一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因及其应用
阅读：911发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，具体是一种大豆 植物 富含甘 氨 酸蛋白基因及其应用，所述大豆植物富含甘氨酸蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明为进一步了解GRP基因参与干旱等逆境反应的分子机制奠定了 基础 ，转GRP过表达载体植株与CK相比具有更强的抗旱能 力 ，且在地上鲜重与地上干重的显著性更明显，通过株高、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重这5项指标的变化，可见，大豆的抗旱能力得到明显提高。，下面是一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因及其应用专利的具体信息内容。
1.一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，所述大豆植物富含甘氨酸蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，在转基因植株的后代检测中所用到的引物为抗除草剂(bar)、35s启动子、noss终止子、目的基因(GRP)。
3.根据权利要求2所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，所述抗除草剂(bar)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，所述35s启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求2所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，所述noss终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求2所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，其特征在于，所述目的基因(GRP)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
7.一种根据权利要求1所述的大豆植物富含甘氨酸蛋白基因在提高大豆抗旱能力中的应用。
一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 大豆是我国非常重要的粮食作物和油料作物，种植面积仅次于水稻、玉米和小麦,居第四位。
[0003] 植物富含甘氨酸蛋白(GRP)是一类在组成结构上由甘氨酸高度重复序列组成的蛋白质。1986年研究至今，从玉米、水稻、拟南芥、烟草等不同植物中分离和鉴定出150多种植物富含甘氨酸蛋白，1986年，Codit与Meagher从矮牵牛中分离出基因PtGRP.1。1987年Reddy和Poovaiah从草莓中提取出GRP。研究发现几乎所有生物中都包含该基因蛋白，植物富含甘氨酸蛋白基因GRP的表达具有严格的发育调控特性，并且受各种环境因素的诱导表达量产生不同变化。大豆中的植物富含甘氨酸蛋白基因GRP蛋白定位于所有木质化细胞如韧皮部纤维，初生木质部和次生木质部细胞壁。已有研究表明，干旱、冷害、机械损伤和脱落酸(ABA)等因素可能会诱导GRPs基因表达水平提高。
[0004] 因此，利用分子生物学方法研究大豆植物富含甘氨酸蛋白(GRP)基因，在大豆中克隆出GRP基因，并建立植物表达载体，继续研究在干旱逆境胁迫条件下不同组织中表达量的变化有着重要的意义。
[0005] 大豆耐高温、抗旱能力较弱，在生育期遭遇干旱、高温、盐碱等非生物逆境胁迫是造成大豆减产的重要影响因素。干旱是造成大豆产量降低的最主要环境因素之一，在一般年份能造成10％-15％的产量损失，严重年份能达到30％-50％。因此，提高大豆品种的抗旱能力，培育抗旱性强的高产大豆新品种十分重要。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因，所述大豆植物富含甘氨酸蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 作为本发明进一步的方案：在转基因植株的后代检测中所用到的引物为抗除草剂(bar)、35s启动子、noss终止子、目的基因(GRP)。
[0010] 作为本发明进一步的方案：所述抗除草剂(bar)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0011] 作为本发明进一步的方案：所述35s启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0012] 作为本发明进一步的方案：所述noss终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
[0013] 作为本发明进一步的方案：所述目的基因(GRP)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
[0014] 一种大豆植物富含甘氨酸蛋白基因在提高大豆抗旱能力中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明为进一步了解GRP基因参与干旱等逆境反应的分子机制奠定了基础，转GRP过表达载体植株与CK相比具有更强的抗旱能力，且在地上鲜重与地上干重的显著性更明显，通过株高、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重这5项指标的变化，可见，大豆的抗旱能力得到明显提高。附图说明
[0016] 图1为GRP基因系统进化树；
[0017] 图2为GRP基因蛋白的疏水性检测结果图；
[0018] 图3为GRP基因蛋白的跨膜区分析结果图；
[0019] 图4为植物过表达载体pCAMBIA-3301-GRP-over expression结构图；
[0020] 图5为植物干扰表达载体pCAMBIA-3301-GRP-RNAi结构图；
[0022] 图7为重组质粒验证图(A:pCAMBIA-3301-35s-GRP-nos；B:pcr产物)；
[0023] 图8为重组质粒PCR产物验证图(A:1-2：pCAMBIA3301-GRP-RNAi酶切产物；B:1,4,7水；2-3正义片段；5-6反义片段；8-9内含子)；
[0024] 图9为转GRP过表达载体基因的PCR检测图(A:35s启动子；B:终止子Nos；C:筛选标记bar)；
[0025] 图10为转GRP干扰表达载体基因的PCR检测图(A:35s启动子；B:终止子Nos；C:筛选标记bar)；
[0026] 图11为转GRP过表达载体基因植株的Southern blot检测图；
[0027] 图12为转GRP干扰表达载体基因植株的Southern blot检测图；
[0028] 图13为转GRP过表达载体基因的qRT-PCR鉴定图；
[0029] 图14为转GRP干扰表达载体基因的qRT-PCR鉴定图。
具体实施方式
[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031] 实施例1
[0032] 1.生物信息学分析
[0033] 1.1植物富含甘氨酸蛋白基因的进化树的构建：在NCBI网与phytozome12通过blast进行序列同源性的查阅，选择大豆中含有GRP基因和拟南芥、玉米、烟草等含有GRP基因的同源序列下载，运用MEGA7.0软件构建系统发育进化树，如图1所示。分析得知，克隆的GRP基因与拟南芥亲缘关系较近，与其他亲缘关系较远。
[0034] 1.2 GRP基因蛋白的理化性质预测及分析
[0035] 运用ExPASy服务器上的ProtParam工具对GRP基因进行基本的蛋白质理化性质分析。结果显示：GRP基因的分子式为C933H1530N254O416S10，相对分子质量为23282.46，总原子数目为3143，理论等电点(theoretical pI)为9.06，氨基酸数目为236，其中4个带正电荷氨基酸(Arg+Lys)，1个带负电荷氨基酸(Asp+Glu)，不稳定系数为63.85，是不稳定蛋白。半衰期为30h。从氨基酸的组成分析表明：丝氨酸的含量为36.0％，苏氨酸的含量为31.8％，甘氨酸的含量为1.3％，异亮氨酸与脯氨酸的含量均为3.4％。脂肪系数为27.80。亲水性平均数为-0.376。
[0036] 1.3 GRP基因蛋白的疏水性分析
[0037] 研究表明，较高正值的氨基酸具有较强的疏水性，而较低负值的氨基酸则具有较强的亲水性。GRP基因的疏水性分析结果如图2所示，最低值-1.7，亲水性最强；最高值1.25，疏水性最强。从整体看来，GRP基因氨基酸序列中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，由此得知GRP基因为亲水性蛋白。
[0038] 1.4 GRP基因的跨膜区分析
[0039] 蛋白质序列含有跨膜区，综合图2、3所示，结果显示：GRP基因蛋白的氨基酸全部位于细胞膜表面，并没有典型的跨膜螺旋区，与蛋白质的疏水性区域分析结果基本一致。表明GRP基因蛋白不是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白。
[0040] 2.材料方法
[0041] 2.1材料
[0042] 大豆种子突变体M18、吉农18、大肠杆菌DH5菌株、农杆菌EHA105菌株、克隆重组载体PMD18-T-GRP、pCAMBIA3301、克隆载体PMD18-T均由吉林农业大学植物生物技术中心提供与保存。
[0043] 2.2方法
[0044] 2.2.1目的片段的获得
[0045] 通过前期研究工作中，筛选到大豆抗旱突变体M18。对M18的研究发现根系特征与野生型吉农18有明显差异。利用RNA-seq筛选差异表达基因，得到一个与GRP同源的表达片段。通过提取大豆抗旱突变体M18苗期叶片的基因组，利用特异性引物扩增得到目的片段，通过同源pcr扩增技术对目标基因进行克隆从而得到目的片度大小为848bp左右的基因序列，pcr扩增体系为25μl,包括：扩增条件为：94℃预变性10min；94℃变性45s,60℃复性45s,72℃延伸45s,42个循环；最后再72℃延伸10min,4℃保存。
[0046] pcr产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳回收后，将回收产物进行测序，将测序结果正确的回收产物连接到克隆载体pMD18T上，获得重组载体pMD18-T-GRP并转化大肠杆菌感受态细胞中，挑取单菌落，提取质粒，送样至吉林省库美公司，进行测序。
[0047] 2.2.2植物过表达载体的构建
[0048] 分别对重组克隆载体pMD18-T-GRP和植物表达载体pCAMBIA3301进行bglⅡ、BsteⅡ双酶切，回收pMD18-T-GRP小片段和pCAMBIA3301大片段,利用T4DNA连接酶连接，用PMD18-T-GRP的小片段替换pCAMBIA-3301中的GUS片段，构建重组植物过表达载体PCAMBIA3301-GRP-over-expression。对该载体进行PCR检测及双酶切鉴定，载体构建图如图4所示。
[0049] 2.2.3 RNAi干扰表达载体的构建
[0050] pcr扩增带有内含子的正反义片段，扩增产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段并将正义片段与基础表达载体pCAMBIA3301,同时用Bgl-Ⅱ和BstEⅡ(限制性内切酶为公司产品)进行双酶切，回收载体和正义片段，按体积比为1:3进行连接，连接体系如下:12μL目的片段，4uL载体，1uLT 4连接酶，2μL T4Buffer,1μL ddH2O。22℃反应过夜。此时得到的载体命名为pCAMBIA-zy。采用同样的方法，用BglⅡ和BstEⅡ双酶切，将反义片段连接入pCAMBIA-zy载体中，得到以抗除草剂(bar)基为筛选标记的RNAi干扰表达载体PCAMBIA3301-GRP-RNAi。对该载体进行PCR检测及双酶切鉴定。载体构建图如图5所示。
[0051] 2.2.4大豆的遗传转化
[0052] 本文采用农杆菌侵染大豆子叶节的方法将重组质粒PCAMBIA-GRP-
[0053] RNAi DNA和PCAMBIA-GRP-over expression DNA分别转入受体大豆品种“吉农18”中,并获得转化植株。
[0054] 2.2.5转基因植株的后代检测
[0055] 2.2.5.1 PCR检测
[0056] 用primer5.0软件设计下述引物：抗除草剂(bar)、35s启动子、noss终止子、目的基因(GRP)的基因序列。BarS/BarAS、35S/35AS、nossS/nossAS、目的基因GRP的引物序列见表1。
[0057] 摘取幼嫩转化大豆植株叶片，用吉林省库美生物科技有限公司提供的NuClean Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组，进行pcr检测，并以未转化的受体大豆(吉农18)叶片基因组作为阴性对照。抗除草剂(bar)、35s基因、noss终止子和目的基因(GRP)的扩增体系均为25μl体系，PCR扩增条件如表2。
[0058] 表1.引物序列
[0059]
[0060]
[0061] 表2
[0062] PCR扩增条件
[0063]
[0064] 2.2.5.2转基因植株的southern blotting检测
[0065] 提取经PCR检测为阳性的T2代大豆叶片的基因组DNA,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切,以纯化的bar为探针,使用DIG DNALabeling andDetection Kit I试剂盒(罗氏公司产品),按照说明书内容标记制备探针,制备样品、转膜、预杂交、杂交、洗膜、染色显影等程序,进行Southern blotting检测。
[0066] 2.2.5.3转基因植株的干旱胁迫试验
[0067] 盆栽法是一种用于植物水分生理生态控制实验的成熟方式。本次试验运用盆栽法，控制水分模拟干旱胁迫，对3份转基因材料：吉农18(未转化的受体植株作为阴性对照CK)、重组表达载体PCAMBIA-GRP-over expression植株、重组表达载体PCAMBIA-GRP-RNAi植株进行苗期的抗旱性鉴定。通过株高、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重这5项指标的变化，进行差异显著性分析，从而比较3份材料的抗旱程度。
[0068] 2.2.5.4转基因植株的荧光定量PCR检测
[0069] 提取southern试验中出现杂交信号的转基因植株，以及受体大豆(吉农18)的RNA，并利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA,5倍稀释备用。并以5倍稀释后的cDNA为模板，选取β-action(Genbank登录号:NM001252731.2)基因为qRT-PCR实验的内参基因，利用primer5.0同时设计定量pcr引物QNCAS与QNCS,荧光定量pcr引物QCGRP与QACGRP引物序列，然后进行荧光定量PCR。荧光定量所需的引物序列见表3。
[0070] RNA提取：其步骤按照TaKaRa公司出产RNAisoPlus试剂盒操作步骤进行。
[0071] qPCR反应：按照GeneCopoeia生产的q RT-PCRmix说明书中的操作进行，其反应体系为20μL，其中2×All-in-oneqRT-PCRmix10μL；相应引物(20umol/L)各1.0μL；cDNA2.0μL；Nuclease-free water6.0μL；每个样本及对照受体的mRNA检测均重复3次,其扩增条件为95℃3min；95℃40s；55℃40s；35个循环，从而得到相应的Ct值，代反应程序结束后，输出数据-△△Ct
并对其进行保存，然后通过相对定量中的2 法进行定量结果的计算。
并对其进行保存，然后通过相对定量中的2 法进行定量结果的计算。
[0072] 最终计算公式：①ΔΔCt＝(Ct靶基因－Ct内参)实验组－(Ct靶基因－Ct内参)对照组。
[0073] 表3.引物序列
[0074]
[0075] 3结果与分析
[0076] 3.1大豆富含甘氨酸蛋白基因(GRP)克隆载体的检测与验证
[0077] 如图6所示，以突变体吉农18植株嫩叶总DNA为模版进行PCR扩增，扩增出大小为848bp特异性强、单一的扩增带结果与预期相符。将PCR产物电泳回收后连入克隆载体中。根据克隆载体PMD18T-GRP的PCR结果表明，获得的片段长度与目的片段长度大小一致，说明克隆片段已经成功连入克隆载体中。
[0078] 3.2大豆富含甘氨酸蛋白基因(GRP)表达载体的检测与验证
[0079] 利用BglII和BstEII两种酶进行双酶切试验，并进行凝胶电泳，以保证重组的质粒载体正确。如图7所示，植物过表达载体pCAMBIA3301-GRP-over expression双酶切片段大小与预计片段大小900bp(包含同源臂片段的总和)相一致，初步说明表达载体构建成功，然后以上述构建好的表达载体质粒为模板，进行常规PCR检测，发现GRP目的基因片段与预期片段大小位置相同，说明植物过表达载体构建成功。
[0080] 如图8所示，植物RNAi表达载体pCAMBIA3301-GRP-RNAi双酶切片段大小与预计片段大小1170bp(包含正、反义片段和内含子片段的总和)相一致，初步说明表达载体构建成功，然后以上述构建好的表达载体质粒为模板，进行常规PCR检测，发现GRP基因的正义片段、反义片段与内含子片段均与预期片段大小位置相同，说明植物干扰表达载体构建成功。
[0081] 3.3 T2代转基因植株的获得及检测
[0082] 将过表达载体PCAMBIA3301-GRP-over expression质粒DNA通过农杆菌侵染法分别导入到大豆受体品种“吉农18”中。经pcr检测获得4株T0代阳性植株，收货T0代阳性种子30粒。通过室内与室外连续种植进行加代处理，得到11株T1代阳性植株，收货T1代阳性种子60粒，继续通过室内与室外连续种植进行加代处理，得到T2代阳性植株14植株，提取叶片基因组DNA，分别利用抗除草剂(bar),35s启动子，noss终止子，目的基因GRP的基因特异性引物进行逐一检测，以重组表达载体PCAMBIA3301-GRP-over expression质粒DNA为阳性对照，未转化的受体大豆植株“吉农18”为阴性对照和水为空白对照，pcr检测结果如图9所示。
[0083] 将干扰载体PCAMBIA3301-GRP-RNAi质粒DNA通过农杆菌侵染法分别导入到大豆受体品种“吉农18”中。经pcr检测获得3株T0代阳性植株，收获T0代阳性种子22粒。同样通过室内与室外连续种植进行加代处理，得到T1代阳性植株9株，获得T1代阳性种子53粒，继续通过室内外连续种植进行加代处理，得到T2代阳性植株12株，提取叶片基因组DNA，分别利用筛选标记bar,35s启动子，noss终止子，目的基因GRP的基因特异性引物进行逐一检测，以重组表达载体PCAMBIA3301-GRP-RNAi质粒DNA为阳性对照，未转化的受体大豆植株“吉农18”和水为阴性对照，pcr检测结果如图10所示。
[0084] 由图9与图10可知，从T2代转基因植株中通过基因特异性引物扩增出的条带与目的基因的大小一致，初步证明植物富含甘氨酸蛋白(GRP)基因已成功整合进入转化的阳性植株中。
[0085] 3.4 T2代转基因植株的southern blotting检测
[0086] 分别按顺序提取经过pcr检测结果为阳性的转基因植株的叶片基因组DNA，用限制性内切酶HindⅢ进行酶切，用筛选标记bar作为探针，分别以以重组表达载体PCAMBIA3301-GRP-over expression质粒DNA和干扰载体PCAMBIA3301-GRP-RNAi质粒DNA为阳性对照，非转化大豆中植株受体(吉农18)为阴性对照，进行southern blotting检测。
[0087] 如图11所示，只有转化的植株才会出现杂交信号，检测的转GRP过表达载体基因植株中有2株出现明显的杂交信号，共获得7株经southern blotting检测为阳性的转基因植株。从图中可知功能元件以单拷贝的形式整合到受体大豆基因组中，整合位点并不相同。
[0088] 如图12所示，只有转化的植株才会出现杂交信号，检测的转GRP干扰载体基因植株中有1株出现明显的杂交信号，共获得6株经southern blotting检测为阳性的转基因植株。从图中可知功能元件以单拷贝的形式整合到受体大豆基因组中，整合位点并不相同。
[0089] 3.5转基因植株的苗期抗旱性试验检测
[0090] 以营养土(微生物基质)为栽培介质，盛放容器选用统一花盆(直径12cm×高10cm)，播种前统一配土、装盆、浇透底水，用电子秤称量，确保各个花盆配土后重量一致，各花盆浇透底水后重量一致。每份材料种植6盆，每盆5粒，出苗后，每盆隔3天浇水550ml，于三叶期开始对胁迫组进行断水处理。根据观察胁迫组大豆植株的情况，设置胁迫处理5天、8天、11天、15天4个断水干旱胁迫组。每个断水干旱胁迫组分为：CK处理、过表达处理、RNAi干扰处理。与对照组(正常隔3天浇水600ml)：CK未处理、过表达未处理、RNAi未处理形成对比。
每个胁迫组在相应处理天数，复水3天后，继续测量胁迫组植株与对照组植株的各项指标。
每个胁迫组在相应处理天数，复水3天后，继续测量胁迫组植株与对照组植株的各项指标。
[0091] 在干旱胁迫处理15天，复水三天后测量指标，由表4可以看出：GRP过表达基因处理后与CK处理后的地上鲜重、地上干重均出现显著性差异，且达到极显著水平。与GRP干扰基因处理后相比CK处理后的株高、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重均存在显著性差异，且达到极显著水平；结果表明干旱胁迫处理后转GRP过表达载体基因植株在干旱胁迫下会通过基因表达表现出比CK更强的抗旱能力。
[0092] 表4胁迫组与对照组的显著性分析
[0093]
[0094] 3.6 T2代转基因植株的荧光定量pcr检测
[0095] 对southern blotting检测结果为阳性的转基因植株继续进行荧光定量pcr检测。分别对GRP过表达和GRP干扰基因在T2代转化植株和未转化植株(吉农18CK)在不同天数的干旱胁迫的表达量情况进行分析。结果图13、14所示：在模拟干旱处理大豆植株的15天中，大豆叶片中的GRP过表达基因表达量成先增后减的趋势，干旱处理8天时，大豆叶片中的GRP基因表达量最高，为对照的5.2倍。大豆根与茎中GRP基因的表达量并无明显变化。GRP干扰基因在模拟干旱处理得到15天中，在根茎叶中的表达量成逐渐下降趋势，在干旱处理第15天时，根中的表达量最少。
[0096] 在很多单子叶和双子叶中植物中都有GRP基因的存在。本发明通过突变体(M18)中克隆了GRP基因，运用生物信息学分析，并成功构建植物表达载体(植物过表达载体和植物干扰载体)，通过农杆菌介导法将功能元件转入受体大豆(吉农18)中，southern blotting检测说明功能原件以单拷贝形式整合到大豆基因组当中。通过植株苗期抗旱性试验中得知GRP过表达基因的抗旱性优于受体植株吉农18(CK)，且表现显著；GRP干扰基因在胁迫试验下没有表现出优于受体植株吉农18(CK)的抗旱性；GRP过表达基因、GRP干扰基因与CK差异出现不规律性和不稳定性，因此其抗旱性鉴定检测应结合更多指标进行综合分析。
[0097] 通过荧光定量pcr检测发现：GRP过表达基因在大豆叶片中的表达量最高，随着干旱胁迫天数的增加，在叶片中的表达量成先增后减的趋势；在根、茎中的表达量较低，表达量的变化不明显。GRP干扰基因在大豆根、茎、叶中的表达量较少，随着干旱胁迫天数的增加，表达量逐渐降低。
[0098] 通过对转GRP基因植株的生物学鉴定可以看出在干旱胁迫的环境下，转GRP过表达载体植株与CK相比具有更强的抗旱能力，且在地上鲜重与地上干重的显著性更明显，这与荧光定量PCR检测结果中，GRP基因在茎、叶中表达量更高的结果相一致。
[0099] 本发明为进一步了解GRP基因参与干旱等逆境反应的分子机制奠定了基础，同时为在大豆中研究GRP基因提供了条件。
[0100] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0101] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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