工程化细菌和使用方法
阅读：311发布：2020-05-12
专利汇可以提供工程化细菌和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含从 哺乳动物 受试者的 微 生物 组样品中分离并经工程化以表达异源多核苷酸的共生细菌群的组合物，包含这样的工程化的共生细菌的组合物以及用于例如通过施用所述工程化的共生/原生细菌向哺乳动物递送 治疗 性多肽的方法。，下面是工程化细菌和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种向有需要的哺乳动物受试者递送治疗性多肽的方法，所述方法包括：
a)从供体受试者获得包含细菌细胞的微生物组样品；
b)从所述微生物组样品中分离细菌细胞，其中，所述细菌细胞来自供体受试者共生/原生的细菌菌株；
c)对分离的细菌细胞进行体外培养以产生基本上同质的分离和培养的细菌细胞群；
d)用与所述细菌和/或供体受试者异源的一种或多种多核苷酸转化所述细菌细胞群，
其中，所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种治疗性多肽；和
e)将至少一部分基本上同质且经转化的分离和培养的细菌细胞群施用至或使其被施
用至接受受试者，其中，所施用的细菌细胞能够在哺乳动物受试者中或其上永久或长期定殖并表达所述一种或多种治疗性多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括确定和/或测量所施用的细菌细胞在所述哺
乳动物受试者中或其上的定殖或存在的步骤。
3.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自选自由以下组
成的组的生物样品：身体排泄物(例如，粪便、唾液、粘液、尿液或呼出物)，表面(例如，胃肠道、口腔、咽、鼻腔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、阴道或眼)的活检或拭子，和病理标本(例如，癌组织、截肢肢体或发炎器官)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞不包含编码致病毒素的
多核苷酸。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细菌细胞不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞对用于选择经转化的细
菌细胞的一种或多种抗生素剂具有抗生素敏感性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞对一种或多种临床使用
的抗生素剂不具有抗生素抗性。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星或罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐或利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B或多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林或哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素或妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟或头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A或烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南或硫霉素)或四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素或替加环素)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码荧
光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、mNeptune)、mTurquoise或mVenus。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码
酶、细胞因子或肽激素。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID 3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺
(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6或ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)或胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述细胞因子选自哺乳动物(例如，人)IL-10、哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和/或Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)、或TGF-β。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。
14.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子
2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，所述一种或多种异源多核苷酸包含密码子
偏好性，所述密码子偏好性被配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离和培养的细菌细胞群中的表达。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合
到经转化的细菌细胞群的染色体中。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB基因和/或yfgG基因中。
18.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸处在
游离地引入经转化的细菌细胞群中的质粒中。
19.如权利要求18所述的方法，其中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合
到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、
99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述异源多核苷酸在组成型启动子
的控制下表达。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述异源多核苷酸在诱导型启动子
的控制下表达。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞来自革兰氏阴性细菌
菌株。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞源自选自由以下组成
的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞源自大肠杆菌。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳
定地定殖于其所施用的组织或表面，持续至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，持续受试者的整个生命周期或在上述任两个时间段所定义的范围内的一段时间。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳
定且永久地定殖于其所施用的组织或表面。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，至少或至少约10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的所施用的细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞：
i)能够代谢一种或多种碳水化合物，所述碳水化合物选自由以下组成的组：蔗糖、木
糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；
ii)利用糖酵解底物和糖异生底物；
iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；
iv)能够产生5-磷酸核糖；
v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的
原养生物)；
vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；
vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；
ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；
x)表达rnf样氧化还原酶复合物；
xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或
xii)不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，没有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛、表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素、和/或没有活性clbA基因。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中，受试者是人。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中，施用至少或至少约106、107、108、109、
1010、1011、1012、1013个细菌细胞。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，供体受试者和接受受试者是同一个
体，例如，其中微生物组样品是受试者自体的。
33.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，供体受试者和接受受试者是不同个
体。
34.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞施用至所述微
生物组样品所获自的相同组织或表面。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自皮肤或眼，并且将所施用的细菌细胞局部施用至所述受试者，例如在缓冲悬液、凝胶、洗剂、乳膏或软膏中局部施用。
36.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自鼻腔，并且所施用的细菌细胞通过鼻管进行施用。
37.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自阴道，并且所施用的细菌细胞经阴道内施用。
38.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自胃肠道，并且所施用的细菌细胞经口服或直肠施用于受试者。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所施用的细菌细胞经胃管或以可食用组合物的形式口服施用于受试者。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物选自由以下组成的组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
42.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物是饮料。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述饮料是缓冲溶液。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞多次施用于受
试者，例如，以每天、每周、每两周或每月的间隔施用。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞以每天、每周、每两周或每月的间隔施用于受试者。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中，所施用的转化的细菌细胞不改变接
受受试者的微生物组。
47.与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述基本上同质的细菌群经转化以表达与所述哺乳动物和/或所述细菌异源的一种或多种多核苷酸。
48.如权利要求47所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，与哺乳动物共生的细菌群能够或被配置成永久或长期地定殖在哺乳动物中或哺乳动物上。
49.如权利要求47至48中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群能够或被配置成在哺乳动物中或哺乳动物上定殖至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、
100、125周以上，例如，哺乳动物的生命周期。
50.如权利要求47至49中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细
胞：
i)能够代谢一种或多种碳水化合物，所述碳水化合物选自由以下组成的组：蔗糖、木
糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；
ii)利用糖酵解底物和糖异生底物；
iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；
iv)能够产生5-磷酸核糖；
v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的
原养生物)；
vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；
vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；
ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；
x)表达rnf样氧化还原酶复合物；
xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或
xii)不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，没有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛、表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素、和/或没有活性clbA基因。
51.如权利要求47至50中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
52.如权利要求47至51中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群对用于选择经转化的细菌细胞的一种或多种抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
53.如权利要求47至52中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群对临床使用的抗生素剂不具有抗生素抗性。
54.如权利要求53所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星或罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐或利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B或多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星或吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林或哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素或妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟或头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A或烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南或硫霉素)、或四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素或替加环素)。
55.如权利要求47至54中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白
(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。
56.如权利要求47至55中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。
57.如权利要求56所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID 3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6或ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)或胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。
58.如权利要求56所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10、哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和/或Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)、和TGF-β。
59.如权利要求56所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-
2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。
60.如权利要求47至59中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。
61.如权利要求47至60中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性，所述密码子偏好性被配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离和培养的细菌细胞群中的表达。
62.如权利要求47至61中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。
63.如权利要求62所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB基因和/或yfgG基因中。
64.如权利要求47至61中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。
65.如权利要求64所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。
66.如权利要求47至64中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、
85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
67.如权利要求47至66中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。
68.如权利要求47至67中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。
69.如权利要求47至68中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。
70.如权利要求47至69中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群是冻干的或冷冻保存的。
71.一种适用于对哺乳动物施用的药物组合物，其包含与哺乳动物共生的基本上同质
的细菌细胞群，其中，细菌群被转化以表达与所述哺乳动物和/或所述细菌异源的一种或多种多核苷酸。
72.一种哺乳动物可食用的组合物，其包含与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞
群，其中，所述基本上同质的细菌细胞群被转化以表达与所述哺乳动物和/或所述细菌异源的一种或多种多核苷酸。
73.如权利要求71至72中任一项所述的组合物，其中，与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群根据权利要求1至44中任一项所述的方法产生。
74.如权利要求71至73中任一项所述的组合物，其中，与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群能够或被配置成永久或长期地定殖在哺乳动物中或哺乳动物上。
75.如权利要求71至74中任一项所述的组合物，其中，所述细菌细胞群能够或被配置成在哺乳动物中或哺乳动物上定殖至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，哺乳动物的生命周期。
76.如权利要求71至75中任一项所述的组合物，其中，所述细菌细胞：
i)能够代谢一种或多种碳水化合物，所述碳水化合物选自由以下组成的组：蔗糖、木
糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；
ii)利用糖酵解底物和糖异生底物；
iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；
iv)能够产生5-磷酸核糖；
v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的
原养生物)；
vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；
vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；
ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；
x)表达rnf样氧化还原酶复合物；
xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或
xii)不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，没有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛、表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素、和/或没有活性clbA基因。
77.如权利要求71至76中任一项所述的组合物，其中，所述基本上同质的细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
78.如权利要求71至77中任一项所述的组合物，其中，所述基本上同质的细菌细胞群对用于选择经转化的细菌细胞的一种或多种抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
79.如权利要求71至78中任一项所述的组合物，其中，所述细菌细胞对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。
80.如权利要求79所述的组合物，其中，所述细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星或罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐或利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B或多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星或吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林或哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素或妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟或头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A或烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南或硫霉素)或四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素或替加环素)。
81.如权利要求71至80中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。
82.如权利要求71至81中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。
83.如权利要求82所述的组合物，其中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID 3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6或ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)或胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。
84.如权利要求82所述的组合物，其中，所述细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10、哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和/或Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)和TGF-β。
85.如权利要求82所述的组合物，其中，所述肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。
86.如权利要求71至81中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。
87.如权利要求71至86中任一项所述的组合物，所述一种或多种异源多核苷酸包含密
码子偏好性，所述密码子偏好性被配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离和培养的细菌细胞群中的表达。
88.如权利要求71至87中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。
89.如权利要求88所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB基因和/或yfgG基因中。
90.如权利要求71至87中任一项所述的组合物，其中，所述异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。
91.如权利要求71至90中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、
99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
92.如权利要求71至91中任一项所述的组合物，其中，所述基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。
93.如权利要求71至92中任一项所述的组合物，其中，所述基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。
94.如权利要求71至93中任一项所述的组合物，其中，所述基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。
95.如权利要求71至94中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包括缓冲溶液或缓冲悬液。
96.如权利要求72所述的组合物，其中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所述基本上同质的细菌细胞群或所施用的细菌细胞经包封。
97.如权利要求72所述的组合物，其中，所述可食用组合物包含饮料。
98.如权利要求72所述的组合物，其中，所述可食用组合物选自由以下组成的组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
99.一种试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器包含一种或多种权利要求71至98中任一项所述的组合物。
100.如权利要求99所述的试剂盒，其中，所述基本上同质的细菌细胞群是冻干的。
101.权利要求47至70中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群、权利要求71所述的药
物组合物、权利要求72至98中任一项所述的组合物或者权利要求99或100所述的试剂盒作为药物的用途。
102.如权利要求47至70中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群、如权利要求71所述
的药物组合物、如权利要求72至98中任一项所述的组合物或者权利要求99或100所述的试剂盒，其用于治疗、改善、预防或抑制肥胖、糖尿病、癌症(例如口腔癌、食道癌、胃癌、结肠癌或直肠癌)、溃疡性结肠炎、克罗恩病、HIV、病原体感染(诸如假单胞菌属、梭菌属或沙门氏菌属感染)、营养不良、乳糖不耐症、苯丙酮尿症、乳糜泻、或脑损伤(例如创伤性脑损伤、神经病、痴呆、脑卒中或脑病)、高胆固醇血症、男性不育、女性不育或慢性肾病。
工程化细菌和使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年4月17日提交的美国临时申请62/486,068的基于35U.S.C.§119(e)的权益，出于所有目的，通过引用以其整体明确并入本文。
[0004] 这项工作部分地得到美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的拨款R03DK114536和1K08DK10290201A1号支持。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
[0005] 测序、质谱和生物信息技术的最新进展促进了我们对微生物组(microbiome)在宿主生理过程中的作用的理解，这些生理过程包括但不限于代谢、炎症、行为和神经系统疾病(Vuong等，Annu Rev Neurosci.(2017)40：21-49)[也引用25271724]。尽管将生理过程与微生物组联系起来在概念上令人兴奋，但该领域仍处于萌芽状态；研究显示出很强的关联性，但几乎尚未显示出微生物群与各种生理过程之间存在明显的机制性关系。例如，由肠道微生物组调节的分析物的绝对数量以及来自肠道上皮的信号传导分子使得难以鉴定可能有助于神经行为过程的微生物组功能。为了发展更好的机制理解和更有效的微生物组介导的疗法，必须采用强调肠道微生物组功能性调节的不同方法。
发明内容
[0007] a)从供体受试者获得包含细菌细胞的微生物组样品；
[0008] b)从微生物组样品中分离细菌细胞，其中，分离的细菌细胞来自供体受试者共生(commensal)/原生(native)的细菌菌株；
[0009] c)将分离的细菌细胞体外培养以产生基本上同质的分离和培养的细菌细胞群；
[0010] d)用与细菌和/或供体受试者异源的一种或多种多核苷酸转化基本上同质的细胞群，其中，所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种治疗性多肽；和
[0011] e)将至少一部分基本上同质且经转化的分离和培养的细菌细胞群施用至或使其被施用至接受受试者，例如，以治疗上足够的量施用，其中，所施用的细菌细胞能够永久或长期地定殖在哺乳动物受试者中或其上，或者经配置成永久或长期地定殖在哺乳动物受试者中或其上，并且表达一种或多种治疗性多肽，例如以足以对该哺乳动物发挥治疗作用的水平表达。在某些实施方式中，所述方法进一步包括确定和/或测量所施用的细菌细胞在所述哺乳动物受试者中或其上的定殖或存在的步骤。在某些实施方式中，微生物组样品获自选自由以下组成的组的生物样品：身体排泄物(例如，粪便、唾液、粘液、尿液、呼出物)，表面(例如，胃肠道(GI)、口腔、咽、鼻腔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、阴道、眼)的活检或拭子，和病理标本(例如，癌组织、肢体截肢、发炎器官)。在某些实施方式中，细菌细胞不包含编码致病毒素的多核苷酸。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述致病毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对用于选择经转化的细菌细胞的一种或多种抗生素具有抗生素敏感性，例如，卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
在某些实施方式中，细菌细胞对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对一种或多种选自以下抗生素的的一种或多种抗生素剂没有抗生
素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(rifampicin)(或立复霉素
(rifampin))、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸
(tabtoxinine)-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南(阿祖培南)、泰比培南、硫霉素)和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID
3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B
(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6，ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)、和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子
1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂(elafin)、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻(Nostoc elipsosporum)蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸处在游离地引入经转化的细菌细胞群中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。在某些实施方式中，异源多核苷酸在组成型启动子的控制下表达。在某些实施方式中，异源多核苷酸在诱导型启动子的控制下表达。在某些实施方式中，细菌细胞来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，细菌细胞源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(Bacteroides)(例如，另枝菌属(Alistipes)、普氏菌属(Prevotella)、副普氏菌属
(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)或臭味杆菌属(Odoribacter))、梭菌属(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、直肠真杆菌
(Eubacterium rectale)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、葡萄球菌属
(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、韦荣球菌属(Veillonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。在某些实施方式中，细菌细胞源自大肠杆菌。在某些实施方式中，可检测比例的所施用细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面持续至少或至少约2、3、
4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，持续受试者的整个生命周期或在上述任何两个时间段所定义的范围内的一段时间。在某些实施方式中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳定且永久地定殖于其所施用的组织或表面。在某些实施方式中，至少或至少约10％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％的所施用的细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面。在某些实施方式中，原生/共生宿主细胞：(i)能够代谢一种或多种选自由以下组成的组的碳水化合物：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；(ii)利用糖酵解和糖异生底物；(iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；(iv)能够产生5-磷酸核糖；(v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；(vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；(vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性clbA基因。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，施用至少或至少约106、107、108、109、1010、1011、1012、
1013个细菌细胞。在某些实施方式中，供体受试者和接受受试者是同一个体，例如，微生物组样品对于该受试者是自体的。在某些实施方式中，供体受试者和接受受试者是不同个体。在某些实施方式中，微生物组样品来自与受试者相同物种的哺乳动物。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞施用至微生物组样品所获自的相同组织或表面。在某些实施方式中，微生物组样品获自皮肤或眼，并且将细菌细胞群局部施用于受试者，例如，以缓冲悬液、凝胶、洗剂、乳膏或软膏局部施用。在某些实施方式中，微生物组样品获自鼻腔，并且所施用的细菌细胞是通过鼻管进行施用的。在某些实施方式中，微生物组样品获自阴道，和所施用的细菌细胞经阴道内施用。在某些实施方式中，微生物组样品获自胃肠道，和所施用的细菌细胞经口服或直肠施用于受试者。在某些实施方式中，所施用的细菌细胞经胃管或以可食用组合物口服施用于受试者。在某些实施方式中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封(encapsulated)。在某些实施方式
中，可食用组合物选自由以下组成的组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
在某些实施方式中，可食用组合物是饮料。在某些实施方式中，所述饮料是缓冲溶液。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞多次施用给受试者，例如，以每天、每周、每两周或每月的间隔。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞以每天、每周、每两周或每月的间隔施用于受试者。在某些实施方式中，转化的细菌细胞的施用不改变接受受试者的微生物组。
在某些实施方式中，细菌细胞对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对一种或多种选自以下抗生素的的一种或多种抗生素剂没有抗生
素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(rifampicin)(或立复霉素
(rifampin))、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸
(tabtoxinine)-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南(阿祖培南)、泰比培南、硫霉素)和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID
3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B
(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6，ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)、和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子
1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂(elafin)、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻(Nostoc elipsosporum)蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸处在游离地引入经转化的细菌细胞群中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。在某些实施方式中，异源多核苷酸在组成型启动子的控制下表达。在某些实施方式中，异源多核苷酸在诱导型启动子的控制下表达。在某些实施方式中，细菌细胞来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，细菌细胞源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(Bacteroides)(例如，另枝菌属(Alistipes)、普氏菌属(Prevotella)、副普氏菌属
(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)或臭味杆菌属(Odoribacter))、梭菌属(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、直肠真杆菌
(Eubacterium rectale)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、葡萄球菌属
(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、韦荣球菌属(Veillonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。在某些实施方式中，细菌细胞源自大肠杆菌。在某些实施方式中，可检测比例的所施用细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面持续至少或至少约2、3、
4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，持续受试者的整个生命周期或在上述任何两个时间段所定义的范围内的一段时间。在某些实施方式中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳定且永久地定殖于其所施用的组织或表面。在某些实施方式中，至少或至少约10％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％的所施用的细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面。在某些实施方式中，原生/共生宿主细胞：(i)能够代谢一种或多种选自由以下组成的组的碳水化合物：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；(ii)利用糖酵解和糖异生底物；(iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；(iv)能够产生5-磷酸核糖；(v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；(vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；(vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性clbA基因。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，施用至少或至少约106、107、108、109、1010、1011、1012、
1013个细菌细胞。在某些实施方式中，供体受试者和接受受试者是同一个体，例如，微生物组样品对于该受试者是自体的。在某些实施方式中，供体受试者和接受受试者是不同个体。在某些实施方式中，微生物组样品来自与受试者相同物种的哺乳动物。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞施用至微生物组样品所获自的相同组织或表面。在某些实施方式中，微生物组样品获自皮肤或眼，并且将细菌细胞群局部施用于受试者，例如，以缓冲悬液、凝胶、洗剂、乳膏或软膏局部施用。在某些实施方式中，微生物组样品获自鼻腔，并且所施用的细菌细胞是通过鼻管进行施用的。在某些实施方式中，微生物组样品获自阴道，和所施用的细菌细胞经阴道内施用。在某些实施方式中，微生物组样品获自胃肠道，和所施用的细菌细胞经口服或直肠施用于受试者。在某些实施方式中，所施用的细菌细胞经胃管或以可食用组合物口服施用于受试者。在某些实施方式中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封(encapsulated)。在某些实施方式
中，可食用组合物选自由以下组成的组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
在某些实施方式中，可食用组合物是饮料。在某些实施方式中，所述饮料是缓冲溶液。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞多次施用给受试者，例如，以每天、每周、每两周或每月的间隔。在某些实施方式中，将所施用的细菌细胞以每天、每周、每两周或每月的间隔施用于受试者。在某些实施方式中，转化的细菌细胞的施用不改变接受受试者的微生物组。
[0012] 另一方面，提供了与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群，其中，该细菌群经转化以表达与哺乳动物和/或细菌异源的一种或多种多核苷酸。在某些实施方式中，哺乳动物原生的或共生的细菌群能够稳定地永久或长期定殖在哺乳动物中或其上，例如，持续至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，在哺乳动物的生命周期中。在某些实施方式中，原生/共生宿主细胞：(i)能够代谢一种或多种选自由以下组成的组碳水化合物：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；(ii)利用糖酵解和糖异生底物；(iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；(iv)能够产生5-磷酸核糖；(v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；(vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；(vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-
3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性
clbA基因。在某些实施方式中，细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。在某些实施方式中，细菌细胞群对一种或多种用于选择经转化的细菌细胞的抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。在某些实施方式中，细菌细胞对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、硫霉素)、和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID 3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6，ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素、和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约
80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。在某些实施方式中，将细菌细胞群冻干或冷冻保存。
3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性
clbA基因。在某些实施方式中，细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。在某些实施方式中，细菌细胞群对一种或多种用于选择经转化的细菌细胞的抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。在某些实施方式中，细菌细胞对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、硫霉素)、和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID 3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6，ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素、和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约
80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。在某些实施方式中，将细菌细胞群冻干或冷冻保存。
[0013] 另一方面，提供了适合施用于哺乳动物的药物组合物，例如，以用于向哺乳动物递送一种或多种治疗性多肽。另一方面，提供了可食用组合物。在某些实施方式中，如上文和本文所述，所述组合物包含与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群，其中，该细菌群经转化以表达与哺乳动物和/或细菌异源的一种或多种多核苷酸。在某些实施方式中，哺乳动物的原生的或共生的细菌群是根据上文和本文所述的方法产生的。在某些实施方式中，与哺乳动物共生的细菌群能够永久或长期地定殖或配置为永久或长期地定植定殖在哺乳动物中或其上，例如，持续至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，在哺乳动物的生命周期中。在某些实施方式中，原生/共生宿主细胞：(i)能够代谢一种或多种选自由以下组成的组的碳水化合物：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；(ii)利用糖酵解和糖异生底物；(iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；(iv)能够产生5-磷酸核糖；(v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；(vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；(vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性clbA基因。在某些实施方式中，细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素、和/或vero细胞毒素。在某些实施方式中，细菌细胞群对一种或多种用于选择经转化的细菌细胞的抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、硫霉素)、和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白
(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：胰高血糖素、哺乳动物胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素、和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。在某些实施方式中，组合物包含缓冲溶液或缓冲悬液。在某些实施方式中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封。在某些实施方式中，可食用组合物包括饮料。在某些实施方式中，可食用组合物选自下组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性clbA基因。在某些实施方式中，细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素、和/或vero细胞毒素。在某些实施方式中，细菌细胞群对一种或多种用于选择经转化的细菌细胞的抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性。在某些实施方式中，细菌细胞或细菌细胞群对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星、罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B、多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟、头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A、烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南、硫霉素)、和四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素、替加环素)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白
(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal或mNeptune)、mTurquoise或mVenus。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。在某些实施方式中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID 3251811)或bshB(基因ID3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)，胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。在某些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：哺乳动物(例如，人)IL-10和哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)和TGF-β。在某些实施方式中，肽激素选自由以下组成的组：胰高血糖素、哺乳动物胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素、和胰岛素原。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。在某些实施方式中，一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性和/或密码子优化，其配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离的和培养的细菌细胞群中的表达。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB和/或yfgG基因中。在某些实施方式中，异源多核苷酸处在游离地位于细菌细胞中的质粒中。在某些实施方式中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。在某些实施方式中，将一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQ ID NO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群来自革兰氏阴性细菌菌株。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。在某些实施方式中，基本上同质的细菌细胞群源自大肠杆菌。在某些实施方式中，组合物包含缓冲溶液或缓冲悬液。在某些实施方式中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封。在某些实施方式中，可食用组合物包括饮料。在某些实施方式中，可食用组合物选自下组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
[0014] 另一方面，提供了试剂盒，其包含一个或多个容器，该容器包含如上所述和本文所述的一种或多种组合物。在某些实施方式中，细菌细胞群是冻干的。
[0015] 定义
[0016] 术语“共生细菌(commensal bacteria)”或“原生细菌(native bacteria)”可互换地是指从哺乳动物的微生物组获得并适应于或配置为该微生物组的细菌细胞或细胞群。共生细菌适于定殖于哺乳动物(例如，身体排泄物(例如，唾液、粘液、尿液或粪便)、表面(例如，粘膜胃肠道、口/咽/鼻腔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、脸颊/嘴巴或眼))或者经配置为定殖于哺乳动物，并且不适合或配置为在实验室环境中进行培养。
[0017] 如本文所用，“施用”是指局部和全身施用，例如，包括肠内、肠胃外、肺内和局部/透皮施用。在本文所述方法中发现有用的工程化原生细菌(ENB)的施用途径包括，例如，口服(经口(P.O.))、直肠(例如，作为栓剂施用)、阴道、鼻腔或吸入、局部接触(例如，皮肤或眼睛)或病灶内施用于受试者。施用可以通过任何途径进行，包括肠胃外和/或粘膜(例如，口服、鼻腔、阴道或直肠)。施用可以由卫生工作者进行，也可以包括自我施用。
[0018] 术语“全身施用”和“全身性施用”是指将化合物或组合物施用于哺乳动物以使该化合物或组合物通过循环系统被递送至体内的部位(包括药物作用的靶部位)的方法。全身性施用包括但不限于口服、鼻内和/或直肠施用。
[0019] 短语“使得施用(cause to be administered)”是指由医学专业人员(例如医师)或控制受试者的医疗的人，其控制和/或允许将所讨论的一种或多种药剂/化合物施用于所述受试者。使得施用可以包括诊断和/或确定适合的治疗或预防方案，和/或为受试者开出特定的一种或多种药剂/化合物。这样的处方可以包括，例如起草处方表格、注释病历等。
[0020] 术语“共同施用”或“同时施用”是指将多个ENB群或一个或多个ENB群与另一种活性剂一起施用，以使两者都能同时实现生理作用。然而，不需要将这两种试剂一起施用。在某些实施方式中，一种药剂的施用可以先于另一种药剂的施用。同时的生理作用不一定需要在循环中同时存在两种药剂。然而，在某些实施方式中，共同施用通常导致两种药剂对于任何给定剂量以其最大血清浓度的很大一部分(例如，20％以上，优选30％或40％以上，更优选50％或60％以上，最优选70％或80％或90％以上)存在于体内(例如，血浆中)。
[0021] 术语“有效量”或“药学上有效的量”是指产生期望的结果所必需的一种或多种化合物的量和/或剂量和/或剂量方案，例如足以减轻哺乳动物的与受试者正在接受治疗的疾病状况相关的一种或多种症状的量，或足以减轻哺乳动物疾病状况的严重性或延缓其发展的量(例如，治疗有效量)，足以降低哺乳动物的疾病风险或延迟其发作和/或降低其最终疾病严重程度的量(例如，预防有效量)。
[0022] 如本文所用，术语“治疗”是指所述术语施用的疾病或病症的或者所述疾病或病症的一种或多种症状的发作延迟、进展延迟或逆转、严重性降低、或减轻或预防。
[0023] 术语“缓解”是指减轻或消除病理或疾病的一种或多种症状，和/或减少该病理或疾病的一种或多种症状的发作速度或延迟发作或减轻严重程度，和/或预防该病理或疾病。
[0024] 术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地是指哺乳动物，优选人或非人灵长类动物，但也指驯养的哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和/或农业哺乳动物(例如，马、牛、猪或绵羊)。在各种实施方式中，受试者可以是在医院、精神病护理设施中作为门诊病人或其他临床情况下的医师或其他卫生工作者的照料下的人(例如，成年男性、成年女性、青春期男性、青春期女性、男童或女童)。在某些实施方式中，受试者可能未接受医生或其他卫生工作者的照料或处方。
[0025] 如本文所用，“基本上同质(substantially homogenous)的细菌细胞群”在遗传上至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，例如，通过全基因组测序或核糖体RNA 16S DNA测序确定。
[0026] 如本文所用，“稳定地定殖”的工程化原生细菌(ENB)细胞在已施用它们的管腔或组织的附近处或附近中建立或分裂(例如，繁殖)，使它们保持，例如，至少3、4、5或6天，例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如在受试者的整个生命周期内或在上述任意两个时间段所定义的范围内的时间段内。
[0027] 术语“异源核酸”或“异源多肽”是指其序列与天然存在于同一宿主细胞或相同宿主中的另一核酸或多肽的序列不同的核酸或多肽。如本文所用，“异源核酸”或“异源多肽”可以与细菌细胞和/或哺乳动物宿主异源。
[0028] 如本文所用，术语“转化(transform/transformation)”是指核酸片段向宿主细菌细胞内的转移，导致基因稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主细菌细胞被称为“重组”或“转基因”或“转化”的生物。
[0029] 术语“治疗性多肽”是指在哺乳动物中具有治疗药理活性的多肽。
[0030] 在两个以上核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分数是指两个以上序列或亚序列相同或者具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(即在参考序列(如表1中所述的异源多核苷酸或多肽序列)的指定区域内具有至少或至少约80％同一性，例如，至少或至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％同一性，当在比较窗口或指定区域进行比较和比对以达到最大对应性时，使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测进行测量。这样的序列然后被称为“基本上相同”。
该定义也涉及对测试序列的补充。优选地，同一性存在于长度为至少或至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，例如存在于长度为50、100、200、300、400个氨基酸或核苷酸的区域上或参考序列的全长。
100％同一性，当在比较窗口或指定区域进行比较和比对以达到最大对应性时，使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测进行测量。这样的序列然后被称为“基本上相同”。
该定义也涉及对测试序列的补充。优选地，同一性存在于长度为至少或至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，例如存在于长度为50、100、200、300、400个氨基酸或核苷酸的区域上或参考序列的全长。
[0031] 为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定其他参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。为了将核酸和蛋白质与参考核酸和蛋白质进行序列比较，使用了BLAST和BLAST 2.0算法以及默认参数。
[0032] 如下所述，两个核酸序列或多肽基本上相同说明由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫学上的交叉反应性。因此，多肽通常与第二多肽基本相同，例如，其中两个肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本相同另外还说明两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两条核酸序列基本相同此外还说明可以使用相同的引物来扩增该序列。附图说明
[0033] 图1示出了本文描述的方法的示意图。原生(即共生)细菌可以用作载体，以向常规饲养的野生型宿主(诸如人类)的微生物组(例如，肠道、皮肤)引入新功能(例如，递送治疗性多肽，例如，胆汁盐水解酶)。
[0034] 图2示出了表达BSH的工程化细菌如何影响神经炎症和认知。胆汁酸(BA)是微生物组-肠-脑轴的关键介导物。腔BA去结合会影响饮食诱发的肥胖小鼠的神经炎症和认知表现。
[0035] 图3A-C.A.胆汁盐水解酶(BSH)对牛磺胆酸的作用。BSH使胆汁酸去结合，诸如将牛磺胆酸(TCA)转化为胆酸(CA)。这种作用使胆汁酸难以再吸收，并使它们被肠道微生物组中的其他细菌进一步处理。B.天然大肠杆菌(此处标识为ENB)可以进行基因修饰以表达BSH，如TCA被PBS缓冲液中的细胞在体外去结合成CA所示。C.天然大肠杆菌(左上)可以被工程化以表达GFP(右上)，并且可以进一步被工程化以表达胆汁盐水解酶(下)，其可以将TDCA(可溶性)去结合成DCA(不溶性–白色晕环)。
[0036] 图4A-F.A.用菌株AZ-39的基因工程衍生物对小鼠定殖。在不同饮食条件下(例如，采用正常食物饮食和高脂饮食喂养条件)，单次灌胃(n＝12-16天至100天；n＝3-8天至300+天)后，工程化的原生大肠杆菌保持稳定水平超过一年以上。B.工程化的原生细菌定殖整个肠道，尤其是远端肠道。经过基因工程改造的原生大肠杆菌在整个肠道内定殖，并且大多集中在回肠和盲肠末端(n＝4-6)。C.工程化的原生细菌不会影响小鼠的正常体重增加或饮食诱发的肥胖。在高脂饮食和正常食物饮食条件下(n＝12-16)，用基因工程化的原生大肠杆菌进行定殖不会影响小鼠体重。应当注意的是，先前在免疫受损和无菌小鼠中表达该基因的报道表明，BSH会影响肥胖倾向，但在常规饲养的野生型小鼠中却不会。D-E.图4F的概要图。用表达GFP的重组原生细菌定殖到无菌小鼠中不会影响粪便胆汁酸成分。但是，表达GFP和BSH的重组原生细菌显示出更高水平的去结合的胆汁酸(n＝3)。F.在无菌小鼠中表达BSH去结合胆汁酸的工程化原生大肠杆菌(蓝色：未定殖的小鼠；绿色：用表达GFP的AZ-39定殖的小鼠；红色：用表达GFP和BSH的AZ-39定殖的小鼠)。表达GFP和BSH(红色)的工程化原生细菌显示出更高水平的去结合的胆汁酸，尤其是TCA和TbMCA(n＝3)。其他去结合/结合的胆汁酸没有显著差异。
[0037] 图5A-C.A.工程化的原生细菌不会改变肠道微生物组的组成。添加重组的原生细菌(无论是否包含BSH)在定殖10周后都不会以16S测序和分析可检测的方式改变肠道微生
物组(上图显示，加权的PCoA、未加权的PCoA和Bray-Curtis距离)定殖后10周。然而，在相关分析中，与拟杆菌属有关的某些OTU与表达BSH的大肠杆菌高度相关，这表明即使总体组成不变，肠内细菌之间的关系也会发生变化。B-C.工程化的原生细菌会影响粪便和血清胆汁酸库。粪便(上)和血清(下)胆汁酸相关图。胆汁盐水解酶与原生细菌的加入会引起粪便胆汁酸的细微变化(参见图6)。然而，具有BSH的原生细菌引起血清胆汁酸的重大变化。在这些小鼠中，血清BA显示出结合和去结合的BA之间的反相关性。
物组(上图显示，加权的PCoA、未加权的PCoA和Bray-Curtis距离)定殖后10周。然而，在相关分析中，与拟杆菌属有关的某些OTU与表达BSH的大肠杆菌高度相关，这表明即使总体组成不变，肠内细菌之间的关系也会发生变化。B-C.工程化的原生细菌会影响粪便和血清胆汁酸库。粪便(上)和血清(下)胆汁酸相关图。胆汁盐水解酶与原生细菌的加入会引起粪便胆汁酸的细微变化(参见图6)。然而，具有BSH的原生细菌引起血清胆汁酸的重大变化。在这些小鼠中，血清BA显示出结合和去结合的BA之间的反相关性。
[0038] 图6A-B.A.工程化的原生细菌会影响粪便胆汁酸。受我们的工程化原生细菌影响的粪便胆汁酸的实例。在接受重组以表达BSH的原生细菌的小鼠中，牛磺-β-鼠胆酸(TbMCA；
左)和TCA(右)低得多。在这些小鼠中，TDCA(中)要高得多。DCA是次生胆汁酸，微生物的DCA合成需要首先进行去结合。B.工程化的原生细菌会影响血清胆汁酸。血清胆汁酸比粪便胆汁酸有更大的差异。在接受了表达BSH的工程化细菌的小鼠中，β-鼠胆酸(bMCA)、牛磺-bMCA和ω-鼠胆酸(oMCA)含量降低。
左)和TCA(右)低得多。在这些小鼠中，TDCA(中)要高得多。DCA是次生胆汁酸，微生物的DCA合成需要首先进行去结合。B.工程化的原生细菌会影响血清胆汁酸。血清胆汁酸比粪便胆汁酸有更大的差异。在接受了表达BSH的工程化细菌的小鼠中，β-鼠胆酸(bMCA)、牛磺-bMCA和ω-鼠胆酸(oMCA)含量降低。
[0039] 图7A-D.A.表达BSH的工程化的原生细菌(ENB)会改变整体代谢：表达和不表达BSH的工程化细菌中呼吸交换率(VCO2/VO2；RER)的测量。定殖了表达BSH的工程化原生细菌的小鼠的RER明显低于定殖不表达BSH的工程化原生细菌的小鼠。这表明这些小鼠优先使用更多的脂肪酸而不是碳水化合物来进行新陈代谢。B.工程化的原生细菌可以改变宿主生理。接受表达BSH的原生细菌的小鼠的空腹胰岛素水平正常(左)。然而，他们的餐后胰岛素水平(右)显著低于对照组，提示胰岛素敏感性更高。C.表达BSH的工程原生细菌影响行为。含有表达BSH的工程化原生细菌(红色)的小鼠比没有这种细菌(绿色)或具有无BSH基因的该细菌(蓝色)的小鼠多运动了近50％。D.表达BSH的工程化原生细菌影响认知。在新物体识别测试中，所有正常饮食的小鼠，无论是否被工程化的细菌定殖，都花了更多的时间在新物体上。然而，如先前的研究所示，维持高脂饮食的小鼠无法区分新物体和旧物体，这表明它们的记忆力有问题。然而，已经接受了表达BSH的工程化原生细菌的小鼠似乎对新物体具有正常的兴趣增加，因此可以挽救记忆功能。
[0040] 图8示出了通过施用经工程化以表达BSH的原生细菌影响了宿主生理。接受表达BSH的工程化的原生细菌的小鼠的空腹胰高血糖素水平较低。
[0041] 图9A-B.A.对野生型常规饲养的小鼠的常规饮食中掺入工程化的的原生细菌的口服葡萄糖耐量试验。尽管表达BSH的工程化原生细菌引起的餐后胰岛素降低，但无论细菌是否表达BSH，其血清葡萄糖水平均无差异。B.对ob/ob常规饲养的小鼠的常规饮食中掺入工程化的的原生细菌的口服葡萄糖耐量试验(蓝色：AZ51/BSH-，橙色：AZ52/BSH+)。在这种肥胖症/2型糖尿病动物模型中，工程化的细菌对BSH的表达显著改善了胰岛素敏感性。
[0042] 图10示出了工程化的原生细菌在一次灌胃后无论饮食如何都能在小鼠中定殖。NFD：无脂饮食，VLFD：极低脂饮食，LFD：低脂饮食。
[0043] 图11示出了在灌胃后22周，工程化的原生细菌保留了BSH活性。
[0044] 图12示出了灌胃后X周，GFP和BSH基因表达的保留。仅一株预期具有BSH活性的分离株不具有BSH活性(粗体)。
[0045] 图13示出了工程化原生大肠杆菌的抗生素敏感性。这些菌株不包含与β-内酰胺同源的基因。同时对头孢氨苄的同耐药和对羧苄西林的敏感性表明通过PBP突变产生了特异性抗性。
[0046] 图14示出了来自定殖小鼠的粪便颗粒中的总胆汁酸。与没有BSH基因的情况下(AZ-51；p<0.003)相比，存在BSH基因的情况下(AZ-52)产生的胆汁酸损失明显更大。
[0047] 图15示出了用于转基因掺入的染色体yfgG位点保留在210个完整大肠杆菌基因组的208个中(NCBI GenBank nt数据库)。直线表示完整的插入位点；垂直错位的折线表示该位点的染色体重排。
[0048] 图16示出了定殖6个月后，无论是否存在BSH，细菌的过度生长都与定殖无关。将末端回肠组织快速冷冻、粉末化并提取总DNA。通过定量PCR评估细菌的16S拷贝数和宿主GAPDH拷贝数，并通过宿主GAPDH拷贝数标准化16S丰度。
[0049] 图17示出了无论是否存在BSH，工程化的原生细菌不会显著改变末端回肠微生物组。
[0050] 图18示出了定殖2个月后，工程化的天然大肠杆菌不会改变宿主的产粪。单独饲养定殖的小鼠，每3小时收集粪便，持续48小时。
具体实施方式
[0051] 1.前言
[0052] 对于研究人员，很少有工具可用于在功能上操纵肠道微生物组并更好地了解宿主与微生物的关系。我们已经开发出一种将功能“敲入(knock-in)”肠道微生物组的技术，以研究其对腔生态学、代谢产物和营养素通量的影响，以及最终对常规饲养的野生型(CR-WT)小鼠的生理学的影响(例如，与在无菌环境中饲养的小鼠相对立)。我们可以通过对易于处理的原生细菌(例如，与实验室菌株或声称的共生细菌相对立)进行鉴定和工程化以在腔环境中表达感兴趣的基因来实现此目的。
[0053] 本文所述的方法和组合物通过改造共生生物以提供治疗功能来避免传统益生菌微生物的问题。微生物的共生菌株是生物的储库，按照其本身定义，它们能够稳定且长期或永久地定殖至少一种特定的哺乳动物宿主。目前的益生菌是单一菌株，可在多个宿主中使用，但尚未以广大群体取得巨大成功。
[0054] 对使用已知的益生菌微生物改变生理过程来定殖新宿主提出了挑战。因此，我们寻求开发一种以更高的可靠性定殖于人的表面(例如胃肠道或皮肤)的方法。本方法基于对可靠地进行微生物组移植的技术的发现。简而言之，将从人受试者分离的共生细菌菌株培养并用异源多核苷酸转化以表达异源蛋白以产生治疗效果，然后以工程化形式(例如，自体或同种异体微生物组移植物)向相同或不同的人受试者施用。在本文中，我们证明了通过使用源自宿主的原生细菌作为载体向腔环境引入新的基因和功能，可以实现肠道微生物组的长期定殖和有效的功能性改变。过去不愿使用此方法的原因在于，据认为难以培养和修饰原生细菌。通过使用原生细菌而不是实验室菌株，我们正在使用已经适应宿主腔环境的宿主细胞。这使工程化的原生细菌(ENB)能够在CR-WT宿主中定殖并诱导功能性改变。
[0055] 我们已经能够鉴定、培养和分离出源自CR-WT宿主的易处理的原生细菌，并使用理论上赋予其有益功能的基因对它们进行遗传修饰，然后将ENB重新引入CR-WT宿主。因此，ENB已经适应了腔环境。在我们的初步研究中，我们使用了从小鼠粪便中分离得到的原生大肠杆菌。大肠杆菌的细菌工程改造几乎可以在任何资源很少的实验室中进行。尽管大肠杆菌是常见的原生细菌，但许多研究人员认为，它们不是好的定殖菌(colonizer)，因为采用实验室菌株时非常令人失望。但是，使用本文所述的方法，我们已经成功创建了工程化的细菌宿主细胞，这些宿主细胞经转化以表达异源多核苷酸并且可以将治疗性多肽递送至哺乳动物。该策略解决了单个特定菌株在定殖许多不同宿主中高度可变的问题。我们证明成功地用经工程化的从单只小鼠的粪便中分离出的共生细菌稳定地定殖在小鼠的胃肠道中。
[0056] 在我们对CR-WT小鼠的研究中，我们使用工程化原生细菌(ENB)以敲入胆汁盐水解酶(BSH)，而改变了腔内胆汁酸和血清胆汁酸，胆汁盐水解酶是一种使腔内胆汁酸(BA)去结合，并认为是影响包括新陈代谢的多种宿主的生理过程的细菌酶。除了影响新陈代谢，我们惊讶地发现肠腔中BSH的激活还影响行为和认知。先前的研究表明BA、神经炎症和认知之间存在联系，本文描述的结果与以下结论一致：BA是微生物组-肠-脑轴的介导物。
[0057] 通过将基因(例如，胆汁盐水解酶(BHS))敲入肠道微生物组，我们能够减轻神经炎症。通过改善神经炎症，我们可以治疗许多病理生理问题，包括但不限于肥胖、2型糖尿病、外伤性脑损伤、痴呆、脑卒中和某些脑病。在这里，我们表明，我们可以改善具有由饮食诱导的肥胖所引起的神经炎症的小鼠的认知。
[0058] 1.工程化的原生/共生细菌的制备方法
[0059] 使用异源多核苷酸用于转化治疗上适合的工程化的原生或共生细菌的制备方法很简单。
[0060] 微生物组样品获自患者。微生物组样品可以来自在个体的表面或腔中稳定定殖的任何细菌群。具有稳定定殖细菌群落的微生物群落可以在身体的所有环境暴露部位上发现，其包括皮肤、鼻咽、口腔、呼吸道、胃肠道和/或女性生殖道。因此，在某些实施方式中，通过擦拭、冲洗皮肤、鼻咽腔或口腔(例如脸颊、舌、牙龈或喉)、呼吸道、胃肠道和/或泌尿生殖道或对其取活检来获得微生物组样品。在某些实施方式中，微生物组样品获自粪便样品。在某些实施方式中，微生物组样品获自组织活检(例如，在内窥镜检查、刮擦活检或穿孔活检期间获得)。在某些实施方式中，微生物组样品是从组织表面获得的(例如，通过擦拭或用溶液冲洗)。适当时，样品可以通过多种方式收集，其包括但不限于：体液(例如唾液、粘液、尿液、粪便或呼出物)、表面活检(例如胃肠道的粘膜活检、口腔/咽/鼻孔的活检、或泌尿生殖道活检、皮肤活检)、拭子(例如皮肤、肛门/直肠、颊/嘴或眼)和/或病理标本(例如癌组织、截肢肢体或发炎的器官)培养。微生物组样品包含足够数量的细胞以在体外启动用于分离的一种或多种培养物，例如至少或至少约1、10、100、1000、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014或1×1015个细菌细胞。
[0061] 将微生物组样品匀浆，并将来自匀浆的细菌细胞培养在固体琼脂基板上，以分离细菌细胞，从中培养出基本上同质的天然或共生细菌细胞群，以用异源多核苷酸转化。利用本领域已知的技术，将匀浆的样品在选择性或指示性固体微生物培养基上划线，这取决于待分离和培养的共生或原生细菌的种类。在人类微生物组中发现并可以分离并转化以表达异源多核苷酸的常见细菌属包括，例如，拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。以前被认为是肠道中最普遍和最丰富的细菌种属的拟杆菌属内的物种已被重新分类为五个属：另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属(Rajilic-Stojanovic等，FEMS Microbiol Rev.2014；38：996–1047)。适当时，MacConkey乳糖琼脂或紫红色胆汁右旋糖琼脂可用于分离和培养大肠杆菌细胞。De Man-Rogosa-Sharpe琼脂可用于分离和培养乳酸杆菌属细胞。胆盐七叶苷琼脂(Bile Esculin Agar)可用于分离和培养肠球菌属细胞。Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂可用于分离和培养拟杆菌属细胞。TPY培养基可用于分离和培养双歧杆菌属。BM9或GM17c培养基可用于乳球菌属。描述了通常在人类微生物组中定殖的细菌种类，例如Human
Microbiome Project Consortium，Nature.(2012)6月13日；486(7402):207-14和Lloyd-Price，Genome Med.2016年4月27日；8(1)：51。
Microbiome Project Consortium，Nature.(2012)6月13日；486(7402):207-14和Lloyd-Price，Genome Med.2016年4月27日；8(1)：51。
[0062] 通常在人结肠中发现的并可以被基本上分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括例如，脆弱拟杆菌、黑色素拟杆菌、口腔拟杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、两歧双歧杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌属、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌、破伤风梭菌、败毒梭菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、普氏粪杆菌、消化链球菌属、和/或消化球菌属。
[0063] 通常在人粪便中发现的并且可以基本上被分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括，例如，大肠杆菌、人体普氏菌、腐败另枝菌和/或普通拟杆菌。
[0064] 皮肤部位主要由棒状杆菌属、丙酸杆菌属和/或葡萄球菌属的细菌属定殖，其可分离并转化成表达异源多核苷酸。通常在人皮肤上发现的并且可以基本上分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括，例如，表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、华氏葡萄球菌、化脓性链球菌、缓症链球菌、痤疮丙酸杆菌、棒状杆菌属、约氏不动杆菌和/或绿脓假单胞菌。
[0065] 通常在人口腔中发现的并且可以基本上分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括，例如，链球菌属(例如，缓症链球菌)、嗜血杆菌属、普氏菌属、粘滑罗斯菌和/或马氏棒状杆菌。
[0066] 胃的主要定殖菌并且可以基本上分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括，例如，包括：链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、螺杆菌属和/或消化链球菌属。
[0067] 通常在人类阴道中发现并且可以基本上分离以用异源多核苷酸转化的细菌种类包括，例如，乳杆菌属(例如，包括卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌或格氏乳杆菌)、加德纳菌属和/或普氏菌属。
[0068] 用于共生体的婴儿肠道微生物组(诸如拟杆菌属、副拟杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属和/或普氏粪杆菌)的富集提供了健康微生物组的几个决定因素。可以将此类细菌种类转化为表达异源多核苷酸。
[0069] 将候选菌落在至少第二种固体琼脂基板上再划线，以将其与污染菌株充分分离。这些纯化菌株的分离物可以作为低温储液保存。对纯化的菌株进行测试以确认其属/种身份、不存在致病性毒素以及对临床使用的抗生素易感。例如，可以进行例如核糖体16S DNA序列的全部或部分的PCR和Sanger测序，以确认属/种身份。
[0070] 该方法不选择或选择消除表达致病性毒素的共生或原生细菌菌落。在某些实施方式中，确认细菌细胞不表达任何已知的致病毒素或选择的致病毒素。在某些实施方式中，确认细菌细胞不表达选自下组的一种或多种致病毒素：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
[0071] 该方法进一步选择对临床使用的抗生素表现出敏感性或易感性(例如，缺乏抗性)的共生或原生细菌菌落。在某些实施方式中，确认细菌细胞对选自下组抗生素的一种或多种抗生素剂敏感或易感(例如，缺乏抗性)：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星或罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐或利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B或多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星或吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林或哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素或妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟或头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A或烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南或硫霉素)、和/或四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素或替加环素)。通常，用异源多核苷酸对纯化的原生细菌菌落的转化赋予抗生素对一种或多种用于选择经转化细菌细胞的抗生素剂的抗生素抗性，例如，对卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶的抗性。
[0072] 用编码与细菌和/或预期宿主异源的一种或多种蛋白质的一种或多种多核苷酸转化被证实不表达已知病理毒素且对临床相关抗生素敏感的分离菌落。在某些实施方式中，异源蛋白被用于检测，例如，荧光蛋白。在某些实施方式中，异源蛋白是治疗性多肽，如下文进一步详细描述。
[0073] 可以使用本领域已知的技术来转化经分离的且基本上同质的原生的/共生细菌菌落。这样的技术例如如以下描述：Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；第4版(2012)。用于指导感兴趣的细菌种类的选择和鉴定的临床微生物学鉴别手册包括，例如，Medical Microbiology，第8版，Murray，Rosenthal和Pfaller，Elsevier，2015；和Medical Microbiology：A Guide to Microbial Infections：Pathogenesis，Immunity，Laboratory Investigation and
Control，第19版，Barer，Irving，Swann和Perera，Elsevier，2018。
Control，第19版，Barer，Irving，Swann和Perera，Elsevier，2018。
[0074] 对分离的原生/共生细菌群体进行转化，例如进行基因修饰，以表达一种或多种感兴趣的异源多肽，例如，表1中所列的一种或多种治疗性多肽和/或可检测的蛋白，例如荧光蛋白。
[0075] 可以将编码异源多肽的多核苷酸引入载体，优选表达载体中。“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。表达载体包括一个或多个调控序列，并指导与其可操作连接的基因的表达。“可操作地连接”是指感兴趣的核苷酸序列与调节序列连接，从而允许核苷酸序列的表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中表达)。术语“调控序列”旨在包括可控制的转录启动子、操纵子、增强子、转录终止子和其他表达控制元件，例如翻译控制序列(例如，Shine-Dalgarno共有序列、起始和终止密码子)。这些调节序列将例如根据所使用的宿主细胞而不同。
[0076] 编码异源多肽的多核苷酸可以是密码子偏好性(codon biased)的以改善在原生/共生细菌宿主细胞中的表达。分离并转化的共生或原生细菌宿主细胞的属和种的优选密码子使用是已知的，并在可用的密码子使用数据库中进行了描述，例如kazusa.or.jp/
codon/。
codon/。
[0077] 载体可以在宿主细胞中自主复制(附加型载体(episomal vector))，或者可以整合到宿主细胞的基因组中，并与宿主基因组一起复制(非附加型(non-episomal)哺乳动物载体)。整合载体通常包含与细菌染色体同源的至少一个序列，该序列允许在载体中的同源DNA与细菌染色体之间发生重组。整合载体还可以包含噬菌体或转座子序列。附加型载体或质粒是环状双链DNA环，可以在其中连接其他DNA片段。当使用重组DNA技术时，能够在宿主中稳定维持的质粒通常是表达载体的优选形式。使用的示例性噬菌体重组系统描述于例如Nafissi等，Appl Microbiol Biotechnol.2014年4月；98(7)：2841-51。使用的另一种噬菌体递送系统描述于例如美国专利公开号2016/0367701。共生生长可能对质粒的维持产生有害影响。根据需要，可以使用本领域已知的方法来促使或促进质粒在转化的共生/原生细菌宿主细胞中的维持或保留。此类质粒保留或维持策略包括但不限于例如，分配系统(例如，parABS；参见，例如，Yamaichi等，Proc Natl Acad Sci U S A.(2000)97(26)：14656-61；
Youngren等，J Bacteriol.2000年7月；182(14)：3924-8；Dubarry等，J Bacteriol.2006年2月；188(4)：1489-96；和Hanai等，J.Biol.Chem.(1996)271：17469-17475)或毒素-抗毒素模块或系统(例如，ccdAB，hok-sok；参见，例如，Fernández-García等，Toxins(Basel).(2016)
7月20日；8(7).pii：E227)；Fang等，Appl.Environ.Microbiol.(2008)74(10)：3216-3228；
Lobato-Márquez等，Front Mol Biosci.2016年10月17日；3：66；Zielenkiewicz等，
J.Bacteriol.(2005)187(17)：6094-6105；Leplae等，Nucleic Acids Research，(2011)39(13)5513–5525和Grady等，Molecular Microbiology(2003)47(5)：1419-1432)。
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Lobato-Márquez等，Front Mol Biosci.2016年10月17日；3：66；Zielenkiewicz等，
J.Bacteriol.(2005)187(17)：6094-6105；Leplae等，Nucleic Acids Research，(2011)39(13)5513–5525和Grady等，Molecular Microbiology(2003)47(5)：1419-1432)。
[0078] 调节序列包括那些仅在某些环境条件下指导核苷酸序列组成型表达的序列以及那些指导核苷酸序列的诱导型表达的序列。细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶并启动编码序列(例如，结构基因)的下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有转录起始区，其通常位于编码序列的5'端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可以具有称为操纵子的第二结构域，其可以与RNA合成开始处的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵子允许负调控的(诱导型)转录，因为基因阻遏蛋白可以结合操纵子从而抑制特定基因的转录。组成型表达可以在没有负调控元件(诸如操纵子)的情况下发生。另外，可以通过基因激活蛋白结合序列来实现正调控，如果存在的话，该基因激活蛋白结合序列通常接近RNA聚合酶结合序列(5')。用于在转化的原生/共生细菌细胞中表达异源多核苷酸的说明性调节子/启动子系统包括但不限于，例如，XylS/Pm(野生型)、XylS/Pm ML1-17(Pm变体)、LacI/PT7lac、LacI/Ptrc和/或AraC/PBAD。参见，Balzar等，Microbial Cell Factories2013，12：26。
[0079] 基因激活蛋白的一个实例是分解代谢物激活蛋白(CAP)，其有助于在大肠杆菌中启动lac操纵子的转录(Raibaud等(1984)Annu.Rev.Genet.18：173)。因此，调节表达可以是阳性或阴性，从而增强或减少转录。正调控元件和负调控元件的其他实例是本领域众所周知的。可以包括在蛋白质表达系统中的各种启动子包括但不限于T7/LacO杂合启动子、trp启动子、T7启动子、lac启动子、p6启动子和噬菌体λ启动子。任何适合的启动子均可用于实施本发明，包括原生启动子或异源启动子。异源启动子可以是组成型活性的或可诱导的。异源启动子的非限制性实例在Kullen和Klaenhammer的美国专利6,242,194号中给出。
[0080] “组成型启动子”是指能够促进编码序列或基因在其控制下和/或与其可操作连接的连续转录的启动子。使用的示例性组成型启动子包括但不限于，例如，BBa_J23100，组成型大肠杆菌σS启动子(例如，osmY启动子(国际遗传工程机器(iGEM)注册标准生物学部件名称BBa_J45992；BBa_J45993))，组成型大肠杆菌σ32启动子(例如，htpG热休克启动子(BBa_J45504))，组成型大肠杆菌σ70启动子(例如，lacq启动子(BBa_J54200；BBa_J56015)，大肠杆菌CreABCD磷酸盐感应操纵子启动子(BBa_J64951)，GlnRS启动子(BBa_K088007)，lacZ启动子(BBa_K119000；BBa_K119001)；M13K07基因I启动子(BBa_M13101)；M13K07基因II启动子(BBa_M13102)，M13K07基因III启动子(BBa_M13103)，M13K07基因IV启动子(BBa_M13104)，M13K07基因V启动子(BBa_M13105)，M13K07基因VI启动子(BBa_M13106)，M13K07基因VIII启动子(BBa_M13108)，M13110(BBa_M13110))，组成型枯草芽孢杆菌σA启动子(例如，启动子veg(BBa_K143013)，启动子43(BBa_K143013)，PliaG(BBa_K823000)，PlepA(BBa_K823002)，Pveg(BBa_K823003))，组成型枯草芽孢杆菌σB启动子(例如，启动子ctc(BBa_K143010)，启动子gsiB(BBa_K143011))，沙门氏菌启动子(例如，来自沙门氏菌的Pspv2(BBa_K112706)，来自沙门氏菌的Pspv(BBa_K112707))，噬菌体T7启动子(例如，T7启动子(BBa_I712074；BBa_I719005；BBa_J34814；BBa_J64997；BBa_K113010；BBa_K113011；BBa_K113012；BBa_R0085；BBa_R0180；BBa_R0181；BBa_R0182；BBa_R0183；BBa_Z0251；BBa_Z0252；BBa_Z0253))，和/或噬菌体SP6启动子(例如，SP6启动子(BBa_J64998))。
[0081] 使用的诱导型启动子的实例包括但不限于，FNR启动子、ParaC启动子、ParaBAD启动子、丙酸盐启动子和/或PTetR启动子。
[0082] 为了维持哺乳动物对象长期或永久定殖的能力(例如，成功地重新引入哺乳动物微生物组的能力)，转化成表达一种或多种异源多肽的原生/共生细菌群体不适合实验室或体外培养环境。将ENB在实验室环境中体外培养尽可能少的分裂，在某些实施方式中，在对接受受试者施用之前，将ENB在供体受试者之外的实验室环境中体外培养30天以下，例如
25、20、15天、10天以下。在某些实施方式中，ENB在从供体受试者收集和施用于接受受试者之间具有约14天以下，例如13、12、11、10、9、8、7天以下的总体体外生长时间。此类体外生长时间或培养时间的计算通常不包括细菌细胞的存储时间(例如，冷冻保存或冻干的时间)，并且包括转化或引入一种或多种异源多核苷酸的时间。
25、20、15天、10天以下。在某些实施方式中，ENB在从供体受试者收集和施用于接受受试者之间具有约14天以下，例如13、12、11、10、9、8、7天以下的总体体外生长时间。此类体外生长时间或培养时间的计算通常不包括细菌细胞的存储时间(例如，冷冻保存或冻干的时间)，并且包括转化或引入一种或多种异源多核苷酸的时间。
[0083] 在某些实施方式中，原生/共生宿主细胞：(i)能够代谢一种或多种选自下组的碳水化合物：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；(ii)利用糖酵解和糖异生底物；(iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子发生突变)；(iv)能够产生5-磷酸核糖；(v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的特定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；(vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；(vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；(viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；(ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；(x)表达rnf样氧化还原酶复合物；(xi)分解色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，不具有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛，不表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素，和/或没有活性
clbA基因。描述了有助于共生细菌稳定定殖在哺乳动物上或哺乳动物中的基因型和表型，例如，在Lozupone等，Genome Res(2012)22：1974-1984；Leatham等，Infect.Immun.(2005)
73(12)：8039-8049；Miranda等，Infect.Immun.(2004)72(3)：1666-1676；Leatham等，Infect.Immun.(2009)77(7)：2876-2886和Goodman等，Cell Host Microbe.2009Sep 17；6(3)：279–289。其他人发现实验室适应的大肠杆菌菌株，例如Nissle 1917，会诱导DNA双链断裂。参见，例如，Nougayrède等，Science(2006)313(5788)：848-851；和Olier等，Gut Microbes.(2012)3(6)：501–509。转化为表达一种或多种异源多肽的原生/共生细菌群可以冷冻保存或冻干以长期保存。
clbA基因。描述了有助于共生细菌稳定定殖在哺乳动物上或哺乳动物中的基因型和表型，例如，在Lozupone等，Genome Res(2012)22：1974-1984；Leatham等，Infect.Immun.(2005)
73(12)：8039-8049；Miranda等，Infect.Immun.(2004)72(3)：1666-1676；Leatham等，Infect.Immun.(2009)77(7)：2876-2886和Goodman等，Cell Host Microbe.2009Sep 17；6(3)：279–289。其他人发现实验室适应的大肠杆菌菌株，例如Nissle 1917，会诱导DNA双链断裂。参见，例如，Nougayrède等，Science(2006)313(5788)：848-851；和Olier等，Gut Microbes.(2012)3(6)：501–509。转化为表达一种或多种异源多肽的原生/共生细菌群可以冷冻保存或冻干以长期保存。
[0084] 2.治疗、改善和/或预防针对的病症
[0085] 取决于ENB表达的异源多核苷酸和给药途径，本文所述的ENB可用于治疗或预防多种疾病，如表1所示。
[0086] 例如，在某些实施方式中，可以将转化以表达胆汁盐水解酶(例如来自乳杆菌或双歧杆菌的)的原生/共生细菌细胞群体例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由肥胖/2型糖尿病、慢性肾病、认知能力下降/缺乏症(例如，由于外伤性脑损伤、痴呆、中风、肝性脑病、婴儿缺氧性脑损伤所致)、高胆固醇血症、男性不育、女性不育、艰难梭菌感染引起的或与之相关的一种或多种症状。在某些实施方式中，异源多核苷酸编码与以下具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的胆汁盐水解酶：GenBank：ACL98194.1(唾液乳杆菌BSH)；NCBI参考序列：YP_193782.1(嗜酸乳杆菌bshA)；NCBI参考序列：YP_193954.1(嗜酸乳杆菌bshB)；或者基因ID：
31838777(嗜热双歧杆菌RBL67结合的胆汁盐水解酶D805_RS01800)。
31838777(嗜热双歧杆菌RBL67结合的胆汁盐水解酶D805_RS01800)。
[0087] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)磺基转移酶家族2A成员1(SULT2A1)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由肥胖/2型糖尿病、高胆固醇血症、非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)和痴呆/认知功能下降引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0088] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)NAPE水解性磷脂酶D(NAPEPLD)、FGF1、FGF15、FGF19和/或胰高血糖素(GLP-1)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由肥胖/2型糖尿病引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0089] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)IL-10、TGFβ、IL-27二聚体和/或抗TNFα抗体的一个或多个原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由自身免疫病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病、1型或自身免疫性糖尿病)引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0090] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)三叶因子(例如，TFF1、TFF2和/或TFF3)或肽酶抑制剂3(PI3)或弹性蛋白酶抑制剂(Serpina1c)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由炎性疾病(例如，口腔粘膜炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病)引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0091] 在某些实施方式中，可以将转化以表达创伤弧菌鞭毛蛋白B的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由癌症(例如，胃肠道癌，例如，口腔癌、食道癌、胃癌、结肠癌或直肠癌)引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0092] 在某些实施方式中，可以将转化以表达椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由HIV引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0093] 在某些实施方式中，可以将转化以表达伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由绿脓假单胞菌感染引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0094] 在某些实施方式中，可以将转化以表达小菌素J25(MccJ25)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由肠道沙门氏菌感染引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0095] 在某些实施方式中，可以将转化以表达胆酰甘氨酸水解酶和/或胆酸7α-脱羟基酶的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由艰难梭菌感染引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0096] 在某些实施方式中，可以将转化以表达阿克曼氏菌Amuc_1100*的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD)和/或老化/衰老引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0097] 在某些实施方式中，可以将转化以表达胆酸-CoA：氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由营养不良引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0098] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)乳糖酶的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由乳糖不耐症引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0099] 在某些实施方式中，可以将转化以表达哺乳动物(例如，人)苯丙氨酸羟化酶的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由酮尿症引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0100] 在某些实施方式中，可以将转化以表达创伤弧菌鞭毛蛋白B的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由酒精不耐受/中毒引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0101] 在某些实施方式中，可以将转化以表达黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由乳糜泻引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0102] 在某些实施方式中，可以将转化以表达7α-羟类固醇脱氢酶(hdhA)和/或7β-羟类固醇脱氢酶(7β-HSDH；EC 1.1.1.201)的原生/共生细菌细胞群例如通过口服和/或直肠施用至胃肠道，以减轻、改善、减少、抑制、逆转和/或预防由外伤性脑损伤、痴呆/认知能力下降、肝性脑病、婴儿缺氧性脑损伤引起的或与之相关的一种或多种症状。
[0103] 接受这种疗法的哺乳动物可能表现出症状或无症状。哺乳动物可能具有家族病史或确定的疾病状况遗传风险。哺乳动物可以是成年、少年、儿童或婴儿。
[0104] 递送至胃肠道时，无论治疗多肽的存在与否，工程化的原生细菌(ENB)均不会显著改变胃肠道微生物组，例如末端回肠微生物组。这可以通过分析例如微生物组的核糖体16S DNA的测序来证实，例如在施用ENB之前和之后。因此，在某些实施方式中，将受试者选择或鉴定为需要此类疗法的一类受试者中的一个，并且可以通过临床或诊断评估来进行这种选择或鉴定。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109] 3.制剂和施用
[0110] 可以将转化成表达异源多核苷酸(ENB)的原生/共生细菌配制成细菌组合物，以施用于需要其的人和其他哺乳动物受试者。通常，细菌组合物与另外的活性和/或非活性物质组合以产生最终产物，其可以是单剂量单位或多剂量形式。在某些实施方式中，细菌组合物包含一种或多种ENB群体，如本文所述。某些实施方式中，细菌组合物包含一种或多种ENB群体和一种或多种益生元。
[0111] 所述组合物可包括不同类型的载剂，这取决于它是以固体还是液体形式进行施用。ENB组合物可以经口服、阴道内、直肠内、局部(例如，包括进入眼睛或结膜)、肿瘤内、通过囊泡滴注(例如，注入膀胱)、病灶内、鼻内、局部或颊部施用。在各种实施方式中，组合物可以例如通过食物、饮料、胶囊、灌胃、灌肠、栓剂、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的定点灌注、经导管、剂灌洗、以脂质组合物(例如，脂质体)、作为气雾剂或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或者上述方式的任意组合进行递送(参见，例如，Lloyd V.Allen，Jr.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，2012，Pharmaceutical Press，通过引用以其整体明确并入本文)。
[0112] 在某些实施方式中，组合物包含至少一种益生元碳水化合物。“碳水化合物”是指糖或糖的聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可以互换使用。大多数碳水化合物是具有多个羟基的醛或酮，通常在分子的每个碳原子上都有一个。碳水化合物通常具有分子式CnH2nOn。碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是单糖，诸如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个连接的单糖。示例性的二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括三个至六个单糖单元(例如，棉子糖或水苏糖)，而多糖包括六个以上单糖单元。示例性的多糖包括淀粉、糖原和/或纤维素。碳水化合物可包含修饰的糖单元，诸如2'-脱氧核糖(其中的羟基被除去)、2'-氟核糖(其中的羟基被氟取代)或N-乙酰氨基葡糖，一种含氮形式的葡萄糖(例如2’-氟核糖、脱氧核糖和/或己糖)。碳水化合物可以以许多不同的形式存在，例如，构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体、端基异构体和/或同分异构体。
[0113] 在某些实施方式中，组合物包含至少一种脂质。如本文所用，“脂质”包括脂肪、油、甘油三酯、胆固醇、磷脂，包括游离脂肪酸在内的任何形式的脂肪酸。脂肪、油和脂肪酸可以是饱和的、不饱和的(顺式或反式)或部分不饱和的(顺式或反式)。在某些实施方式中，脂质包含选自以下的至少一种脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、十七烷酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(EPA)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(DHA)和/或二十四烷酸(24:0)。
在其他实施方式中，组合物包含至少一种改性的脂质，例如已经通过烹饪改性的脂质。
在其他实施方式中，组合物包含至少一种改性的脂质，例如已经通过烹饪改性的脂质。
[0114] 在某些实施方式中，组合物包含至少一种补充矿物质或矿物质来源。矿物的实例包括但不限于：氯化物、钠、钙、铁、铬、铜、碘、锌、镁、锰、钼、磷、钾和/或硒。任何前述矿物质的适合形式包括可溶性矿物质盐、微溶性矿物质盐、不溶性矿物质盐、螯合矿物质、矿物质络合物、非反应性矿物质(诸如羰基矿物质)和/或还原矿物质以及它们的组合。
[0115] 在某些实施方式中，组合物包含至少一种补充维生素和/或抗氧化剂。至少一种维生素可以是脂溶性或水溶性维生素。适合的维生素包括但不限于维生素C、维生素A、维生素E、维生素B12、维生素K、核黄素、烟酸、维生素D、维生素B6、叶酸、吡哆醇、硫胺素、泛酸和/或生物素。前述任何一种的适合形式是维生素的盐、维生素的衍生物、具有与维生素相同或相似活性的化合物以及维生素的代谢物。
[0119] 在制剂包含厌氧细菌菌株的情况下，可以选择药物制剂和赋形剂以防止细菌菌株暴露于氧气。
[0120] 在其他实施方式中，组合物包含粘合剂作为赋形剂。适合的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基氧杂唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖或寡糖及它们的组合。
[0121] 在另一实施方式中，组合物包含润滑剂作为赋形剂。适合的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、硬脂酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和/或轻质矿物油。
[0122] 在其他实施方式中，组合物包含分散增强剂作为赋形剂。适合的分散剂的非限制性实例包括淀粉、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化的木质纤维素、淀粉羟乙酸钠、异晶硅酸盐和/或作为高HLB乳化剂表面活性剂的微晶纤维素。
[0123] 在某些实施方式中，组合物包含崩解剂作为赋形剂。在其他实施方式中，崩解剂是非泡腾崩解剂。适合的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉(诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和/或改性淀粉)、甜味剂、粘土(诸如膨润土)、微晶纤维素、藻酸盐、淀粉羟乙酸钠或树胶(诸如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和/或黄蓍胶)。在另一个实施方式中，崩解剂是泡腾崩解剂。适合的泡腾崩解剂的非限制性实例包括与柠檬酸结合的碳酸氢钠和/或与酒石酸结合的碳酸氢钠。
[0124] 在另一实施方式中，赋形剂包含调味剂。调味剂可以选自合成调味油和/或调味芳香剂；天然油；植物、树叶、花朵和/或水果的提取物；及其组合。在某些实施方式中，调味剂选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树；香草；柑橘油，诸如柠檬油、橙油、葡萄和/或葡萄柚油；和/或水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和/或杏。
[0125] 在其他实施方式中，赋形剂包含甜味剂。适合的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖和/或它们的混合物(当不用作载体时)；糖精和/或其各种盐，诸如钠盐；二肽甜味剂，诸如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物，甘草甜素；甜叶菊(甜菊糖)；蔗糖的氯代衍生物，诸如三氯蔗糖；和/或糖醇，诸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇(sylitol)等。还考虑了氢化淀粉水解物和合成甜味剂3,6-二氢-6-甲基-1,2,3-氧杂噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特别是其钾盐(乙酰磺胺酸钾)和/或钠盐和钙盐。
[0126] 在某些实施方式中，组合物包含着色剂。适合的着色剂的非限制性实例包括食品、药物和化妆品色素(FD&C)、药物和化妆品色素(D&C)和/或外部药物和化妆品色素(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
[0127] 在各种实施方式中，制剂中的赋形剂或赋形剂组合的重量分数通常为组合物总重量的约或在99％以下(但不是零)，诸如约或在95％以下(但不是零)、约或在90％以下(但不是零)、约或在85％以下(但不是零)、约或在80％以下(但不是零)、约或在75％以下(但不是零)、约或在70％以下(但不是零)、约或在65％以下(但不是零)、约或在60％以下(但不是零)、约或在55％以下(但不是零)、约或在50％以下(但不是零)、约或在45％以下(但不是零)、约或在40％以下(但不是零)、约或在35％以下(但不是零)、约或在30％以下(但不是零)、约或在25％以下(但不是零)、约或在20％以下(但不是零)、约或在15％以下(但不是零)、约或在10％以下(但不是零)、约或在5％以下(但不是零)、约或在2％以下(但不是零)或约或在1％以下(但不是零)。
[0128] 用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、囊片、丸剂、锭剂、含片、粉末剂和/或颗粒剂。胶囊通常包括包含细菌组合物的芯材料和包封该芯材料的壳壁。在某些实施方式中，芯材料包括固体、液体和/或乳液中的至少一种。在其他实施方式中，壳壁材料包括软明胶、硬明胶和/或聚合物中的至少一种。适合的聚合物包括但不限于：纤维素聚合物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和/或共聚物，诸如由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸铵、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成的那些(例如，以商品名“Eudragit”出售的那些共聚物)；乙烯基聚合物和/或共聚物，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物和/或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；和/或虫胶(纯紫胶)。在其他实施方式中，至少一种聚合物用作掩味剂。
[0129] 片剂、丸剂等可以是压缩的、多次压缩的、多层的和/或包衣的。包衣可以是单层或多层。在一个实施方式中，包衣材料包含提取自植物、真菌和/或微生物中的至少一种的糖、多糖和/或糖蛋白中的至少一种。非限制性实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、纤维素、半纤维素、葡聚糖、麦芽糊精、环糊精、菊粉、果胶、甘露聚糖、阿拉伯胶、刺槐豆胶、牧豆树胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、印度树胶、黄蓍胶、funori、卡拉胶、琼脂、藻酸盐、壳聚糖或结冷胶。在某些实施方式中，包衣材料包含蛋白质。在另一实施方式中，包衣材料包括脂肪和油中的至少一种。在其他实施方式中，脂肪和油中的至少一种是高温熔融的。在另一实施方式中，脂肪和油中的至少一种被氢化或部分氢化。在一个实施方式中，脂肪和油中的至少一种源自植物。在其他实施方式中，脂肪和油中的至少一种包括甘油酯、游离脂肪酸和/或脂肪酸酯中的至少一种。在某些实施方式中，包衣材料包含至少一种食用蜡。可食用蜡可以源自动物、昆虫或植物。非限制性实例包括蜂蜡、羊毛脂、杨梅蜡、巴西棕榈蜡和/或米糠蜡。片剂和丸剂还可以用肠溶衣制备。
[0130] 作为另一种选择，可以将体现本文公开的细菌组合物的粉末或颗粒掺入食品中。在某些实施方式中，食品是用于口服施用的饮料。适合的饮料的非限制性实例包括果汁、果汁饮料、人工调味饮料、人工甜味饮料、碳酸饮料、运动饮料、液体日用产品、奶昔、酒精饮料、咖啡因饮料或婴儿配方奶粉。其他适合口服施用的产品包括水溶液和非水溶液、乳液、悬浮液和/或由非泡腾颗粒复溶的溶液和/或悬浮液，其中至少包含一种或多种适合的溶
剂、防腐剂、乳化剂、助悬剂、稀释剂、甜味剂、着色剂和/或调味剂。
剂、防腐剂、乳化剂、助悬剂、稀释剂、甜味剂、着色剂和/或调味剂。
[0131] 在某些实施方式中，食品可以是固体食品。固体食品的合适实例包括但不限于食物棒、点心棒、饼干、布朗尼蛋糕、松饼、薄脆饼干、冰淇淋或冰淇淋棒、酸奶或冷冻酸奶棒。
[0132] 在其他实施方式中，将本文公开的组合物掺入治疗性食物中。在某些实施方式中，治疗性食物是即食食物，可选地，其包含某些或全部必要的大量营养素和微量营养素。在另一实施方式中，将本文公开的组合物掺入补充食品中，所述补充食品被设计成可与现有膳食混合。在一个实施方式中，补充食品或营养保健食品包含某些或全部必要的大量营养素和微量营养素。在另一实施方式中，将本文公开的细菌组合物与现有食品混合或添加到现有食品中以强化食品的蛋白质营养。实例包括主食(谷物、盐、糖、食用油或人造黄油)、饮料(咖啡、茶、苏打水、水、啤酒、烈酒或运动饮料)、零食或甜食和其他食品。
[0133] 在一实施方式中，将制剂装入明胶胶囊中用于口服施用。合适的胶囊的实例是250mg明胶胶囊，其中包含10mg(最多100mg)冻干粉(例如108至1011个细菌细胞)、160mg微晶纤维素、77.5mg明胶和2.5mg硬脂酸镁。在另一个实施方式中，可以使用105至1012个细菌细
5 7 6 7 8 10
胞，例如10至10、10至10或10 至10 个细菌细胞，并且如果需要的话可以对赋形剂随之
进行调整。在另一个实施方式中，可以使用肠溶衣胶囊或片剂或者具有缓冲性或保护性组合物。
5 7 6 7 8 10
胞，例如10至10、10至10或10 至10 个细菌细胞，并且如果需要的话可以对赋形剂随之
进行调整。在另一个实施方式中，可以使用肠溶衣胶囊或片剂或者具有缓冲性或保护性组合物。
[0134] 通常对哺乳动物受试者，通常将配制具有或不具有一种或多种益生元的细菌组合物用于口服或胃内施用。在特定的实施方式中，将组合物配制成用于口服施用的固体、半固体、凝胶或液体形式，诸如丸剂、片剂、胶囊或锭剂形式。在某些实施方式中，尽管孢子通常对胃和小肠有抵抗力，但是这种制剂包含肠溶衣或由肠溶衣包被以保护细菌通过胃和小肠。在其他实施方式中，可以将具有或不具有一种或多种益生元的细菌组合物与发芽剂
(germinant)一起配制以增强植入或功效。在其他实施方式中，细菌组合物可以与益生元物质共同配制或共同施用，以增强植入或功效。在某些实施方式中，细菌组合物可以与益生元物质共同配制或共同施用，以增强植入或功效。
(germinant)一起配制以增强植入或功效。在其他实施方式中，细菌组合物可以与益生元物质共同配制或共同施用，以增强植入或功效。在某些实施方式中，细菌组合物可以与益生元物质共同配制或共同施用，以增强植入或功效。
[0135] 可以将具有或不具有一种或多种益生元的细菌组合物配制成在给定的哺乳动物受试者中单次施用或多次施用有效。例如，单次施用在哺乳动物受试者中基本上有效地减少或增加了目的疾病病症的监测症状或生物标志物，例如，在施用组合物的哺乳动物受试者中，胰岛素增加、代谢增加、认知能力增加、炎症和/或自身免疫反应减少。基本上有效是指在施用组合物后，在受试者中存在的所监测的症状或生物标志物减少或增加至少10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。
[0136] 在某些实施方式中，配制组合物，使得单次口服剂量包含细菌实体和/或真菌实体的至少或至少约1×104个菌落形成单位，并且单次口服剂量通常将包含约或等于1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个细菌实体的CFU。如果已知，例如，给定菌株或所有菌株的聚集的细胞浓度为4 5 6 7 8 9 10
每克组合物或每剂给药剂量1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×
1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个活细菌实体(例如，CFU)。
每克组合物或每剂给药剂量1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×
1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015或大于1×1015个活细菌实体(例如，CFU)。
[0137] 在某些制剂中，以质量计，组合物包含至少或至少约0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的细菌细胞。在某些制剂中，施用剂量以质量计不超过200毫克、300毫克、400毫克、500毫克、600毫克、700毫克、800毫克、900毫克或1克、1.1克、1.2克、1.3克、1.4克、1.5克、1.6克、1.7克、1.8克或1.9克。
[0138] 4.试剂盒
[0139] 如本文所述，进一步提供包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器包含一种或多种分离的工程化原生细菌(ENB)群或者一种或多种组合物，所述组合物包含一种或多种分离的工程化原生细菌群。在各种实施方式中，容器可包含多个单位部分或剂量的组合物，所述组合物包含经转化以表达相同的一个或多个异源多核苷酸的ENB群。在各种实施方式中，容器可包含多个单位部分或剂量的组合物，所述组合物包含经转化为表达不同的一种或多种异源多核苷酸的ENB群。在各种实施方式中，容器容纳可食用组合物，例如食品、饮料或胶囊。在各种实施方式中，容器包含单位体积的缓冲溶液或悬浮液，其包含ENB群，例如经转化以表达相同的一个或多个异源多核苷酸的ENB群。在各种实施方式中，容器包含单位剂量的冻干ENB，例如，以及用于重建的缓冲溶液。
[0140] 实施例
[0141] 提供以下实施例以提供示例性，但不限制要求保护的发明。
[0142] 实施例1.工程化的共生细菌制备的示例性方法
[0143] 样品收集。对于人类患者，在内窥镜检查期间进行十二指肠、回肠和结肠的粘膜活检，并在室温下悬浮在15mL锥形管中的1.8mL 1×PBS中。在8小时内，将样品转移到无菌的2mL螺旋顶微量离心管中，并加入无菌的1.5mm直径镀铬钢珠。
[0144] 对于小鼠，通过将小鼠置于无菌的1L聚丙烯杯中收集粪便，直到它们排泄2至5个完整的小球。将小鼠放回他们的笼子中，并用无菌镊子收集小球，并将其置于无菌的预先称重的2mL螺旋顶微量离心管中。通过二氧化碳和颈椎脱位安乐死后收集组织样本，并将其放入预先称重的无菌2mL螺旋顶微量离心管中。对于组织和粪便，后续处理相同。在2小时内，将试管重新称重，并向每个试管中加入1mL无菌去离子水，然后加入无菌的1.5mm直径的铬珠。
[0145] 样品处理。将这些样品用BioSpec Bead Beater Mini 24以3800RPM均质1分钟，在冰上冷却约1分钟，再以3800RPM均质1分钟，再在冰上冷却约1分钟。通过将稀土磁铁向上拖动到试管侧面以除去珠，可以除去铬钢珠。
[0146] 对于人类组织样品，所得匀浆以14,000RPM的速度在Eppendorf 5430R离心机中放置1分钟，以沉淀细胞和组织。将1.5mL所得的上清液转移至新鲜的干净的螺旋顶微量离心管中并在室温下保存。通过将微量离心管涡旋30-60秒，将沉淀重悬在剩余的上清液中。
[0147] 对于小鼠样品，随后将均质的样品直接使用。
[0148] 菌株分离。对于每个所得的均质样品，将200μL分配到装有25mL硬化的选择性琼脂培养基的10cm一次性培养皿中，并使用10-50个直径1mm无菌玻璃珠分散，直到水蒸发或被培养基吸收。随后将样品稀释10倍，然后将100μL稀释的样品铺板到同一板上。进行这样的稀释铺板直至稀释1000倍。
[0149] 为了分离大肠杆菌菌株，选择性琼脂培养基是MacConkey Lactose Agar(“MacConkey”)或Eosin-Methylene Blue Lactose Agar(“EMB”)。为了分离乳杆菌菌株，选择性琼脂培养基是De Man-Rogosa-Sharpe Agar(“MRS”)。
[0150] 为了分离大肠杆菌，将所得的琼脂平板在湿润的室内空气(即有氧)环境中于37℃温育。为了分离乳杆菌属种类，将得到的琼脂平板在装有AnaeroPack(Mitisubishi Gas Chemical America)的密封罐中于37℃温育。当大约12-24小时后可见菌落(及其培养基特异表型，如MacConkey琼脂上的晕环中)时，挑出候选菌落并手动划线，以在与原始平板相同的琼脂培养基上进行分离。在与原始平板相同的条件下温育这些琼脂平板后，挑出由至少3mm无生长区分离的菌落，并在装有1mL液体生长培养基的无菌16mm x 160mm玻璃培养管中生长。对于大肠杆菌，液体培养基是含有0.2％w/v葡萄糖和5g/L NaCl的Lysogen Broth。对于乳酸杆菌菌株，液体培养基为De Man-Rogosa-Sharpe培养基，并用橡胶塞密封试管。将培养物在37℃的摇床中振荡培养直至浑浊，然后将0.5mL培养物转移到装有甘油的螺杆式冰冻小瓶中(乳酸杆菌0.05mL，大肠杆菌0.1mL)，通过研磨混合，并保存在-80℃。
[0151] 菌株识别。将剩余液体培养物中的细胞转移至无菌的1.7mL微量离心管中，并以14,000RPM离心1分钟进行收集。吸出上清液，弃去，将细胞沉淀物重悬于50μL无菌去离子水中。
[0152] 使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)，使用对V3-V4区具有特异性的引物，通过PCR扩增核糖体16S DNA。从浓缩的细胞浆液开始，以10倍的稀释度将水悬浮细胞直接用作模板材料。总反应体积为25μL。循环后，通过在1％w/v 0.5x TAE琼脂糖凝胶上用SYBR Safe DNA染色(Invitrogen)进行洗脱，分析5μL的每个反应。鉴定出显示没有明显引物二聚体的约450bp产物，或非特异性产物带的反应，并使用硅胶旋转柱试剂盒
(Invitrogen或New England Biolabs)纯化剩余的20μL PCR溶液。通过紫外-可见分光光度法对所得的DNA进行定量，并由服务提供商(Eton)通过Sanger双脱氧测序进行测序。
(Invitrogen或New England Biolabs)纯化剩余的20μL PCR溶液。通过紫外-可见分光光度法对所得的DNA进行定量，并由服务提供商(Eton)通过Sanger双脱氧测序进行测序。
[0153] 收到测序结果后，手动检查色谱图是否存在强的分离良好的荧光峰。使用BLAST编译来自这些色谱图的DNA碱基检出物，并将其与NCBI非冗余(“nr”)数据库比对。通过具有与样品序列≥97％同一性的属/种基因组的优势，初步鉴定了菌株。
[0154] 为了确认菌株的身份并彼此唯一地鉴定菌株，对由16S测序指定的身份特异的高度可变的基因区域进行了扩增和测序。对于大肠杆菌，使用了gyrB和fumC序列等位基因。表
2总结了我们分离的不同大肠杆菌菌株的菌株身份。
2总结了我们分离的不同大肠杆菌菌株的菌株身份。
[0155] 表2
[0156]菌株 来源 adk fumC gyrB icd mdh purA recA #匹配 ST复合物
AZ39 小鼠 13 52 17 156 14 17 25 0
AZ61 人 335 10 1
AZ73 人 100 17 8
AZ74 人 24 9 93 ST73
AZ75 人 38 19 93 ST95
AZ76 人 11 4 608 多重
AZ39 小鼠 13 52 17 156 14 17 25 0
AZ61 人 335 10 1
AZ73 人 100 17 8
AZ74 人 24 9 93 ST73
AZ75 人 38 19 93 ST95
AZ76 人 11 4 608 多重
[0157] 前体菌株工程化。在42℃诱导型启动子的控制下，用pSIM18转化大肠杆菌MG1655(实验室适应性菌株)，该pSIM18编码λ-红重组基因bet、exo和gam，所述菌株赋予了对潮霉素的抗性，并且由于在37℃以上温度下的非选择生长，可能会从含有菌株中丢失。使用该菌株MG1655(pSIM18)创建了许多其他衍生菌株。
[0158] 为了赋予标志物基因绿色荧光蛋白(GFP)组成型表达，我们使用了将gfpmut2基因融合到大肠杆菌基因rplN的启动子区域的序列，且该序列包含来自质粒收集库中的aph卡那霉素抗性基因，所述质粒收集库如Zaslaver等，Nat Methods.2006年8月；3(8)：623-8所述。通过PCR扩增该序列，该PCR结合了与噬菌体λ附着位点attB同源的30-40个核苷酸突出端。该PCR片段用于与MG1655(pSIM18)重组以产生菌株MG1655 attB::[aph PrplN-gfpmut2]KmR，其在蓝光照射下发出绿色荧光，并且其序列通过Sanger双脱氧测序证实(SEQ ID NO:1)。用噬菌体P1vir裂解这些细胞的培养物以产生转导噬菌体P1vir(attB::[aph
PrplN-gfpmut2]KmR)。
PrplN-gfpmut2]KmR)。
[0159] 为了赋予异源基因表达，我们构建了一个包含杂合Ptrc启动子序列，[aph PrhaB-ccdB]反选择盒和氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的表达盒。如果需要，cat基因的侧翼为两个FRT重组位点，以便随后切除。通过PCR扩增该盒，以掺入与yfgG-yfgH基因间区域同源的30-40个核苷酸突出端，并引入MG1655(pSIM18)，随后进行质粒固化和Sanger双脱氧测序以产生MG1655(yfgG::[Ptrc-[aph Prha-ccdB]FRT-cat-FRT])(SEQ ID NO:2)。然后用pSIM18和含有唾液乳杆菌JCM1046(GenBank ACL98194.1)的预测序列的密码子优化变体以及与Ptrc表达区ORF同源的延伸序列的PCR产物对该菌株进行再转化。随后的菌株被pSIM18治愈，该序列通过PCR和Sanger双脱氧测序确认，并随后以MG1655(yfgG::[Ptrc-BSH FRT-cat-
FRT])(SEQ ID NO:3)的形式存储。通过在含有CaCl2和牛磺脱氧胆酸钠的Lennox LB琼脂培养基上一次分离培养来证实BSH基因的活性，这产生了琼脂中的被白色晕环包围的菌落，以及体外牛磺胆酸钠去结合反应的薄层色谱，其中包含在-20℃冻融循环中部分裂解的相同细胞菌株。将这些细胞的培养物用噬菌体P1vir裂解以产生转导噬菌体P1vir(yfgG::
[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT]CmR)。
FRT])(SEQ ID NO:3)的形式存储。通过在含有CaCl2和牛磺脱氧胆酸钠的Lennox LB琼脂培养基上一次分离培养来证实BSH基因的活性，这产生了琼脂中的被白色晕环包围的菌落，以及体外牛磺胆酸钠去结合反应的薄层色谱，其中包含在-20℃冻融循环中部分裂解的相同细胞菌株。将这些细胞的培养物用噬菌体P1vir裂解以产生转导噬菌体P1vir(yfgG::
[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT]CmR)。
[0160] 遗传嵌段转移到M-ACT菌株。通过上述方法，从UCSD处保持在病毒菌落中的雄性野生型、常规饲养的C57B6小鼠的粪便样品中分离出AZ-39菌株。该菌株对卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素、甲氧苄啶和环丙沙星敏感。AZ-39的基因组序列是在长读长高通量测序仪(Pacific Biosciences)上从提取的DNA中获得的数据确定的。AZ-39在其基因组序列中未显示溶血素或其他已知的毒素基因(例如志贺样毒素、脆性溶素)。
[0161] 随后使用P1vir(attB::[aph PrplN-gfpmut2]KmR)将AZ-39转化为卡那霉素抗性和氯霉素抗性，以生产AZ-51(AZ39 GFP+)，随后用P1vir(yfgG::[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT]CmR)产生菌株AZ-52(AZ-39GFP+BSH+)。AZ-51和AZ-52在蓝光照射下均发出绿色荧光，但AZ-
52(而不是AZ-51)在含有牛磺脱氧胆酸钠的固体琼脂培养基上单独分离时，会产生晕环。
52(而不是AZ-51)在含有牛磺脱氧胆酸钠的固体琼脂培养基上单独分离时，会产生晕环。
[0162] 野生型常规饲养小鼠的定殖。将菌株AZ-51和AZ-52进行划线而使其从各自的甘油储备液中单独分离。测试了来自这些划线的单个菌落的正确BSH活性表型，然后接种到Lennox LB+1mM MgCl2的1mL培养物中，其中卡那霉素(25μg/mL)用于AZ-51，氯霉素(10μg/mL)用于AZ-52。这些培养物在215RPM摇动下于37℃生长12小时。随后如Studier(2005)
Protein Purification&Expression的描述，将每种培养物在500mL带挡板的培养瓶中以
50mL相同的培养基反稀释1000倍，该瓶中还装有1mM MgCl2和0.5x M缓冲液。这些培养物在
215RPM摇动下于37℃进一步生长12小时。在生长期结束时，培养物在600nm处具有1cm路径长度的吸光度通常在10.0和20.0之间(考虑到测量前的稀释度)。从一定体积的液体培养物中收集细胞，并将其重悬于冷的无菌1×PBS中，使其细胞密度为5×1010/mL，假定原始培养液中的细胞密度为1×109个细胞/mL/OD600。随后将该溶液保持在冰上。在一个小时内，通过口服灌胃将0.2mL的这种细胞悬浮液递送至野生型常规饲养的C57B6小鼠。随后将小鼠送回其住处。灌胃后的第一周，每周两次更换笼子，在随后两周，每周更换一次，此后每两周更换一次。
Protein Purification&Expression的描述，将每种培养物在500mL带挡板的培养瓶中以
50mL相同的培养基反稀释1000倍，该瓶中还装有1mM MgCl2和0.5x M缓冲液。这些培养物在
215RPM摇动下于37℃进一步生长12小时。在生长期结束时，培养物在600nm处具有1cm路径长度的吸光度通常在10.0和20.0之间(考虑到测量前的稀释度)。从一定体积的液体培养物中收集细胞，并将其重悬于冷的无菌1×PBS中，使其细胞密度为5×1010/mL，假定原始培养液中的细胞密度为1×109个细胞/mL/OD600。随后将该溶液保持在冰上。在一个小时内，通过口服灌胃将0.2mL的这种细胞悬浮液递送至野生型常规饲养的C57B6小鼠。随后将小鼠送回其住处。灌胃后的第一周，每周两次更换笼子，在随后两周，每周更换一次，此后每两周更换一次。
[0163] 如上所述，通过收集、均质化并平铺新鲜的粪便样品来监测定殖状态，不同之处在于，一旦均质化后，将粪便样品另外铺板在含有卡那霉素(25μg/mL)或氯霉素(10μg/mL)的Lennox LB琼脂培养基上。通过用蓝光透照法在向外生长后拍摄所得板来记录成像数据。通过将无抗生素板(例如EMB蔗糖、MacConkey乳糖)中的克隆重新划线到含有CaCl2和TDCA的Lennox LB琼脂培养基上来测试BSH活性的保留。
[0164] 实施例2.重新引入和工程化的共生细菌对小鼠肠道的定殖
[0165] 在该实施例中，从C57Bl/6小鼠中分离出大肠杆菌菌株，对其进行工程改造以表达GFP和来自乳杆菌的胆汁盐水解酶基因，然后将其重新引入C57Bl/6小鼠。
[0166] 前言
[0167] 营养不良与鼠模型中社交、沟通、压力相关和认知行为的改变有关(11,12)。人体研究将肠道微生物组的变动和自闭症谱系障碍(13)、严重抑郁症(14)和帕金森氏病(12)联系在一起。越来越多的证据表明，微生物组-神经免疫相互作用可以介导在鼠模型中观察到的行为和生理异常，特别是通过脑转录组的整体变化、小胶质细胞成熟和功能的改变以及血脑屏障(BBB)的完整性(1,15)。然而，尚不清楚这些作用是什么试剂通过什么机制介导的。接下来，我们回顾了肠道微生物组、胆汁酸(BA)、神经炎症和行为障碍之间的联系。
[0168] 微生物组和胆汁酸代谢：胆汁盐水解酶(BSH)对微生物进行BA的微生物去结合(即去除甘氨酸或牛磺酸；图3A)在宿主生理中起关键作用。去结合可防止BA从小肠重新摄取，并导致其在结肠中转化为继生性BA(16)。尽管大量的次级BA疏水性库被排泄，但通过被动扩散吸收了足够的水以改变血清BA库并充当信号分子(17)。BA信号传导由两种已知的受体介导：法呢类X受体(FXRα)(18)和G蛋白偶联的BA受体1(TGR5)(19)。在人类和小鼠模型的宏基因组学研究中，已确定BSH具有针对肥胖、营养不良和许多其他生理障碍的潜在的保护作用(20)。
[0169] 胆汁酸和神经炎症：BA可以调节神经炎症。在包括小胶质细胞和神经元在内的脑组织中都发现了FXRα和TGR5受体。熊去氧胆酸(UDCA)是细菌产生的继生性BA，其肝牛磺酸缀合物(TUDCA)是影响小胶质细胞的免疫调节剂。UDCA抑制促炎性细胞因子IL-1β和一氧化氮(NO)的产生，并可以抵消神经毒素对体外神经元死亡和突触变化的影响(21,22)。在神经病理学的小鼠模型中，TUDCA减少了小胶质细胞的活化，减少了炎性细胞因子，并保留了神经元的完整性(2,23)。尽管大多数关于BA和神经炎症的研究都使用UDCA或其缀合物，但尚不清楚其他BA是否具有类似作用。UDCA免疫调节作用是通过TGR5受体介导的(5)。实际上，TGR5激动剂还减少了小胶质细胞的活化和增殖，并减少了促炎性细胞因子(10)。然而，也已经提出了BA可以通过其他受体影响神经炎症的受体(4)。
[0170] 高脂饮食、肥胖和神经炎症：高脂饮食(HFD)消耗会导致神经元瘦素和胰岛素抗性，破坏体内稳态信号并产生积极的能量平衡(24,25)。与周围的新陈代谢组织(例如肝脏、脂肪组织)相似，对这些信号的神经元抵抗与炎症信号级联反应的激活有关(26-28)。在大脑中，HFD喂养伴随着促炎性细胞因子的表达、神经胶质增生、脉管系统的改变和BBB通透性的破坏(29)。特别是在海马体中，IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA和蛋白质表达增加，并且小胶质细胞增生增加(29-32)。
[0171] 高脂饮食和行为功能障碍：在啮齿动物中，有充分的证据表明，HFD诱发的神经炎症会引起记忆功能障碍和焦虑，尤其是长时间暴露。至少16周接受HFD(60％能量来自脂肪)的小鼠认知记忆明显受损(通过新物体识别测试评估)，而暴露于HFD 5周的小鼠则没有(33-35)。长时间暴露于HFD(即>20周)也会导致空间记忆和学习受损(29,31,36-38)，并且通过弹球掩埋测试、高架十字迷宫和开放视野测试评估的焦虑水平增加(33,35,39)。这些认知缺陷伴有神经炎症，如IL-6和TNF-α水平升高以及小胶质细胞活化所确定。
[0172] 肠道微生物组功能操纵的局限性：肠道微生物组可以调节多种宿主生理过程，但尚不清楚其作用如何介导。此外，目前尚不清楚大多数针对微生物组组成的干预措施(例如，益生菌——被认为对健康有益的活细菌)是否对肠道微生物组有可检测的影响(40)，或微生物组的人际多样性和可塑性是否在常规饲养的野生型(CR-WT)宿主(例如人)是健康的(41)。为了建立更好的机制理解和更有效的微生物组介导的疗法，必须采用强调肠道微生物组功能性调节的另一种方法。解决该问题的当前策略集中于从实验室适应的细菌菌株产生工程化的细菌。但是，由于这些细菌不会在CR-WT宿主中定殖(41)，因此这些工作费力、昂贵且令人失望。
[0173] 在本文中，我们介绍了在肠道微生物组中采用“敲入”功能的方法和组合物，并研究了它们对CR-WT宿主的腔生态、代谢物和养分通量以及生理的影响。在使用此工具调查腔BA生物转化对宿主代谢的影响时，我们注意到敲入BSH的小鼠的行为存在明显的明显差异。
[0174] 当前的规范及其局限性：需要新的工具来了解由宏基因组学、代谢组学和/或元转录组学确定的生化功能是否可以传达或破坏表型。由于肠道菌群可以感知和操纵腔环境，因此它们已成为基于工程化细胞的疗法的诱人途径。然而，工程化的实验室适应性细菌无法以有用的数量和/或在有意义的时间段内将CR-WT宿主定殖和/或无法在CR-WT哺乳动物中实现生理变化，这迄今限制了它们在机械和治疗研究中的用途(41)。利用工程化的细菌对CR-WT宿主的肠道微生物组进行长期功能性操作仍然遥遥无期。对于不适应于宿主的益生菌(无论是否经过工程改造)，很难与腔中已经存在的菌群竞争。它们在腔环境中的生存存在多种障碍，包括来自宿主的障碍(例如蠕动、先天和适应性免疫)和其他天然微生物的障碍(例如竞争、生态位可用性)(42)。
[0175] 众所周知，实验室菌株不是功能传递的合适载体。为了解决这个问题，某些研究小组开发了工具来操纵肠道微生物组中常见的细菌家族，特别是双歧杆菌属、乳球菌属和乳杆菌属。通过将数百种假定的共生物种工程化并将它们系统地喂给CR-WT小鼠，这些实验室一直在寻找长期的定殖菌。尽管使用了大量资源，但该方法尚未在CR-WT宿主中产生定殖菌。此外，用这种方法开发定殖菌可能需要用于新宿主(例如，转基因小鼠、人类宿主)和新遗传功能的类似大量资源，这使得这些方法超出了资源有限的实验室的范围。
[0176] 本发明新范例：我们已经开发出一种技术，该技术已提高了我们利用工程化的细菌有效改变CR-WT宿主生理的能力。我们已经能够通过鉴定源自CR-WT宿主的易处理的原生/共生细菌，使用赋予有益功能的基因对它们进行遗传修饰，然后将工程化的原生细菌(ENB)重新引入CR-WT宿主来实现这一目标。因此，ENB已经适应了腔环境。过去不愿使用此方法是出于对原生细菌很难培养和修饰的假定。我们使用了从小鼠粪便中分离得到的原生大肠杆菌。大肠杆菌的细菌工程化几乎可以在任何资源很少的实验室中进行。尽管大肠杆菌是常见的原生细菌，但许多研究人员认为，由于实验室适应菌株的令人失望的经验，它们是劣质的定殖菌。但是，我们已经成功创建了工程化的细菌(包括大肠杆菌)，它们可以：
[0177] (1)一次灌胃后，在不同饮食下维持定殖宿主数月(例如，稳定定殖至少140天)。
[0178] (2)在肠道中表达可以改变腔BA的基因(例如“敲入”BSH)。
[0179] (3)以可预测的方式改变血清代谢物(例如，降低血清结合的BA)。
[0180] (4)改变宿主的核心代谢过程。
[0181] (5)改变动物的行为。
[0182] ENB扩展了我们在功能上操纵肠道微生物组和进行更多机械微生物组研究的能力，包括鉴定微生物组-肠-脑轴的介导物。具体而言，我们可以确定BA去结合是否会影响宿主的行为和认知。此外，ENB可用作CR-WT宿主(包括人)中的治疗剂。
[0183] 结果
[0184] 使用ENB进行体外代谢物修饰：天然微生物群落为易于处理且可定殖于宿主的载体提供了丰富的储存库。通过培养C57BL/6小鼠的粪便，我们确定了遗传上易处理的大肠杆菌EcAZ。通过将两个基因导入该菌株的染色体中，我们将EcAZ转化为表达BSH的ENB，两个基因为PrplN-GFPmut2盒和包含异源基因的一步导入位点的Ptrc盒(43)。修饰EcAZ以表达密BSH+
码子优化的唾液乳杆菌BSH(EcAZ )。BSH从BA核心固醇的侧链上切割牛磺酸(图3A)。这种新的ENB在体外反应中将牛磺胆酸(TCA)水解为胆酸(CA)(薄层色谱；图3B)。当在含有10mM TCA的琼脂平板上生长时，在BSH阳性菌株周围而不是亲本BSH阴性菌株周围形成难溶水解产物(CA)的白色晕环(图3C)。
码子优化的唾液乳杆菌BSH(EcAZ )。BSH从BA核心固醇的侧链上切割牛磺酸(图3A)。这种新的ENB在体外反应中将牛磺胆酸(TCA)水解为胆酸(CA)(薄层色谱；图3B)。当在含有10mM TCA的琼脂平板上生长时，在BSH阳性菌株周围而不是亲本BSH阴性菌株周围形成难溶水解产物(CA)的白色晕环(图3C)。
[0185] ENB可以在一次灌胃后在CR-WT小鼠的肠内定殖：十周大的CR-WT C57BL/6小鼠接受了一次灌胃的GFP+EcAZ(EcAZBSH+/EcAZBSH-)固定相培养。分别从每只小鼠收集粪便样品，并将其铺在琼脂培养基上。在正常的饮食(NCD)和HFD喂养条件下，在超过20周的时间内每克粪便中GFP+菌落形成单位的数量为约106(数据显示长达15周；图4A)。添加BSH基因不会影响ENB在肠道中定殖的能力(图4A)。8周后，对某些小鼠实施安乐死，收集器官并铺板以确定定殖程度。EcAZ在末端回肠和盲肠中以最高浓度定殖在治疗小鼠的整个胃肠道中(图
4B)。它没有定殖小鼠的脾脏、肺脏、心脏或肝脏。所有的小鼠都看起来健康，彼此之间没有区别。用EcAZBSH+或EcAZBSH-定殖未影响体重(图4C)。在无菌(GF)小鼠中，EcAZBSH+使BA去结合，而EcAZBSH-没有(图4D，4E)。
4B)。它没有定殖小鼠的脾脏、肺脏、心脏或肝脏。所有的小鼠都看起来健康，彼此之间没有区别。用EcAZBSH+或EcAZBSH-定殖未影响体重(图4C)。在无菌(GF)小鼠中，EcAZBSH+使BA去结合，而EcAZBSH-没有(图4D，4E)。
[0186] ENB可以在内脏中进行BA生物转化并影响血清BA库：粪便分析表明，添加ENB不会导致微生物组组成发生重大变化(图5A)。靶向代谢组学证实了EcAZBSH+可以使原始BA去结合，从而导致腔中BA库的超代谢改变(图5B)。尽管各组之间许多粪便BA有所不同，但变化是不可预测的。然而，血清BA组成的变化容易预测得多。结合的BA的总体减少(图5C)，因此ENB可用于改变宿主BA的组成。
[0187] ENB可以引起生理和行为变化：对EcAZBSH+小鼠的代谢笼评估显示出独特的代谢特征，其特征为低呼吸交换率(RER)，表明脂肪酸氧化增加(图7A)。BA信号传导也影响葡萄糖稳态。用EcAZBSH+治疗的小鼠餐后胰岛素水平明显降低(图7B，右)。为了量化在这些条件下BSH+对小鼠之间行为差异的观察，我们进行了行为和认知实验。与两个对照相比，EcAZ 小鼠在转轮上花费的时间增加了50％(图7C)。EcAZBSH+在新物体识别测试中的表现也稍好一些(图7D)。尽管20周后接受HFD的小鼠在该认知测试中表现不佳，但是用EcAZBSH+治疗的HFD小鼠没有任何困难(图7D)。因此，微生物组中单个基因BSH的表达诱导了CR-WT宿主的代谢、行为以及可能的认知变化。
[0188] 实验方法与设计
[0189] ENB对腔BA的修饰会影响CR-WT小鼠的认知。
[0190] 我们的数据表明高脂饮食(HFD)的消耗会导致新物体识别能力受损。但是，用EcAZBSH+处理的HFD小鼠的表现与正常饮食(NCD)小鼠的表现相同，这表明细菌BA去结合会影响宿主的认知。
[0191] 方法：ENB定殖和体内评估。八周龄的WT雄性C57BL/6小鼠(总共72只小鼠)用于该实验。仅使用雄性小鼠，因为它们容易因饮食引起肥胖，而雌性C57BL/6小鼠在接受HFD时不会变得肥胖(44)。在实验过程中监测体重和食物消耗。2周后，10周龄的小鼠接受一次灌胃的PBS、EcAZGFP+/BSH-或EcAZGFP+/BSH+(每组24只小鼠)。在整个实验过程中，使用粪便培养物监测定殖和BSH活性。2周后，将每组的一半从NCD切换为HFD(每种条件12只小鼠；LabDiet 58Y1；18％蛋白质，61％脂肪，21％碳水化合物)。当存在与HFD相关的认知缺陷时，行为测试将在20周后开始(34)。
[0192] 体内腔和血清BA特征评估。灌胃后二十二周(饮食改变后二十周)，从所有小鼠收集血液(颌下)，用于目标BA代谢组学。通过液相色谱-偶联质谱法(LC-MS/MS)评估ENB对目标粪便和血清BA库的影响。
[0193] 行为测试：用于行为测试的设备可高压灭菌，适用于高屏障设施。这是为了最小化可以影响微生物组组成的环境因素。此外，测试顺序旨在最小化测试过程中的混淆。在可能导致短暂疼痛或不适感(诸如，尾悬吊)的测试之前进行较温和的测试。按照以下顺序进行测试，间隔3-5天。
[0194] 野外测试。这是对“情绪”的测试，用于测量暴露于压力环境刺激(明亮照明的开放空间)中的啮齿动物的焦虑样反应，以及捕获自发活动度量。将每只动物放置在开放式竞技场的中心(45)，并在30分钟的观察期内记录并分析一些行为参数(行进距离、速度、中心时间、中心频率、站立(rearing)、理毛)。
[0195] 吊线测试。吊线测试可以评估抓地力和运动协调性(46)。握住小鼠，使其只有前肢才能接触到由大环架平行于桌子固定的高架金属棒，然后放手任其悬挂。确定跌倒的时间和基于悬挂策略的得分。
[0196] 新物体识别测试。该测试可在不影响物体空间位置的情况下分析识别记忆(47-49)。基本原理是动物探索新环境，并且反复接触会减少探索的发生(即习惯化
(habituation))，然后优先探索新物体(习惯化解除(dishabituation))，因为它不同于动物记忆(50-52)。视频记录行为，然后对接触进行评分(用鼻子触碰或在物体0.5cm内用鼻子指向物体)。
(habituation))，然后优先探索新物体(习惯化解除(dishabituation))，因为它不同于动物记忆(50-52)。视频记录行为，然后对接触进行评分(用鼻子触碰或在物体0.5cm内用鼻子指向物体)。
[0197] 弹球掩埋测试。弹球掩埋测试用于利用挖掘的物种典型行为(55)来评估焦虑样行为(53)和强迫症样行为(54)。将小鼠单独放置在装有深度为5cm的草垫的标准鼠标笼中30分钟，其中设有20颗均匀分布的弹球，然后移出小鼠，并确定埋藏的弹球数量(至少2/3被草垫覆盖)。
[0198] 空间记忆的巴恩斯迷宫测试。巴恩斯迷宫测试是一种空间学习和记忆测试，其中涉及使用远端视觉线索逃避明亮的圆形视野(56-58)。每次都由对小鼠实验条件未知的实验者进行录像和评分，然后进行分析以评估行进距离、运动速度以及路径分析。
[0199] 尾部悬挂测试。尾部悬吊测试是检查小鼠无助/抑郁样行为的经典测试(59,60)。使用胶带将每只老鼠的尾巴悬在金属棒上持续6分钟，该棒位于平坦表面上方30cm处。通过测量在观察不到全身性运动时的时间量来量化稳定性。稳定性时间的增加指示抑郁症行为增加。
[0200] 统计分析。使用StatView(版本5.0.1；SAS Institute Inc.)。使用重复测量方差分析(ANOVA)对每个行为测试的数据进行评估，受试者间因素组和受试者内因素时间或试验取决于测试。如果有显著的主要影响或这些影响之间的显著相互作用，可以使用费舍尔保护的最小显著差异(PLSD)事后测试。
[0201] BA信号传导的事后评估。进行行为表型分析后，从每只小鼠收集空腹血清和粪便。通过CO2窒息然后断头将小鼠处死。将脑、肺、心脏、肝脏、脾脏和肠道的不同段在PBS中匀浆，然后对EcAZ特异性基因组岛mRNA(61)、GFPmut2和BSH以及培养组织进行qPCR，以确定EcAZ定殖位点。在血清、粪便、肝脏、脑以及末端回肠和盲肠内容物中测量BA和短链脂肪酸。
从末端回肠、盲肠、肝脏和海马体中提取宿主RNA。对于一半的小鼠(每种条件6只)，进行RNA-seq(Illumina HiSeq SE50)。通过qRT-PCR在另一半小鼠中证实了关键基因的转录组结果(每种条件6只)。
从末端回肠、盲肠、肝脏和海马体中提取宿主RNA。对于一半的小鼠(每种条件6只)，进行RNA-seq(Illumina HiSeq SE50)。通过qRT-PCR在另一半小鼠中证实了关键基因的转录组结果(每种条件6只)。
[0202] 肠腔中细菌BA去结合的增加导致末端回肠BA库的变化。这会激活FXR和TGR5通路。行为测试表明，EcAZGFP+/BSH+小鼠与PBS和EcAZGFP+/BSH-组的小鼠之间存在认知差异。这可能是由于例如神经炎症减少、血脑屏障通透性变化、BA对神经元本身的直接作用或多种因素的组合。
[0203] ENB对腔BA的修饰影响CR-WT小鼠的小胶质细胞基因表达。
[0204] HFD消耗可通过多种机制引起行为功能障碍，包括破坏BBB通透性、增加神经炎症或改变神经元转录组。由于BA可以调节神经炎症，因此我们通过改变血清BA库来确定ENB是否影响小胶质细胞的激活。我们注意到，在没有小胶质细胞激活变化的情况下，BSH活性可以诱导认知变化，同样可以引起小胶质细胞激活变化而不诱导认知变化。
[0205] 方法：ENB定殖、体内评估和BA信号的事后评估。使用八周龄的WT雄性C57BL/6小鼠(总共48只小鼠)。按照特定目的1(SA1)的描述，对动物进行饲养、评估和定殖，不同之处在于6种条件中的每种条件下有8只小鼠。这些小鼠也使用了SA1中用于评估定殖和BSH活性的所有方法。
[0206] 小胶质细胞分离。如前所公开(62)，小鼠在HFD上维持24周后，小胶质细胞被分离。简而言之，禁食6小时后，用CO2深度麻醉小鼠，然后用冰冷的DPBS快速向心内灌注。取出全脑，解剖出海马体，一半用于免疫染色和小胶质细胞重建(见下文)，另一半用于小胶质细胞分离和RNA-Seq。将海马体组织轻轻匀浆，过滤并离心。然后将沉淀的匀浆物重悬于37％等渗的Percoll中，然后用70％等渗的Percoll覆盖。然后将试管离心，回收37％-70％Percoll相间的部分，并用HBSS洗涤。然后将细胞在冰上的染色缓冲液中与CD16/CD32阻断抗体一起温育，然后与抗小鼠CD11b-PE和CD45-Alexa488抗体一起温育。用鉴定为单峰CD11b+CD45低事件的小胶质细胞进行分选，其涵盖了所有CD11b+事件的>95％。然后将分离的小胶质细胞制成颗粒，并保存在-80℃以用于下游程序。
[0207] RNA分离、测序和分析：通过TRIzol从小胶质细胞匀浆中分离出总RNA。文库的制备和测序由UCSD测序核心完成。使用STAR将来自RNA-Seq实验的Fastq文件绘制到小鼠源菌株的单个基因组。
[0208] 免疫染色和小胶质细胞重建。分离小胶质细胞，并使用先前公开的方法进行免疫染色(12)。解剖的海马组织固定在4％(w/v)多聚甲醛中。使用振动刀，产生50mm的矢状截面。自由漂浮的切片用小鼠抗FXR NR1H4、兔抗GPCR TGR5和山羊抗Iba1进行染色。然后用抗小鼠IgG-AF647和抗兔IgG-AF546以及抗山羊IgG-AF488进行染色。安装切片并用共聚焦显微镜成像。进行小胶质细胞体和突起的半自动化重建。每只动物分析20到60个细胞。
[0209] 细胞因子定量。使用多平台评估组织匀浆和血清中的TNF-α、IL-6和其他细胞因子。
[0210] 肠腔中细菌BA去结合的增加导致神经炎症的减少，如形态学(例如，突起的直径、分支点的数量、总分支长度)和细胞因子的产生(通过多重/ELISA或转录)所确定。在用GFP+/BSH+ GFP+/BSH-
EcAZ 治疗的小鼠中，转录组程序与NCD对照小鼠更相似，然而用EcAZ 治疗的小
鼠与用载体治疗的HFD群体则没有区别。最后，转录组途径表明由增加的BA去结合诱导的变化是否由已知的BA受体或某些其他不确定的机制介导。
EcAZ 治疗的小鼠中，转录组程序与NCD对照小鼠更相似，然而用EcAZ 治疗的小
鼠与用载体治疗的HFD群体则没有区别。最后，转录组途径表明由增加的BA去结合诱导的变化是否由已知的BA受体或某些其他不确定的机制介导。
[0211] 通过使用绕过防止大多数益生菌定殖宿主的障碍的有效肠道定殖菌，ENB对如何分析和理解肠道微生物组以及治疗微生物组介导的疾病具有巨大影响。在本文中，我们提供了使用ENB来确定微生物组-肠-脑轴的介导物的基础。
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[0275] 实施例3.重新引入和工程化的共生细菌对人类肠道的定殖
[0276] 健康的人类受试者在无菌拭子上提供粪便样本，并在实验室进行培养。将粪便样品中的共生细菌细胞改造为表达标记物，诸如荧光蛋白。随后将用异源多核苷酸转化的细菌作为活生物体的浓缩溶液返回受试者，例如，将其混入食品(例如，燕麦片、酸奶)中，或者作为在立即食用前包装到大的凝胶胶囊中的强缓冲溶液中的悬浮液。给人类受试者提供无菌拭子，用于以预定间隔(例如，每半周一次，持续2个月)收集和提交粪便样品，以追踪工程化的细菌菌株在受试者的胃肠道中重新定殖的成功。
[0277] 应当理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且对本领域技术人员给出根据其作出的各种修改或改变的启示，其应包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
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