XP2)，室温12000g离心1min，弃废液；
(5)在吸附柱中加入700uL SPW Wash Buffer，室温12000g离心1min；重复该步骤一次；
(6)将吸附柱置于新的离心管中，在柱中央加入30μLElution Buffer，室温静置2min；
(7)12000g离心1min，收集DNA。
(1)切取琼脂糖凝胶中目的DNA条带，放入1.5mL离心管，称重；
(2)加入等体积的Binding Buffer(XP2)，50-60℃水浴7min，期间不断震荡，使胶彻底溶解；
(3)将上述溶液加入 DNA Mini Column中，室温10000g离心1min，弃废液；
(4)在吸附柱中加入300uL Binding Buffer(XP2)，室温12000g离心1min，弃废液；
(5)在吸附柱中加入700uL SPW Wash Buffer，室温12000g离心1min；重复该步骤一次；
(6)将吸附柱置于新的离心管中，在柱中央加入30μLElution Buffer，室温静置2min；
(7)12000g离心1min，收集DNA。
[0026] 载体连接、转化与鉴定将纯化后的PCR产物与pMD19-T克隆载体16℃过夜连接，反应体系如下：组分 体积
Solution I 5uL
pMD19-T 1uL
PCR纯化产物 4μL
Total 10uL
将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，并进行阳性菌株的鉴定，具体步骤如下：
(1)取50uL冰上融化的大肠杆菌感受态细胞，加入10uL连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；
(2)42℃水浴热击45s，快速将离心管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；
(3)向离心管中加入500uLLB培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1h；
(4)吸取300uL的培养液，均匀涂布于含有X-α-gal、IPTG和Amp的LB平板上；
(5)倒置平板，37℃过夜培养；
(6)挑取生长出来的白色单菌落，接种于LB+Amp(50mg/ml)液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养后进行菌液PCR验证；
(7)PCR鉴定的阳性菌液进行测序。
Solution I 5uL
pMD19-T 1uL
PCR纯化产物 4μL
Total 10uL
将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，并进行阳性菌株的鉴定，具体步骤如下：
(1)取50uL冰上融化的大肠杆菌感受态细胞，加入10uL连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；
(2)42℃水浴热击45s，快速将离心管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；
(3)向离心管中加入500uLLB培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1h；
(4)吸取300uL的培养液，均匀涂布于含有X-α-gal、IPTG和Amp的LB平板上；
(5)倒置平板，37℃过夜培养；
(6)挑取生长出来的白色单菌落，接种于LB+Amp(50mg/ml)液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养后进行菌液PCR验证；
(7)PCR鉴定的阳性菌液进行测序。
[0027] ScABI3序列分析将克隆得到的ScABI3基因进行序列分析，利用Gene Structure Display Server2.0(GSDS)在线软件进行结构绘制；通过ExPASy数据库上的SOPMA工具对ScABI3蛋白二级结构进行预测；利用Mega5.1构建NJ树；利用DNAman软件进行序列氨基酸同源性比对。
[0028] 结果与分析齿肋赤藓ABI3基因克隆：根据unigene基因序列设计引物，并以齿肋赤藓复水24h的cDNA为模板，进行RT-PCR克隆，得到齿肋赤藓ABI3基因，命名为ScABI3。
[0029] 结论：复水24h的齿肋赤藓为材料，采用RT-PCR扩增出ScABI3基因，该基因全长1695bp，编码564个氨基酸，具有保守的B1、B2和B3结构域，属于B3家族转录因子。ScABI3具有564个氨基酸，由49.29％的无规则卷曲、25.53％的α-螺旋和15.78％的延伸链组成，其中规则卷曲是ScABI3最大量的二级结构元件，α-螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。ScABI3与已知植物ABI3蛋白具有较高的同源性，其中与小立碗藓同源性为69％，玉米60％，拟南芥
51％，油菜47％，辣椒45％。从系统发育树可以看出，ScABI3属于苔藓植物支系，在进化上与被子植物相距较远，与小立碗藓的亲缘关系最近。
51％，油菜47％，辣椒45％。从系统发育树可以看出，ScABI3属于苔藓植物支系，在进化上与被子植物相距较远，与小立碗藓的亲缘关系最近。
[0030] 实施例2、齿肋赤藓ScABI3基因转化拟南芥及抗逆功能验证通过生物学常规操作获得转基因拟南芥ScABI3纯合种子，然后在非生物胁迫下对转基因拟南芥抗逆性分析
(1)转基因拟南芥ScABI3基因表达量分析
对ScABI3转基因拟南芥T3代纯合系进行半定量RT-PCR，用α-tublin作为内参基因。通过扩增条带亮度强弱，分析ScABI3基因在转基因拟南芥株系中的表达情况。随后，选择11个转基因株系中表达量相对居中的4号和8号以及表达量较高11号，用于后续试验研究，分别命名为：Line1、Line2和Line3，如图2所示。
(1)转基因拟南芥ScABI3基因表达量分析
对ScABI3转基因拟南芥T3代纯合系进行半定量RT-PCR，用α-tublin作为内参基因。通过扩增条带亮度强弱，分析ScABI3基因在转基因拟南芥株系中的表达情况。随后，选择11个转基因株系中表达量相对居中的4号和8号以及表达量较高11号，用于后续试验研究，分别命名为：Line1、Line2和Line3，如图2所示。
[0031] (2)非生物胁迫下转基因拟南芥萌发能力分析转基因和野生型(WT)拟南芥播种于MS和分别含有150mM NaCl、250mM Mannitol和0.5μM ABA的MS培养基平板上，正常生长条件下培养14d，结果如图3所示。
[0032] 统计各株系种子萌发率和子叶出现率，结果如图4所示。结果表明：正常条件下，三个转基因株系在萌发率和子叶出现率上与WT相比并无差异。但在NaCl和ABA胁迫条件下，转基因株系萌发率和子叶出现率明显高于WT，特别是子叶出现率差异极显著。而在Mannitol胁迫下，转基因株系萌发率和子叶出现率与WT相比没有显著区别。实验结果说明ScABI3基因具有提高种子抗盐胁迫和ABA的能力。
[0033] (3)非生物胁迫下转基因拟南芥幼苗抗逆分析转基因和野生型(WT)拟南芥播种于MS培养基，萌发7d后，转移至MS和分别含有175mM NaCl、200mM Mannitol和0.5μM ABA的MS培养基平板上，正常生长条件下竖直培养12d，结果如图5所示。统计各株系幼苗的鲜重和侧根数，结果如图6所示。结果表明：在MS培养基上，ScABI3转基因株系和WT相比，没有明显的区别，但是在NaCl、Mannitol和ABA胁迫条件下，ScABI3基因的过表达株系幼苗长势明显优于WT株系，表现为具有更多的侧根数量和幼苗鲜重，说明ScABI3基因通过提高拟南芥幼苗地上和地下生物量来提升植株抗逆境能力。
[0034] (4)非生物胁迫下转基因拟南芥成苗的抗逆分析将土壤中生长3-4w的转基因和WT拟南芥分别用水、200mM NaCl、300mM Mannitol和100μM ABA液体浇灌，处理10d，观察植株的长势，结果如图7所示。统计各株系成苗鲜重和存活率，结果如图8所示。结果表明：在正常条件下，转基因株系和WT长势基本一致，但在NaCl、Mannitol和ABA胁迫条件下，ScABI3基因的过表达株系长势明显强于WT和其他转基因植株，表现为更高的鲜重和存活率。实验结果再次证明ScABI3基因具有明显提高植株抗逆境胁迫的功能。
[0035] (5)转基因拟南芥内源ABA含量测定转基因和WT拟南芥在非生物胁迫下内源ABA含量如图9所示。结果显示：在对照条件下ScABI3转基因株系和WT内源ABA含量没有差异，这说明在拟南芥中过表达ScABI3基因不会引起ABA合成或代谢的变化。在NaCl胁迫下，转基因植株内源ABA含量明显减少，相比WT差异极显著。在Mannitol胁迫下，转基因植株内源ABA含量明显升高，相比WT差异极显著。在NaCl和Mannitol胁迫下，转基因拟南芥内源ABA含量出现了相反的表现形式，其中原因尚不清楚。但至少可以认为，ScABI3作为ABA信号因子，在正常条件下它的过表达不会引起植株内源ABA含量的变化；反而在非生物胁迫下，ScABI3的过表达会引起植株内源ABA含量变化。
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