AtGA2ox1基因在调节植物抗逆性中的应用及培育抗逆性植物的方法
阅读：413发布：2020-05-11
专利汇可以提供AtGA2ox1基因在调节植物抗逆性中的应用及培育抗逆性植物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种AtGA2ox1基因在调节 植物 抗逆性中的应用及培育抗逆性植物的方法，涉及植物 生物 工程 技术领域，本发明通过实验证明，拟南芥赤霉素2 氧 化酶 基因AtGA2ox1能够调节植物抗逆性。因此，应用AtGA2ox1基因、包括AtGA2ox1基因的重组载体、包括AtGA2ox1基因的表达盒、包括AtGA2ox1基因的细胞或包括AtGA2ox1基因的重组菌中任意一种物质，能够有效调整植物的抗逆性，提高植物自身的抗逆境胁迫能 力 。本发明提供的培育抗逆性植物的方法，操作简单，成功率高，为今后的植物的育种，特别是提高植物的抗逆能力提供一种新的方法与思路。，下面是AtGA2ox1基因在调节植物抗逆性中的应用及培育抗逆性植物的方法专利的具体信息内容。
1.如下(a)-(e)中任意一种物质在调节植物抗逆性中的应用：
(a)拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1；
(b)包括所述AtGA2ox1基因的重组载体；
(c)包括所述AtGA2ox1基因的表达盒；
(d)包括所述AtGA2ox1基因的细胞；
(e)包括所述AtGA2ox1基因的重组菌；
其中，所述抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性，所述植物为玉米。
2.一种培育抗逆性植物的方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求1中所述的AtGA2ox1基因克隆进表达载体中，采用农杆菌介导法，侵染植物幼胚，得到所述抗逆性植物；
其中，所述抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性，所述植物为玉米。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达载体为单子叶植物表达载体，所述单子叶植物表达载体为pCAM-UGN。
AtGA2ox1基因在调节植物抗逆性中的应用及培育抗逆性植物
的方法
技术领域
背景技术
[0002] 玉米是全世界重要的粮食经济作物，其生长往往受到外界环境所干扰，干旱是目前影响玉米生长的主要因素之一。据估计，每年因干旱而造成玉米减产15％-20％，并且这一趋势随着干旱气候越来越频繁和严重而增加。因此，如何提高玉米的抗旱性成为人们关注的焦点。
[0003] 赤霉素，是广泛存在的一类植物激素。其代谢模式和作用机理已经研究的比较透彻了，在模式植物拟南芥中与此相关的大多数基因已被克隆出来。而近期研究发现，植物在响应干旱等非生物胁迫时，体内的赤霉素代谢途径通常会发生改变，并且相关研究表明赤霉素在逆境胁迫下发挥了重要作用。
[0004] 有报道显示，拟南芥赤霉素缺陷型突变体材料ga1-3在高盐胁迫下表现出更高的成活率(92.7％)，而野生材料仅有52.7％的成活率。拟南芥4重 DELLA蛋白突变体，赤霉素不敏感材料，其缺少编码DELLA蛋白的GAI， RGA，RGL1和RGL2基因组，这导致其与野生型材料对比，GA1和GA4 分别减少了23％和56％，但同时获得了耐盐胁迫的能力。多效唑 (Paclobutrazol)作为一种赤霉素抑制剂，可以提高植物的抗逆境胁迫能力。上述结论证明，可以通过减少生物活性赤霉素的水平来，以使植株提高耐盐能力。此外，也有相关报道证明，可以通过提高赤霉素2-氧化酶(GA2ox) 基因的表达水平来降低内源赤霉素含量，提高植物体内一些活性氧解毒酶的相关基因的表达，以使植物细胞延缓死亡，进而提高植物的抗逆境胁迫。与之相反的是，通过外施赤霉素，会使植物对逆境胁迫更加的敏感。对拟南芥ga1-3突变体材料喷施外源赤霉素发现，其在盐胁迫下的成活率降低到 54.5％。
[0005] 在高等植物体内赤霉素的代谢过程中，GA2ox基因家族是在赤霉素代谢途径中发挥关键作用，将有生物活性的赤霉素代谢成无生物活性的赤霉素。过表达GA2ox基因可以有效的降低内源赤霉素含量，并且GA2ox在响应植物逆境胁迫的过程中也发挥了重要的作用。相关研究报道，通过将 OsGA2ox5基因在拟南芥和水稻中过表达，发现转基因植物表现出对高盐胁迫的耐受性。
[0006] 因此，如何利用GA2ox基因提高玉米抗逆性，尤其是抗旱性已经日益成为研究的热点。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0008] 本发明的第一个目的在于提供拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1、包括AtGA2ox1基因的重组载体、包括AtGA2ox1基因的表达盒、包括 AtGA2ox1基因的细胞或包括AtGA2ox1基因的重组菌中任意一种物质在调节植物抗逆性中的应用，本发明的第二个目的在于提供一种培育抗逆性植物的方法，以缓解现有技术中存在的利用AtGA2ox1基因提高植物抗逆性的相关研究不足的技术问题。
[0009] 本发明提供了如下(a)-(e)中任意一种物质在调节植物抗逆性中的应用：
[0010] (a)拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1；
[0011] (b)包括所述AtGA2ox1基因的重组载体；
[0012] (c)包括所述AtGA2ox1基因的表达盒；
[0013] (d)包括所述AtGA2ox1基因的细胞；
[0014] (e)包括所述AtGA2ox1基因的重组菌。
[0015] 进一步地，所述植物为玉米。
[0016] 进一步地，所述抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性。
[0017] 进一步地，所述调节植物抗逆性为通过如下(A)-(C)中一种或更多种方法：
[0018] (A)降低植物中赤霉素含量；
[0019] (B)激活植物体内的抗氧化系统；
[0020] (C)提高维持细胞渗透压的化合物的积累。
[0021] 进一步地，所述激活植物体内的抗氧化系统的方法为提高植物中抗氧化酶的活性，所述抗氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶中的一种或更多种。
[0022] 进一步地，所述维持细胞渗透压的化合物为脯氨酸或可溶性糖中的一种或两种。
[0023] 另外，本发明还提供了一种培育抗逆性植物的方法，所述方法包括：
[0024] 将上述的AtGA2ox1基因克隆进表达载体中，采用农杆菌介导法，侵染植物幼胚，得到所述抗逆性植物。
[0025] 进一步地，所述表达载体为单子叶植物表达载体，所述单子叶植物表达载体为pCAM-UGN。
[0026] 进一步地，所述植物为玉米。
[0027] 进一步地，所述抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性。
[0028] 实验证明，拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1能够调节植物抗逆性。因此，应用AtGA2ox1基因、包括AtGA2ox1基因的重组载体、包括AtGA2ox1 基因的表达盒、包括AtGA2ox1基因的细胞或包括AtGA2ox1基因的重组菌中任意一种物质，能够有效调整植物的抗逆性，提高植物自身的抗逆境胁迫能力。本发明提供的培育抗逆性植物的方法，操作简单，成功率高，为今后的植物的育种，特别是提高植物的抗逆能力提供一种新的方法与思路。附图说明
[0029] 图1为本发明实施例1提供的pCAM-UGN-GA2ox植物表达载体 T-DNA区载体图谱；
[0030] 图2A为本发明实施例2提供的过表达AtGA2ox1基因玉米PCR检测结果图；
[0031] 图2B为本发明实施例2提供的过表达AtGA2ox1基因玉米RT-PCR检测结果图；
[0032] 图3A为本发明实施例4提供的转基因植株和非转基因植株中脯氨酸含量的结果图；
[0033] 图3B为本发明实施例4提供的转基因植株和非转基因植株中可溶性糖含量的结果图；
[0034] 图3C为本发明实施例4提供的转基因植株和非转基因植株中丙二醛含量的结果图；
[0035] 图4A为本发明实施例5提供的转基因植株和非转基因植株中SOD酶活性的结果图；
[0036] 图4B为本发明实施例5提供的转基因植株和非转基因植株中CAT酶活性的结果图；
[0037] 图4C为本发明实施例5提供的转基因植株和非转基因植株中POD酶活性的结果图；
[0038] 图5A为本发明实施例7提供的与氧化应激反应相关基因 (Zm00001d002704)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0039] 图5B为本发明实施例7提供的与过氧化物酶体相关基因 (Zm00001d003744)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0040] 图5C为本发明实施例7提供的与过氧化氢分解代谢过程相关基因 (Zm00001d014848)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0041] 图5D为本发明实施例7提供的与蛋白质导入过氧化物酶体基质相关基因(Zm00001d016170)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0042] 图5E为本发明实施例7提供的与过氧化氢反应相关基因 (Zm00001d037232)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0043] 图5F为本发明实施例7提供的与过氧化物酶活性相关基因 (Zm00001d042022)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0044] 图5G为本发明实施例7提供的与过氧化物酶体相关基因 (Zm00001d048890)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0045] 图5H为本发明实施例7提供的与过氧化氢反应相关基因 (Zm00001d051001)在转基因植物和非转基因植物中的表达水平的结果图；
[0046] 图6为本发明实施例8提供的实际生产中转基因植物和非转基因植物的产量结果图。
具体实施方式
[0047] 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0048] 本发明提供了如下(a)-(e)中任意一种物质在调节植物抗逆性中的应用：
[0049] (a)拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1；
[0050] (b)包括AtGA2ox1基因的重组载体；
[0051] (c)包括AtGA2ox1基因的表达盒；
[0052] (d)包括AtGA2ox1基因的细胞；
[0053] (e)包括AtGA2ox1基因的重组菌。
[0054] 在植物体内，通过导入包括AtGA2ox1基因的重组载体、包括AtGA2ox1 基因的表达盒、包括AtGA2ox1基因的细胞或者包括AtGA2ox1基因的重组菌中的一种，使植物体内过表达AtGA2ox1基因，从而达到提高植物抗逆性的目的。
[0055] 在本发明中，植物为玉米；抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性。
[0056] 其中，抗逆性可以为耐旱性或者耐低氮性，或者兼具耐旱性和耐低氮性。能够保证植物在干旱条件下和/或低氮条件下的成活率，甚至达到增产的目的。
[0057] 在本发明中，调节植物抗逆性为通过如下(A)-(C)中一种或更多种方法：
[0058] (A)降低植物中赤霉素含量；
[0059] (B)激活植物体内的抗氧化系统；
[0060] (C)提高维持细胞渗透压的化合物的积累。
[0061] 在本发明中，激活植物体内的抗氧化系统的方法为提高植物中抗氧化酶的活性。其中，抗氧化酶为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶中的一种或更多种。
[0062] 通过激活植物体内的抗氧化系统来对抗自由氧基团，提高了自由氧解毒酶的活性并降低自由氧的含量，进而提高植物的抗逆境胁迫能力。同时，抗氧化系统的激活也使得植物体内的丙二醛(MDA)含量降低。丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度， MDA的积累也会对膜和细胞造成一定的伤害。因此，降低MDA在植物体内的含量，也能够提高植物的抗逆境胁迫能力。
[0063] 在本发明中，维持细胞渗透压的化合物为脯氨酸或可溶性糖中的一种或两种。
[0064] 脯氨酸和可溶性糖作为重要的渗透调节物质，在维持细胞的渗透势，保护细胞和维持渗透平衡中发挥了重要的作用，因此脯氨酸和可溶性糖含量也能间接的反应出植物对抗逆境胁迫的能力，提高脯氨酸和/或可溶性糖的含量，也能够提高植物的抗逆境胁迫能力。
[0065] 另外，本发明还提供了一种培育抗逆性植物的方法，包括：
[0066] 将上述的AtGA2ox1基因克隆进表达载体中，采用农杆菌介导法，侵染植物幼胚，得到所述抗逆性植物。
[0067] 在本发明中，表达载体为单子叶植物表达载体，单子叶植物表达载体为pCAM-UGN。
[0068] 在本发明中，植物为玉米，抗逆性为耐旱性和/或耐低氮性。
[0069] 本发明的发明人通过实验证明，拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1 能够调节植物抗逆性。应用AtGA2ox1基因、包括AtGA2ox1基因的重组载体、包括AtGA2ox1基因的表达盒、包括AtGA2ox1基因的细胞或包括 AtGA2ox1基因的重组菌中任意一种物质，能够有效调整植物的抗逆性，提高植物自身的抗逆境胁迫能力。本发明提供的培育抗逆性植物的方法，操作简单，成功率高，为今后的植物的育种，特别是提高植物的抗逆能力提供一种新的方法与思路。
[0070] 为了有助于更好的理解本发明，现通过具体的实施例详细介绍如下。
[0071] 实施例1植物表达载体构建及玉米的遗传转化
[0072] 克隆AtGA2ox1基因(GENE BANK登陆号：AT1g78440)全长cDNA，将其连入进单子叶植物表达载体pCAM-UGN中，得到含有AtGA2ox1基因的表达载体，并命名为pCAM-UGN-GA2ox，如图1所示。采用农杆菌介导法，侵染HiII玉米幼胚，获得到转基因玉米植株。
[0073] 实施例2转基因植株的鉴定和外源基因的表达分析
[0074] 转基因植株的鉴定：
[0075] 采用CTAB法提取转基因植物叶片总DNA。根据AtGA2ox1基因序列设计PCR扩增引物，如下表所示：
[0076] 名称 编号 引物序列(5’-3’)AtGA2ox-445F SEQ ID NO.1 GGTTCGGGTCCACTATTT
AtGA2ox-445R SEQ ID NO.2 CTATGCCTCACGCTCTTG
AtGA2ox-445R SEQ ID NO.2 CTATGCCTCACGCTCTTG
[0077] PCR反应体系为：
[0078]试剂 体积(μL)
Taq Buffer(10×) 2.0
dNTP(2.5mM) 2.0
AtGA2ox-445F(10μM) 1.5
AtGA2ox-445R(10μM) 1.5
Taq DNA polymerase 0.2
ddH2O to 20.0
Taq Buffer(10×) 2.0
dNTP(2.5mM) 2.0
AtGA2ox-445F(10μM) 1.5
AtGA2ox-445R(10μM) 1.5
Taq DNA polymerase 0.2
ddH2O to 20.0
[0079] PCR反应条件为：
[0080]
[0081] 扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察PCR 电泳结果。
[0082] 外源基因的表达分析：
[0083] 提取玉米叶片总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，分别用玉米内参引物和上述AtGA2ox1引物进行PCR扩增，PCR反应条件同上述转基因植株检测方法。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图 2A和图2B所示，其中，M为2000marker；1为空白对照(水)；2为 pCAM-UGN-GA2ox质粒；3-5为过表达AtGA2ox1基因玉米；6为非转基因玉米对照。通过PCR和RT-PCR的检测结果表明，AtGA2ox1基因已经可以在转基因玉米中正常表达。
[0084] 玉米内参引物如下表所示：
[0085]名称 编号 引物序列(5’-3’)
ZmGAPDH-304F SEQ ID NO.3 AACTTCCTGCGGTGCTG
ZmGAPDH-304R SEQ ID NO.4 CCGCCTGGATGTGCTT
ZmGAPDH-304F SEQ ID NO.3 AACTTCCTGCGGTGCTG
ZmGAPDH-304R SEQ ID NO.4 CCGCCTGGATGTGCTT
[0086] 实施例3玉米植株干旱胁迫的表型分析
[0087] 选取生长于温室，温度为27℃±2℃，盆栽(10×10cm)，草炭土：蛭石(5:1，v/v)，自然光照条件下生长21天的玉米植株(每个基因型各10株)，进行干旱胁迫处理，停止浇水9天。取干旱胁迫后第9天的玉米叶片，液氮冷冻后存放于-80℃冰箱，用于后续相关生理指标的测定。每个独立实验材料所用基质和水分的量保持一致。
[0088] 本实施例要进一步评估过表达AtGA2ox1基因是否可以提高玉米植株的抗干旱胁迫能力提供，随机选取3个独立的转基因玉米line(1#，2#，4#) 进行相关的实验分析。选取21天苗期的玉米植株，停止浇水，进行干旱胁迫，共胁迫9天。从玉米植株实际生长结果中可以看出，干旱胁迫后，非转基因植株对比转基因植株，表现出明显的萎蔫，生长受到抑制等缺水表型。
[0089] 实施例4生理指标测定
[0090] 脯氨酸含量的测定：
[0091] 脯氨酸含量的分析参照茚三酮比色法。取不同处理的植物叶片各0.5g，剪碎后置于大试管中，加入5mL 3％磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10 min。取出试管后冷却至室温，吸取上清液2mL，加2mL冰醋酸和3mL 2.5％酸性茚三酮显色液，于沸水浴中加热40min，然后从标准曲线中查出样品中脯氨酸的浓度，按照下式计算脯氨酸含量：脯氨酸[μg·g-1(鲜重或干重)]＝[(C·V0/V)/W]·N，其中C为样品中脯氨酸含量；V0为样品提取液总体积；V为测定时所吸取的体积；W为样品重；N为稀释倍数。
[0092] 可溶性糖含量的测定：
[0093] 蒽酮比色法测量可溶性糖含量，具体方法为：称取0.1～0.2g样本，加入1mL蒸馏水研磨成匀浆，倒入有盖离心管中，95℃水浴10min(盖紧，以防止水分散失)，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液于10mL 试管中，用蒸馏水定容至10mL，摇匀备用。吸取样品提取液0.5mL于20 mL刻度试管中，加蒸馏水1.5mL。按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在620nm波长下测其吸光度。
[0094] 标准条件下测定的回归方程为：y＝4.275x-0.07；其中，x为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值。
[0095] 按样本鲜重计算：可溶性糖(mg/g鲜重)＝[(ΔA+0.07)/4.275×V1]/ (W×V1/V2)＝2.34×(ΔA+0.07)/W；其中，V1：加入样本体积，mL；V2：加入提取液体积，mL；W：样本鲜重，g。
[0096] 植物受到干旱等胁迫后，会在体内合成脯氨酸及可溶性糖，以维持自身细胞的渗透式，达到保护细胞和维持渗透平衡的目的，因此脯氨酸和可溶性糖含量也间接的反应出植物对抗干旱胁迫的能力。本实施例测量了实施例3提供的干旱胁迫后第9天的转基因植株和非转基因植株的脯氨酸和可溶性糖含量。结果如图3A和3B所示(#为转基因植物，WT为野生型植物，单因素方差分析，P＜0.05*，P＜0.01**)，从结果图中可以发现，转基因植株的脯氨酸含量和可溶性糖含量比非转基因植株高，这一结果也说明，转基因植株积累脯氨酸及可溶性糖这类渗透调节物质的能力要高于非转基因植株。
[0097] 丙二醛含量的测定：
[0098] 丙二醛含量的分析方法为：取不同处理的植物叶片各0.2g，剪碎后放入研钵中，加入2mL 10％TCA和少量石英砂，研磨成匀浆，再加8mL TCA 进一步研磨，将匀浆转移到离心管中，4000rpm离心10min，上清液即为提取液。吸取上清液2mL，加入2mL 0.6％TBA溶液，混匀后在沸水浴上煮沸15min，冷却后再离心1次。取上清液，分别测定波长450nm、532nm 和600nm下的吸光度值。按照C＝6.45(D532-D600)-0.56D450求得提取液中 MDA的浓度，并根据植物组织的鲜重计算样品中MDA的含量，MDA(μmol ·g-1)＝MDA浓度(μmol·L-1)×提取液体积(L)/植物组织鲜重(g)。
[0099] 植物组织在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA 从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。本实施例测量了干旱胁迫后第9天的转基因植株和非转基因植株的MDA含量，如图3C所示(#为转基因植物， WT为野生型植物，单因素方差分析，P＜0.05*，P＜0.01**)，其中转基因植株的MDA含量比非转基因植株低，这一结果也说明，在干旱胁迫下转基因植株比非转基因植株更耐受。
[0100] 实施例5SOD、CAT、POD酶活的测定
[0101] SOD活性的测定方法为：将50mM磷酸钠缓冲液(pH为7.8)，100μM EDTA，20μL/mL的酶提取物和10mM的邻苯三酚酶混合为混合物。酶活性[U(mg蛋白)-1]是由420nm的分光光度计在60s的时间间隔下对反应混合物进行监测而确定的。
[0102] CAT活性测定通过Beers&Sizer法，测量H2O2消失的初始速率。将 0.05mM的磷酸钠缓冲液(pH为7)，20μL/mL的酶提取物和1mM过氧化氢混合为混合物。H2O2的减少伴随着测量A240的减少，酶活性[U(mg 蛋白)-1]是利用摩尔吸收系数计算，40mM-1cm-1H2O2。
[0103] POD测定活性的方法为：将50mM磷酸盐缓冲液(pH为7)，28μL 愈创木酚、100μL酶提取物和19μL H2O2混合为3.9mL的反应混合物。在 420nm处，30s的时间间隔内对吸光度进行至少2min的监测；0.01的吸光度变化表示POD活性的一个单位
[0104] 由于转基因植株相比非转基因植株在干旱胁迫下丙二醛的含量更少，因此有可能转基因植株受到的氧化损伤也更少，为此，本实施例测量了能清除自由氧的抗氧化还原酶的相关活性，主要包括SOD、CAT、POD。从图4A、4B和4C中可以发现(#为转基因植物，WT为野生型植物，单因素方差分析，P＜0.05*，P＜0.01**)，在干旱胁迫下转基因植株的SOD活性、 CAT活性以及POD活性均比对照组要高。这些结果表明，在干旱胁迫下，过表达AtGA2ox1基因提高了转基因玉米植株抗氧化酶的活性，从而降低了自由氧在植物体内的积累，减少氧化反应对细胞膜的损伤。
[0105] 实施例6
[0106] 制备数字表达文库和测序：
[0107] 为了分析过表达AtGA2ox1基因对玉米植株转录水平的影响，本实施例选取转基因玉米1#line及其相同世代分离出的阴性植株进行表达模式分析。转基因植物及阴性植株在室内生长5周后，分别从10株植物中采集叶片，液氮冷冻后存放于-80℃冰箱。测序库使用nebnext ultratm RNA文库，试剂盒为Illumina公司生产，mRNA使用Poly-T寡附磁珠纯化，破碎是利用离子高温NEBnext第一链合成反应缓冲液(5×)。利用随机引物和 M-MuLV逆转录合成cDNA第一链(RNase H)，随后使用DNA聚合酶I 和RNase H进行第二链cDNA合成。DNA片段的3’末端腺苷酸化后，用发夹环结构的NEBNext Adaptor结扎准备杂交。为了选择优先200-250bp 的cDNA片段，文库通过AMPure XP系统纯化。然后选择3μL酶，在37℃温度下连接接头基因片段15min，然后在进行PCR前于95℃预热5min，然后应用高保真DNA聚合酶进行PCR，引物为通用PCR引物和指数(x) 引物。最后进行PCR产物纯化(AMPure XP系统)和文库质量评估(Agilent Bioanalyzer 2100系统)。索引的编码样本的聚类是利用TruSeq PE集群套件V4CBOT HS CBOT簇生成系统完成。集群形成、文库进行测序是利用 Illumina HiSeq
2500平台，同时配对末端读取生成。
2500平台，同时配对末端读取生成。
[0108] 分析数字基因表达(DGE)标签和差异表达基因的鉴定：
[0109] 从数据集中删除了接头序列和低质量序列。原始序列经过数据处理后转化为clean reads，然后将这些clean reads被映射到参考基因组序列。根据参考基因组进一步分析和注释只有完全匹配或有一个错配的reads。Tophat2 工具软件用于比对参考基因组，基因功能注释的基础为以下数据库：Nt (NCBI non-redundant nucleotide sequences)；Pfam(Protein family)；KOG/COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins)；
Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)；KO(KEGG Ortholog database)；GO (Gene Ontology)。在基因表达差异分析之前，对每个序列库，通过一个缩放归一化因子读取计数调整程序包，两样本差异表达分析采用DEGseq进行。 Q值＜0.005并且log2≥1设为显著差异表达的阈值。
Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)；KO(KEGG Ortholog database)；GO (Gene Ontology)。在基因表达差异分析之前，对每个序列库，通过一个缩放归一化因子读取计数调整程序包，两样本差异表达分析采用DEGseq进行。 Q值＜0.005并且log2≥1设为显著差异表达的阈值。
[0110] GO改进和KEGG通路分析
[0111] GO的富集差异表达基因分析(DEGS)采用Wallenius非中心超几何分布的GOseq R实现，其中，GOseq R可调整程度的基因长度偏差。
[0112] KEGG是从分子水平的信息理解高级功能和生物系统的公用数据库资源，如细胞、有机体和生态系统，尤其是大规模的分子数据集的基因组测序和高通量实验技术产生。本实施例使用KOBAS软件测试在KEGG通路富集差异表达基因的统计。
[0113] 转录组测序发现有3088个基因的表达发生改变，其中1959个基因上调，1129个基因下调。进一步利用GO富集分析发现，与响应热胁迫，干旱胁迫，过氧化氢等16个相关通路被富集(表1)。KEGG富集结果显示，参与氨基酸的生物合成，蔗糖和淀粉的代谢，脯氨酸代谢，甘油脂类以及过氧化物酶代谢等通路被富集(表2)。结合以上数据，我们认为这些与干旱胁迫相关通路表达模式的改变，是提高过表达AtGA2ox1基因玉米植株抗干旱胁迫的能力的原因。
[0114] 表1差异表达基因部分GO富集结果文件(生物学过程)
[0115]GO.ID 功能描述 基因数目 差异表达基因数目
GO:0009408 热反应 329 99
GO:0010286 热适应 35 18
GO:0042542 过氧化氢反应 237 52
GO:0009269 干旱反应 36 7
GO:0009737 脱落酸反应 585 81
GO:0080135 细胞应激反应 123 23
GO:0034605 细胞对热的反应 13 2
GO:0009636 对有毒物质的反应 30 4
GO:0009415 对水的反应 370 54
GO:0071462 细胞对水刺激的反应 41 5
GO:0042631 细胞对缺水的反应 41 5
GO:0006979 氧化应激反应 660 91
GO:0080134 应激反应的调节 237 34
GO:0000302 活性氧反应 344 65
GO:0009414 缺水反应 352 51
GO:0031347 防卫反应的调节 121 31
GO:0009408 热反应 329 99
GO:0010286 热适应 35 18
GO:0042542 过氧化氢反应 237 52
GO:0009269 干旱反应 36 7
GO:0009737 脱落酸反应 585 81
GO:0080135 细胞应激反应 123 23
GO:0034605 细胞对热的反应 13 2
GO:0009636 对有毒物质的反应 30 4
GO:0009415 对水的反应 370 54
GO:0071462 细胞对水刺激的反应 41 5
GO:0042631 细胞对缺水的反应 41 5
GO:0006979 氧化应激反应 660 91
GO:0080134 应激反应的调节 237 34
GO:0000302 活性氧反应 344 65
GO:0009414 缺水反应 352 51
GO:0031347 防卫反应的调节 121 31
[0116] 表2差异表达基因部分KEGG富集结果文件
[0117]
[0118] 实施例7实时荧光定量分析
[0119] 利用RNA提取试剂盒从100mg的速冻粉叶提取总RNA，使用 第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。实时定量表达本实施例使用SYBR Green supermix ROX和选定的基因特异性引物，在ABI7900HT 系统进行检测。每组实验三个重复。
[0120] 为了验证上述转录组的数据的准确性，我们选取了上述与干旱胁迫相关通路中的8个基因做了qRT-PCR的验证(选取基因见表3)。qRT-PCR 的结果显示，与响应氧化应激，过氧化氢代谢，过氧化氢酶的激活等相关基因的表达水平在转基因玉米中提高了，结果见图
5A、5B、5C、5D、5E、 5F、5G和5H(CI为转基因植物，T1为非转基因植物，单因素方差分析， P＜
0.05*，P＜0.01**)。这一结果与生理生化结果相一致。进一步说明过表达AtGA2oX1基因是通过激活玉米体内的抗氧化系统来提高玉米植株抗干旱胁迫能力的。
5A、5B、5C、5D、5E、 5F、5G和5H(CI为转基因植物，T1为非转基因植物，单因素方差分析， P＜
0.05*，P＜0.01**)。这一结果与生理生化结果相一致。进一步说明过表达AtGA2oX1基因是通过激活玉米体内的抗氧化系统来提高玉米植株抗干旱胁迫能力的。
[0121] 表3差异表达基因及注释
[0122]
[0123]
[0124] 实施例8实际生产
[0125] 本实施例将实施例3提供的随机选取的3个独立转基因玉米line(1#， 2#，4#)，于2016年5月在中国吉林省公主岭市连续5年不施氮肥的低氮肥试验地上投入实际生产，每个小区按照3m行长，每行12株的种植比例，各种植BC1F1世代材料24行。待玉米长到6叶1芯时，采取在第6片展开叶叶尖涂抹除草剂的方式区分转基因植株和非转基因植株。在玉米成熟后采取随机取样法，取样数n＝72，进行产量统计(t-test，*代表0.05水平下显著，**代表
0.01水平下显著)。结果见表4(+为转基因植物，-为非转基因植物)和图6，从图表中可以发现，在低氮肥条件下，或者在不进行人工施肥的条件下，转基因玉米的产量比对照组增产
12.23％-13.94％。因此说明，AtGA2oX1基因具有提高植物耐低氮的能力，或者说在低氮肥条件下显著增产。
0.01水平下显著)。结果见表4(+为转基因植物，-为非转基因植物)和图6，从图表中可以发现，在低氮肥条件下，或者在不进行人工施肥的条件下，转基因玉米的产量比对照组增产
12.23％-13.94％。因此说明，AtGA2oX1基因具有提高植物耐低氮的能力，或者说在低氮肥条件下显著增产。
[0126] 表4
[0127] 转化事件 亩产(kg)1#+ 811.08±5.103**
1#- 711.81±4.277
2#+ 555.93±5.791**
2#- 495.34±5.504
4#+ 611.62±8.04*
4#- 539.64±15.189
1#- 711.81±4.277
2#+ 555.93±5.791**
2#- 495.34±5.504
4#+ 611.62±8.04*
4#- 539.64±15.189
[0128] 注：*代表P值小于0.05，**代表P值小于0.01
[0129] 从上述实验结果可以看出，拟南芥赤霉素2氧化酶基因AtGA2ox1能够调节植物抗逆性。因此，通过过表达AtGA2ox1基因，能够有效调整植物的抗逆性，提高植物自身的抗逆境胁迫能力。另外，本发明提供的培育抗逆性植物的方法，操作简单，成功率高，为今后的植物的育种，特别是提高植物的抗逆能力提供一种新的方法与思路。
[0130] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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