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蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用

阅读：692发布：2020-05-14

专利汇可以提供蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于生物技术领域，具体涉及蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用。本发明要解决的技术问题是为蜡梅育种提供一种新选择。本发明提供了蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，具有如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列。本发明还提供了蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在蜡梅花发育及对抗逆境胁迫中的用途，为蜡梅育种调控以及蜡梅切花保鲜提供了新方向。，下面是蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，其特征在于：具有如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，其特征在于：蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
3.蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅花发育中的用途，其特征在于：连接酶CpSIZ1具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅花发育中的用途，其特征在于：所述蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1，具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
5.蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅抗胁迫能力中的用途，其特征在于：连接酶CpSIZ1具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅抗胁迫能力中的用途，其特征在于：蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
具体的，所述的胁迫为干旱、低温、高温或脱落酸ABA处理中的至少一种。
具体的，所述的低温为4℃。
具体的，所述的高温为42℃。
具体的，所述的干旱为30％质量分数PEG6000处理。
具体的，所述的脱落酸ABA处理为100μmol·L-1的ABA。
7.提高蜡梅抗逆能力的制剂，其特征在于：其主要活性成分为蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，或/和表达蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1的载体或宿主，其蛋白质具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的提高蜡梅抗逆能力的制剂，其特征在于：所述的蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。

说明书全文

蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1及其应用。

背景技术

[0002] 蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)的一种落叶灌木或小乔木，是我国少有的传统的冬季开花植物。植物冬季开花过程的成花诱导、开花启动、花器官发育等不同于一般植物的春暖花开过程，同时在抗寒性方面也存在其特殊性，因此，探索冬季开花植物的花发育和抗寒方面的机理，对于冬季开花植物的花期调控、农林生产中的冻害防御有重要的指导意义，同时可以丰富植物花发育和抗寒机理研究的内容。SUMO E3连接酶在真核生物中广泛存在，并参与到真核生物SUMO化修饰中，不仅如此，根据E3连接酶的底物特异性还决定了它在植物中的多种生物功能。目前为止，植物SIZ/PIAS-type SUMO E3连接酶SIZ1基因的研究最为广泛，研究表明：SIZ1在植物的抗寒性、抗热性、抗旱性、磷酸饥饿反应、抗病防御以及花期调控等生理过程中都发挥着重要作用。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是为蜡梅育种提供一种新选择。

[0004] 本发明提供了蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，具有如SEQ ID No.30所示的氨基酸序列。

[0005] 具体的，所述的蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。

[0006] 本发明还提供了蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅花发育中的用途，该连接酶CpSIZ1具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。

[0007] 具体的，所述蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。

[0008] 本发明还提供了所述的蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1在调控蜡梅抗胁迫能力中的用途，该连接酶CpSIZ1具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。

[0009] 具体的，所述蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。

[0010] 具体的，所述的胁迫为干旱、低温、高温或脱落酸ABA处理中的至少一种。

[0011] 具体的，所述的低温为4℃。

[0012] 具体的，所述的高温为42℃。

[0013] 具体的，所述的干旱为30％质量分数PEG6000处理。

[0014] 具体的，所述的脱落酸ABA处理为100μmol·L-1的ABA。

[0015] 本发明还提供了提高蜡梅抗逆能力的制剂，其主要活性成分为蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1，或/和表达蜡梅SUMO E3连接酶CpSIZ1的载体或宿主，其蛋白质具有如SEQ ID No.30所示氨基酸序列。

[0016] 具体的，所述的蜡梅SUMO E3连接酶的编码基因CpSIZ1具有如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。

[0017] 本发明的有益效果：本发明首次克隆了蜡梅SUMO E3连接酶基因CpSIZ1，并对其功能进行了研究。经研究发现，该基因与蜡梅花的发育密切相关，同时又参与逆境胁迫的调控。为蜡梅育种调控以及蜡梅切花保鲜提供了新的选择和方向。附图说明

[0018] 图1为CpSIZ1蛋白和其它植物SIZ1蛋白序列的多重比对。A：CpSIZ1基因序列全长图谱，包含有外显子(extron)和内含子(intron)区域；B：用来做多序列比对的蛋白序列及NCBI上的登录号：拟南芥(AtSIZ1，AED97325.1)，水稻(OsSIZ1，NP_001054517.1)，无油樟(AmSIZ1，ERM99329.1)，甜橙(CsSIZ1，XP_006488142.1)，苹果(MdSIZ1，XP_008385288.1)，荷花(NnSIZ1，XP_010253567.1)，碧桃(PpSIZ1，AND67228.1)，梅花(PmSIZ1，XP_016650561.1)，葡萄(VvSIZ1，XP_002282690.2)。

[0019] 图2为CpSIZ1蛋白进化树分析。

[0020] 图3为CpSIZ1蛋白的亚细胞定位。A：用于亚细胞定位的载体图谱构建，其中CaMV35S为烟草花叶病毒35S启动子，EGFP为绿色荧光蛋白，NosT为胭脂氨酸合成酶基因终止子。B：CpSIZ1蛋白在烟草叶表皮细胞中的亚细胞定位，其中，35S:GFP为阳性对照，UV为GFP绿色荧光蛋白图像，DAPI+UV为染色剂DAPI染色后的GFP荧光蛋白图像，Merge为共定位下的GFP荧光蛋白图像。

[0021] 图4为CpSIZ1在蜡梅不同组织和器官中的表达分析。A：CpSIZ1在蜡梅不同组织和花期中的表达分析；B：CpSIZ1在蜡梅花朵开放时(stage 4-6)不同花器官中的表达分析。

[0022] 图5为CpSIZ1在不同胁迫处理后的蜡梅幼苗中的表达分析。A，B，C，D分别为CpSIZ1在高温(42℃)、低温(4℃)、脱落酸(ABA)和干旱(PEG)胁迫处理后的蜡梅幼苗中的表达分析。

[0023] 图6为转CpSIZ1拟南芥生长相关表型。WT为野生型拟南芥，OE为CpSIZ1基因在野生型拟南芥植株中的过量表达株系，siz1-2为拟南芥SIZ1基因的缺失突变体，HB为CpSIZ1基因在siz1-2突变体植株中的过量表达株系。A：2周((a)-(d))、5周((e)-(h))和8周(i)大的WT，OE，siz1-2以及HB植株的生长表型；B：CpSIZ1基因在转基因拟南芥植株中的表达量分析；C：生长55天的拟南芥WT，OE，siz1-2和HB植株高度；D：生长55天的拟南芥WT，OE，siz1-2和HB植株主茎直径。

[0024] 图7为转CpSIZ1拟南芥植株开花表型。WT为野生型拟南芥，OE为CpSIZ1基因在野生型拟南芥植株中的过量表达株系，siz1-2为拟南芥SIZ1基因的突变体，HB为CpSIZ1基因在siz1-2突变体植株中的过量表达株系。A：5周大的拟南芥WT，OE，siz1-2和HB植株的开花时间表型；B：WT，OE，siz1-2和HB拟南芥植株抽葶时间统计。

[0025] 图8为转CpSIZ1拟南芥植株衰老表型。WT为野生型拟南芥，OE为CpSIZ1基因在野生型拟南芥植株中的过量表达株系，siz1-2为拟南芥SIZ1基因的突变体，HB为CpSIZ1基因在siz1-2突变体植株中的过量表达株系。A：45天大的WT，OE，siz1-2和HB拟南芥的莲座叶生长状况；B：65天大的WT，OE，siz1-2和HB拟南芥的莲座叶生长状况；C：55天大的WT，OE，siz1-2和HB拟南芥的叶绿素含量测定。

[0026] 图9为转CpSIZ1拟南芥回复突变体的ABA胁迫处理。A：在不同ABA浓度下的生长10天的三个回复突变体株系(HB1，HB2，HB6)和突变体(siz1-2)表型；B：48h后统计的生长在不同ABA浓度下三个回复突变体株系(HB1，HB2，HB6)和突变体(siz1-2)发芽率；C：5天后统计的生长在0.2μM ABA浓度下的三个回复突变体株系(HB1，HB2，HB6)和突变体(siz1-2)子叶绿化率。

[0027] 图10为转CpSIZ1拟南芥回复突变体的低温处理。A：野生型(WT)，三个回复突变体株系(HB1，HB2，HB6)和突变体(siz1-2)，在非驯化下进行-4℃和-6℃低温处理后正常生长一周的表型；B：-4℃低温处理后恢复生长一周后的植株的存活率。

具体实施方式

[0028] 实施例1蜡梅CpSIZ1基因的分离

[0029] 用Trizol法提取蜡梅叶片总RNA，通过反转录合成cDNA。根据蜡梅EST数据库(GenBank登录号:DW222667-DW223533)中已知的序列片段，用软件Primer primer 5.0设计特异引物进行PCR扩增核心片段，再利用5’race(CpSIZ1-5’-SP1和CpSIZ1-5’-SP2)和3’race(CpSIZ1-3’-SP1和CpSIZ1-3’-SP2)引物克隆序列cDNA全长，所用引物序列如下：

[0030] CpSIZ1-5’-SP1：CTCACACTGAATCATTGAATCGGAAAGC(SEQ ID No.1)

[0031] CpSIZ1-5’-SP2：CTCTTTGCCCAACCATGCGTTTTAG(SEQ ID No.2)

[0032] CpSIZ1-3’-SP1：AGATGCTTTTGCCCGTGTTTACCGC(SEQ ID No.3)

[0033] CpSIZ1-3’-SP2：GGAGTGGGTTGAAAATGAAGATTGC(SEQ ID No.4)

[0034] CpSIZ1-FULL-F：ACAGATCGAGAACGCAGCAACG(SEQ ID No.5)

[0035] CpSIZ1-FULL-R：GGCACTATCAAATAAAATCAAGCGG(SEQ ID No.6)

[0036] 以蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpSIZ1基因，PCR反应体系及反应条件如下：ddH2O 17.8μL，10×HiFi TaqPCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM)2.0μL，CpSIZ1-FULL-F(10μM)1μL，CpSIZ1-FULL-R(10μM)1μL，蜡梅cDNA 1μL，HiFi TaqTM 0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性
30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，28个循环；72℃延伸10min。

[0037] 将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序，获得蜡梅CpSIZ1基因cDNA全长。用CTAB法提取蜡梅叶片的总DNA，根据拟南芥SIZ1基因的全长查找到蜡梅CpSIZ1基因可能的内含子位点，设计引物，分别用cDNA和DNA为模板进行扩增。具体的引物序列如下，扩增的片段大小及引物对为：N0(1-624bp，N0-F和N0-R)，N1(540-1591bp，N1-F和N1-R)，N2(1539-2500bp，N2-F和N2-R)，N3(1612-3063bp，N3-F和N3-R)。扩增反应体系和程序同上，将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序，进而比对内含子所在的具体序列和位置。

[0038] N0-F：GGTCGACAGACAGATCGAGAAC(SEQ ID No.7)

[0039] N0-R：AAGACCAAGCTGAGTGAGAAC(SEQ ID No.8)

[0040] N1-F：ATGGATTTGGCAGCTAGTTGC(SEQ ID No.9)

[0041] N1-R：CACTGTCACTGTCTGCATTCT(SEQ ID No.10)

[0042] N2-F:AAGATGCTTTTGCCCGTGTT(SEQ ID No.11)

[0043] N2-R:GTTCGGCATCACCACTTGTAC(SEQ ID No.12)

[0044] N3-F:ATTTGGAAGTTGTGGCTGAGT(SEQ ID No.13)

[0045] N3-R:CTACAGAAGAATGTCCTCAG(SEQ ID No.14)

[0046] 所得的全长序列如SEQ ID No.29所示。CpSIZ1基因的全长为6648bp，包含540bp的5’非编码区，1235bp的3’非编码区，以及4873bp的编码区。编码区中还包括了长度分别为
1073bp，1043bp,137bp和103bp的四段内含子(位置分别为从翻译起始位点ATG开始25-
26bp，1098-1099bp，1340-1341bp和1422-1423bp处)，编码区可编码的最大编码ORF框(ORF框)为2523bp，可编码841个氨基酸。在NCBI数据库进行Blastp对比，结果显示蜡梅CpSIZ1基因编码蛋白(SEQ ID No.30)与拟南芥AtSIZ1，水稻OsSIZ1，苹果MdSIZ1等植物的SIZ1蛋白序列具有较高的同源性(如图1)。构建进化树分析发现，CpSIZ1属于双子叶植物，在遗传性距离上，CpSIZ1与无油樟AmSIZ1，荷花NnSIZ1等木本植物的进化距离较近，与拟南芥AtSIZ1，烟草NtSIZ1等草本模式植物进化距离较远(如图2)。但集中在模式植物拟南芥AtSIZ1在生长发育，开花调控以及非生物胁迫响应上的功能研究较多。

[0047] 实施例2蜡梅CpSIZ1基因亚细胞定位

[0048] 1亚细胞定位载体的构建

[0049] 去除CpSIZ1基因终止子后，分析基因ORF框所含酶切位点种类及所用的亚细胞定位载体pCAMBIA1300-GFP多克隆位点酶切位点的需要，在两端设计含酶切位点的特异引物V-CpSIZ1-F、V-CpSIZ1-R，分别在基因上下游引入KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点。引物序列如下：

[0050] V-CpSIZ1-F(5'-3'):Cggatcca ATGGATTTGGCAGCTAGTTGCAAG(SEQ ID No.15)[0051] V-CpSIZ1-R(5'-3'):GCtctaga CTACTCAGAATCTGTATCTATTGAAAG(SEQ ID No.16)[0052] PCR扩增CpSIZ1基因，PCR体系及条件如下：ddH2O 17.8μL，10×HiFi TaqPCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM)2.0μL，V-CpSIZ1-F(10μM)1μL，V-CpSIZ1-R(10μM)1μL，质粒DNA 1μL，HiFi TaqTM 0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸2min，28个循环；72℃延伸10min。

[0053] 取2μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步检测后，回收目的片段进行连接转化培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，扩大培养阳性克隆，提取质粒进行酶切验证。用KpnⅠ和XbaⅠ酶分别酶切该重组质粒和载体pCAMBIA1300-GFP，37℃酶切4h，80℃灭活30s，1％琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切产物中载体大片段及目的小片段。用T4连接酶连接两个片段，4℃连接过夜。

[0054] 酶切体系如下：10×Green Buffer 2μL，Kpn I 0.5μL，Xba I 0.5μL，重组质粒pCAMBIA1300-GFP 7μL，ddH2O 10μL。连接反应体系：ddH2O 1μL，目标片段片段6.7μL，载体片段1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0μL，T4 DNA Ligase 0.3μL。4℃过夜连接。将过夜的连接产物转化大肠杆菌TOP10后，涂布在含卡纳抗生素(kan，50mg/L)的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR菌液检测，扩大培养阳性克隆，提取质粒进行酶切验证。将PCR鉴定和酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为pCAMBIA1300-CpSIZ1，即为CpSIZ1基因亚细胞定位载体。将重组质粒pCAMBIA1300-CpSIZ1以电转法转化农杆菌GV3101感受态细胞，挑取单菌落，置于800μL含有YEB+Kan+Gen无菌的1.5mL离心管中(50mg/L Kan和3 Gen)中，28℃振荡培养36～48h，以菌液为模板进行PCR检测。验证正确的农杆菌菌液即为含有表达载体pCAMBIA1300-CpSIZ1重组质粒的工程菌。

[0055] 2融合载体注射烟草表皮细胞

[0056] 将含有pCAMBIA1300-CpSIZ1载体质粒和空载质粒的农杆菌工程菌分别加入50mL YEB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至OD600＝1.0～2.0。离心后用包含50mg/L Kan、50mg/L Gen、200μM AS、10mM MES-KOH(pH值5.7)、10mM MgCl2的注射缓冲液重悬，调整OD至
0.5。选取4～6叶期(一月龄)健壮本氏烟草，用1～2mL注射器吸取农杆菌渗透注射悬浮液，去除针头，左手食指前端平顶叶片针孔处，右手轻推注射器使液体缓慢注射入叶片内。小孔注射后避光保湿培养36h，小心切取所取注射部位的2mm×2mm烟草叶片组织，浸没于5g/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液中3～5min。然后在载玻片上滴一滴10％甘油，将叶片背面朝下铺于载玻片上，盖上盖玻片后置于共聚焦显微镜下，488nm处激发GFP，40倍镜下观察烟草表皮细胞中绿色荧光表达情况并拍照保存。

[0057] 结果显示，空载体pCAMBIA1300-GFP荧光信号则分布于整个细胞，而重组质粒的GFP融合蛋白荧光信号也同对照一样，既分布在细胞核也分布在细胞质中(如图3)。综上，烟草表皮细胞上的定位表明，CpSIZ1基因可能既定位在细胞核，又定位在细胞膜中。

[0058] 实施例3 CpSIZ1在蜡梅中的表达分析

[0059] 1蜡梅不同组织和不同时期材料的采集

[0060] 选取3株长势一致的蜡梅幼苗分别在同一植株上采集根、茎、叶等组织，液氮速冻后在-70℃冰箱保存；选取处于花期的3株长势良好无病虫害的蜡梅，在同一植株上分别采集不同时期(包括萌动、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期和落花期)花芽，以及盛花期不同花器官(包括外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊和雌蕊)，收集材料于-70℃冰箱保存，用于总RNA的提取。

[0061] 2蜡梅幼苗高温处理材料的采集

[0062] 将15株长势相近的蜡梅幼苗放入人工气候箱中，温度42℃(其他培养条件如常)，处理0h、1h、6h、12h和24h后，分别剪取3株幼苗同部位叶片用于后续实验。

[0063] 3蜡梅幼苗低温处理材料的采集

[0064] 将15株长势相近的蜡梅幼苗放入人工气候箱中，温度4℃(其他培养条件如常)，处理0h、1h、6h、12h和24h后，分别剪取3株幼苗同部位叶片用于后续实验。

[0065] 4蜡梅幼苗ABA处理材料的采集

[0066] 将15株长势相近的蜡梅幼苗用浓度为100μM的ABA激素进行喷施处理，并在处理0h、3h、6h、12h、24h后，分别减取3株同部位的幼苗叶片用于后续实验。

[0067] 5蜡梅幼苗PEG处理材料的采集

[0068] 将15株长势相近的蜡梅幼苗用浓度为30％的进行PEG胁迫处理，并在处理0h、2h、6h、12h、24h后，分别减取3株同部位的幼苗叶片用于后续实验。

[0069] 6合成蜡梅cDNA第一链

[0070] 用cDNA第一链合成试剂盒和已提取的总RNA为模板进行合成。反应分为两个阶段，如下所示。

[0071] (1)去基因组DNA的反应见表1(表中名称均为试剂盒中名称)：

[0072] 表1去基因组DNA

[0073]试剂试剂用量
去RNA酶水(DEPC H2O) 6μL
5×gDNA Erase Buffer 2μL
gDNA Erase 1μL
RNA 1μL

[0074] 42℃反应2min，获得反应液Ⅰ。

[0075] (2)反转录反应见表2：

[0076] 表2反转录反应

[0077]试剂试剂用量
反应液Ⅰ 10μL
5×PrimeScript Buffer2 4μL
DEPC H2O 4μL
Prime Script RT Mnzyme MixⅠ 1μL
RT Priner Mix 1μL

[0078] 37℃反应15min，然后85℃反应5s。-20℃冰箱保存反应产物。

[0079] 7 CpSIZ1基因表达的实时荧光定量分析

[0080] (1)实时荧光定量PCR引物设计

[0081] 选取蜡梅Cp-Tublin基因和Cp-Actin基因作为双内参基因，运用Primer Premier5.0软件设计内参基因和目标基因扩增所需的特异引物，引物序列见表3。

[0082] 表3实时荧光定量PCR引物序列

[0083]

[0084]

[0085] (2)实时荧光定量PCR引物的特异性检测

[0086] 采用Eva Green染料法进行实时荧光定量PCR。根据SsoFastTM Supermix试剂盒(Bio-Rad)说明书配制反应体系，每个样本三次技术重复。反应体系见表4(表中名称均为试剂盒中名称)。

[0087] 表4反应体系

[0088]

[0089] 由于不同退火温度对扩增效率有影响，故需要对引物的退火温度进行优化。采用温度梯度扩增筛选最佳温度，反应条件为：98℃预变性30s；95℃变性5s，55～65℃退火/延伸5s(每个循环后采集荧光)，共40个循环；95℃变性10s，做65～95℃熔解曲线分析，温度以0.5℃每步上升，每个温度停留5s。最终根据熔解曲线的峰值特征对引物扩增的特异性进行分析，确定最佳反应体系。

[0090] (3)CpSIZ1基因表达的荧光定量分析

[0091] 以上述反转得到的cDNA为模板，按照配制反应体系，对CpSIZ1基因在蜡梅不同组织,不同胁迫下如高温、低温ABA以及PEG胁迫下的幼苗叶中的表达量进行实时荧光定量分析。试验所得的数据通过Bio-Rad ManagerTM Software(Version 1.1)软件进行分析，用2-△△CT法计算CpSIZ1基因在各反应中的相对表达量。

[0092] 结果显示，CpSIZ1基因在蜡梅的组织和器官中均有表达，表明CpSIZ1可能参与到蜡梅的生长发育调控(如图4A)。其中，CpSIZ1在蜡梅花中的表达比在蜡梅其他组织中的表达高，而且在蜡梅的初衰期(stage6)表达量达到最高。在蜡梅花朵开放中花器官的表达分析表明，CpSIZ1集中在蜡梅盛花期(stage4,stage5)的外瓣和中瓣中表达，而在衰老初期时，CpSIZ1在其外瓣和雄蕊中的表达显著上调(如图4B)。表明CpSIZ1有可能参与到蜡梅花朵的衰老调控。除了花中的高量表达，CpSIZ1基因在蜡梅的成熟叶中的表达量最高。蜡梅幼苗的胁迫处理表明，CpSIZ1在蜡梅幼苗低温(4℃)、脱落酸(ABA)和干旱(PEG)胁迫处理后表达量上调然后在下调，在高温处理(42℃)后表现出轻微的表达量下调，最后又恢复到初始的表达水平(如图5)。表明CpSIZ1可能响应蜡梅的低温(4℃)，脱落酸(ABA)和干旱(PEG)胁迫，而不响应其高温胁迫(42℃)。

[0093] 实施例4转CpSIZ1拟南芥功能分析

[0094] 1蜡梅CpSIZ1基因植物超表达载体的构建

[0095] 根据蜡梅基因CpSIZ1的最大ORF框序列以及结合植物表达载体pCAMBIA-2301G的多克隆位点的分析，设计一对特异的引物序列，并且在引物的上下游分别加上酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ以及它们相应的保护碱基。引物序列如下：

[0096] CpSIZ1-F(5'-3'):Cggatcc ATGGATTTGGCAGCTAGTTGCAAG(SEQ ID No.23)[0097] CpSIZ1-R(5'-3'):GCtctaga CTACTCAGAATCTGTATCTATTGAAAG(SEQ ID No.24)[0098] 以提取得到的CpSIZ1基因的质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系及条件如下：ddH2O 17.8μL，10×HiFi TaqPCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM)2.0μL，CpSIZ1-F(10μM)1μL，CpSIZ1-R(10μM)1μL，质粒DNA 1μL，HiFi TaqTM 0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。

[0099] 将PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目标片段，然后连接到pMD19-T克隆载体上，并转化到大肠杆菌中，涂布于氨苄抗性(Amp，50mg/mL)的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落送测。

[0100] 将测序正确的含目的基因的单菌落提取质粒，用BamHⅠ和XbaⅠ分别酶切带酶切位点的CpSIZ1基因质粒和pCAMBIA-2301G载体质粒，反应体系如下：10×Green Buffer 2μL，KpnI 0.5μL，Xba I 0.5μL，重组质粒10μL，ddH2O 7μL。37℃恒温箱酶切3～4h，80℃灭活5min。1％琼脂糖电泳后回收各自片段。将回收的CpSIZ1基因片段和pCAMBIA-2301G载体片段连接，连接体系同上。

[0101] 把连接产物转化到大肠杆菌中，并涂布在含100mg/L Kan的LB平板上于37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，阳性的菌液送测。将测序正确的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证，双酶切验证正确则表示CpSIZ1基因植物超表达载体构建成功。命名为pCAMBIA 2301G-CpSIZ1。以电转的方式将重组质粒转到农杆菌GV3101中。

[0102] 2蜡梅CpSIZ1转化拟南芥

[0103] (1)拟南芥的培养

[0104] 取适量野生型和siz1-2缺失突变体(SALK_065397)拟南芥种子于1.5mL离心管中，并向离心管中加入17％浓度的次氯酸钠(NaClO)消毒8～10min(期间充分振荡)，快速用枪头将上层的NaClO溶液洗掉，然后无菌水将种子冲洗5～6次，再用移液枪将拟南芥的种子播种在MS培养基上，4℃春化3d后将平板放在16h光照，8h黑暗，2000Lux照明条件，以及22℃、70％湿度的环境下培养，约10天左右将拟南芥移栽至培养基质中(蚯蚓土：蛭石：草炭＝1:
1:1)，注意在培养过程中可以减掉拟南芥最开始长出的顶生花序，以达到促进侧枝生长的目的。一般拟南芥在基质中生长到花葶长度约为5cm左右时即可进行侵染。

[0105] (2)花序侵染法转化拟南芥

[0106] 在YEB+Kan(50mg/L)+Gen(100mg/L)培养基平板上活化含有植物超表达载体质粒的农杆菌，28℃暗培养36～48h。挑取单菌落接种到650μL YEB(Kan：50mg/L，Gen：100mg/L)液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养36～48h。对培养的农杆菌菌液用特异引物进行PCR鉴定，确定正确后取500μL上述菌液接种于25mL无抗的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD600在1～1.2之间备用。吸取10mL上述菌液于无菌离心管，28℃，5000rpm离心15min，倒掉上清，收集沉淀，然后用现配侵染液(无菌水+5％蔗糖+0.5‰L-77)重悬，稀释至OD600约0.8。初次侵染要剪去拟南芥植株上面已开放的花朵，只留下刚刚露白的花蕾，此外可以在处理前一天浇水以保持基质的湿度，侵染前也需要用喷壶将纸箱四壁喷湿。将花葶头大约0.5cm长度放入到浸入侵染液中10秒左右，取出放入纸箱中，避光，于22℃培养20h后取出，然后转移到正常的生长环境中。侵染1周后根据拟南芥的生长情况看是否能够进行二次侵染以提高转化效率。

[0107] (3)转基因拟南芥的筛选和鉴定

[0108] 在转化1个月后，收取成熟的T0代种子，放在37℃恒温烘箱中约2周后，于4度冰箱存储，用于后续实验。将T0代转基因种子消毒后，播种于含25mg/L Kan的MS平板上，密封后于4℃冰箱放置3d，然后转移到正常培养环境，转基因拟南芥可以在含Kan的培养基上正常生长。得到若干不同株系，并对各株系的T1、T2代种子继续筛选，直至所有株系收获的种子播种后都为绿色抗性苗，一般T3代种子即为转基因纯合株系。

[0109] 利用CTAB法，提取转基因株系以及野生型株系的植株叶片DNA，用一对CpSIZ1基因的特异引物进行PCR鉴定，且重组质粒pCAMBIA1300-CpSIZ1作为阳性对照。结果显示，T3代转基因拟南芥的DNA和阳性对照质粒都能检测到大小一致的目的条带，而野生型拟南芥的DNA并没有被检测到，表明目的基因CpSIZ1已成功插入到拟南芥基因组中。

[0110] (4)转基因拟南芥的荧光定量PCR检测

[0111] 提取DNA检测为阳性的转基因拟南芥叶片的总RNA，将提取的RNA反转录获得cDNA第一链，用拟南芥的AtActin基因作为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测CpSIZ1基因在不同转基因株系种的表达量，每个转基因株系设置2个生物重复以及3个技术重复。引物序列见表5：

[0112] 表5引物序列

[0113]

[0114] 3转基因拟南芥功能分析

[0115] (1)表型观察

[0116] 对鉴定为阳性的T3代转基因拟南芥株系进行表达量分析(如图6B)，选取表达量较高的纯合的转基因过表达株系(OE)和互补株系(HB)各1个，并以野生型拟南芥(WT)和纯合突变体拟南芥(siz1-2)为对照，每个转基因株系和对照各选择10～15株，为表型观察记录植株。每天定时观察比较从苗期到抽葶结实期再到衰败时期的表型，并进行相关数据统计。

[0117] 结果表明：转基因拟南芥生长表型观察中我们发现，生长20天的拟南芥幼苗在表型上没有明显的差别(如图6A)。生长35天的拟南芥中，我们发现互补表达的拟南芥(HB)与siz1-2突变体出现明显不同的表型，叶片生长旺盛，不再有明显的卷曲，叶的长、宽远远大于siz1-2植株，并且呈现于野生型相似的表型(如图6A)。由此我们推测，互补表达拟南芥植株在很大程度上互补了突变体中SIZ1基因的表达，表现出与野生型相近的形态学特征。生长55天的过量表达植株OE和互补表达植株HB与野生型相比，有极显著的高度优势(如图6A)。此外，生长55d的拟南芥主茎直径之间有明显的差距，过表达植株OE与野生型植株WT直径有极显著地差异，其直径明显大于野生型植株直径，互补表达植株HB野生型植株直径相比也有显著性差异(如图6C,D)。综上所示，我们发现CpSIZ1在转基因拟南芥的生长上有显著的促进作用，由此推测，CpSIZ1可能也参与蜡梅生长发育方面的调控。

[0118] (2)开花表型观察

[0119] 选取表型观察的转基因过表达株系(OE)和互补株系(HB)各1个(同上)，并以野生型拟南芥(WT)和纯合突变体拟南芥(siz1-2)为对照，每个转基因株系和对照各选择约30株，为表型观察记录植株。观察抽葶和开花时的表型，并进行相关数据统计。

[0120] 结果表明，与野生型拟南芥WT相比，过表达拟南芥(OE)的开花时间明显要晚于野生型WT和互补表达拟南芥(HB)(如图7A)。抽葶时间统计发现，过表达株系在抽葶时间上与野生型WT植株之间达到了显著性水平的差异，而且互补表达拟南芥(HB)并没有出现早花现象，而是与野生型WT植株之间没有差异性(如图7B)。由此我们证明蜡梅CpSIZ1在转基因拟南芥植株中负调控其开花，因而CpSIZ1有可能参与蜡梅的开花调控。

[0121] (3)衰老表型观察

[0122] 选取表型观察的转基因过表达株系(OE)和互补株系(HB)各1个(同上)，并以野生型拟南芥(WT)和纯合突变体拟南芥(siz1-2)为对照，每个转基因株系和对照各选择约30株，为表型观察记录植株。观察植株衰老相关表型并进行叶绿素含量测定(如图8)。

[0123] 结果表明，生长45d大的拟南芥叶片已经开始出现衰老，但是野生型拟南芥(WT)，过表达拟南芥(OE)和互补表达拟南芥(HB)的叶片衰老情况没有明显的差异(如图8A)。生长65d大的拟南芥叶片衰老表型显著，甚至部分叶片已经死亡，但是此时野生型拟南芥(WT)，过表达拟南芥(OE)和互补表达拟南芥(HB)的叶片衰老表现出显著性的不同，转基因拟南芥OE和HB株系莲座叶几乎全部衰老，而野生型拟南芥WT还有约三分之一的叶片未完全衰老(如图8B)。我们统计了生长55d的拟南芥植株莲座叶叶绿素含量，发现过表达拟南芥(OE)和互补表达拟南芥(HB)的叶片中叶绿素含量与野生型拟南芥(WT)相比有所下降，并且分别呈现显著性和极显著性地差异(如图8C)。由此表明，转CpSIZ1基因的拟南芥植株会促进其莲座叶的衰老进程。由此推测，CpSIZ1可能也参与蜡梅生长衰老方面的调控。

[0124] (4)ABA处理实验

[0125] 选取经鉴定的三个转基因拟南芥互补株系(HB1，HB2，HB6)种子，并以野生型拟南芥(WT)和纯合突变体拟南芥(siz1-2)种子为对照，进行不同浓度的ABA处理实验：0,0.05,0.1和0.2μM。每种处理播种约30粒种子，做3～5个生物学重复，播种48h后统计不同浓度ABA处理的各种子的萌发率，播种5天后统计不同浓度ABA处理的植株双子叶变绿的比率。

[0126] 结果表明，三个HB株系，WT和siz1-2突变体拟南芥种子在MS培养基上的萌发率和子叶变绿率没有差异，然而在添加ABA的MS培养基上，它们的种子萌发率和子叶变绿率出现显著性差异，其中随着ABA浓度的增加，siz1-2突变体萌发率和子叶变绿率逐渐下降，但是HB植株的萌发率和子叶变绿率有所增加，甚至与野生型植株没有差异(如图9)。由此表明CpSIZ1基因能互补siz1-2突变体对ABA的敏感性，在功能上与AtSIZ1具有保守性。

[0127] (5)土壤低温处理实验

[0128] 选取经鉴定的三个转基因拟南芥互补株系(HB)，并以野生型拟南芥(WT)和纯合突变体拟南芥(siz1-2)为对照，每个转基因株系和对照各选择约20株，参照相关文献分别进行-4℃和-6℃的低温处理，处理时间为4h，培养室恢复生长1周后拍照，统计存活率。

[0129] 结果表明，转基因拟南芥互补株系HB的低温抗性与siz1-2突变体相比，显著提高，并表现出近乎与野生型拟南芥WT一致的低温抗性(如图10)。由此说明，蜡梅CpSIZ1基因能互补siz1-2突变体对低温的敏感性，并且参与到蜡梅的低温响应中去。

[0130] 上文已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，对本技术领域的技术人员，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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