一种植物诱导型启动子及其应用
阅读：448发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种植物诱导型启动子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 植物 诱导型启动子及其应用。通过 染色 体步移法从盐生植物野 大麦 基因组中获得了一段1750bp的HbCIPK2启动子序列，利用该启动子序列获得的拟南芥转proHbCIPK2:GUS株系在NaCl不同浓度和不同时间胁迫下均可驱动GUS基因的表达，而且随着胁迫时间和浓度的增加，GUS的表达活性增强；在PEG和ABA胁迫下HbCIPK2启动子驱动GUS基因的诱导表达活性相对较低；但相同的转基因株系在无胁迫处理、低温和高温胁迫下均无GUS基因的表达。本发明获得的1750bp的DNA序列是一种新型的逆境诱导型启动子，在高 盐胁迫 下具有较强的启动子活性,可诱导转录因子等调控基因的适量表达。，下面是一种植物诱导型启动子及其应用专利的具体信息内容。
1.一种启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.与权利要求1所述启动子有关的生物材料，为下述A1）-A4）中的任意一种：
A1）含有权利要求1所述启动子的表达盒；
A2）含有权利要求1所述启动子或A1）所述表达盒的重组载体；
A3）含有权利要求1所述启动子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的重组微生物；
A4）含有权利要求1所述启动子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的重组细胞系。
3.权利要求1所述启动子在作为植物诱导型启动子中的应用；所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ABA诱导型启动子；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫；所述植物为野大麦或拟南芥。
4.权利要求1所述启动子或权利要求2的A1）-A3）中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应用及在培育植物品种中的应用，所述植物为野大麦或拟南芥。
5.一种权利要求1中SEQ ID NO. 1所示的启动子的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：1）采用CTAB 法提取野大麦基因组 DNA，2）采用基因组步移法克隆野大麦HbCIPK2启动子区域；步骤2)中进行两轮PCR扩增，分别使用 2条反向引物 SP1和SP2，所述 SP1和SP2引物分别为序列表中SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示的DNA分子。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述启动子和目的基因导入植物中，得到所述目的基因受逆境胁迫诱导和/或ABA诱导表达的植物，所述植物为野大麦或拟南芥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）构建以权利要求1所述启动子驱动GUS基因的表达载体proHbCIPK2:GUS；2）利用表达载体proHbCIPK2:GUS获得转基因株系；
所述步骤1）的具体操作方法为：使用引物proHbCIPK2-F、 proHbCIPK2-R采用PCR方法扩增权利要求1所述启动子并引入酶切位点PstI和XhoI，测序后插入载体pYBA1121，构建获得表达载体proHbCIPK2:GUS；所述引物proHbCIPK2-F、 proHbCIPK2-R分别为序列表中SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示DNA分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2）的具体操作方法为：将载体proHbCIPK2:GUS电击转化到农杆菌菌株，制备转化菌液，对植株进行浸染转化，收获的T0代种子在平板上筛选转化子。
一种植物诱导型启动子及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种植物诱导型启动子序列及其在植物抗逆调控中的应用。
背景技术
[0002] 盐渍化和干旱是制约农业可持续发展的重要环境因素。据统计，全世界103个国家有盐渍化土壤，面积达38,000万公顷，约占全球可耕地面积的10％；我国约有1.4亿亩盐渍化耕地和4亿亩的盐渍化荒地。更为严重的是，因全球气温升高，海平面上升，加之工业污染和农业灌溉、施肥不当等人为因素的影响，次生盐渍化土壤面积还在以每年3％的速度扩展；加上水资源日趋紧张，干旱发生极为频繁，每年因干旱减产粮食100亿公斤以上，直接经济损失达100-200亿元。这“双重威胁”给农业生产带来重大损失。因此，如何在高盐和干旱等逆境条件下最大限度地发挥作物的生产潜力，是我国目前农业生产迫切需要解决的问题。其中培育耐盐、抗旱新品种是解决农作物高盐、干旱胁迫的根本有效途径，而挖掘、研究和利用植物中调控抗逆性的关键基因和重要调控元件是培育耐盐、抗旱新品种的重要手段。
[0003] 植物诱导型启动子可以精细调节植物在受到外界刺激时基因的表达，诱导型启动子的研究一直是植物转录表达调控的热点问题，特别是诱导型启动子在植物抗逆转基因育种中作为关键元件备受关注。目前诱导型启动子主要集中在生物和非生物胁迫诱导启动子方面，包括响应干旱、高盐、高温、冷害、病害和外源ABA胁迫的启动子，其中一些启动子已广泛应用于植物抗逆转基因育种中。比如，拟南芥Rd29启动子已成功应用于抗旱转基因小麦育种；高盐、干旱和ABA诱导启动子OsNCED3、Wsi18已应用于水稻抗逆转基因育种。尽管目前已克隆出一些逆境诱导型启动子，但还是不能满足不同植物不同转基因育种的要求。尤其对于转调控基因作物育种来说，选择诱导表达活性适中的启动子非常重要。所以挖掘和研究新的逆境诱导型启动子，特别是从特殊生境植物筛选克隆逆境诱导活性适中的启动子具有重要价值和意义。
[0004] 蛋白激酶在植物抗逆响应中起重要信号传递作用。其中，CIPK(CBL-interacting protein kinase,CIPK)蛋白激酶是一类植物所特有的、与钙离子感受器CBLs(calcineurin B-like,CBL)特异作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。CBL-CIPK-靶蛋白构成了感知、传递和响应逆境信号的调控通路，是植物逆境调控研究的热点之一。但由于该调控途径存在复杂性、多样性和交叉性，CBL-CIPK所涉及到的调控功能比预期的要复杂的多。
[0005] 迄今为止，已鉴定出的、被广泛认可的响应逆境胁迫的CBL-CIPK调控途径有：响应高盐胁迫的SOS途径、响应低钾胁迫的CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1途径、响应高pH胁迫的CBL2-CIPK11-AHA2途径。CIPKs作为植物逆境响应信号调控途径的枢纽，在逆境信号传导中起重要作用。但是不同的CIPK成员可能参与相同的调控途径，相同的CIPK也可能参与不同逆境胁迫响应。到目前为止，除SOS2/AtCIPK24外，在已研究的部分AtCIPKs成员中还未见其他成员参与拟南芥耐盐性调控。迄今，研究的材料大部分局限于模式植物或甜土植物，非特殊种质。一些特殊生境种质材料可能具有解密逆境Ca2+信号的特殊途径，挖掘克隆特殊生境植物信号组分，解析其在逆境胁迫中的作用，对有效利用基因资源改良作物抗逆性具有重要意义。
[0006] 在解析CIPK基因功能的同时，其启动子的功能也备受关注。但是目前报道的大部分CIPK启动子活性均表现为组织特异性，如AtCIPK1启动子、AtCIPK3启动子和AtCIPK9启动子等，而且启动子研究多集中于模式植物，从非模式植物克隆并进行启动子功能分析的报道较少，仅见从芥菜中分离获得的BjSOS2启动子具有逆境诱导表达活性，而且诱导表达活性较强，对于驱动逆境胁迫响应下游基因来说，是一种比较合适的启动子，而对于调控基因(转录因子和信号传导因子)的诱导表达来说，则需要诱导表达活性适中的启动子来驱动。因此，逆境诱导启动子的分离与功能研究具有重要意义。
[0007] 野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，具有显著的耐盐性，是研究植物耐盐生理和耐盐机制的优异资源。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，在野大麦耐盐分子机制和基因克隆方面的研究较少。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种植物诱导型启动子，该启动子可应用于植物耐盐等抗逆分子机理研究和农作物抗逆转基因育种。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0009] 1)或2)或3)的DNA分子：
[0011] 2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的DNA分子；
[0012] 3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的DNA分子。
[0013] DNA分子有关的生物材料，为下述A1)-A6)中的任意一种：
[0014] A1)含有所述DNA分子的表达盒；
[0015] A2)含有所述DNA分子的重组载体，或A1)所述表达盒的重组载体；
[0016] A3)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组微生物；
[0017] A4)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组细胞系；
[0018] A5)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0019] A6)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物器官。
[0020] 所述DNA分子在作为植物诱导型启动子中的应用。
[0021] 进一步的，所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ABA诱导型启动子；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
[0022] 所述DNA分子或A1)-A3)中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应用及在培育植物品种中的应用。
[0023] 一种SEQ ID NO.1所示的DNA分子的获得方法，包括如下步骤：1)采用CTAB法提取野大麦基因组DNA，2)采用基因组步移法克隆野大麦HbCIPK2启动子区域；步骤2)中进行两轮PCR扩增，分别使用2条反向引物SP1和SP2，所述SP1和SP2引物分别为序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
[0024] 一种培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子和目的基因导入植物中，得到所述目的基因受逆境胁迫诱导和/或ABA诱导表达的植物。
[0026] 进一步的，所述步骤1)的具体操作方法为：使用引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R采用PCR方法扩增所述DNA分子并引入酶切位点PstI和XhoI，测序后插入载体pYBA1121，构建获得表达载体proHbCIPK2:GUS；所述引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R分别为序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示DNA分子。
[0028] 本发明公开的DNA序列为来自盐生野大麦。该序列位于HbCIPK2基因翻译起始位点第1位到1750位调控区的核苷酸序列，该序列的调控元件包含有涉及干旱胁迫应答、高低温等应答元件。该序列可被高盐、干旱和外源ABA逆境所诱导表达，但诱导表达活性有差别，能用于植物诱导型表达载体，在生物工程领域中具有广泛的适用性和很好的应用前景。
[0029] 本发明的有益效果为：
[0030] (1)首次从盐生种质-野大麦中分离获得HbCIPK2启动子序列(DNA序列)，经功能分析证明该启动子属于典型的逆境诱导型启动子；
[0031] (2)该DNA序列的逆境诱导表达活性与HbCIPK2基因在不同逆境条件下的诱导表达结果一致，其功能阐述属于首次。
[0032] (3)该DNA序列与已报道的BjSOS2启动子在序列上完全不同，而且在功能上也不同。后者在高盐、ABA和干旱胁迫下诱导表达活性较强，并在高低温胁迫下也有诱导表达活性；该DNA序列作为启动子在高盐胁迫下诱导表达活性明显，在干旱和ABA胁迫下诱导活性稍弱，但不响应高低温胁迫，说明二者起调控作用的顺式元件可能不同。该DNA序列的诱导表达活性特点有利于驱动转录因子等调控基因在作物抗逆转基因中的研究与利用，丰富了基因调控元件资源，将在植物转基因研究和利用方面发挥重要作用。
附图说明
[0034] 图1为本发明野大麦HbCIPK2启动子预测的重要顺式元件位置示意图；
[0035] 图2为转proHbCIPK2:GUS拟南芥和空载体对照株系PCR检测图；
[0036] 图3为拟南芥转proHbCIPK2:GUS株系GUS活性分析图；
[0037] 图4为拟南芥转proHbCIPK2:GUS株系GUS基因qRT-PCR分析图。
[0038] 其中：Marker为TRANS1Kb(购买自天根生化科技有限公司)；1-3为转proHbC IPK2:GUS株系；质粒为PCR扩增阳性对照；Empty为转空载体对照株系。
具体实施方式
[0039] 实施例1
[0040] 如1)或2)或3)的DNA分子：
[0041] 1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
[0042] 2)在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的DNA分子；
[0043] 3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的DNA分子。
[0044] 一种SEQ ID NO.1所示的DNA分子的获得方法，包括如下步骤：1)采用CTAB法提取野大麦基因组DNA，2)采用基因组步移法克隆野大麦HbCIPK2启动子区域；步骤2)中进行两轮PCR扩增，分别使用2条反向引物SP1和SP2，所述SP1和SP2引物分别为序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
[0045] 本实施例中获得SEQ ID NO.1所示的DNA分子具体操作步骤如下：
[0046] 材料的选取：
[0047] 盐生牧草-野大麦(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)，采自内蒙古盐渍化草原。在室温条件下野大麦种子用去离子水浸泡12h后，放入到4℃冰箱中过夜。用灭菌的去离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25℃萌芽。经过4～5天待其大部分发芽之后，转到灭菌的盛有1/2Hoagland培养液的玻璃瓶中(用不透光的纸包住)，在温度22-23℃，光照强度1000-3000umol m-2s-1，光照12h/天、黑暗12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时取材备用[Hoagland营养液配方：0.51g/L KNO3、0.82g/L Ca(N03)2、0.49g/L MgSO4.7H20、0.136g/L KH2PO4；再加入lmL Fe EDTA溶液(配制方法：分别溶解7.45g Na2EDTA、5.57g FeSO4.7H20于200mL蒸馏水中，加热。不断搅拌Na2EDTA溶液与FeS04溶液混合，定容至1L)；然后加入lmL A-Z溶液(配制方法：H3B032.80mg/L，CuS04·5H200.08mg/L，ZnSO4·7H200.22mg/L，MgCl2·6H2081mg/L，HMoO·4H200.09mg/L)]。
[0048] HbCIPK2启动子区域的克隆：
[0049] 采用CTAB法提取野大麦基因组DNA，采用基因组步移法(Genome Walking Kit,Clontech)克隆野大麦HbCIPK2启动子区域。首先根据本实验室已克隆获得的HbCIPK2基因序列设计2条反向引物SP1和SP2，引物序列分别如下：
[0050] SP1：5'-CGACGCTCTGCGAGGTCTCGATGTTGCGG-3'；
[0051] SP2：5'-CCGAGCATCTTCCCCATCTCGTACTTGTGC-3'。
[0052] 根据Clontech试剂盒操作说明，以野大麦基因组为模板建立4种酶切文库，以试剂盒提供的非特性引物AP1(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3')和特异性引物SP1,进行第一轮PCR扩增,以第一轮PCR产物为模板,AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3')和SP2为引物进行第二轮巢氏扩增,电泳后回收明显的带谱,克隆至pGEM-T Easy vector(Promega)载体上测序。
[0053] HbCIPK2启动子区域的顺式元件分析：
[0054] 测定序列经比对分析确认为HbCIPK2基因上游序列。采用植物启动子顺式元件在线分析软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)结合PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi？lang＝en&pj＝640&action＝page&page＝newplace)来分析预测HbCIPK2基因表达调控区域的顺式元件。
[0055] 结果分析：
[0056] 采用基因组步移法，提取野大麦幼苗高质量完整DNA，根据Clontech试剂盒操作说明，构建四种酶切文库，利用已克隆获得的野大麦HbCIPK2基因序列信息，在该基因5`端设计反向引物，通过两轮巢式扩增，获得大小约为1900bp的电泳条带。经测序分析及与HbCIPK2基因序列比对，确认该序列含有一段HbCIPK2基因CDS区5`端序列及其上游调控序列。HbCIPK2基因上游调控序列位于起始密码子ATG前1750bp处，序列如下(SEQ ID NO.1)：
[0057]
[0058] 采用在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi？lang＝en&pj＝640&action＝page&page＝newplace)分析预测HbCIPK2基因表达调控区域的顺式元件。野大麦HbCIPK2启动子含有13个典型的TATA盒和10个CAAT盒，表明野大麦HbCIPK2启动子具备启动基因转录表达的特征。
[0059] 经分析野大麦HbCIPK2启动子含有多种与逆境响应有关的调控元件，包括多种响应脱水胁迫元件：5个ABRELATERD1(ACGTG)、6个ACGTATERD(ACGT)、11个ABRERATCAL(MACGYGB)、1个MYB1AT(WAACCA)、3个MYB2CONSENSUSAT(YAACKG)和4个MYBCORE(CNGTTR)及2个MYCATRD22(CACATG)；多种低温胁迫响应元件：2个CBFHV(RYCGAC)、1个LTRE1HVBLT49(CCGAAA)和1个LTRECOREATCOR15(CCGAC)；2个ABA响应元件ABRE(CACGTG)；多种与WRKY转录因子结合的元件：2个WBBOXPCWRKY1(TTTGACY)、3个WBOXATNPR1(TTGAC)、1个WBOXNTCHN48(CTGACY)、5个WBOXNTERF3(TGACY)和6个WRKY71OS(TGAC)；2个热击响应元件CCAATBOX1(CCAAT)等(图1)。这些预测元件都与逆境胁迫响应有关，表明野大麦HbCIPK2启动子在逆境胁迫响应调控中起重要作用。此外，该启动子还含有与生长发育有关的其他调控元件。
[0060] 实施例2
[0061] 实施例1中所述1)、2)、3)DNA分子的应用。
[0062] 与实施例1中所述DNA分子有关的生物材料，为下述A1)-A6)中的任意一种：
[0063] A1)含有所述DNA分子的表达盒；
[0064] A2)含有所述DNA分子的重组载体，或A1)所述表达盒的重组载体；
[0065] A3)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组微生物；
[0066] A4)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组细胞系；
[0067] A5)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0068] A6)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物器官。
[0069] 所述DNA分子在作为植物诱导型启动子中的应用。所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ABA诱导型启动子；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
[0070] 所述DNA分子或A1)-A3)中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应用及在培育植物品种中的应用。
[0071] 实施例3
[0072] 使用实施例1中所述DNA分子获得抗逆型转基因植物的方法。
[0073] 一种培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子和目的基因导入植物中，得到所述目的基因受逆境胁迫诱导和/或ABA诱导表达的植物。
[0074] 所述的方法包括如下步骤：1)构建以实施例1中DNA分子驱动GUS基因的表达载体proHbCIPK2:GUS；2)利用表达载体proHbCIPK2:GUS获得转基因株系。
[0075] 所述步骤1)的具体操作方法为：使用引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R采用PCR方法扩增实施例1中DNA分子序列并引入酶切位点PstI和XhoI，测序后插入载体pYBA1121，构建获得表达载体proHbCIPK2:GUS；所述引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R序列分别为序列表中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示DNA分子。载体pYBA1121是从BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心(http://www.biovector.net/product/163197.html，400-800-2947)购买。
[0076] 所述步骤2)的具体操作方法为：将载体proHbCIPK2:GUS电击转化到农杆菌菌株，制备转化菌液，对植株进行浸染转化，收获的T0代种子在平板上筛选转化子。
[0077] 其中被侵染的植物可以为模式植物也可以为非模式植物，优选为拟南芥、水稻。
[0078] 实施例4
[0079] 在实施例3的基础上，优选获得拟南芥转基因株系，具体操作如下。
[0080] proHbCIPK2:GUS融合表达载体的构建：
[0081] 设计引物(proHbCIPK2-F：5'-TCTGCAGGCCAGTGCTACTACTACTGCTTCCCG-3'；proHbCIPK2-R：5'-TCTCGAGGGTGGCAGGCAGATGTACACAGACAAAATC-3')，PCR扩增序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子并引入酶切位点PstI和XhoI，测序正确后插入载体pYBA1121，构建获得表达载体proHbCIPK2:GUS。
[0082] 拟南芥转基因株系的获得：
[0083] 将该载体proHbCIPK2:GUS电击转化到农杆菌菌株Gv3101，制备转化菌液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，OD600＝0.8～1.2)。按照Clough和Bent(1998)提出的蘸花法(floral dip)对拟南芥野生型(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia)进行浸染转化。收获的T0代种子在含50mg/L Kan的MS平板(含4.3g/L MS粉，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，pH5.8)上筛选转化子。同时，以未插入上述载体pYBA1121转化拟南芥作为对照。
[0084] HbCIPK2启动子活性分析：
[0085] 首先，提取拟南芥转基因株系叶片DNA，并以此为模板,分别用引物Gus-986-F(AAGCCAGACAGAGTGTGATATCT)和Gus-2134-R(AACATTACATTGACGCAGGTGAT)进行PCR扩增,检测为阳性的植株用于GUS表达分析。
[0086] 用于GUS表达分析的拟南芥转基因株系种子用10％次氯酸钠处理后用无菌水冲洗3-5次，4℃沉积处理2天后播于MS平板上，在25℃培养间培养12天，将发芽一致的幼苗进行不处理、分别用含NaCl 300、400mM、PEG 10％、20％以及ABA 100、200uM溶液分别处理2和4天，以及将幼苗放置于低温(4℃)和高温(42℃)处理2和4天。处理和对照材料分别浸没于GUS反应混和液(10mmol/L EDTA-Na2,0.5mmol/L K3Fe(CN)6,0.5mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O,
1mg/mL X-gluc,0.1％TritonX-100,pH7.0),37℃温育过夜；之后分别用50、70和100％乙醇脱色,显微镜下观察。
1mg/mL X-gluc,0.1％TritonX-100,pH7.0),37℃温育过夜；之后分别用50、70和100％乙醇脱色,显微镜下观察。
[0087] HbCIPK2启动子活性分析结果：
[0088] 1、proHbCIPK2:GUS在拟南芥中的表达
[0089] 将筛选出的转proHbCIPK2:GUS拟南芥阳性株系和空载体对照株系提取基因组DNA,采用引物Gus-986-F和Gus-2134-R分别扩增各株系(图2，1～3为转proHbCIPK2:GUS株系；Empty为转空载体对照株系；质粒为阳性对照)。结果表明，GUS基因已整合到拟南芥基因组中。
[0090] 2、转HbCIPK2启动子拟南芥的GUS组织化学染色分析
[0091] 为了确定HbCIPK2启动子是否具有逆境诱导表达活性，选择经鉴定为纯合的转proHbCIPK2:GUS拟南芥株系幼苗，在不同胁迫条件下开展GUS组织化学染色分析。
[0092] 2.1高盐胁迫下HbCIPK2启动子活性分析
[0093] 为了确定HbCIPK2诱导活性与盐胁迫浓度、时间的关系，选择300mM和400mM NaCl分别胁迫转基因株系幼苗，然后观察幼苗GUS染色程度(图3)。结果显示，同一NaCl浓度下，胁迫4天GUS表达活性强于胁迫2天的表达活性；在同一胁迫时间内，NaCl浓度越大，GUS表达活性相对越强，而对照组则没有任何GUS的表达。由此说明，野大麦CIPK2启动子驱动GUS基因的表达受NaCl诱导而产生，且HbCIPK2启动子诱导活性与NaCl胁迫强度成正相关，可应用于作物耐盐转基因育种改良。
[0094] 启动子顺式元件分析表明，HbCIPK2启动子的高盐诱导表达活性可能与脱水、ABA胁迫响应元件有关。
[0095] 2.2模拟干旱胁迫下HbCIPK2启动子活性分析
[0096] 为了明确HbCIPK2活性与干旱诱导的关系，采用10％和20％PEG模拟干旱条件处理转基因株系，分别处理2天和4天后进行GUS染色分析(图3)。结果显示，Hb CIPK2启动子具有较弱的干旱诱导表达活性，而且启动子活性表达强度与模拟干旱的强度有关。说明HbCIPK2启动子是干旱诱导型启动子，主要可应用于驱动转录因子等调控基因的转基因育种。
[0097] 启动子顺式元件分析表明在HbCIPK2启动子区域存在多种与干旱诱导响应的调控元件，但究竟与哪种调控元件相关，而且多种元件之间是否存在竞争抑制的问题，需进一步研究。
[0098] 2.3 ABA胁迫下HbCIPK2启动子活性分析
[0099] 为了确定HbCIPK2启动子活性是否与外源ABA胁迫有关，分别采用100uM和200uM ABA溶液处理拟南芥转基因幼苗，分别处理2天和4天后取样进行GUS染色分析(图3)。结果显示，100uM ABA溶液处理后幼苗根和根茎连接处可被染色，而且处理时间稍长局部染色增强，特别是根茎连接处越明显。但是，200uM ABA溶液处理后幼苗叶和根均不能染色，说明有可能ABA浓度太高，超出了HbCIPK2启动子诱导范围。
[0100] HbCIPK2启动子ABA诱导表达活性可能与该启动子序列上的ABA响应元件ABRE(CACGTG)有关。
[0101] 2.4高温和低温胁迫下HbCIPK2启动子活性分析
[0102] 为了确定高温和低温逆境对HbCIPK2启动子活性是否具有诱导作用，将生长在MS平板上的转基因幼苗放置于高温(42℃)和低温(4℃)条件下分别生长2天和4天后取样。GUS染色结果表明，经高温和低温处理后幼苗均未被染色，说明高温和低温逆境均不能诱导HbCIPK2启动子活性的表达。
[0103] 2.5在处理条件下转基因拟南芥HbCIPK2启动子驱动GUS基因的表达分析[0104] 1)转proHbCIPK2:GUS拟南芥株系GUS基因qRT-PCR分析方法
[0105] 用于GUS基因表达分析的转proHbCIPK2:GUS拟南芥株系种子用10％次氯酸钠处理后用无菌水冲洗3-5次，4℃沉积处理2天后播于MS平板上，在25℃培养间培养10天，将发芽一致的幼苗进行不处理(CK)、逆境和ABA胁迫处理。逆境胁迫处理具体为用含300mM和400mM的NaCl溶液、10％和20％的PEG以及100μM和200uM的ABA溶液分别进行处理2天和4天，以及将幼苗放置于低温(4℃)和高温(42℃)分别处理2天和4天。未处理和逆境胁迫处理的拟南芥幼苗材料共18份，按照RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN,Stockach,Germany)提取RNA,使用Invitrogen公司的SuperScript III试剂盒反转录cDNA。为了确定GUS基因在逆境胁迫下的表达情况，应用Bio-Rad CFX96real-time系统开展定量表达分析。选择GAPDH基因为内参，采用primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/)在线设计GUS基因和GAPDH基因引物，PCR扩增后在2％琼脂糖凝胶上检测条带是否特异，扩增具有特异条带的引物用于real-time扩增，引物如下：
[0106] GAPDH-RT-F:5'-TTTCGGAAGGATCGGGAG-3’
[0107] GAPDH-RT-R:5'-ACAGCCTTGGCAGCACCA-3’
[0108] GUS-RT-F:5'-CTCCTACCGTACCTCGCATTAC-3’
[0109] GUS-RT-R:5'-ACGCGCTATCAGCTCTTTAATC-3’
[0110] PCR程序如下：94℃预变性15min，然后94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；20μl反应体系，包含10μl SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa BIO INC.,Otsu,Shiga,Japan),3μl cDNA和10μM引物；所有反应重复三次；使用2-ΔΔCt方法分析GUS基因的相对表达。
[0111] 2)盐胁迫下proHbCIPKK2:GUS拟南芥株系GUS基因相对定量表达分析[0112] 为了确定在盐胁迫下HbCIPK2启动子可诱导GUS基因表达，选择300mM和400mM NaCl分别胁迫处理转proHbCIPK2:GUS拟南芥幼苗，分析幼苗GUS基因qRT-PCR情况(图4)。结果显示，以未处理2天材料为对照，同一NaCl浓度下，胁迫4天GUS基因相对表达量高于胁迫2天的表达量；在同一胁迫时间内，NaCl浓度越大，GUS基因相对表达量相对较高。由此说明，HbCIPK2启动子驱动GUS基因的表达受NaCl诱导而产生，且HbCIPK2启动子诱导活性与NaCl胁迫浓度、时间成正相关。
[0113] 3)模拟干旱胁迫下proHbCIPK2:GUS拟南芥株系GUS基因相对定量表达分析[0114] 采用10％和20％PEG模拟干旱条件处理转proHbCIPK2:GUS拟南芥幼苗，分别处理2天和4天后进行GUS基因相对定量表达分析(图4)。结果显示，在模拟干旱处理条件下GUS基因表达量相对NaCL处理的表达量低；但在同一PEG浓度下，胁迫4天GUS基因相对表达量高于胁迫2天的表达量；胁迫强度也与GUS基因的表达量呈正相关。由此说明，HbCIPK2启动子具有干旱诱导表达活性。
[0115] 4)ABA处理下proHbCIPK2:GUS拟南芥株系GUS基因相对定量表达分析[0116] 采用100μM和200μM ABA溶液处理转proHbHAK2:GUS拟南芥幼苗，分别处理2天和4天后进行GUS基因相对定量表达分析(图4)。结果显示，100μM ABA溶液处理后幼苗中GUS基因表达量明显高于对照。但是，200μM ABA溶液处理后幼苗中GUS基因表达量与对照相比，没有差异。说明有可能ABA浓度太高，不适合诱导HbCIPK2启动子活性表达。
[0117] 5)高温和低温胁迫下proHbHAK2:GUS拟南芥株系GUS基因相对定量表达分析[0118] 为了确定高温和低温逆境对HbCIPK2启动子活性是否具有诱导作用，将生长在MS平板上的转proHbCIPK2:GUS拟南芥幼苗放置于高温(42℃)和低温(4℃)条件下分别生长2天和4天后取样。GUS基因相对定量表达分析结果表明，经高温和低温处理后幼苗中GUS基因均未被诱导表达(图4)，说明高温和低温逆境均不能诱导HbCIPK2启动子的活性表达。
[0119] 综上所述，HbCIPK2启动子是典型的逆境诱导启动子，响应高盐、干旱和ABA胁迫，但在高盐诱导条件下启动子活性较强，而在干旱和外源ABA胁迫下启动子活性较弱。这一特性有利于转录因子等调控基因的转基因研究和利用。
[0120] 本发明通过染色体步移法从盐生植物野大麦基因组中获得了一段1750bp的HbCIPK2启动子序列(DNA分子)，拟南芥转proHbCIPK2:GUS株系在NaCl不同浓度和不同时间胁迫下均可驱动GUS基因的表达，而且随着胁迫时间和浓度的增加，GUS的表达活性增强；在PEG和ABA胁迫下HbCIPK2启动子驱动GUS基因的诱导表达活性相对较低；但相同的转基因株系在无胁迫处理(对照)、低温(4℃)和高温(42℃)胁迫下均无GUS基因的表达。结果表明HbCIPK2-1750bp启动子是一种新型的逆境诱导型启动子，在高盐胁迫下具有较强的启动子活性，可诱导转录因子等调控基因的适量表达。该启动子可应用于植物耐盐等抗逆分子机理研究和农作物抗逆转基因育种。
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