技术领域
[0001] 本
发明属于胰岛细胞移
植物制备技术领域，涉及一种包裹胰岛细胞团的微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 糖尿病是一种普遍的复杂代谢性
疾病,据最新报告，2017年全球约4.25亿成人患糖尿病，平均每11个人中就有1位患病。其中，中国患病人数达1.14亿人，糖尿病负担最重。注射胰岛素是目前控制糖尿病的有效手段，但是外源性的胰岛素并不能达到生理性调节血糖的作用，因此糖尿病并发症难以得到改善，从而大大降低患者的
生活质量，最终导致死亡。
[0003] 研究发现，胰岛替代
治疗即胰腺(胰岛)移植是目前很好的治疗糖尿病的手段之一。然而，人胰腺(胰岛)供体的匮乏致使众多糖尿病患者无法进行胰岛移植。因此，近年来利用猪胰岛细胞异种移植代替人胰岛移植有望成为解决供体匮乏的重要途径。但是，猪胰岛移植过程中存在缺
氧、缺少营养物质和免疫排斥等问题，仍然是猪胰岛移植成功的重大障碍。如何在移植过程中和移植后保护猪胰岛细胞，是临床急需解决的重大课题。
[0004] “人工细胞”伴随着包裹技术和微囊化技术的出现开始在
生物医学领域获得广泛应用。人工细胞的概念由Chang，T.M.S提出于1965年，至今已有四十年历史，其概念是将包括细胞、酶和
吸附剂在内的生命材料用
生物相容性高分子膜包裹起来，形成细胞微胶囊。通过微胶囊的选择渗透性对细胞起到免疫保护作用。使用微囊化胰岛目前主要移植到
腹腔或者大网膜，在移植的过程中，大多数微囊化胰岛因为缺氧和饥饿导致凋亡，从而无法达到预期的治疗效果。
[0005] 间充质干细胞(MSC)本质上是存在于成体组织中的成体多能干细胞，能分泌多种白介素和趋化因子、造血及非造血生长因子,如M-CSF、SCF、FIT-3配基、TPO、IL-6、IL-8、IL-12D等，这些因子对胰岛细胞团的保护和修复起到重要作用。然而，要利用间充质干细胞对胰岛细胞团起到保护和修复作用，需要大量的间充质干细胞。通过猪来源可以获得足量的所需间充质干细胞量，且猪来源的间充质干细胞分泌的因子，可以被猪胰岛细胞更好的利用保护和修复自身。
[0006] 目前虽然有将营养物质与胰岛细胞混合包裹的微囊，但是营养物质在微囊移植后仍然会很快流失，无法长期供给胰岛细胞营养物质。而间充质干细胞可以被固定在微囊内，分泌多种营养物质，以供胰岛细胞摄取。尤其是MSC受到缺氧、缺少营养物质等恶劣条件刺激下，会分泌许多保护因子，被包裹在其中的胰岛细胞能不断摄取营养因子来抵抗移植过程中的多种损伤机制。然而目前，还没有见到将MSC细胞与胰岛细胞团共同包裹成微囊的产品以及方法。
[0007] 此外，MSC细胞易于分化，因此将MSC和胰岛细胞共同包裹之后还要让MSC能一直保持其原有形态长期分泌营养因子，因此，要阻止MSC与胰岛细胞直接
接触，包裹MSC和胰岛细胞团的过程要分段进行。
发明内容
[0008] 本发明的首要目的是针对目前胰岛细胞移植过程中存在的免疫排斥、缺氧、饥饿等问题，提供一种利用间充质干细胞围绕胰岛细胞团制备的微胶囊。
[0009] 一种胰岛细胞微胶囊：是包括间充质干细胞和胰岛细胞团的微胶囊。
[0010] 进一步的，所述的胰岛细胞微胶囊：所述的间充质干细胞包裹胰岛细胞团。
[0011] 间充质干细胞在外部收到外界条件刺激会优先分泌抵抗的营养因子，胰岛细胞摄取了这些因子以后具有更好的抵抗能
力，因为胰岛细胞团不能自我增殖和修复，所以一旦胰岛细胞团优先被外界条件刺激损伤以后，MSC再分泌得到的营养因子无法修复胰岛细胞团。因此，本发明采用了间充质干细胞包裹胰岛细胞团微胶囊的结构。
[0012] 进一步的，所述的胰岛细胞微胶囊：在微胶囊化的胰岛细胞团表面包裹间充质干细胞，再进行胶囊化，形成包含间充质干细胞和胰岛细胞的微胶囊。
[0013] 进一步的，所述的胰岛细胞微胶囊：间充质干细胞来源于猪脐带间充质干细胞或者猪骨髓间充质干细胞，且都为P1-P2代的间充质干细胞，胰岛细胞团来源于猪。
[0014] 本发明的第二个目的是提供上述胰岛细胞微胶囊的制备方法。
[0015] 所述的胰岛细胞微胶囊的制备方法：采用制备微胶囊的材料与胰岛细胞团制备胰岛细胞团微胶囊；然后采用间充质干细胞，以及制备微胶囊的材料，再次包裹胰岛细胞团微胶囊。
[0016] 第一次包裹制备的胰岛细胞团微胶囊直径在300～400微米之间，第二次包裹制备的MSC包裹胰岛的微胶囊直径在500～600微米左右。
[0017] 制备微胶囊的材料包括海藻酸钠和氯化
钙。
[0018] 进一步的，所述的胰岛细胞微胶囊的制备方法：包括以下步骤：
[0019] (1)将胰岛细胞团均匀混合于海藻酸钠溶液中，再将混合溶液缓慢滴入
氯化钙溶液中，形成胰岛细胞团微胶囊；
[0020] (2)将胰岛细胞团微胶囊与猪间充质干细胞均匀混合于海藻酸钠溶液中，再将混合溶液缓慢滴入氯化钙溶液中，形成间充质干细胞包裹胰岛细胞团的微胶囊。
[0021] 进一步的，所述的制备微胶囊的材料包括：0.5～5％海藻酸钠溶液和50～500mM氯化钙溶液。
[0022] 进一步的，步骤(1)将5000～15000IEQ胰岛细胞团均匀混合于0.5～1.5ml 0.5～5％的海藻酸钠溶液中，缓慢滴入50～100ml 50～500mM氯化钙溶液中。
[0023] 步骤(2)将步骤(1)过滤后得到的胰岛细胞团微胶囊以及2.5×106～7.5×106个间充质干细胞均匀混合于1ml 0.5～5％的海藻酸钠溶液中，缓慢滴入50-100ml 50～500mM氯化钙溶液中。
[0024] 进一步的，所述的胰岛细胞微胶囊的制备方法，制备胰岛细胞团胶囊使用27G
注射器针头，以每毫升2～3min速度滴注；制备间充质干细胞和胰岛细胞团微胶囊使用23G注射器针头，以每毫升3～5min速度滴注。
[0025] 所述的胰岛细胞微胶囊的应用，用于胰岛细胞的移植。
[0026] 本发明针对目前胰岛移植，尤其是猪胰岛细胞移植存在的缺氧、饥饿，免疫排斥等问题，利用猪间充质干细胞、海藻酸钠-氯化钙微胶囊，开发了一种利用猪间充质干细胞围绕猪胰岛细胞制备的微胶囊。通过猪间充质干细胞在缺氧、饥饿条件刺激下，分泌的各种因子，包括：提高猪胰岛细胞的耐缺氧、抗
炎症、抗凋亡因子，保护和修复猪胰岛细胞。并且通过微胶囊的隔离作用和间充质干细胞的免疫调节功能来降低猪胰岛免疫排斥作用，从而在移植过程中和移植后保护猪胰岛细胞。
附图说明
[0027] 图1为用AO/EB
染色法检测猪胰岛细胞的活力；
[0028] a为单独包裹猪胰岛团微胶囊；
[0029] b为本发明猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊；
[0030] c为单独包裹猪胰岛团微胶囊AO/EB染色；
[0031] d为本发明包裹猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊AO/EB染色。
[0032] 图2为用
葡萄糖刺激试验检测猪胰岛微胶囊(左)和本发明的猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞团微胶囊(右)功能。
[0033] 图3为猪胰岛微胶囊和本发明猪间充质干细胞包裹胰岛细胞团微胶囊分别移植到糖尿病裸鼠腹腔一个月的血糖监测状况。
[0034] 图4为猪胰岛微胶囊和本发明猪间充质干细胞包裹胰岛细胞团微胶囊DTZ染色结果。
[0035] 图中g为小鼠中微囊回收；
[0036] h为
显微镜下回收的单独包裹胰岛团微胶囊细胞形态；
[0037] j为显微镜下回收的本发明猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊细胞形态；
[0038] k为回收的本发明猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊细胞DTZ染色。
[0039] 图5为对比
实施例1制备的包裹猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊。
[0040] 图6为对比实施例1制备的包裹猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊移植到糖尿病裸鼠腹腔一个月的血糖监测状况。
[0041] 图7为对比实施例1制备的包裹猪间充质干细胞包裹胰岛的微胶囊DTZ染色结果。
[0042] 图8为包裹了VEGF和猪胰岛细胞团的微胶囊(中)、猪胰岛微胶囊(左)和本发明猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞团微胶囊(右)3种微胶囊对胰岛细胞的保护作用。
具体实施方式
[0043] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0044] 实施例1
[0045] 猪胰岛细胞团微胶囊和本发明猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞微胶囊制备[0046] 猪胰岛细胞计数：每次于猪胰岛细胞悬液中取出50μl样品，镜下计数DTZ阳性细胞团并重复取样3次，按下列公式计数胰岛：胰岛产量＝(3次阳性胰岛数值之和/3)×[样本总量(ml)/50μl]。
[0047] 将一份10000IEQ胰岛细胞团均匀分布于1ml 2％海藻酸钠溶液中，用27G注射器针头以每毫升2～3min速度将胰岛细胞海藻酸钠悬液滴入50ml的100mM氯化钙溶液中，形成直6
径300μm左右的猪胰岛微胶囊，收集猪胰岛细胞团微胶囊与5×10个猪间充质干细胞和1ml
2％海藻酸钠溶液混匀，用23G注射器针头以每毫升3～5min速度将猪胰岛细胞团微胶囊与猪间充质干细胞的海藻酸钠混匀溶液滴入50ml的120mM氯化钙溶液中，形成直径500～600μm间充质干细胞包裹猪胰岛的微胶囊。
[0048] 另将一份10000IEQ胰岛细胞团均匀分布于1ml 1～2％海藻酸钠溶液中，用27G注射器针头以每毫升2～3min速度将胰岛细胞海藻酸钠悬液滴入50ml的120mM氯化钙溶液中，形成直径300μm猪胰岛微胶囊。猪胰岛微胶囊和猪间充质干细胞包裹的猪胰岛细胞团微胶囊分别置于2％血清浓度，37℃，5％二氧化
碳,2％缺氧条件下培养24h。用AO/EB染色法检测猪胰岛细胞的活力，用葡萄糖刺激试验检测猪胰岛微胶囊和猪间充质干细胞包裹猪胰岛微胶囊功能。
[0049] 图1结果显示，猪间充质干细胞包裹猪胰岛微胶囊中在缺氧24h情况下胰岛活力完好，而胰岛微胶囊在缺氧24h以后部分胰岛细胞已经开始凋亡。在缺氧24h后，猪间充质干细胞包裹猪胰岛微胶囊在糖刺激情况下胰岛素释放量也比猪胰岛微胶囊释放的胰岛素高。因此，猪间充质干细胞包裹猪胰岛微胶囊可以很好的提高猪胰岛细胞存活，抵抗缺氧，饥饿等恶劣情况。
[0050] 实施例2猪胰岛细胞微胶囊和猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞团微胶囊糖尿病小鼠移植实验
[0051] 按照实施例1中所述方法制备猪胰岛微胶囊和猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞团微胶囊，分别移植到糖尿病裸鼠腹腔中。每组各5只小鼠，每只小鼠按照2000IEQ猪胰岛细胞量移植。每2天监测小鼠血糖，监测一个月。回收微胶囊，做DTZ染色。图4实验结果显示，猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞微胶囊在一个月后还能回收到有功能的胰岛细胞团，DZT染色可以将猪胰岛细胞染成猩红色，而猪胰岛微胶囊中的胰岛细胞大部分都凋亡了。利用猪间充质干细胞可以很好靶向保护猪胰岛细胞，提高猪胰岛的疗效。
[0052] 对比实施例1
[0053] 按照实施例1中的方法以1.2×107个MSC细胞包裹10000IEQ胰岛细胞微胶囊(实施例1中为5×106个MSC细胞包裹10000IEQ胰岛细胞微胶囊)。从图5中可以明显看出MSC细胞比例太高包裹出来的微胶囊外表不圆滑，外层的部分MSC细胞没有包裹完全。将微胶囊移植到5只糖尿病裸鼠腹腔中，每只2000IEQ。每2天监测小鼠血糖，监测一个月，见图6。回收微胶囊，做DTZ染色。图7实验结果显示，可以回收到少量有部分功能的胰岛，胰岛微胶囊大多破裂从而回收不到。
[0054] 对比实施例2
[0055] 按照实施例1中的方法，在1ml海藻酸钠溶液中加入50ng VEGF与猪胰岛细胞团混合，制备包裹了VEGF和猪胰岛细胞团的微胶囊，再与实施例1制备的猪胰岛微胶囊和猪间充质干细胞包裹猪胰岛细胞团微胶囊，3种微胶囊分别置于2％血清浓度，37℃，5％二氧化碳，2％缺氧条件下培养48h和72h。用MTS检测胰岛细胞的活率。图8结果显示VEGF与猪胰岛细胞团混合包裹制备的微胶囊在48h内对胰岛细胞有一定的保护作用，而MSC细胞包裹猪胰岛细胞团的微胶囊可以在72h还具备对胰岛的保护作用，说明MSC细胞包裹猪胰岛细胞团的微胶囊对胰岛的保护时间更长。
