지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법{Differentiation method of adipose-derived mesenchymal stem cells into neural stem cells, neural cells, and GABAergic neural cells}

본 발명은 인간 지방줄기세포로부터 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성(Gamma-aminobutyric acid; GABA) 신경세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

신경손상과 퇴행성 신경질환은 아직까지 뚜렷한 치료법이 없어, 임상의와 과학자들에게 주요한 문제로 남아있다. 줄기세포는 자가증식능과 여러 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 세포치료의 효과적인 공급원으로 여겨지고 있다. 배아줄기세포(ESCs)와 유도만능줄기세포(iPSCs)를 포함하는 인간만능줄기세포는 재생치료에 적용할 수 있는 강력한 후보들이며, 다양한 대사질환, 유전질환, 퇴행성질환 등 의생명분야와 임상연구 분야에서 줄기세포의 전분화능이 유용하지만, 아직까지 여러 잠재적인 문제와 제약이 존재한다. 배아줄기세포에 관련된 윤리적 문제 외에도, 유도만능줄기세포는 발암 경로를 활성화 시킬 수도 있는 외래 세포 재프로그래밍 인자에 관련된 안전성 문제를 가지고 있으며, 느린 재프로그래밍 과정과 낮은 효율 등 기술적 문제를 가지고 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서 대안으로 화학물질, microRNA 분자, 직접 교차분화 방법이 이용되어왔다(Bao et al., 2013; Lin et al., 2009; Maroof et al., 2013).

괄목할 만한 발전에도 불구하고 여전히 유도만능줄기세포의 임상 적용은 난관으로 남아있다. 배아줄기세포나 유도만능줄기세포와 비교해 볼 때, 자가 적합성, 높은 획득성, 강한 증식능을 이유로 성체중간엽줄기세포 중 하나인 인간 지방유래 줄기세포가 재생의학에 있어 더 적합한 세포 공급원이다(Anghileri et al., 2008).

최근 보고에 따르면, 인간 지방유래줄기세포가 신경줄기세포와 테트로도톡신 감수성 나트륨이온 전류 또는 외향성 칼륨이온 전류를 만들 수 있는 신경세포유사세포로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 시험관상에서 신경교세포 유사세포로도 분화할 수 있다는 것이 알려졌다(Feng et al., 2013; Jang et al., 2010). 이러한 결과는 성체중간엽줄기세포의 신경세포 분화능을 나타내지만, 이뿐만 아니라 활동전위와 같은 기능적인 특성도 평가되어야 한다. 성체 중간엽줄기세포를 신경세포 또는 특정한 신경세포로 분화시키기 위한 노력에도 불구하고, 기능적, 모양적으로 확인된 GABA 분비 개재뉴런으로의 분화 프로토콜에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다.

신경줄기세포로 분화 유도된 세포에서는 초기신경발달과정에서 발현되는 Pax6, Sox1, Nestin, Vimentin과 같은 신경줄기세포 표지의 발현을 확인할 수 있었다(Pankratz et al., 2007). SMAD 신호를 상승적으로 억제하는 방법으로 Lefty/Actin/TGFβ 신호 억제제인 SB431542와 골격형성단백질 억제제인 Noggin, 그리고 LDN193189를 이용해 배아줄기세포와 유도만능줄기세포의 신경세포로의 교차분화능을 강화할 수 있다(Chambers et al., 2009). 저분자 억제제는 성체중간엽줄기세포의 신경세포으로의 교차분화도 진척시킨다(Madhu et al., 2015). 유도된 신경줄기세포는 유도만능줄기세포 GABA 분비 개재뉴런으로의 분화와 같이 신경성장인자(BDNF; brain-derived neurotrophic factor), 음파고슴도치단백질(SHH; sonic hedgehog), 퍼모프아민(purmorphamine), 사이클릭AMP(cAMP), 다이뷰티릴 사이클릭AMP(dbcAMP) 처리 시 신경세포, 성상교세포, 초기 희소돌기신경교세포, GABA분비 개재뉴런으로의 분화능을 갖는다(Liu et al., 2013).

이에, 본 발명자들은 유전자 조작 없이 저분자 억제제와 성장인자만을 이용해 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포, 신경세포, 가바성 신경세포로의 최적의 분화 조건을 확립하는 프로토콜을 만들고자 노력하였고, 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 세포 배양 배지에 저분자 억제제인 SB431543, Noggin 및 LDN193189를 첨가하여 6 내지 8일간 배양한 다음(단계 1: 전-처리 단계), B27, N2, 및 ascorbic acid를 첨가한 배지에 5일간 배양하고(단계 2: 신경 유도 단계), bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 EGF (epidermal growth factor)를 첨가한 배지에서 5 내지 7일간 더 배양하여(단계 3: 증식 단계), 신경줄기세포로 분화시키고, 상기 단계 3의 세포 배양액에 purmorphamine 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용하여 추가적으로 신경세포로 분화시켰으며, 또한, 상기 단계 2의 세포 배양액� � purmorphamine 및 BDNF와 dbcAMP 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용하여 상기 신경세포를 가바성 신경세포로 분화시키는 방법을 확립하였다. 상기 본 발명은 인간 신경세포 또는 GABA 분비 개재뉴런의 발달과 연관된 분자 기작을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 본 발명의 분화방법을 이용한 시험관상에서 특정 질병의 성질을 가진 성체중간엽줄기세포로부터 유도된 신경세포 또는 유도된 GABA분비 개재신경세포는 신경학적 질병 규명과 약물 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유전자 조작 없이 저분자 억제제와 성장인자만을 이용해 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포, 신경세포, 가바성 신경세포로의 최적의 분화 조건을 확립하는 프로토콜을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포(neural stem cell)로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하여 신경줄기세포로 분화시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 신경줄기세포를 purmorphamine 및 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경세포(neural cell)로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 세포를 purmorphamine 및 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 첨가한 배지에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 신경세포를 dbcAMP(dibutyryl cyclic AMP) 및 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 가바성 신경세포(GABAergic neural cells)로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포, 신경세포, 및 가바성 신경세포를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포를 포함하는 신경 손상 세포치료용 조성물, 신경 손상 세포치료제 스크리닝용 조성물, 뇌질환 치료제 스크리닝용 조성물, 시신경 손상 관련 질환 예방 및 치료용 조성물 및 인공 망막 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 세포 배양 배지에 저분자 억제제인 SB431543, Noggin 및 LDN193189를 첨가하여 6 내지 8일간 배양하고(단계 1: 전-처리 단계), 그런 다음, B27, N2, 및 ascorbic acid를 첨가한 배지에 5일간 배양하고(단계 2: 신경 유도 단계), bFGF 및 EGF를 첨가한 배지에서 5 내지 7일간 더 배양하여(단계 3: 증식 단계), 신경 줄기세포로 분화시킨 결과, 저분자 억제제를 첨가한 실험군이 미처리 실험군보다 신경줄기세포의 분자표지인 Nestin, Sox1, Pax6, Musashi-1, Vimentin, Olig2, Nkx2.1, FoxG1, Tuj1, 및 Ascl1의 mRNA 발현이 증가함을 확인하였고, 형광 면역세포염색법분석을 통해 Nestin과 Sox2를 모두 발현하는 유도 신경줄기세포의 검출을 확인하였으며, 다음으로 상기 단계 3의 세포 배양액에 purmorphamine 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용하여 상기 신경줄기세포를 � �가적으로 신경세포로 분화시킨 결과, 성숙한 신경세포와 관련된 유전자들의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였고, 또한, 상기 단계 2의 세포 배양액에 purmorphamine 및 BDNF와 dbcAMP 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용하여 상기 신경세포를 가바성 신경세포로 분화시킨 결과, 내측 신경절 융기 (MGE) 세포 분자표지인 NKX2.1, DLX2, LHX6와 신경세포 분자표지인 TuJ1, MAP2를 발현함을 확인하였으며, 상기 가바성 신경세포는 글루탐산 수용체 차단제가 함께 있을 때의 자발적 억제성 시냅스 후 전류 (IPSC)가 나타났다가 GABA _A 수용체 차단제를 처리하면 사라짐을 확인함으로써, 기능을 가진 가바성 신경세포로 최종 분화됨을 확인하였으며, 따라서 상기 분화방법을 통한 신경세포 및 가바성 신경세포는 신경학적 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 저분자 억제제(small molecule inhibitor; SMI)를 이용한 신경줄기세포 교차분화 프로토콜의 최적화를 나타낸 도이다:
A: 지방세포 유래 중간엽 줄기세포에서부터 신경줄기세포로의 유도에 대한 과정을 도식화한 것이다.
B: Scale bar: 100 μm.
C: 유도신경줄기세포의 특성을 실시간 유전자 증폭 분석법 (Real time PCR)을 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다. 세로축은 상대적인 유전자 발현량을 나타낸다.
^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 유의확률은 지방세포 유래 중간엽 줄기세포와 비교한 값이고 ^† P < 0.05, ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001 유의확률은 저분자 억제제를 처리하지 않은 그룹과 비교한 값이다.
D: 형광 유세포 분석기기 (FACS Caliber)를 이용해 신경세포막 부착 단백질 (neural cell adhesion molecule; NCAM)을 유세포 분석함으로써 유도 신경줄기세포의 정량화를 나타낸 도이다.
도 2는 저분자 억제제를 처리하여 교차분화시킨 유도 신경줄기세포의 특성을 나타낸 도이다:
A: 형광 면역세포염색법분석을 통해 Nestin과 Sox2를 모두 발현하는 유도 신경줄기세포의 검출을 나타낸 도이다.
B: 실시간 유전자 증폭 분석을 이용하여, 신경줄기세포 교차분화과정을 따라 신경줄기세포와 초기 신경세포 분자표지 (Sox1, Sox2, Nestin, Musashi-1, FoxG1, Nkx2.1, Pax6, Gli3, Vimentin, Tuj1, Emx1)의 발현 변화를 나타낸 도이다. 세로축은 상대적인 유전자 발현량을 나타낸다.
^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 유의확률은 지방세포 유래 중간엽 줄기세포와 비교한 값이다.
^† P < 0.05, ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001 유의확률은 단계1에서의 세포와 비교한 값이며 ^# P < 0.05 유의확률은 단계 2에서의 세포와 비교한 값이다.
도 3은 유도 신경세포에 대한 실험개요와 그 형태를 나타낸 도이다:
A: 지방세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 유도 신경세포로의 분화에 대한 실험의 도식화를 나타낸다.
B: 유도 신경세포가 성숙된 신경세포와 같은 형태를 보임을 나타낸다. Scale bar: 100 μm.
C: iNSC(induced neural stem cells), iN(induced neural cells)
^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 유의확률은 지방세포 유래 중간엽 줄기세포와 비교한 값이며 ^† P < 0.05, ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001 유의확률은 유도 신경줄기세포와 비교한 값이다.
도 4는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 유도 신경세포의 특징을 나타낸 도이다:
A: Scale Bar: 20 μm.
B: 신경세포 전구세포, 신경세포, 신경교세포 분자표지를 발현하는 유도 신경세포의 수를 적어도 서로 다른 세 영역에서 계수하였다. 백분율는 전체 세포 수에 해당하는 DAPI를 발현하는 유도신경세포 중에서 해당 분자표지를 발현하는 유도신경세포의 수가 차지하는 비율을 나타낸다. (평균값 ± 평균의 표준오차)
C: 전형적인 신경세포의 형태를 가지는 유도 신경세포로부터 측정된 전기생리학적 기록 표본을 나타내었다. 표본 이미지와 전류 주입에 의한 활동전위 유도를 나타내며, 전류 주입 프로토콜은 활동전위 기록 아래에 있다. 하단부 기록은 전압고정 클램프 방식(-60mV 고정)에서 유도 신경세포로부터 얻어진 대표적인 자발적 시냅스 활동이며, 확대한 단일 전류는 연속적으로 나타낸 기록 아래에 나타내었다.
도 5는 가바성 신경세포로의 교차분화 프로토콜의 최적화를 나타낸 도이다:
B: Scale bar: 20 μm.
C: 내측 신경절 융기(MGE) 세포와 신경세포 분자표지를 발현하는 유도 가바성 신경세포의 수는 적어도 서로 다른 세 영역에서 계수되었다. 백분율는 전체 세포 수에 해당하는 DAPI를 발현하는 유도신경세포 중에서 해당 분자표지를 발현하는 유도 가바성 신경세포의 수가 차지하는 비율을 나타내는 것이다. (평균값 ± 평균의 표준오차)
D: Scale bar: 100 μm.
도 6은 유도 가바성 신경세포의 기능적 특성을 나타낸 도이다:
A, B: ^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 유의확률은 지방세포 유래 중간엽 줄기세포와 비교한 값이며 ^† P < 0.05, ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001 유의확률은 시험관 배양 25일 차의 유도 가바성 신경세포와 비교한 값이다.
C: Scale bar: 20 μm.
D: 가바성 신경세포 분자표지를 발현하는 유도 가바성 신경세포의 수를 적어도 서로 다른 세 영역에서 계수하였다. 백분율는 전체 세포 수에 해당하는 DAPI를 발현하는 유도 가바성 신경세포 중에서 해당 분자표지를 발현하는 유도 가바성 신경세포의 수가 차지하는 비율을 나타낸다(평균값±평균의 표준오차).
E: 상단 좌측 패널은 전류고정 클램프 방식으로 기록된 유도 가바성 신경세포의 활동전위 발화 기록을 나타낸 것이다. 활동전위 기록 아래에는 전류 주입 프로토콜을 나타내었다.
상단 우측 패널에는 유도 가바성 신경세포에서 램프 프로토콜 적용이 빠른 전류유입을 유도하고 고정전압을 탈분극 시킴을 보여주고 있다. 전압은 1초 동안 점진적으로 -100 mV에서 0 mV까지 증가했으며, 점선으로 된 상자는 별표로 표시한 전류를 확대한 것이다.
실험디자인의 모식도를 하단 좌측 패널에 나타냈다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADMSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포(neural stem cell)로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하여 신경줄기세포로 분화시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 신경줄기세포를 purmorphamine 및 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경세포(neural cell)로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cell; ADSC)를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 세포를 purmorphamine 및 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)를 첨가한 배지에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 신경세포를 dbcAMP(dibutyryl cyclic AMP) 및 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 가바성 신경세포(GABAergic neural cells)로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 BMP 억제제는 Noggin 및 LDN193189인 것이 바람직하고, TGF 베타 신호전달 저해제는 ALK(activin receptor-like kinase) 수용체 저해제인 SB431542인 것이 바람직하다.

상기 단계 1)의 배지는 DMEM F-12 기본배지에 0.5 내지 30% KOSR, 0.5 내지 1.5% Penicillin/ Streptomycin, 0.1 내지 10% Glutamax, 0.1 내지 10% non-essential amino acid 그리고 1 내지 500 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor), 1 내지 200 μM SB431542, 0.01 내지 1 μg/ml Noggin, 0.1 내지 20 μM LDN193289을 첨가한 배지인 것이 바람직하고, 특히 5 내지 20 μM SB431542, 0.05 내지 0.2 μg/ml Noggin, 0.1 내지 1.0 μM LDN193289을 첨가하는 것이 신경줄기세포로의 분화를 증가시키는데 더욱 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 분화 효율이 감소될 수 있다.

상기 단계 2)의 배지는 DMEM F-12:Neurobasal (1:1) 기본배지에 0.1 내지 10% Glutamax, 1 내지 20 mM D-glucose, 0.01 내지 2 mM ascorbic acid, 0.1 내지 10 mM sodium pyruvate, 0.1 내지 10% B27 및 0.1 내지 10% N2를 첨가한 배지인 것이 바람직하며, 단계 3)의 배지는 DMEM F-12:Neurobasal (1:1) 기본배지에 0.1 내지 10% Glutamax, 1 내지 20 mM D-glucose, 0.01 내지 2 mM ascorbic acid, 0.1 내지 10 mM sodium pyruvate, 0.1 내지 10% B27 및 0.1 내지 10% N2, 1 내지 500 ng/ml bFGF 및 1 내지 500ng/ml EGF(epidermal growth factor)를 첨가한 배지인 것이 바람직하다.

상기 단계 1)의 배양은 4 내지 12일, 상기 단계 2)의 배양은 3 내지 10일, 상기 단계 3)의 배양은 3 내지 10일 동안 실시하는 것이 바람직하고, 1)의 배양은 6 내지 8일, 2)의 배양은 5일, 3)의 배양은 5 내지 7일 동안 실시하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 신경세포(neural cell)로 분화시키는 방법 상기 단계 4)의 배지는 DMEM F-12:Neurobasal (1:1) 기본배지에 0.1 내지 10% Glutamax, 1 내지 20 mM D-glucose, 0.01 내지 2 mM ascorbic acid, 0.1 내지 10 mM sodium pyruvate, 0.1 내지 10% B27 및 0.1 내지 10% N2, 0.1 내지 50 μM purmorphamine 및 1 내지 500 ng/ml BDNF를 첨가한 배지인 것이 바람직하고, 특히 0.8 내지 2.0 μM purmorphamine 및 5 내지 30 ng/ml BDNF를 첨가하는 것이 신경세포로의 분화를 증가시키는데 더욱 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 분화 효율이 감소될 수 있다.

상기 배양은 7 내지 16일 동안 실시하는 것이 바람직하고, 12 내지 14일 동안 실시하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 가바성 신경세포(GABAergic neural cells)로 분화시키는 방법 상기 단계 4)의 배지는 DMEM F-12:Neurobasal (1:1) 기본배지에 0.1 내지 10% Glutamax, 1 내지 20 mM D-glucose, 0.01 내지 2 mM ascorbic acid, 0.1 내지 10 mM sodium pyruvate, 0.1 내지 10% B27 및 0.1 내지 10% N2, 0.01 내지 1 mM dbcAMP 및 1 내지 500 ng/ml BDNF를 첨가한 배지인 것이 바람직하고, 특히 0.04 내지 0.1 mM dbcAMP 및 5 내지 30 ng/ml BDNF를 첨가하는 것이 가바성 신경세포로의 분화를 증가시키는데 더욱 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 분화 효율이 감소될 수 있다.

상기 배양은 10 내지 40일 동안 배양하는 것이 바람직하고, 13 내지 35일인 것이 더욱 바람직하며, 18일 내지 30일 동안 배양하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시 예에서, 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 세포 배양 배지에 저분자 억제제인 SB431543, Noggin, 및 LDN193189를 첨가하여 6 내지 8일간 배양하고(단계 1: 전-처리 단계), 그런 다음, B27 및 N2를 첨가한 배지에 5일간 배양하고(단계 2: 신경 유도 단계), bFGF 및 EGF를 첨가한 배지에서 5 내지 7일간 더 배양하여(단계 3: 증식 단계), 신경 줄기세포로 분화시킨 결과, 저분자억제제를 첨가한 실험군이 미처리 실험군보다 신경줄기세포의 분자표지인 Nestin, Sox1, Pax6, Musashi-1, Vimentin, Olig2, Nkx2.1, FoxG1, Tuj1, 및 Ascl1의 mRNA 발현이 증가함을 확인하였고, 형광 면역세포염색법분석을 통해 Nestin과 Sox2를 모두 발현하는 유도 신경줄기세포의 검출을 확인하였으며(도 1 및 도 2 참조), 다음으로 상기 단계 3의 세포 배양액에 purmorphamine 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용� �여 상기 신경줄기세포를 추가적으로 신경세포로 분화시킨 결과, 성숙한 신경세포와 관련된 유전자들의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였고(도 3 및 도 4 참조), 또한, 상기 단계 2의 세포 배양액에 purmorphamine 및 BDNF와 dbcAMP 및 BDNF를 첨가한 배지를 이용하여 상기 신경세포를 가바성 신경세포로 분화시킨 결과, 내측 신경절 융기 (MGE) 세포 분자표지인 NKX2.1, DLX2, LHX6와 신경세포 분자표지인 TuJ1, MAP2를 발현함을 확인하였으며, 상기 가바성 신경세포는 글루탐산 수용체 차단제가 함께 있을 때의 자발적 억제성 시냅스 후 전류 (IPSC)가 나타났다가 GABA _A 수용체 차단제를 처리하면 사라짐을 확인함으로써, 기능을 가진 가바성 신경세포로 최종 분화됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).

따라서 본 발명의 분화방법을 통한 신경세포 및 가바성 신경세포는 신경학적 질환 치료방법의 개발을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 또는 토끼 등의 모든 유래일 수 있으며, 구체적으로 인간 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, "B27" 및 “N2”는 무혈청 보충제로써 본 발명의 방법에 사용되는 배지의 성분이다.

본 발명에서 “bFGF”는 세포증식, 세포분화 등을 비롯해 분열 촉진 인자, 혈관 생성 인자, 뼈 형성 인자 및 신경성장인자로써 기능하는 FGF 패밀리에 속하는 단백질로써 FGF2라고도 불리며 주로 FGFR 1b, FGFR 1c, FGFR 2c, FGFR 3c, FGFR 4c를 포함하는 수용체 단백질을 활성화시키며, 특히 FGFR 1c, FGFR 3c를 강력히 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 상기 FGFR을 활성화시키는 FGF 패밀리 단백질을 포함하여 bFGF와 유사한 신호를 전달할 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "TGF (Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제"는 TGF 베타 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. 상기 TGF 베타는 생체 내에서 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 세포외기질(ECM)의 생산 혈관형성, 발생 등 다양한 생리적 과정을 조절하는 물질이다.

본 발명에서 상기 TGF 베타 신호전달 저해제는 TGF 신호전달을 억제시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 ALK (activin receptor-like kinase) 수용체 저해제가 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 ALK 수용체 저해제인 SB431542를 사용하였다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 신경줄기세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 세포를 표피성장인자(EGF) 및 염기성 섬유모세포성장인자 (bFGF)를 첨가한 배지에서 배양하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 신경줄기세포를 purmorphamine 및 BDNF를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 신경세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 BMP(Bone morphogenic protein) 억제제, TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포를 B27, N2, 및 ascorbic acid를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 신경줄기세포를 purmorphamine 및 BDNF를 첨가한 배지에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계; 및

4) 상기 신경세포를 dbcAMP 및 BDNF를 첨가한 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 가바성 신경세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포, 신경세포, 및 가바성 신경세포를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포를 포함하는 신경 손상 세포치료용 조성물, 신경 손상 세포치료제 스크리닝용 조성물, 뇌질환 치료제 스크리닝용 조성물, 시신경 손상 관련 질환 예방 및 치료용 조성물 및 인공 망막 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 지방세포유래 중간엽 줄기세포로부터 상기 단계별 조성물을 이용하면, 일차 신경세포 및 일차 가바성 신경세포와 기능적, 유전적으로 유사한 특성을 가진 신경세포 및 가바성 신경세포를 제조하는 데에 유용하게 사용될 수 있으며, 최종 순수 분리된 신경세포 및 가바성 신경세포는 신경학적 질환의 치료 약물을 개발하기 위한 약물 스크리닝, 및 약물 독성분석에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

지방세포 유래 중간엽 줄기세포 ( hADSC ) 배양

지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 유지하기 위해 DMEM 기본 배지에 10% 우태아 혈청, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 배지에서 배양하며, 37℃ 5% CO ₂ incubator 에서 유지한다. 그런 다음, 0.25% trypsin-EDTA를 세포를 배양한 디쉬에 처리하여 세포를 떼어낸 후, 젤라틴 코팅이 된 10㎝ ² 조직배양 디쉬에 8 X 10 ⁴ 세포수로 넣어 4일 간격으로 계대배양하였다. 배지는 이틀에 한번씩 새로운 배지로 갈아주고, 세포는 계대배양하는 passage를 9 이상 넘지 않도록 하였다.

< 실험예 1> 지방유래 줄기세포에서 유래된 유사 신경줄기세포로의 교차분화방법 확립의 확인

<1-1> 3단계 분화조건의 확립

지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포로 교차분화하는 방법을 위해, 아무런 처리 없이 3% knock out serum replacement (KOSR)를 넣은 조건과, 저분자 억제제 처리와 함께 3% KOSR을 넣은 조건으로 나누어 초기 비교실험을 진행하여 분화조건을 확립하였다.

분화는 크게 3단계로 나누어지며, 1 단계는 지방세포 유래 중간엽 줄기세포 2 X 10 ⁵ 세포를 6cm ² 의 젤라틴 코팅된 디쉬에 넣어 37℃ 5% CO ₂ 배양기에 하루 정도 배양한다. 다음날 전처리 유도 배지(pre-induction medium)로 갈아주는데, 배지의 조성은 DMEM F-12 기본배지에 3% KOSR, 1% Penicillin/ Streptomycin, 1% Glutamax, 1% non-essential amino acid 그리고 4 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor)가 포함되어 있으며 8일 동안 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 유지한다. 이 단계에서, 조건을 저분자 억제제인 10 μM SB431542, 0.1 ㎍/ml Noggin, 0.5 μM LDN193289을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어 신경줄기세포로의 분화를 비교하였다.

그 다음, 두번째 단계에서, 배지조성을 신경유도 배지(Neural induction medium)로 바꾸어 주는데, 이는 DMEM F-12:Neurobasal (1:1) 기본배지에 1% Glutamax, 3 mM D-glucose, 0.2 mM ascorbic acid, 1 mM sodium pyruvate, 2% B27 그리고 1% N2이 포함되어 있으며 5일 동안 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양하였다.

마지막 세번째 단계는 신경줄기 유사세포 수를 불리기 위해 신경유도 배지에 성장인자인 20 ng/ml bFGF와 20 ng/ml EGF(epidermal growth factor)가 포함된 성장 배지로 교체하여 7일간 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양한다. 그런 다음, 신경줄기세포로 제대로 분화가 되었는지 확인하기 위해, 3단계가 끝난 세포들을 PBS로 씻은 후 1X TryPLE select를 3~4분간 37℃ 배양기에서 처리하여 단일세포로 잘 부수어 준다. 그리고 미리 1 μg/ml Poly-L- ornithine (PLO)/ 10 μg/ml Fibronectin(FN)로 코팅시켜 준비한 6cm ² 디쉬와 12mm ² 의 커버 글래스를 넣은 4well 디쉬에 붙여 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 2~3일간 배양시킨 후 세포의 분화를 분석하였다. 6cm ² 디쉬는 real-time PCR 분석을 통해 타겟 유전자 발현을 비교하였고, 커버 글래스가 있는 4 well 디쉬는 면역형광염색법 분석을 통해 단백질 발현 및 발현 모양을 관찰하였다.

<1-2> Real time PCR을 통한 유도된 신경줄기세포의 분화 관련 유전자 발현정도 확인

상기 분화 유도된 신경줄기세포의 유전자 발현정도를 분석하기 위해, cell scraper를 이용하여 샘플링을 하고 Trizol reagent을 이용하여 매뉴얼 방법대로 Total RNA를 분리하였다. 분리한 Total RNA는 M-MLV 역전사 효소를 통해 42℃에서 1시간 반응으로 _C DNA로 합성하였다. 합성된 _C DNA를 주형으로 SYBR Green gene expression assays 분석을 통해 유전자 발현을 비교하였고, 비교하고자 하는 타겟 유전자 및 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 타겟 유전자의 발현량은 endogenous GAPDH에 의해 표준화 시키고, 유전자 레벨의 비교는 측정 유전자의 Ct 값 비교법을 이용하였다. Ct 값은 형광 레벨이 임계값에 도달하는 cycle 주기로 ΔC t 값은 표적 유전자 [ Δ C t = C t(target)- C t( GAPDH )]의 값으로부터 GAPDH의 값을 제거한, CT 값을 계산함으로써 결정하였고, 표준 발현 유전자를 타겟 유전자의 상대값 GAPDH = 2 ^{Δ C t} 의 ΔCT으로 나타내었다.

<1-3> 면역형광염색법을 통한 유도된 신경줄기세포의 분화 관련 단백질 발현 확인

4 well 디쉬에 유지하던 유도된 신경줄기세포를 4%의 포름알데하이드를 이용하여 15분간 고정시킨 후 칼슘 이온과 마그네슘 이온이 포함된 PBS(phosphate buffered saline)로 두번 세척하였고, 항체의 투과를 위해 PBS에 계면활성제 종류인 Triton X-100을 0.1%로 희석하여 10분에 한번씩 두번 처리하였다.

그리고 비특이적 항체가 붙어 검출되는 것을 막기 위해 염소 혈청을 0.1% Triton X-100/PBS에 5%로 희석하여 넣어 시료에 1시간 반응시킨다. 1차 항체는 세포에 따라 붙이는 항체 종류가 다르며, 단백질에 따른 타겟 항체 및 희석양을 표 2에 나타내었다.

1차 항체를 붙인 뒤 4℃ shaker에서 16시간 동안 반응시켰다. 2차 항체는 1차항체의 숙주(host)와 파장에 따라 선택하여 사용하였으며, goat anti-(mouse IgG)-conjugated Alexa Fluor® 555 (1:200 희석), goat anti-(mouse IgG)-conjugated Alexa Fluor® 488 (1:200 희석), goat anti-(rabbit IgG)-conjugated Alexa Fluor® 555 (1:200 희석) 그리고 goat anti-(rabbit IgG)-conjugated Alexa Fluor® 488 (1:200 희석)을 사용하였다. 또한 DAPI (1:1000 희석)를 이용하여 핵을 염색하였다.

염색이 완료된 시료는 공초점 현미경 (confocal laser-scanning microscope)인 Carl Zeiss LSM700을 이용하여 촬영 및 분석하였고, 상기의 과정은 도 1a에 도식화하였다.

그 결과, 도 1B 내지 1D에 나타난 바와 같이, 유도신경줄기세포는 신경줄기세포 교차분화 과정에서 저분자 억제제 처리군과 미처리군 모두에서 크기가 작아지고 균일한 형태를 보였다(도 1B). 그러나, 도 1c에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포의 분자표지인 Nestin, Sox1, Pax6, Musashi-1, Vimentin, Olig2, Nkx2.1, FoxG1, Tuj1, 및 Ascl1의 mRNA 발현이 저분자 억제제 처리 조건과 미처리 조건에서 모두 증가하였으나, 저분자억제제를 처리한 군이 미처리 군보다 신경줄기세포 분자표지 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 1C). 또한, 형광 유세포 분석기기 (FACS Caliber)를 이용해 신경세포막 부착 단백질 (neural cell adhesion molecule; NCAM)을 유세포 분석하여 유도 신경줄기세포를 정량하였다(도 1D).

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 형광 면역세포염색법분석을 통해 Nestin과 Sox2를 모두 발현하는 유도 신경줄기세포의 검출을 확인하였고(도 2A), 실시간 유전자 증폭 분석을 통해, 신경줄기세포 교차분화과정을 따라 신경줄기세포와 초기 신경세포 분자표지 (Sox1, Sox2, Nestin, Musashi-1, FoxG1, Nkx2.1, Pax6, Gli3, Vimentin, Tuj1, Emx1)의 발현 변화가 나타남을 확인하였다(도 2B).

< 실험예 2> 지방유래 줄기세포에서 성숙한 신경세포로의 분화방법 확립의 확인

상기 <실험예 1>의 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 신경줄기세포로 분화하는 방법을 바탕으로 3단계의 분화방법으로 진행하여, 신경줄기세포와 유사한 특성을 가진 세포들이 불균질하게(heterogeneous) 존재하였고 이를 성숙한 신경세포로 분화시키기 위해 하기 실험을 수행하였다.

구체적으로, 지방세포 유래 중간엽 줄기세포 2 X 10 ⁵ 개를 6 cm ² 의 젤라틴 코팅된 디쉬에 넣어 37℃ 5% CO ₂ 배양기에 하루 동안 배양하였다. 다음날 DMEM F-12 기본 배지에 3% KOSR(knockout serum replacement), 1% Penicillin/ Streptomycin, 1% Glutamax, 1% non-essential amino acid 그리고 4 ng/ml bFGF를 첨가한 전처리 유도배지(pre-induction medium)에 저분자 억제제인 10 μM SB431542, 0.1 ㎍/ml Noggin, 0.5 μM LDN193289를 첨가한 배지로 갈아주고, 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 6일 동안 배양한다. 두 번째 단계에서, 2% B27과 1% N2가 포함된 신경유도 배지 (neural induction medium)로 바꾸어 주고 5일 동안 37℃ 5% CO ₂ 배지에서 배양한다. 그런 다음, 마지막 세번째 단계로 신경줄기 유사세포 수를 불리기 위해 신경유도 배지에 성장인자인 20 ng/ml bFGF와 20 ng/ml EGF가 포함된 성장 배지로 교체하여 5일간 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양한다. 그 후, 성숙한 신경세포로 분화시키기 위해, 상기 3단계의 분화과정이 끝난 세포들을 PBS로 씻은 후 1X TryPLE select를 3~4분간 37℃ 배양기에서 처리하여 단일세포로 잘 부수어 준다. 그리고 미리 PLO/FN 코팅된 35 mm ² 디쉬에 1 X 10 ⁶ 세포수로, 12 mm ² 커버 글래스가 들어있는 4 well 디쉬에는 1 X 10 ⁵ 세포수/well로 넣고 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양기에서 하루 동안 안정화시킨다. 다음날, 신경유도 배지에 1 μM purmorphamin과 10 ng/ml BDNF(brain-derived neurotrophic factor)를 포함한 배지로 갈아주고, 12~14일 동안 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 3일에 한번씩 새로운 배지로 갈아주면서 배양한다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 유도 신경세포는 작은 세포체에서 나온 양극 또는 다극 신경돌기를 가지는 것과는 달리 성숙된 신경세포와 같은 형태를 나타내었다(도 3B).

또한, 실시간 유전자 증폭 분석법을 통해 정량분석을 수행하여, 신경세포의 분자표지인 Tuj1, MAP2와 발달과정 중 초기와 후기에 발현되는 내측 신경절 융기(medial ganglionic eminence; MGE) 관련 전사인자들 (FoxG1, Nkx2.1, Pax6, Dlx2, Dlx5, Lhx6), 그리고 초기 GABA 분자표지 (GAD67)와 나트륨이온채널 유전자(SCN5A)의 발현 변화를 확인한 결과, 유도 신경세포에서 성숙한 신경세포와 관련된 유전자들의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 3C).

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 유도 신경세포에서 신경세포 전구세포 분자표지들(TuJ1, Pax6), 성숙한 신경세포 분자표지들(NeuN/MAP2), 성상세포 분자표지들(GFAP/S100), 초기 희소돌기아교세포 분자표지(Olig2)과 같은 뇌 발달과 관련된 신경세포 분자표지들이 발현됨을 확인하였고(도 4A), 이러한 분자표지를 단독 또는 공통적으로 발현하는 유도 신경세포의 수의 비율을 정량적으로 확인하였다(도 4B). 또한, 도 4c에 전형적인 신경세포의 형태를 가지는 유도 신경세포로부터 측정된 전기생리학적 기록 표본을 나타내었으며, 표본 이미지와 전류 주입에 의한 활동전위 유도를 나타내었다. 전류 주입 프로토콜은 활동전위 기록 아래에 나타나있고, 하단부 기록은 전압고정 클램프 방식(-60mV 고정)에서 유도 신경세포로부터 얻어진 대표적인 자발적 시냅스 활동이다. 확대한 단일 전류는 연속적으로 나타낸 기록 아래에 나타내었다(도 4C).

<실험예 3> 지방유래 줄기세포에서 가바성 신경세포로의 분화방법 확립의 확인

마찬가지로, 상기 <실험예 1>에서 확립한 3 단계의 분화방법을 바탕으로 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 가바성 신경세포로 분화시키는 방법을 확립하였다. 신경성숙 배지에서 배양하는 일수를 늘이기 위해 신경줄기세포 교차분화 일수를 단축하였고 이어 purmorphamine, BDNF로 구성된 신경세포유도 배지와 dbcAMP와 BDNF로 구성된 신경세포성숙 배지를 이용하였다.

구체적으로, 지방세포 유래 중간엽 줄기세포 2 X 10 ⁵ 세포를 6 cm ² 의 젤라틴 코팅된 디쉬에 넣어 37℃ 5% CO ₂ 배양기에 하루 동안 배양하였다. 다음날, DMEM F-12 기본 배지, 3% KOSR, 1% Penicillin/ Streptomycin, 1% Glutamax, 1% nonessential amino acid 그리고 4 ng/ml bFGF의 전처리 유도배지(Pre-induction medium)에 저분자 억제제인 10 μM SB431542, 0.1 ㎍/ml Noggin, 0.5 μM LDN193289를 첨가한 배지로 갈아주고, 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 6일 동안 배양하였다. 상기 단계 1의 배양이 끝난 후, 세포를 PBS로 씻은 후 1X TryPLE select를 3~4분간 37℃ 배양기에서 처리하여 단일세포로 잘 부수어 PLO/FN 코팅된 35 mm ² 디쉬에 1 X 10 ⁶ 세포수로, 12 mm ² 커버 글래스가 들어있는 4 well 디쉬에는 1 X 10 ⁵ 세포수/well로 나누어 넣고 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양기에서 하루 동안 안정화 시킨다. 두 번째 단계인 2% B27과 1% N2가 포함된 신경유도 배지 (neural induction medium)로 바꾸어 주고 5일 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한다. 그런 다음, 가바성 신경세포로 분화시키기 위해, 신경세포 분화 조건인 신경유도 배지에 1 μM purmorphamine과 10 ng/ml BDNF를 포함한 배지로 갈아주고, 10 내지 14일 동안 37℃ 5% CO ₂ 배양기에서 배양하는데 동일하게 3일에 한번씩 새로운 배지로 갈아준다. 10 내지 14일 동안 신경세포로 분화시킨 후, 가바성 신경세포로 더 분화를 유도시키기 위해 신경유도 배지에 50 μM dbcAMP와 20 ng/ml BDNF를 첨가하여 13~20일 동안 분화를 더 시켰다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 유도 가바성 신경세포는 신경구 유사 집단에서부터 뻗어 나오는 수 많은 방사형의 신경돌기를 나타내었고, 유도 가바성 신경세포 중 많은 수가 내측 신경절 융기 (MGE) 세포 분자표지인 NKX2.1, DLX2, LHX6와 신경세포 분자표지인 TuJ1, MAP2를 발현함을 확인하였고(도 5B), 이러한 분자표지를 단독 또는 공통적으로 발현하는 유도 가바성 신경세포의 수의 비율을 정량적으로 확인하였다(도 5C). 또한, 유도 가바성 신경세포는 신경구 유사 세포 집단에서부터 뻗어 나오는 신경돌기를 나타내었고, 신경미세섬유 분자표지인 neurofilament-M (NF-M)을 발현함을 확인하였다(도 5D).

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시간 유전자 증폭 분석법의 결과, 신경세포 (MAP2), 내측 신경절 융기(MGE) 전사인자(Dlx2, Dlx5), 성상세포 (GFAP), 칼슘결합단백질 (CALB2), GABA 수용체 (GABRA1. GABRA2, GABRA5) 그리고 GABA (GAD65, GAD67)의 유전자 발현의 변화를 확인하였다. 대부분의 시험관 배양 32일 차의 분화 일수가 높은 유도 가바성 신경세포는 시험관 배양 25일 차의 유도 가바성 신경세포 보다 성숙한 가바성 신경세포의 유전자 발현의 극적인 증가를 보인 반면, 상대적으로 초기 가바성 신경세포 유전자 발현의 감소를 보였다(도 6A 및 6B). 또한, 형광 면역세포염색법 분석을 통해 가바성 신경세포와 성숙한 신경세포의 분자표지(GABA/MAP2, GAD/MAP2, PSD95/MAP2, PSD95/SYP)를 모두 발현하고 있음을 확인하였고(도 6C), 이를 정량적으로 확인하였다(도 6D). 또한, 도 6E의 하단 오른쪽에 나타난 바와 같이, 글루탐산 수용체 차단제 (50 M APV and 20 M CNQX)가 함께 있을 때의 자발적 억제성 시냅스 후 전류 (IPSC)가 나타났다가 GABA _A 수용체 차단제인 10 M bicuculline을 처리하면 사라짐을 확인하였다(도 6E).

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Differentiation method of adipose-derived mesenchymal stem cells into neural stem cells, neural cells, and GABAergic neural cells <130> 2016P-06-017 <150> KR 10-2016-0044968 <151> 2016-04-12 <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB2 F <400> 1 ctccaggaat acacccaaa 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB2 R <400> 2 cagctcatgc tcgtcaatgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlx2 F <400> 3 gcacatgggt tcctaccagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlx2 R <400> 4 tccttctcag gctcgttgtt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlx5 F <400> 5 ccaaccagcc agagaaagaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dlx5 R <400> 6 gcaaggcgag gtactgagtc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Emx1 F <400> 7 aagcgcggct ttaccataga g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Emx1 R <400> 8 gctggggtga gggtagttg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxG1 F <400> 9 agaagaacgg caagtacgag a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxG1 R <400> 10 tgttgaggga cagattgtgg c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA1 F <400> 11 ggattgggag agcgtgtaac c 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA1 R <400> 12 tgaaacgggt ccgaaactg 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA2 F <400> 13 gttcaagctg aatgcccaat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA2 R <400> 14 acctagagcc atcaggagca 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA5 F <400> 15 atcttggatg ggctcttgg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GABRA5 R <400> 16 tgtactccat ttccgtgtcg 20 <210> 1 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAD65 F <400> 17 ggtggctcca gtgattaaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAD65 R <400> 18 tgtccaaggc gttctatttc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAD67 F <400> 19 aggcaatcct ccaagaacc 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAD67 R <400> 20 tgaaagtcca gcaccttgg 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP F <400> 21 caacctgcag attcgagaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP R <400> 22 gtcctgcctc acatcacatc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gli3 F <400> 23 tggttacatg gagccccact a 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gli3 R <400> 24 gaatcggaga tggatcgtaa tgg 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHX6 F <400> 25 gggcgcgtca taaaaagcac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Ar tificial Sequence <220> <223> LHX6 R <400> 26 tgaacggggt gtagtggatg 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Map2 F <400> 27 cgctcagaca cccttcagat aac 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Map2 R <400> 28 aaatcatcct cgatggtcac aac 23 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mash1 F <400> 29 tgcactccaa tcattcacg 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mash1 R <400> 30 gtgcgtgtta gaggtgatgg 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Musashi F <400> 31 ttcgggtttg tcacgtttga g 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Musashi R <400> 32 ggcctgtata actccggctg 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin F <400> 33 cacctgtgcc agcctttctt a 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin R <400> 34 tttcctccca ccctgtgtct 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Seque nce <220> <223> NKX2.1 F <400> 35 gtgagcaaga acatggccc 19 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2.1 R <400> 36 aaccagatct tgacctgcgt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig2 F <400> 37 gctgcgacga ctatcttccc 20 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig2 R <400> 38 gcctcctagc ttgtcccca 19 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6 F <400> 39 aggtattacg agactggctc c 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6 R <400> 40 tcccgcttat actgggctat tt 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCN5A F <400> 41 ggatcgagac catgtgggac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCN5A R <400> 42 gctgtgaggt tgtctgcact 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox1 F <400> 43 agatgccaca ctcggagatc a 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox1 R < 400> 44 gagtacttgt cctccttgag cagc 24 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 F <400> 45 agtctccaag cgacgaaaaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 R <400> 46 gcaagaagcc tctccttgaa 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TuJ1 F <400> 47 ggcctttgga catctcttca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TuJ1 R <400> 48 atactcctca cgcaccttgc 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin F <400> 49 agaactttgc cgttgaagct g 21 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin R <400> 50 ccagagggag tgaatccaga tta 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 51 gtcagtggtg gacctgacct 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 52 caccaccctg ttgctgtagc 20