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一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在 土壤生态修复中的应用

阅读：758发布：2020-05-19

专利汇可以提供一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在土壤生态修复中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在土壤生态修复中的应用。该固氮菌是云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12397。本发明从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，筛选到高效固氮菌微球菌GD1925，本发明的微球菌GD1925的固氮酶活性和ACC脱氨酶活性均极显著高于微球菌GD192和微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。，下面是一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在土壤生态修复中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12397。
2.一种菌剂，含有权利要求1所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1)-9)中任一菌剂：
1)用于固氮的菌剂；
2)产生固氮酶的菌剂；
3)促进植物生长的菌剂；
4)改良培肥土壤的菌剂；
5)抑制植物产生乙烯的菌剂；
6)降低植物对逆境敏感性的菌剂；
7)提高植物抗逆性的菌剂；
8)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的菌剂；
9)修复土壤的菌剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述抗逆性为对逆境的抗性，所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或/和重金属污染。
5.权利要求1所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397或权利要求2或3或4所述的菌剂的下述P1)-P11)中的任一应用：
P1)在固氮中的应用；
P2)在生产固氮酶中的应用；
P3)在促进植物生长中的应用；
P4)在改良培肥土壤中的应用；
P5)在抑制植物产生乙烯中的应用；
P6)在降低植物对逆境敏感性中的应用；
P7)在提高植物抗逆性中的应用；
P8)在生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用；
P9)在修复土壤中的应用；
P10)在蔬菜工厂化育苗中的应用；
P11)在制备生物有机肥中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为对逆境的抗性，所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或/和重金属污染。
7.含有权利要求1所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397或权利要求2、3或4所述的菌剂的生物有机肥。
8.培养权利要求1所述云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397的方法，包括将云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397在用于培养微球菌的培养基中培养的步骤。
9.权利要求2、3或4所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925CGMCC No.12397作为活性成分，得到所述菌剂。

说明书全文

一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在 土壤生态修复中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株产ACC脱氨酶的固氮菌及其在土壤生态修复中的应用。

背景技术

[0002] 氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70％～80％。煤炭、石油、天然气等化石能源不可再生，依靠化学氮肥的农业生产难以持续发展。化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的环境污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。

[0003] 大气中含有78％的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势：①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20％～40％，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。

[0004] 修路、开矿、干旱、洪涝等对自然环境植被和土壤生态影响巨大，修复土壤生态环境需要新的技术手段。乙烯是高等植物的内源激素，植物生长发育通常只需要较低水平的乙烯，但在接近成熟或遇到干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭时会大量产生乙烯，这是植物对环境的一种生理应激反应，但过量乙烯会导致植物生长发育受阻甚至死亡。1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)是乙烯合成的前体物质，近年来发现，许多植物促生细菌(plant growth promoting bacteria,PGPB)具有ACC脱氨酶活性，能够把ACC分解成氨和α-丁酮酸减少乙烯合成，从而降低植物对逆境的敏感性，提高植物抗逆能力，而且可以促进有机物污染和重金属污染土壤的植物修复，因此人们采用检测ACC脱氨酶的方法来筛选植物促生细菌。近年来，微生物技术在生态环境修复中的作用越来越大。

[0005] 菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需要能够高效固氮、提高作物抗逆性的微生物肥料生产用菌种。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一株具有较高固氮酶活性和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的细菌。

[0007] 本发明提供的细菌是云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12397，以下简称为云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925。

[0008] 含有云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925或/和云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物的菌剂也属于本发明的保护范围。

[0009] 该菌剂除包含云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925或/和云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925或/和云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

[0010] 所述菌剂可为下述1)-9)中的任一菌剂：

[0011] 1)用于固氮的菌剂；

[0012] 2)产生固氮酶的菌剂；

[0013] 3)促进植物生长的菌剂；

[0014] 4)改良培肥土壤的菌剂；

[0015] 5)抑制植物产生乙烯的菌剂；

[0016] 6)降低植物对逆境敏感性的菌剂；

[0017] 7)提高植物抗逆性的菌剂；

[0018] 8)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的菌剂；

[0019] 9)修复土壤生态的菌剂。

[0020] 上述菌剂的活性成分可为云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925或/和云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的活性成分本领域技术人员可根据固氮酶活性和/或ACC脱氨酶活性确定。

[0021] 上文中，云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物可从云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的发酵液中获得。云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925，除去液体培养物(发酵液)中的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925即得到云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925的代谢物。

[0022] 云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925或所述菌剂的下述P1)-P11)中的任一应用也属于本发明的保护范围：

[0023] P1)在固氮中的应用；

[0024] P2)在生产固氮酶中的应用；

[0025] P3)在促进植物生长中的应用；

[0026] P4)在改良培肥土壤中的应用；

[0027] P5)在抑制植物产生乙烯中的应用；

[0028] P6)在降低植物对逆境敏感性中的应用；

[0029] P7)在提高植物抗逆性中的应用；

[0030] P8)在生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中的应用；

[0031] P9)在修复土壤中的应用；

[0032] P10)在蔬菜工厂化育苗中的应用；

[0033] P11)在制备生物有机肥中的应用。

[0034] 上文中，所述抗逆性为对逆境的抗性，所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭和/或重金属污染等。

[0035] 本发明的另一个目的是提供一种含有所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397或所述菌剂的生物有机肥。

[0036] 本发明的又一目的是提供一种培养云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的方法，包括将云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397在用于培养微球菌的培养基中培养的步骤。

[0037] 本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤：将所述的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397作为活性成分，得到所述菌剂。

[0038] 本发明从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，最终筛选到高效固氮菌云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的固氮酶活性和ACC脱氨酶活性均极显著高于微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778和微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的固氮酶活性是微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的固氮酶活性的2.8倍，是微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性的5.3倍，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的ACC脱氨酶活性是微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的ACC脱氨酶活性的3.2倍，是微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的ACC脱氨酶活性的21倍，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

[0039] 保藏说明

[0040] 菌种名称：云南微球菌

[0041] 拉丁名：Micrococcus yunnanensis

[0042] 菌株编号：GD1925

[0043] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0044] 保藏机构简称：CGMCC

[0045] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0046] 保藏日期：2016年4月25日

[0047] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12397

具体实施方式

[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0050] 下述实施例中所用的培养基如下：

[0051] 固氮菌富集培养液ACCC55：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、用蒸馏水定容至1000ml、pH 7.0～7.2。

[0052] 无氮液体培养基：溶质及其浓度为蔗糖10g/L，NaCl 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，CaCO3 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L；溶剂为蒸馏水；pH 7.2。

[0053] 无氮固体培养基：在无氮液体培养基中加入琼脂，至琼脂的含量为15-20g/L。

[0054] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2。

[0055] 改良固氮培养基：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂15-20g，pH 7.0～7.2。

[0056] 改良固氮液体培养基：与改良固氮培养基的区别仅在于不含琼脂。

[0057] 多碳源低氮培养基(CCM)：溶液Ⅰ：KH2PO4 0.2g，NaCl 0.1g，K2HPO4 0.8g，Na2FeEDTA 28mg，钼酸钠25mg，酵母浸膏100mg，甘露醇5g，蔗糖5g，乳酸钠0.5mL，蒸馏水900mL。溶液Ⅱ：
MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.06g，蒸馏水100mL。将溶液Ⅰ、Ⅱ分别灭菌，冷却至50℃左右混合，加入生物素(5μg/L)和维生素(10μg/L)各0.5mL。

[0058] DF培养基：KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，组分一、组分二溶液各0.1ml，H2O 1000mL，pH 7.2；其中组分一：H3BO3 10mg，MnSO4·H2O 11.19mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水中；组分二：FeSO4·7H2O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中。

[0059] 不含(NH4)2SO4的DF培养基：与DF培养基的区别仅在于不含(NH4)2SO4。

[0060] ADF培养基：将ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到灭菌不含(NH4)2SO4的DF培养基中，终浓度为3.0mM。

[0061] 下述实施例中所用的圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103(参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009,42(6):2043-2051”)。公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得该菌株，以重复本申请的实验。

[0062] 实施例1、云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的分离与鉴定

[0063] 一、作物根际固氮菌GD1925的富集与分离

[0064] 取10g土样(采自中国黑龙江省)放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中，100rpm，28℃进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮菌分离。吸取1ml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成10-1稀释度，继续稀释制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的菌悬液，每个稀释度取0.1ml涂布在无氮固体培养基平板上，29℃静置培养。2～3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化，分离得到作物根际固氮菌。

[0065] 二、ACC脱氨酶阳性菌株筛选

[0066] 对步骤一所得的作物根际固氮菌进行ACC脱氨酶阳性菌株筛选，具体方法如下所述：把分离到的作物根际固氮菌，接入5mL无氮液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h；吸取上述培养液0.1mL接种至5mL DF培养基振荡培养24h；吸取上述培养液0.1mL接种至5mL ADF培养基中振荡培养24～48h；将在ADF中生长的菌种重复转接、培养，并以ADF培养基作为阴性对照，能够以ACC为唯一氮源生长的菌株为ACC脱氨酶阳性菌株。将筛选所得的一株ACC脱氨酶阳性菌株命名为作物根际固氮菌GD1925。

[0067] 三、作物根际固氮菌GD1925的鉴定

[0068] 从以下几个方面鉴定步骤二分离纯化并筛选得到的作物根际固氮菌GD1925：

[0069] 1、形态学鉴定

[0070] 将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤二分离并纯化得到的作物根际固氮菌GD1925进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

[0071] 对于处于对数生长期的所述作物根际固氮菌GD1925，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

[0072] 结果表明，上述步骤二分离并纯化得到的作物根际固氮菌GD1925菌落圆形凸起，浅乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体球状；革兰氏阳性。

[0073] 2、生理生化特征分析

[0074] 参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定上述作物根际固氮菌GD1925的生理生化特征。

[0075] 作物根际固氮菌GD1925的生理生化特征测定结果如下：

[0076] 接触酶反应：阳性；

[0077] 氧化酶反应：阴性；

[0078] 生长温度：4℃不生长，28℃生长，37℃不生长，60℃不生长；

[0079] 耐盐性试验：2％NaCl生长，5％NaCl不生长，7％NaCl不生长，10％NaCl不生长；

[0080] 苯丙氨酸脱氨酶试验：阴性；

[0081] 利用柠檬酸盐：阴性；

[0082] 水解淀粉：阴性；

[0083] 卵黄卵磷脂酶：阴性；

[0084] 甲基红试验：阴性；

[0085] V.P试验：阴性；

[0086] PH 5.7生长：阳性；

[0087] 糖醇发酵产酸：葡萄糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阴性，蔗糖阴性。

[0088] 3、16s rDNA序列同源性分析

[0089] 常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GD1925，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由上海生物工程有限公司完成，序列拼接及相似性分析使用clustalx-MEGA6 软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在线完成。

[0090] PCR基因扩增得到作物根际固氮菌GD1925的16S rDNA基因片段序列如序列表中序列1，与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示作物根际固氮菌GD1925与云南微球菌Micrococcus yunnanensis YIM65004T的同源性最高，达到99.78％。

[0091] 4、生长特性分析

[0092] 进行了作物根际固氮菌GD1925的最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。

[0093] 结果表明，所述作物根际固氮菌GD1925的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。

[0094] 鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GD1925鉴定为细菌域放线菌群微球菌科(Micrococcaceae)的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)。该云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925已于2016年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12397。

[0095] 实施例2、云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397固氮酶活性测定

[0096] 分别以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103和同属微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778(已于2014年11月19日在中国发明专利文献CN
103343097B中授权公告)作为对照组，实施例1的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397作为实验组进行固氮酶活性测定，具体方法如下：在15×150mm螺口玻璃管中加入5mL改良固氮培养基制成斜面，接种菌株，28℃培养。以不接种空白斜面为阴性对照，每个处理设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10％，用医用胶布密封，继续培养72h，取100μL反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h)＝C2H4nmol/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C2H4nmol＝1000×C2H4体积(μl)×273×P/[22.4×(273+t℃)×760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度。

[0097] 其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5mL生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向菌体中加入3mL 0.5M的NaOH溶液沸水煮沸5min，加入3mL 0.5M的HCl溶液混合，离心后取上清1.0mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。

[0098] 结果显示，云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的固氮酶活性为132.238±3.246nmol C2H4/h·mg蛋白，微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的固氮酶活性为47.838±2.159nmol C2H4/h·mg蛋白，微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25.100±1.334nmol C2H4/h·mg蛋白，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的固氮酶活性是微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的固氮酶活性的2.8倍，是微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性的5.3倍，统计分析云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的固氮酶活性极显著高于微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778和微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性。这一结果表明，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397具有很高的固氮潜能，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

[0099] 实施例3、云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397 1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性测定

[0100] 分别以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103和同属微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778(已于2014年11月19日在中国发明专利文献CN
103343097B中授权公告)作为对照组，实施例1的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397作为实验组进行固氮酶活性测定，具体方法如下：

[0101] 用5mL无氮液体培养基活化菌株，吸取0.5mL培养液接种到60mL无氮液体培养基中，30℃培养24～48h，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，用15mL不含(NH4)2SO4的DF培养基离心洗涤菌体2次，将菌体重悬于24mL ADF培养基中，30℃培养24h，收集并记录菌体重量。用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)离心洗涤菌体2次，将菌体平均分在3个EP管中，-20℃贮存。取贮存菌体重悬于1mL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，12000rmp离心5min收集菌体，重悬于600μL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入30μL 甲苯，迅速振荡30s破碎细胞，取
100μL粗酶液4℃贮存，用于测定蛋白浓度；其余粗酶液进行ACC脱氨酶活性测定。取粗酶液
200μL加入20μL浓度为0.5M的ACC溶液混匀，置于30℃水浴反应15min，加入1mL 0.56M HCl溶液终止反应，12000rmp离心5min，取上清1mL，加入800μL 0.56M HCl溶液和300μL 0.2％
2，4-二硝基苯肼溶液(2M HCl溶液中溶解)，30℃保温30min；加入2mL 2M NaOH溶液混匀，
540nm测吸光度值。对照α-酮丁酸标准曲线和牛血清白蛋白标准曲线计算菌株的酶活性。
ACC脱氨酶表示方法为：上述反应条件下，每毫克菌体蛋白每小时催化ACC脱氨形成α-丁酮酸的微摩尔数，单位是(μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白)。其中，粗酶液蛋白含量测定方法如下：
取100μL粗酶液，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。实验重复三次。

[0102] 结果显示，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的ACC脱氨酶活性为10.539±0.601μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白，微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的ACC脱氨酶活性为3.326±0.853μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白，微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的ACC脱氨酶活性为0.501±0.103μmolα-丁酮酸/h·mg蛋白，本发明的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的ACC脱氨酶活性是微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778的ACC脱氨酶活性3.2倍，是微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的ACC脱氨酶活性21倍，统计分析云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397的ACC脱氨酶活性极显著高于微球菌(Micrococcus sp.)GD192 CGMCC No.7778和微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的ACC脱氨酶活性。

[0103] 这一结果表明，云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397具有ACC脱氨酶活性，进而具有提高作物抵御干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染等逆境条件的潜能。

[0104] 实施例4、云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397在土壤生态修复中的应用

[0105] 一、制备土壤生态修复菌剂

[0106] 对实施例1所得到的云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397进行土壤生态修复菌剂制备，具体方法如下所述：采用上述改良固氮液体培养基，实验室条件下摇床培养云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397。1L三角瓶装量250mL，28℃、200rpm振荡培养18h～24h至OD600达到1.5～1.8，活菌数达到15～20亿cfu/mL。罐装，密封，即得到多功能土壤生态修复菌剂。室温保存，用于土壤培肥田间试验。

[0107] 二、土壤生态修复现场试验

[0108] 土壤生态修复现场试验在京新高速公路G7河北省兴和县路段施工现场进行。由于修建高速公路，农田耕层土壤被剥离，高速公路护坡(坡度约50度)新土层全部为贫瘠的生荒土(有机质(％)0.435±0.2，全氮(％)0.027±0.006，碱解氮(mg/kg)0，全磷(％)0.089±0.006，有效磷(mg/kg)21.3±1.6)。生态环境恶化，急需建植、培肥、恢复生态。

[0109] 生态修复采用坡面挂网喷播建植。2014年5月15日进行了坡面建植和菌剂施用。播种植物为木本、草本植物混播，包括榆树、柠条、紫穗槐、刺槐、胡枝子、苜蓿、冰草、披碱草、沙打旺、波斯菊等。试验处理设：1)不施菌剂(CK0)、2)施用菌剂(T1)，实验重复三次，每次重复每个试验处理面积2000m2。实验方法如下：

[0110] T1：将步骤一的多功能土壤生态修复菌剂用无菌水1000倍稀释后喷施于坡面，用量为每600m2坡面1L。

[0111] CK0：与T1的区别仅在于用等量的无菌水替换步骤一的多功能土壤生态修复菌剂。

[0112] 三、土壤生态修复效果检测方法

[0113] 1、土壤可培养微生物数量测定

[0114] 取新鲜土样10.00g加入到带玻璃珠的90ml无菌水中，摇床振荡20min，然后无菌操作制成101～106系列稀释梯度，取100μL土壤悬液分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)、马丁培养基(真菌)和高氏一号培养基(放线菌)固体平板上，细菌采用较高的稀释度，均匀涂布，3次重复，28℃培养2～5天，观察计数。

[0115] 2、土壤酶活性测定

[0116] 测定了试验地土壤的蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶和木聚糖酶。具体操作如下：

[0117] 2.1土壤蔗糖酶活性测定(比色法)称5.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混匀，静置15min，再加15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育24h。然后混匀、过滤，吸取1mL滤液于50mL容量瓶中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容到50mL，混匀，测定508nm处的吸光度值(x)，按照标准曲线(y＝(x+0.0171)/16.08)计算葡萄糖含量。土壤蔗糖酶活性定义为：37℃、pH 5.5条件下5g风干土壤24h水解蔗糖生成葡萄糖的毫克(mg)数。

[0118] 2.2土壤过氧化氢酶活性测定(容量法)称2.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加40mL蒸馏水、20mL 0.3％过氧化氢溶液，120r/min振荡30min，立即准确加入20mL 1.5mol/L硫酸溶液，充分混合过滤。取20mL滤液置于100mL三角瓶中，用0.1mol/L高锰酸钾溶液滴定至微红色，且30sec不褪色，记录消耗体积。按照高锰酸钾溶液的标定值计算出高锰酸钾溶液的消耗量。土壤过氧化氢酶活性定义为：2g风干土壤30min分解过氧化氢的数量折和氧化分解等量过氧化氢所需0.1mol/L高锰酸钾的毫升(mL)数。

[0119] 2.3土壤脲酶活性测定(靛酚蓝比色法)

[0120] 试剂的配制：10％尿素溶液：称取10g尿素，用水溶至100ml。

[0121] 柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾(KOH)溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/L NaOH将pH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

[0122] 苯酚钠溶液(1.35mol/L)：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml(A液)，存于冰箱中；27g NaOH溶于100ml水(B液)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

[0123] 次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

[0124] 氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释10倍(吸取10ml标准液定容至100ml)制成氮的工作液(0.01mg/ml)。

[0125] 操作步骤：

[0126] 称10.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混匀，静置15min，加入10mL 10％尿素溶液和20mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液，混匀，37℃温育3h，然后混匀、过滤，用
38℃蒸馏水定容至100mL。取1mL滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至20mL，加入4mL苯酚钠溶液混匀，立即加入3mL次氯酸钠溶液混匀，20min后定容至50mL，溶液呈现蓝色，测定
578nm处吸光度，按照预先测定的硫酸铵标准曲线(y＝(x+0.0006)/241.14)计算出氨氮含量。土壤脲酶活性定义为：37℃、pH6.7条件下10g风干土壤3h分解尿素释放NH3－N的毫克(mg)数。

[0127] 2.4土壤磷酸酶活性测定(磷酸苯二钠比色法)

[0128] 试剂的配制：

[0129] Gibbs试剂：将200mg 2，6-双溴苯醌氯酰亚胺溶于乙醇，并稀释至100mL。

[0130] 硼酸盐缓冲液(pH 9.6):

[0131] 0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L。

[0132] 0.2mol/L NaOH溶液8g NaOH溶至1L。

[0133] 取50ml 0.05mol/L硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml。

[0134] 操作步骤：

[0135] 称10.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混匀，静置15min，加入10mL 0.5％磷酸苯二钠溶液和10mL pH9.6碱性硼酸盐缓冲液，37℃温育24h，然后混匀、过滤，用38℃蒸馏水定容至100mL，充分混合过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL碱性硼酸盐缓冲液，用蒸馏水稀释至25mL，加入1mL Gibbs试剂，20min后定容至100mL，溶液呈现青色，测定578nm处吸光度，按照预先测定的标准曲线(y＝(x-0.0014)/200.88)计算出酚含量。土壤磷酸酶活性定义为：37℃、pH9.6条件下10g风干土壤24h分解释放酚的毫克(mg)数。

[0136] 2.5土壤纤维素酶活性测定(硝基水杨酸比色法)称10.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1.5mL甲苯，混匀，静置10min，加入20mL 1％羧甲基纤维素钠溶液和5mL pH 5.5磷酸盐缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育72h。用无磷滤纸过滤，取1mL滤液置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容至50mL，混匀，
15min后，测定530nm处的吸光度值，按照预先测定的标准曲线(y＝(x+0.0009)/5.3571)计算葡萄糖含量。土壤纤维素酶活性定义为：37℃、pH5.5条件下10g风干土壤72h分解释放葡萄糖的毫克(mg)数。

[0137] 2.6土壤木聚糖酶活性测定(硝基水杨酸比色法)

[0138] 称5.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混匀，静置10min，加入20mL 0.5％木聚糖溶液和5mL pH 5.5的磷酸盐缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育120h。培养结束后，用无磷滤纸过滤，取1mL滤液，置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容至50mL，混匀，15min后，测定550nm处的吸光度值，按照预先测定的标准曲线(y＝(x+0.0057)/4.1605)计算还原糖含量。土壤木聚糖酶活性定义为：37℃、pH5.5条件下5g风干土壤120h分解释放还原糖的毫克(mg)数。

[0139] 四、土壤生态修复试验结果

[0140] 1、施用多功能土壤生态修复菌剂对试验地土壤微生物数量的影响

[0141] 施用步骤一的多功能土壤生态修复菌剂3个月后，2014年8月7日进行了现场调查采样。分别采集了施用多功能土壤生态修复菌剂处理(T1)土壤样品和不施菌剂(CK0)土壤样品，带回实验室进行分析测定(3次重复)。结果显示施用多功能土壤生态修复菌剂对土壤中三类微生物的数量产生了影响。统计分析表明，土壤中可培养细菌总数，施用步骤一的多功能土壤生态修复菌剂的处理极显著高于不施菌剂处理；土壤中可培养真菌总数，同样是施用步骤一的多功能土壤生态修复菌剂的处理显著高于不施菌剂处理；土壤中可培养放线菌总数测定结果有所不同，施用步骤一的多功能土壤生态修复菌剂与不施菌剂处理无差异(表1)。

[0142] 表1土壤生态修复试验可培养微生物数量检测结果

[0143]

[0144] 注：表中数据后上标字母表示处理间差异显著性，大写字母不同表示达到0.01差异水平，小写字母不同表示达到0.05差异水平。

[0145] 2、施用多功能土壤生态修复菌剂对试验地土壤酶活性的影响

[0146] 统计分析表明，施用步骤一的多功能土壤生态修复菌剂后，试验地土壤的蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶和木聚糖酶活性均显著或及显著地高于不施菌剂的空白处理(表2)。

[0147] 表2土壤生态修复试验土壤酶活性测定结果

[0148]

[0149] 注：表中数据后上标字母表示处理间差异显著性，大写字母不同表示达到0.01差异水平，小写字母不同表示达到0.05差异水平。

[0150] 上述实验结果显示出采用云南微球菌(Micrococcus yunnanensis)GD1925 CGMCC No.12397制成的多功能土壤生态修复菌剂对于生荒地土壤培肥、生态修复具有显著效果。

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