腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
阅读：328发布：2020-05-13
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1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含：
a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白赋予以下特性中的一种或多种：
i)与包含野生型AAV病毒体的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比，提高的对所述神经干细胞的感染性；
ii)与包含野生型AAV病毒体的对照AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比，提高的对所述神经元细胞的感染性；
iii)与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体跨过细胞屏障的能力相比，提高的跨过所述细胞屏障的能力；
iv)与由包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比，提高的所述抗性；以及
b)包含编码异源基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
2.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：
a)来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；
b)来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；
c)来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；
d)来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及
e)来自所述第二AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
3.如权利要求2所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
4.如权利要求2所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
5.如权利要求2所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
6.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：
a)来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；
b)来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；
c)来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；
d)来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及
e)来自第四AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
7.如权利要求6所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
8.如权利要求6所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
9.如权利要求6所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
10.如权利要求6所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
11.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：
a)来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；
b)来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；
c)来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；
d)来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及
e)来自第四AAV血清型的氨基酸201-800的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
f)来自所述第四AAV血清型的氨基酸251-960的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；
g)来自所述第二AAV血清型的氨基酸301-1120的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及
h)来自所述第二AAV血清型的氨基酸351至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。
12.如权利要求11所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
13.如权利要求11所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
14.如权利要求11所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
15.如权利要求11所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
16.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：
a)来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；
b)来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；
c)来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；
d)来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及
e)来自第四AAV血清型的氨基酸201-800的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
f)来自所述第四AAV血清型的氨基酸251-960的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；
g)来自所述第二AAV血清型的氨基酸301-1120的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及
h)来自所述第二AAV血清型的氨基酸351至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。
17.如权利要求16所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
18.如权利要求16所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
19.如权利要求16所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
20.如权利要求16所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
21.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的所述对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍的对所述神经干细胞的感染性。
22.如权利要求21所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
23.如权利要求21所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
24.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的所述对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比呈现出提高至少10倍的对所述神经干细胞的感染性。
25.如权利要求24所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
26.如权利要求24所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
27.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与图8中所描绘的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
28.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与图8中所描绘的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
29.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含图8中所描绘的氨基酸序列。
30.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与图9中所描绘的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与图9中所描绘的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
32.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含图9中所描绘的氨基酸序列。
33.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出提高的所述抗性。
34.如权利要求33所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
35.如权利要求33所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
36.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出高至少约1.5倍的所述抗性。
37.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出高至少约3倍的所述抗性。
38.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出高至少约5倍的所述抗性。
39.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出高至少约10倍的所述抗性。
40.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述神经干细胞来自室管膜下区。
41.如权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述神经干细胞来自小脑。
42.如权利要求1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是干扰RNA或适体。
43.如权利要求1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是多肽。
44.如权利要求43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是神经保护性多肽、抗血管生成多肽、诱导神经干细胞分化的多肽，或增强神经干细胞功能的多肽。
45.如权利要求43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是脑活素、层粘连蛋白-IKVAV、cripto、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、纤毛神经营养因子、表皮生长因子、X连锁的凋亡抑制蛋白、芳族L-氨基酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、三肽基肽酶、天冬氨酸环化酶，或音猬因子。
46.如权利要求43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是基因组编辑酶。
47.如权利要求46所述的rAAV病毒体，其中所述基因组编辑酶是Cas9多肽、锌指核酸酶、TALEN，或无酶活性的II型CRISPR/Cas多肽。
48.如权利要求47所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是选自以下的RNA指导的核酸内切酶：II型CRISPR/Cas多肽、V型CRISPR/Cas多肽，以及VI型CRISPR/Cas多肽。
49.如权利要求1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是RNA指导的核酸内切酶和指导RNA。
50.一种药物组合物，其包含：
a)如权利要求1-49中任一项所述的重组腺相关病毒病毒体；以及
b)药学上可接受的赋形剂。
51.一种将基因产物递送到个体中的神经干细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1-49中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体或如权利要求50所述的组合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述施用是通过颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射进行。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述基因产物是短干扰RNA或适体。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述基因产物是多肽。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述多肽是神经保护性多肽、抗血管生成多肽、诱导神经干细胞分化的多肽，或增强神经干细胞功能的多肽。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述多肽是脑活素、层粘连蛋白-IKVAV、cripto、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、纤毛神经营养因子、表皮生长因子、X连锁的凋亡抑制蛋白，或音猬因子。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述多肽是基因组编辑酶。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述基因组编辑酶是Cas9多肽、锌指核酸酶、TALEN、或无酶活性的II型CRISPR/Cas多肽。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述多肽是选自以下的RNA指导的核酸内切酶：II型CRISPR/Cas多肽、V型CRISPR/Cas多肽，以及VI型CRISPR/Cas多肽。
60.如权利要求51所述的方法，其中所述基因产物是RNA指导的核酸内切酶和指导RNA。
61.一种治疗神经病症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的根据权利要求1-49中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体或如权利要求50所述的组合物。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述神经病症是脊髓小脑共济失调、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、溶酶体贮积症、弗里德希共济失调、成胶质细胞瘤、雷特综合征、额颞叶痴呆，或癫痫。
63.一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比赋予提高的对所述神经干细胞的感染性。
64.一种分离的经遗传修饰的宿主细胞，其包含如权利要求63所述的核酸。
65.一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比赋予提高的对所述神经干细胞的感染性。
腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
[0001] 交叉引用
[0003] 引言
[0004] 腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科和依赖病毒属，其成员需要与诸如腺病毒等辅助病毒进行合并感染以促进复制，并且AAV在辅助物不存在下建立潜伏感染。病毒体由25nm二十面体衣壳构成，其包括具有以下两个开放阅读框的4.7kb单链DNA基因组：rep和cap。非结构rep基因编码对病毒复制来说必要的四种调节蛋白，而cap编码装配成60聚体衣壳壳体的三种结构蛋白(VP1-3)。此病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物屏障的能力—包括细胞表面受体结合、胞吞、胞内运输、及核内的启封。
[0005] 在本领域中需要具有变体衣壳蛋白的AAV病毒体，所述变体衣壳蛋白赋予提高的跨过细胞屏障的能力和/或赋予提高的感染神经干细胞的能力和/或赋予提高的感染神经元细胞的能力。发明内容
[0006] 本公开提供了具有变体衣壳蛋白的重组腺相关病毒病毒体，其中所述重组AAV(rAAV)病毒体与对照AAV相比呈现出以下特性中的一种或多种：提高的跨过神经元细胞屏障的能力、提高的对神经干细胞的感染性、提高的对神经元细胞的感染性，以及降低的对抗体中和的易感性，且其中所述rAAV病毒体包含异源核酸。本公开提供了将基因产物递送到个体中的神经干细胞或神经元细胞的方法。本公开还提供了修饰存在于神经干细胞或神经元细胞中的靶核酸的方法。附图说明
[0007] 图1A至图1F提供了在应用最短路径重组问题(Recombination as a Shortest Path Problem,RASPP)方法之后的嵌合腺相关病毒(AAV)文库的SCHEMA指导设计。
[0008] 图2提供了用于设计构建体及扩增AAV cap基因的引物序列。
[0010] 图4提供了用于SCHEMA AAV文库的组合金门克隆的聚合酶链式反应(PCR)。
[0011] 图5提供了这样的引物，所述引物被设计为在区块接合处并入沉默突变以促进组合金门克隆到pBluescript载体主链中。
[0012] 图6A至图6D提供了关于AAV定向进化的Cre依赖性选择策略的绘图。
[0014] 图8提供了SCH9衣壳的氨基酸序列。
[0015] 图9提供了SCH2衣壳的氨基酸序列。
[0016] 图10提供了SCH9和SCH2 AAV cap氨基酸序列与亲本AAV血清型的氨基酸比对。SCH9氨基酸序列：SEQ ID NO:1；SCH2氨基酸序列：SEQ ID NO:2；AAV2衣壳氨基酸序列：SEQ ID NO:136；AAV6衣壳氨基酸序列：SEQ ID NO:11；AAV8衣壳氨基酸序列：SEQ ID NO:137；
AAV9衣壳氨基酸序列：SEQ ID NO:138。
AAV9衣壳氨基酸序列：SEQ ID NO:138。
[0017] 图11A至图11B提供了SCH9衣壳的三维模型。
[0018] 图12描绘了重组自补AAV载体的病毒基因组产量。
[0019] 图13A至图13I描绘了SCH9对室管膜下区(SVZ)中的神经干细胞的转导的影响。
[0020] 图14A至图14C描绘了在小脑浦肯野细胞中SCH9转导的标记物表达。
[0021] 图15描绘了在深部小脑核中单侧注射重组AAV1或SCH9之后三周GFP在小脑中的表达。
[0022] 图16A至图16C描绘了SCH9聚糖结合及对中和抗体的抗性的表征。
[0023] 图17描绘了与AAV2(一种已知利用AAVR的对照)相比，SCH2和SCH9的感染性。
[0024] 图18A至图18F提供了酿脓链球菌Cas9多肽和变体的氨基酸序列。
[0025] 图19提供了金黄色葡萄球菌Cas9多肽的氨基酸序列。
[0026] 图20A至图20C提供了各种Cpf1多肽的氨基酸序列。
[0027] 图21A至图21C提供了AAV衣壳蛋白环IV(GH环)区的氨基酸序列的比对。插入位点以粗体和下划线示出。
[0028] 定义
[0029] 如本文所用，术语“神经干细胞”(NSC)是指可以增殖、自我更新并分化成脑的主要成年神经细胞的未分化神经细胞。NSC能够自我维持(自我更新)，意味着在每次细胞分裂时，一个子细胞也将是干细胞。NSC的非干细胞子代被称为神经祖细胞。由单一多潜能NSC产生的神经祖细胞能够分化成神经元、星形胶质细胞(I型和II型)和少突胶质细胞。因此，NSC是“多潜能的”，因为它们的子代具有多个神经细胞的命运。因此，NSC在功能上可被定义为具有以下能力的细胞：1)增殖，2)自我更新，及3)产生可分化成中枢神经系统中所见的三种主要细胞类型的功能性子代：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。对于成熟神经元、成熟胶质细胞、成熟少突胶质细胞和成熟星形胶质细胞的标记物，NSC通常呈阴性。
[0030] 如本文所用，术语“神经祖细胞”或“神经前体细胞”指的是可以产生子代如神经元细胞(例如，神经元前体或成熟神经元)、神经胶质前体、成熟星形胶质细胞或成熟少突胶质细胞的细胞。典型地，细胞表达一些表型标记物，它们是神经谱系的特征。“神经元祖细胞”或“神经元前体细胞”是可以产生子代(也就是成熟神经元)的细胞。这些细胞可能有也可能没有产生胶质细胞的能力。
[0031] 如本文所用，“神经元细胞”与“神经细胞”可互换使用并且指的是中枢神经系统或外周神经系统的神经元和神经胶质。术语“神经元细胞”包括细胞如星形胶质细胞、少突胶质细胞和许旺氏细胞。该术语包括任何脑组织(例如，脑组织，诸如大脑半球、大脑皮层、皮层下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑)的神经元细胞。成熟神经元可以表达成熟神经元的一种或多种标记物，其中这类标记物包括例如巢蛋白、NeuroD1、神经元特异性烯醇酶(NSE)、神经元特异性核内蛋白(NeuN)、神经丝(NF)、S100β、tau、微管相关蛋白2(MAP2)、tau、双皮质素(DCX)等等。
[0032] “AAV”是腺相关病毒的缩写，且可用于指代病毒本身或其衍生物。除非另外需要，该术语涵盖所有亚型及天然存在的和重组的形式。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。术语“AAV”包括AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、AAV 9型(AAV-9)、AAV 10型(AAV-10)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV，以及羊AAV。“灵长类动物AAV”是指从灵长类动物中分离的AAV，“非灵长类动物AAV”是指从非灵长类哺乳动物中分离的AAV，“牛AAV”是指从牛哺乳动物(例如，奶牛)中分离的AAV等等。
[0033] 如本文所用，“rAAV载体”是指包含不是AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，该多核苷酸序列通常是用于引入靶细胞中的感兴趣序列。一般来说，异源多核苷酸侧接有至少一个，且一般两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体粒子和rAAV载体质粒。
[0034] “AAV病毒”或“AAV病毒粒子”或“rAAV载体粒子”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(通常包括野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化的多核苷酸rAAV载体构成的病毒粒子。如果所述粒子包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如有待递送给哺乳动物细胞的转基因)，那么其通常被称为“rAAV载体粒子”或简称为“rAAV载体”。因此，rAAV粒子的产生必然包括rAAV载体的产生，因为此类载体包含在rAAV粒子内。
[0035] “包装”是指引起AAV粒子的装配和衣壳化的一系列细胞内事件。
[0036] AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中被称为AAV“包装基因”。
[0037] 用于AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)由哺乳动物细胞来复制和包装的病毒。用于AAV的多种此类辅助病毒在本领域中是已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘)。腺病毒包括许多不同的亚组，但最通常使用亚组C的5型腺病毒。人、非人哺乳动物及鸟类来源的许多腺病毒是已知的且可从诸如ATCC等保藏机构获得。疱疹家族病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病毒(PRV)；它们也可获自诸如ATCC等保藏机构。
[0038] “辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所述的用于复制和包装的其它要求)。如本文所述，“辅助病毒功能”可以许多方式提供，包括通过向转运中的生产者细胞提供辅助病毒或提供例如编码必需功能的多核苷酸序列。
[0039] “感染性”病毒或病毒粒子是包含多核苷酸组分的病毒或病毒粒子，它们能够递送所述多核苷酸组分到病毒物种趋向的细胞中。该术语不一定意味着病毒的任何复制能力。如本文所用，“感染性”病毒或病毒粒子是可以到达靶细胞、可以感染靶细胞并且可以在靶细胞中表达异源核酸的病毒或病毒粒子。因此，“感染性”是指病毒粒子可以到达靶细胞、感染靶细胞并在靶细胞中表达异源核酸的能力。感染性可指的是体外感染性或体内感染性。
用于为感染性病毒粒子计数的测定在本公开的别处和本领域中描述。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。总病毒粒子可表示为病毒基因组(vg)拷贝的数量。
病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可称为“转导”。病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可使用许多技术来测定，包括评估标记物基因，如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如，其中病毒包含编码GFP的核苷酸序列)，其中GFP在感染了病毒粒子的细胞中产生并且检测和/或测量；或例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所产生的蛋白质。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。测定感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率的方法在本领域中是已知的。参见，例如Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337(描述了TCID50感染性滴度测定)；及Zolotukhin等人(1999)Gene Ther.6:973。
用于为感染性病毒粒子计数的测定在本公开的别处和本领域中描述。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。总病毒粒子可表示为病毒基因组(vg)拷贝的数量。
病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可称为“转导”。病毒粒子在细胞中表达异源核酸的能力可使用许多技术来测定，包括评估标记物基因，如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如，其中病毒包含编码GFP的核苷酸序列)，其中GFP在感染了病毒粒子的细胞中产生并且检测和/或测量；或例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量所产生的蛋白质。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。测定感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率的方法在本领域中是已知的。参见，例如Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337(描述了TCID50感染性滴度测定)；及Zolotukhin等人(1999)Gene Ther.6:973。
[0040] “有复制能力的”病毒(例如，有复制能力的AAV)是指表型上为野生型的病毒，所述病毒为感染性的，并且也能够在受感染细胞中(即，在辅助病毒或辅助病毒功能存在下)进行复制。在AAV的情况下，复制能力一般需要功能性AAV包装基因的存在。一般来说，如本文所述的rAAV载体在哺乳动物细胞(特别是人细胞)中由于缺乏一个或多个AAV包装基因而没有复制能力。通常，这种rAAV载体缺乏任何AAV包装基因序列以便使有复制能力的AAV通过AAV包装基因与引入的rAAV载体之间的重组生成的可能性减到最低。一般来说，如本文所述的rAAV载体制剂是含有极少的(如果有的话)有复制能力的AAV(rcAAV，也称为RCA)(例如，小于约1个rcAAV/102个rAAV粒子、每小于约1个rcAAV/104个rAAV粒子、小于约1个rcAAV/10812
个rAAV粒子、小于约1个rcAAV/10 个rAAV粒子，或无rcAAV)的那些rAAV载体制剂。
个rAAV粒子、小于约1个rcAAV/10 个rAAV粒子，或无rcAAV)的那些rAAV载体制剂。
[0041] 术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可插入非核苷酸组分。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后进行。如本文所用的术语多核苷酸可互换地指代双链和单链分子。除非另有规定或需要，否则关于本文所述的多核苷酸的本发明任何实施方案包括双链形式与已知的或预计要形成双链形式的两条互补单链形式的每一条。
[0042] 多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有某“序列同一性”百分比意味着，当比对时，在比较两条序列时此百分比的碱基或氨基酸是相同的。序列相似性可以许多不同的方式测定。为了测定序列同一性，可使用方法和计算机程序比对序列，所述计算机程序包括可由万维网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST。另一种比对算法是FASTA，可由来自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing Group(GCG)包(Oxford Molecular Group,Inc.的全资子公司)获得。用于比对的其它技术描述于Methods in Enzymology,第266卷:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),Doolittle编著,Academic Press,Inc.,Harcourt Brace&Co.的一个部门,San Diego,California,USA中。特别感兴趣的是容许序列中的空位的比对程序。Smith-Waterman是容许序列比对中的空位的一种类型的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序也可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)
[0043] 所感兴趣的是使用Smith Waterman的局部同源性算法的BestFit程序(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)以测定序列同一性。空位产生罚分将一般将在1至5范围内，通常为2至4并且在一些情况下将为3。空位延伸罚分一般将在约0.01至0.20范围内且在许多情况下将为0.10。程序具有由待比较的输入序列所决定的默认参数。优选地，使用由程序决定的默认参数测定序列同一性。此程序也可获自来自Madison,Wisconsin,USA的Genetics Computing Group(GCG)包。
[0044] 所感兴趣的另一程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,
Selected Methods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc.中。通过FastDB，基于以下参数计算序列同一性百分比：
Selected Methods and Applications,第127-149页,1988,Alan R.Liss,Inc.中。通过FastDB，基于以下参数计算序列同一性百分比：
[0045] 错配罚分：1.00；
[0046] 空位罚分：1.00；
[0047] 空位大小罚分：0.33；及
[0048] 连接罚分：30.0。
[0049] “基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，其在被转录和翻译后，能够编码特定的蛋白质。
[0050] 如本文所用，术语“指导RNA”是指包含以下的RNA：i)结合至指导RNA指导的核酸内切酶(例如，2类CRISPR/Cas核酸内切酶，诸如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)并激活RNA指导的核酸内切酶的“激活子”核苷酸序列；及ii)包含与靶核酸杂交的核苷酸序列的“靶标子”核苷酸序列。“激活子”核苷酸序列和“靶标子”核苷酸序列可在单独的RNA分子(例如“双指导RNA”)上；或可在同一RNA分子(“单指导RNA”)上。
[0051] “小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向感兴趣基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过在RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA“靶向”基因是因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些情况下，siRNA的双链体长度小于30个核苷酸。在一些情况下，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些情况下，双链体的长度是19-25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除双链体部分之外，发夹结构还可含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环长度可变化。在一些情况下，环长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可含有3'或5'突出端部分。在一些情况下，突出端是0、1、2、3、4或5个核苷酸长度的3'或5'突出端。
[0052] 如本文所用，术语“微RNA”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于内源性微RNA和人工微RNA(例如，合成miRNA)。内源性微RNA是在基因组中天然编码的小RNA，其能够调节mRNA的生产利用。人工微RNA可以是除内源性微RNA以外的任何类型的RNA序列，其能够调节mRNA的活性。微RNA序列可以是由这些序列中的任何一个或多个构成的RNA分子。微RNA(或“miRNA”)序列已描述于以下出版物中，如Lim等人,2003,Genes&Development,17,991-1008；Lim等人,2003,Science,299,1540；Lee和Ambrose,2001,Science,294,862；Lau等人,
2001,Science 294,858-861；Lagos-Quintana等人,2002,Current Biology,12,735-739；
Lagos-Quintana等人,2001,Science,294,853-857；及Lagos-Quintana等人,2003,RNA,9,
175-179。微RNA的示例包括任何RNA，它们是更大RNA的一个片段或者是miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其它小非编码RNA。参见，例如美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“微RNA前体”(或“前miRNA”)是指具有并入了微RNA序列的茎-环结构的核酸。“成熟微RNA”(或“成熟miRNA”)包括这样的微RNA，所述微RNA已从微RNA前体(“前miRNA”)裂解，或已经合成(例如，在实验室中通过无细胞合成来合成)，并且长度为约19个核苷酸至约27个核苷酸，举例来说，成熟微RNA的长度可为19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt，或27nt。成熟微RNA可结合至靶mRNA并抑制靶mRNA的翻译。
2001,Science 294,858-861；Lagos-Quintana等人,2002,Current Biology,12,735-739；
Lagos-Quintana等人,2001,Science,294,853-857；及Lagos-Quintana等人,2003,RNA,9,
175-179。微RNA的示例包括任何RNA，它们是更大RNA的一个片段或者是miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其它小非编码RNA。参见，例如美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“微RNA前体”(或“前miRNA”)是指具有并入了微RNA序列的茎-环结构的核酸。“成熟微RNA”(或“成熟miRNA”)包括这样的微RNA，所述微RNA已从微RNA前体(“前miRNA”)裂解，或已经合成(例如，在实验室中通过无细胞合成来合成)，并且长度为约19个核苷酸至约27个核苷酸，举例来说，成熟微RNA的长度可为19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt，或27nt。成熟微RNA可结合至靶mRNA并抑制靶mRNA的翻译。
[0053] “重组”当应用于多核苷酸时意味着多核苷酸是克隆、限制或连接步骤及产生不同于自然界中出现的多核苷酸的构建体的其他工序的不同组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒粒子。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制品及原始病毒构建体的子代。
[0054] “控制元件”或“控制序列”是涉及功能性调控多核苷酸的分子相互作用的核苷酸序列，包括所述多核苷酸的复制、加倍、转录、剪接、翻译或降解。调控可影响所述过程的频率、速度、或特异性，并且调控可以是在性质上增强或抑制。本领域中已知的控制元件包括例如转录调控序列，如启动子和增强子。启动子是能在一定条件下结合RNA聚合酶并引发通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区域的转录的DNA区域。
[0055] “可操作地连接”或“可操作连接”指的是遗传元件的一种并列关系，其中这些元件是呈一种允许它们以预期方式行使功能的关系。例如，启动子可操作地连接到编码区域，如果该启动子有助于引发编码序列的转录的话。在启动子和编码区域之间可以有间插残基，只要能维持这种功能关系。
[0056] “表达载体”是含有编码目标多肽的区域的载体，并且用于实现预定靶细胞中该蛋白质的表达。表达载体还包含可操作地连接到编码区域以促进蛋白质在靶标中的表达的控制元件。控制元件与其可操作连接以用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多都是本领域中已知和可获得的或可容易由本领域中可获得的组分来构建。
[0057] “异源的”意指从一种实体衍生出来的，该实体在基因型上截然不同于正被比较的实体的其余部分。例如，通过基因工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从启动子的天然编码序列中去除且可操作地连接到不是其天然连接的编码序列上的启动子是异源启动子。因此，例如，含有编码异源基因产物的异源核酸的rAAV是含有天然存在的野生型AAV中通常不含有的核酸的rAAV，且所编码的异源基因产物是天然存在的野生型AAV通常不编码的基因产物。作为另一示例，包含插入衣壳蛋白的GH环中的异源肽的变体AAV衣壳蛋白是含有通常不包含在天然存在的野生型AAV中的肽插入物的变体AAV衣壳蛋白。
[0058] 术语“基因改变”或“遗传修饰”(及其语法上的变型)在本文中可互换使用来指代不通过有丝分裂或减数分裂将遗传元件(例如，多核苷酸)引入细胞中的方法。所述元件对细胞可以是异源的，或者可以是早已存在于细胞中的元件的额外拷贝或改进形式。基因改变可例如通过本领域已知的任何方法用重组质粒或其它多核苷酸转染细胞来实现，所述方法如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸-脂质体复合物接触。基因改变也可例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。遗传元件通常被引入细胞的染色体或微型染色体中；但任何改变细胞及其子代的表型和/或基因型的变化均被归入该术语。
[0059] 如果某序列在细胞的体外长期培养期间能被利用执行其功能，就认为该细胞受到该基因序列“稳定地”改变、转导、遗传修饰或转化。一般来说，这种细胞通常是“遗传上”受到改变的(遗传修饰)，即引入的基因改变也可遗传给所改变细胞的子代。
[0060] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指示任何长度的氨基酸聚合物。该术语还包括被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、或与标记组分缀合。当在向哺乳动物受试者递送基因产物的情形下论述时，多肽如抗血管生成多肽、神经保护性多肽等及其组合物是指保留了完整蛋白质所需的生化功能的各自完整多肽、或其任何片段或基因工程化的衍生物。类似地，编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护性多肽的核酸、及用于递送基因产物到哺乳动物受试者(可被称为有待向受者细胞递送的“转基因”)的其它这种核酸包括编码拥有所需生化功能的完整多肽或任何片段或基因工程化的衍生物的多核苷酸。
[0061] “分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒体、宿主细胞、或其它物质是指所述物质不含至少一些其它组分的制剂，这些组分也可存在于这些物质或类似物质天然存在时或最初从其制备时。因此，例如，分离的物质可使用纯化技术从来源混合物中富集而制备。可以在一个绝对的基础上测量富集，如每体积溶液的重量，或者可以相对于来源混合物中存在的第二潜在干扰物质进行测量。本发明的实施方案的富集程度增加则分离程度也增加。分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞、或其它物质在一些情况下是纯化的，例如约80％至约90％纯的、至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少约98％纯的、或至少约99％或以上纯的。
[0062] 本文使用的术语“治疗(treatment/treating/treat)”等一般是指获得所需药理和/或生理效果。该效果根据完全或部分地预防疾病或其症状可以是预防性的，和/或根据疾病和/或可归因于该疾病的副作用的部分或完全稳定或治愈可以是治疗性的。术语“治疗”包括在哺乳动物(特别是人)中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病和/或症状在易患所述疾病或症状但还没有确诊的受试者中发生；(b)抑制所述疾病和/或症状，即抑制疾病和/或相关症状的进展；或(c)减轻所述疾病和相关症状，即造成所述疾病和/或症状的消退。需要治疗的那些可包括已罹患(例如患有神经病症)的那些以及其中需要预防的那些(例如，对神经病症有增加的易感性的那些；疑似患有神经病症的那些；具有神经病症的一个或多个风险因素的那些等等)。
[0063] 术语“受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且指的是需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，如人。用于治疗的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，如非人灵长类动物、狗、马、猫、奶牛、绵羊、山羊、猪、骆驼等。在一些情况下，所述哺乳动物是人。
[0064] “治疗有效量”或“有效量”意指化合物当向哺乳动物或其它受试者施用来治疗疾病时与另一试剂组合或单独以一个或多个剂量足以实现所述疾病的这种治疗的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病和其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
[0065] 术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指的是哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猴和人；哺乳动物运动动物(例如，马、骆驼等)；哺乳动物农场动物(例如，绵羊、山羊、奶牛等)；哺乳动物宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。在一些情况下，所述个体是人。
[0066] 在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案，且不旨在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
[0067] 当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单位的十分之一)和任何其他所说明的或者在所说明的范围中的中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，且在所说明范围内明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明内。当所述范围包括所述限值中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。
[0068] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语皆具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任何方法和材料还可用于实践或测试本发明，但现在描述优选方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。
[0069] 除非文中另外清楚指出，必须指出如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此，举例来说，提及“神经干细胞”包括多个这类细胞且提及“rAAV”包括提及一个或多个rAAV及本领域技术人员已知的其等价物，诸如此类。还应注意，权利要求书可能撰写成排除了任何可选要素。因此，此声明旨在用作排除性术语如“单独”、“仅仅”等与权利要求要素的陈述相关联的前提基础,或采用“负”限制。
[0070] 应当理解，为清楚起见在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特点也可在单个实施方案中以组合形式提供。相反，为简洁起见在参照单一实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特点也可单独地或以任何适合的子组合方式给出。关于本发明的实施方案的所有组合具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个组合个别地和明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个这种子组合个别地且明确地在本文中公开一样。
[0071] 本文所论述的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权使借助于在先发明的这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地确认。
具体实施方式
[0072] 本公开提供了具有变体衣壳蛋白的重组腺相关病毒病毒体，其中所述重组AAV(rAAV)病毒体与对照AAV相比呈现出以下特性中的一种或多种：提高的跨过神经元细胞屏障的能力、提高的对神经干细胞的感染性、提高的对神经元细胞的感染性，以及降低的对抗体中和的易感性，且其中所述rAAV病毒体包含异源核酸。本公开提供了将基因产物递送到个体中的神经干细胞、神经元祖细胞或神经元细胞的方法。本公开还提供了修饰存在于神经干细胞或神经元细胞中的靶核酸的方法。本公开还提供了治疗神经疾病的方法。
[0073] 具有变体衣壳多肽的重组AAV病毒体
[0074] 本公开提供了一种感染性rAAV病毒体，其包含：i)本公开的变体AAV衣壳多肽；和ii)包含编码异源多肽(即，非AAV多肽)的核苷酸序列的异源核酸。在一些情况下，所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸。所述变体衣壳蛋白赋予以下特性中的一种或多种：i)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对神经干细胞或神经祖细胞的感染性相比、或与野生型AAV病毒体相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比，提高的对所述神经干细胞或神经祖细胞的感染性；ii)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比、或与野生型AAV病毒体相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比，提高的对所述神经元细胞的感染性；iii)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体跨过细胞屏障的能力相比、或与野生型AAV病毒体跨过细胞屏障的能力相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比，提高的跨过细胞屏障的能力；iv)与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比或与野生型AAV病毒体相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比，提高的所述抗性。
[0075] 对照AAV病毒体可包含亲本AAV衣壳蛋白。对照AAV病毒体可以是包含野生型AAV衣壳的AAV病毒体，例如，仅包含野生型衣壳(并且不是本公开的任何变体AAV衣壳)。举例来说，对照AAV病毒体可包含野生型AAV2衣壳。作为另一个示例，对照AAV病毒体可包含野生型AAV6衣壳。作为另一个示例，对照AAV病毒体可包含野生型AAV9衣壳。
[0076] 提高的对神经干细胞或神经祖细胞的感染性
[0077] 本公开提供了具有变体衣壳蛋白的rAAV病毒体，其中rAAV病毒体与不包含变体衣壳蛋白的对照亲本AAV、或野生型AAV、或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体感染NSC或神经祖细胞的能力相比呈现出提高的对神经干细胞(NSC)或神经祖细胞的感染性；且其中所述rAAV病毒体包含异源核酸。
[0078] 在一些情况下，NSC是室管膜下区(SVZ)NSC。SVZ沿着室管膜细胞层定位，其分隔来自SVZ的室管膜空间。SVZ。NSC可导致扩增祖细胞的转运，祖细胞在变为成神经细胞之前分裂了几次。在一些情况下，NSC在海马齿状回内的颗粒下层(SGZ)中。位于SGZ中的内颗粒细胞层与门部交界处的放射状胶质样NSC(RGL)产生中间祖细胞(IPC)，IPC在形成成神经细胞前呈现出有限轮次的增殖。神经祖细胞(NPC)包括转运扩增细胞、RGL、IPC和成神经细胞。在一些情况下，NSC来自于海马或存在于海马中。在一些情况下，NSC存在于正在发育的神经系统中；例如，NSC存在于胚胎中。
[0079] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对NSC的感染性相比、与不包含变体衣壳多肽的AAV病毒体对NSC的感染性相比、或与野生型AAV病毒体(包含野生型AAV衣壳)对NSC的感染性相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对NSC的感染性相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对NSC的感染性。
[0080] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的AAV病毒体对NSC的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对NSC的感染性。
[0081] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的AAV病毒体对NPC的感染性相比、与不包含变体衣壳多肽的AAV病毒体对NPC的感染性相比、或与野生型AAV病毒体(包含野生型AAV衣壳)对NPC的感染性相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对NPC的感染性相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对NPC的感染性。
[0082] 在一些情况下，本发明rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的AAV病毒体对成神经细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对成神经细胞的感染性。
[0083] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的AAV病毒体对成神经细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对成神经细胞的感染性。
[0084] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对转运扩增细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对转运扩增细胞的感染性。
[0085] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对转运扩增细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对转运扩增细胞的感染性。
[0086] 给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对NSC或NPC的感染性可在体外或体内确定。举例来说，给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对NSC的感染性可通过使NSC在体外与rAAV病毒体接触并检测由rAAV病毒体所编码的异源基因产物在NSC中的表达来确定。异源基因产物可提供可检测信号，并且在NSC中的可检测信号的水平可提供一个指示，即给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对NSC的感染性。
[0087] 在一些情况下，包含以下各物的本公开的rAAV病毒体当向个体施用时：a)包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段的本公开的变体衣壳，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，如下所述；和b)编码异源基因产物的异源核苷酸序列，造成神经干细胞中的异源基因产物的水平是当包含以下各物的对照rAAV病毒体向所述个体施用时所造成的神经干细胞中的基因产物水平的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍：a)对照AAV(例如，野生型AAV衣壳)；和b)编码异源基因产物的异源核苷酸序列。施用可经由许多途径进行，例如经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射。
[0088] 给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对NSC的感染性可通过评估由rAAV病毒体所编码的治疗性基因产物在NSC中的治疗效果来确定。治疗效果可包括例如a)神经发生增加；b)神经系统疾病或病症的症状改善；等等。例如，包含以下各物的本公开的rAAV病毒体当向个体施用(例如经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射)时：a)本公开的变体衣壳；和b)编码异源治疗性基因产物的异源核苷酸序列，造成治疗性基因产物在神经干细胞中的治疗效果是当包含以下各物的对照rAAV病毒体经由相同的施用途径施用时产生的治疗效果的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于
50倍：a)对照AAV衣壳(例如，野生型AAV衣壳)；和b)编码异源治疗性基因产物的异源核苷酸序列。
50倍：a)对照AAV衣壳(例如，野生型AAV衣壳)；和b)编码异源治疗性基因产物的异源核苷酸序列。
[0089] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对NSC的感染性相比、或与野生型AAV病毒体(包含野生型AAV衣壳多肽)对NSC的感染性相比呈现出至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍对NSC的提高的感染性。
[0090] 提高的对神经元细胞的感染性
[0091] 如上所示，在一些情况下，存在于本公开的rAAV病毒体中的变体衣壳多肽与不包含变体衣壳蛋白的对照亲本AAV或野生型AAV感染神经元细胞的能力相比赋予rAAV病毒体提高的对神经元细胞的感染性。
[0092] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳多肽的AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对神经元细胞的感染性。
[0093] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比、或与野生型AAV对神经元细胞的感染性相比、或与包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对神经元细胞的感染性。
[0094] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对大脑半球、大脑皮层、皮层下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干或小脑的神经元细胞的感染性相比或与包含野生型AAV衣壳多肽的AAV病毒体对神经元细胞的感染性相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对相同组织的神经元细胞的感染性。
[0095] 作为一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对浦肯野细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对浦肯野细胞的感染性。
[0096] 作为一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对浦肯野细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对浦肯野细胞的感染性。
[0097] 作为一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对GABA能细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对GABA能细胞的感染性。
[0098] 作为一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对GABA能细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对GABA能细胞的感染性。
[0099] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对胶质细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对胶质细胞的感染性。
[0100] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对胶质细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对胶质细胞的感染性。
[0101] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对星形胶质细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对星形胶质细胞的感染性。
[0102] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体对星形胶质细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的对星形胶质细胞的感染性。
[0103] 给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性可在体外或体内确定。举例来说，给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性可通过使神经元细胞在体外与rAAV病毒体接触并检测由rAAV病毒体所编码的异源基因产物在神经元细胞中的表达来确定。异源基因产物可提供可检测信号，并且在神经元细胞中的可检测信号的水平可提供一个指示，即给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性。
[0104] 给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性可通过在向个体施用所述rAAV病毒体之后检测由rAAV病毒体所编码的异源基因产物在神经元细胞中的表达来确定。给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性可通过在颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用所述rAAV病毒体之后检测由rAAV病毒体所编码的异源基因产物在神经元细胞中的表达来确定。例如，包含以下各物的本公开的rAAV病毒体：a)包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段的本公开的变体衣壳，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，如上所述；和b)编码异源基因产物的异源核苷酸序列，当施用时，造成神经元细胞中的异源基因产物的水平是包含以下各物的对照rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时所造成的神经元细胞中的基因产物水平的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍：a)对照AAV衣壳或野生型AAV衣壳；和b)编码异源基因产物的异源核苷酸序列。
[0105] 给定的rAAV病毒体是否呈现出提高的对神经元细胞的感染性可通过评估由rAAV病毒体所编码的治疗性基因产物在神经元细胞中的治疗效果来确定。治疗效果可包括例如a)神经元细胞功能增强；b)神经系统疾病或病症的症状改善；等等。例如，包含以下各物的本公开的rAAV病毒体：a)包含肽插入物或肽替代物的本公开的变体衣壳，如上所述；和b)编码异源治疗性基因产物的异源核苷酸序列，当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时造成治疗性基因产物在神经元细胞中的治疗效果是当包含以下各物的对照rAAV病毒体经由相同的施用途径施用时在神经元细胞中产生的治疗效果的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍：a)不包含肽插入物或肽替代物的对照AAV衣壳；和b)编码异源治疗性基因产物的异源核苷酸序列。
[0106] 跨过细胞屏障
[0107] 本公开提供了具有变体衣壳蛋白的重组腺相关病毒病毒体，其中所述rAAV病毒体呈现出提高的跨过细胞屏障(即，生理屏障)的能力。例如，细胞屏障可包含介于不包括神经干细胞的第一隔区与包括神经干细胞的第二隔区之间的细胞层。这类屏障包括例如内衬侧脑室的室管膜细胞层、细胞减少层、星形胶质细胞的细胞体层、血脑屏障、和过渡区层。因此，本公开提供了一种具有变体衣壳蛋白的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体与不包含变体衣壳蛋白的对照AAV或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV跨过室管膜细胞层、细胞减少层、星形胶质细胞的细胞体层和过渡区层中的一个或多个的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过所述层的能力；且其中所述rAAV病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码异源基因产物的核苷酸序列。
[0108] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过室管膜细胞层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过内衬侧脑室的室管膜细胞层的能力。
[0109] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过血脑屏障的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过血脑屏障的能力。
[0110] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨过室管膜细胞层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过室管膜细胞层的能力。
[0111] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过细胞减少层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过细胞减少层的能力。
[0112] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨过细胞减少层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过细胞减少层的能力。
[0113] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过星形胶质细胞的细胞体层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过星形胶质细胞的细胞体层的能力。
[0114] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨过星形胶质细胞的细胞体层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过星形胶质细胞的细胞体层的能力。
[0115] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过过渡区层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的跨过过渡区层的能力。
[0116] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨过过渡区层的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍跨过过渡区层的能力。
[0117] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照rAAV病毒体跨过脑实质的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍跨过脑实质的能力。
[0118] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射施用时与当经由相同的施用途径施用时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒体跨过脑实质的能力相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍跨过脑实质的能力。
[0119] 在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用注射时与当经由相同的施用途径注射时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体经室管膜层定位的程度相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的经室管膜层的定位。
[0120] 例如，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用注射时与当经由相同的施用途径注射时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至细胞减少层的程度相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的到细胞减少层的定位。
[0121] 作为另一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用注射时与当经由相同的施用途径注射时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至星形胶质细胞的细胞体层相比呈现出提高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的到星形胶质细胞的细胞体层的定位。
[0122] 作为另一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用注射时与当经由相同的施用途径注射时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至过渡区层的程度相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的到过渡区层的定位。
[0123] 作为另一个示例，在一些情况下，本发明的rAAV病毒体当经由颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内施用注射时与当经由相同的施用途径注射时包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳蛋白的对照AAV病毒体定位至脑实质的程度相比呈现出提高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或大于50倍的到脑实质的定位。
[0124] 降低的对由中和抗体所进行的中和的易感性
[0125] 如上所示，在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与中和抗体同包含野生型AAV衣壳的AAV的结合相比呈现出减少的与中和抗体的结合。
[0126] 减少的与中和抗体的结合是有利的。中和抗体结合至野生型衣壳蛋白。中和抗体与野生型衣壳蛋白的结合可具有若干效应，包括限制包含野生型衣壳蛋白的rAAV病毒体在病毒粒子中的停留时间、防止病毒结合至细胞表面、使病毒聚集、诱导衣壳的结构变化、以及防止病毒去装配和脱壳(释放DNA所必需的步骤)。具有减少的与中和抗体的结合的rAAV粒子因此具有提高的感染细胞的能力，及延长的在施用rAAV病毒体的个体的体内的停留时间。因此，递送基因产物的有效特续时间延长。
[0127] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与野生型AAV(“wt AAV”)或包含野生型衣壳蛋白的AAV相比呈现出提高的对中和抗体的抗性。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与wt AAV相比具有约1.5倍至约10倍10,000倍的对中和抗体的抗性；例如，在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与wt AAV相比具有约1.5倍至约2倍、约2倍至约2.5倍、约2.5倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约6倍、约6倍至约7倍、约7倍至约8倍、约8倍至约9倍、或约9倍至约10倍的对中和抗体的抗性。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与wt AAV相比具有约10倍至约10,000倍的对中和抗体的抗性，例如，本公开的rAAV病毒体与野生型AAV或包含野生型衣壳蛋白的AAV相比具有约10倍至约25倍、约25倍至约50倍、约50倍至约75倍、约75倍至约100倍、约100倍至约150倍、约150倍至约200倍、约200倍至约250倍、约250倍至约
300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍至约450倍、约450倍至约500倍、约500倍至约
550倍、约550倍至约600倍、约600倍至约700倍、约700倍至约800倍、约800倍至约900倍、约
900倍至约1000倍、约1,000倍至约2,000倍、约2,000倍至约3,000倍、约3,000倍至约4,000倍、约4,000倍至约5,000倍、约5,000倍至约6,000倍、约6,000倍至约7,000倍、约7,000倍至约8,000倍、约8,000倍至约9,000倍、或约9,000倍至约10,000倍的对中和抗体的抗性。
300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍至约450倍、约450倍至约500倍、约500倍至约
550倍、约550倍至约600倍、约600倍至约700倍、约700倍至约800倍、约800倍至约900倍、约
900倍至约1000倍、约1,000倍至约2,000倍、约2,000倍至约3,000倍、约3,000倍至约4,000倍、约4,000倍至约5,000倍、约5,000倍至约6,000倍、约6,000倍至约7,000倍、约7,000倍至约8,000倍、约8,000倍至约9,000倍、或约9,000倍至约10,000倍的对中和抗体的抗性。
[0128] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体呈现出减少的与结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合。例如，在一些情况下，本公开的rAAV病毒体呈现出减少约10倍至约10,000倍的与结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体的结合。例如，在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与抗体对野生型AAV衣壳蛋白的结合亲和力相比呈现出减少约10倍至约25倍、约25倍至约50倍、约50倍至约75倍、约75倍至约100倍、约100倍至约150倍、约150倍至约200倍、约200倍至约250倍、约250倍至约300倍、至少约350倍、至少约400倍、约400倍至约450倍、约
450倍至约500倍、约500倍至约550倍、约550倍至约600倍、约600倍至约700倍、约700倍至约
800倍、约800倍至约900倍、约900倍至约1000倍、约1,000倍至约2,000倍、约2,000倍至约3,
000倍、约3,000倍至约4,000倍、约4,000倍至约5,000倍、约5,000倍至约6,000倍、约6,000倍至约7,000倍、约7,000倍至约8,000倍、约8,000倍至约9,000倍、或约9,000倍至约10,000倍的与结合野生型衣壳AAV蛋白的中和抗体的结合(例如亲和力降低)。
450倍至约500倍、约500倍至约550倍、约550倍至约600倍、约600倍至约700倍、约700倍至约
800倍、约800倍至约900倍、约900倍至约1000倍、约1,000倍至约2,000倍、约2,000倍至约3,
000倍、约3,000倍至约4,000倍、约4,000倍至约5,000倍、约5,000倍至约6,000倍、约6,000倍至约7,000倍、约7,000倍至约8,000倍、约8,000倍至约9,000倍、或约9,000倍至约10,000倍的与结合野生型衣壳AAV蛋白的中和抗体的结合(例如亲和力降低)。
[0129] 在一些情况下，抗AAV中和抗体以小于约10-7M、小于约5×10-6M、小于约10-6M、小于约5×10-5M、小于约10-5M、小于约10-4M或更低的亲和力结合至本公开的rAAV病毒体。
[0130] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体与野生型AAV相比呈现出延长的体内停留时间。例如，在一些情况下，本公开的rAAV病毒体呈现出与野生型AAV的停留时间相比至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约100％、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约
25倍、至少约50倍、至少约100倍或更长的停留时间。
25倍、至少约50倍、至少约100倍或更长的停留时间。
[0131] 本公开的给定rAAV是否呈现出减少的与中和抗体的结合可使用用于测定亲和力的多种标准结合测定中的任一种来确定。
[0132] 选择性的感染性
[0133] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体选择性地感染神经元细胞，例如，本公开的rAAV病毒体以与非神经元细胞相比10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或大于50倍的特异性感染神经细胞。
[0134] 在一些情况下，本公开的rAAV病毒体选择性地感染神经干细胞，例如，本发明的rAAV病毒体以与非神经干细胞(例如，间充质干细胞、造血干细胞等)相比10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或大于50倍的特异性感染神经干细胞。
[0135] 变体衣壳多肽
[0136] 如上所述，本公开的rAAV病毒体包含变体AAV衣壳蛋白。在一些情况下，存在于本公开的rAAV病毒体中的变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，且每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸。
[0137] 本公开的变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的区段。例如，在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及来自所述第二AAV血清型的氨基酸
201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。在一些情况下，第一AAV血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，且第三AAV血清型是AAV8。
201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。在一些情况下，第一AAV血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，且第三AAV血清型是AAV8。
[0138] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的氨基酸51-
320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的氨基酸
101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；及来自第四AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。在一些情况下，第一AAV血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，第三AAV血清型是AAV8，且第四AAV血清型是AAV2。
320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的氨基酸
101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；及来自第四AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。在一些情况下，第一AAV血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，第三AAV血清型是AAV8，且第四AAV血清型是AAV2。
[0139] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：i)第一区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV6衣壳氨基酸序列的氨基酸1-160的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；ii)第二区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸1-160的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；iii)第三区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV8衣壳氨基酸序列的氨基酸101-480的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；iv)第四区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸151-640的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；v)第五区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸201至C末端的一段连续氨基酸具有至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。
[0140] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：i)第一区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的且包含与图10中所描绘的AAV6衣壳氨基酸序列的氨基酸1-160的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；ii)第二区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸1-160的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；iii)第三区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV8衣壳氨基酸序列的氨基酸101-480的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列；
iv)第四区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸151-640的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％或100％的氨基酸序列；v)第五区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV2衣壳氨基酸序列的氨基酸201至C末端的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。
iv)第四区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV9衣壳氨基酸序列的氨基酸151-640的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％、至少99％或100％的氨基酸序列；v)第五区段，其长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸且包含与图10中所描绘的AAV2衣壳氨基酸序列的氨基酸201至C末端的一段连续氨基酸具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。
[0141] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；第三AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段；来自第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。在一些情况下，第一AAV血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，第三AAV血清型是AAV8，且第四AAV血清型是AAV2。
[0142] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含与图10中所描绘的SCH9氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。在一些情况下，所述变体衣壳蛋白包含图10中所描绘的SCH9氨基酸序列的氨基酸序列。
[0143] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含：来自第一AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约
160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；
来自第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段；来自所述第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。在一些情况下，第一血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，第三AAV血清型是AAV8，且第四AAV血清型是AAV2。
160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；
来自第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段；来自所述第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。在一些情况下，第一血清型是AAV6，第二AAV血清型是AAV9，第三AAV血清型是AAV8，且第四AAV血清型是AAV2。
[0144] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含与图10中所描绘的SCH2氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。在一些情况下，所述变体衣壳蛋白包含图10中所描绘的SCH2氨基酸序列的氨基酸序列。
[0145] 在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含与图8中所描绘的SCH9氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的变体AAV衣壳蛋白包含与图9中所描绘的SCH2氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列。
[0146] 额外的变异
[0147] 在一些情况下，本公开的变体衣壳多肽包含一个或多个额外的突变(例如，氨基酸取代；一个或多个氨基酸的插入；一个或多个氨基酸的缺失)。
[0148] 例如，在一些情况下，本公开的变体衣壳多肽相对于相应亲本AAV衣壳蛋白在衣壳蛋白GH环中包含约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如，5个氨基酸至7个氨基酸、7个氨基酸至10个氨基酸、10个氨基酸至15个氨基酸、或15个氨基酸至20个氨基酸)的插入物。插入位点可在AAV衣壳蛋白的GH环或环IV中，例如在AAV衣壳蛋白的GH环或环IV的溶剂可接近部分中。关于AAV衣壳的GH环/环IV，参见，例如van Vliet等人(2006)Mol.Ther.14:809；Padron等人(2005)J.Virol.79:5047；及Shen等人(2007)Mol.Ther.15:1955。
[0149] 在一些情况下，将长度约5个氨基酸至约20个氨基酸(例如，5至7个、7至10个、10至12个、12至15个、或15至20个氨基酸)的异源肽插入衣壳蛋白的GH环或环IV相对于相应亲本AAV衣壳蛋白的插入位点中。例如，插入位点可在AAV衣壳蛋白的氨基酸411-650内，如图21A至图21C中所描绘，或在本公开的变体AAV衣壳蛋白的相应区域中。本领域技术人员考虑到图21A至图21C中所描绘的氨基酸序列可容易确定本公开的变体衣壳中的合适的插入位点。
例如，插入位点可介于AAV2的氨基酸587与588之间、或介于AAV2的氨基酸588与589之间、或在另一种AAV血清型的衣壳亚基的相应位置中、或在本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中。应注意，插入位点587/588是基于AAV2衣壳蛋白。长度5个氨基酸至约20个氨基酸(例如，5至7个、7至10个、10至12个、12至15个、或15至20个氨基酸)的异源肽可插入除AAV2以外的AAV血清型(例如AAV8、AAV9等)的相应位点中、或本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中。本领域技术人员基于比较各种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列将知晓“对应于AAV2的氨基酸587-588”的插入位点将在任何给定AAV血清型的衣壳蛋白中或在本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中的何处。，参见，例如，关于AAV1，GenBank登录号NP_049542；关于AAV4，GenBank登录号NP_044927；关于AAV5，GenBank登录号AAD13756；关于AAV6，GenBank登录号AAB95459；关于AAV7，GenBank登录号YP_077178；关于AAV8，GenBank登录号YP_077180；关于AAV9，GenBank登录号AAS99264；关于AAV10，GenBank登录号AAT46337；且关于AAVrh10，GenBank登录号AAO88208。关于祖先AAV衣壳，参见，例如Santiago-Ortiz等人(2015)Gene Ther.22:934。
例如，插入位点可介于AAV2的氨基酸587与588之间、或介于AAV2的氨基酸588与589之间、或在另一种AAV血清型的衣壳亚基的相应位置中、或在本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中。应注意，插入位点587/588是基于AAV2衣壳蛋白。长度5个氨基酸至约20个氨基酸(例如，5至7个、7至10个、10至12个、12至15个、或15至20个氨基酸)的异源肽可插入除AAV2以外的AAV血清型(例如AAV8、AAV9等)的相应位点中、或本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中。本领域技术人员基于比较各种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列将知晓“对应于AAV2的氨基酸587-588”的插入位点将在任何给定AAV血清型的衣壳蛋白中或在本公开的变体AAV衣壳的衣壳亚基的相应位置中的何处。，参见，例如，关于AAV1，GenBank登录号NP_049542；关于AAV4，GenBank登录号NP_044927；关于AAV5，GenBank登录号AAD13756；关于AAV6，GenBank登录号AAB95459；关于AAV7，GenBank登录号YP_077178；关于AAV8，GenBank登录号YP_077180；关于AAV9，GenBank登录号AAS99264；关于AAV10，GenBank登录号AAT46337；且关于AAVrh10，GenBank登录号AAO88208。关于祖先AAV衣壳，参见，例如Santiago-Ortiz等人(2015)Gene Ther.22:934。
[0150] 在一些情况下，本公开的变体衣壳多肽包含含有选自以下的氨基酸序列的插入物：LGETTRP(SEQ ID NO:3)、NETITRP(SEQ ID NO:4)、KAGQANN(SEQ ID NO:5)、KDPKTTN(SEQ ID NO:6)、KDTDTTR(SEQ ID NO:7)、RAGGSVG(SEQ ID NO:8)、AVDTTKF(SEQ ID NO:9)和STGKVPN(SEQ ID NO:10)。
[0151] 在一些情况下，本公开的变体衣壳多肽包含含有选自以下的氨基酸序列的插入物：LALIQDSMRA(SEQ ID NO:151)；LANQEHVKNA(SEQ ID NO:152)；TGVMRSTNSGLN(SEQ ID NO:153)；TGEVDLAGGGLS(SEQ ID NO:154)；TSPYSGSSDGLS(SEQ ID NO:155)；TGGHDSSLDGLS(SEQ ID NO:156)；TGDGGTTMNGLS(SEQ ID NO:157)；TGGHGSAPDGLS(SEQ ID NO:158)；TGMHVTMMAGLN(SEQ ID NO:159)；TGASYLDNSGLS(SEQ ID NO:160)；TVVSTQAGIGLS(SEQ ID NO:161)；TGVMHSQASGLS(SEQ ID NO:162)；TGDGSPAAPGLS(SEQ ID NO:163)；TGSDMAHGTGLS(SEQ ID NO:164)；TGLDATRDHGLSPVTGT(SEQ ID NO:165)；TGSDGTRDHGLSPVTWT(SEQ ID NO:
166)；NGAVADYTRGLSPATGT(SEQ ID NO:167)；TGGDPTRGTGLSPVTGA(SEQ ID NO:168)；
LQKNARPASTESVNFQ(SEQ ID NO:169)；LQRGVRIPSVLEVNGQ(SEQ ID NO:170)；
LQRGNRPVTTADVNTQ(SEQ ID NO:171)；和LQKADRQPGVVVVNCQ(SEQ ID NO:172)。在一些情况下，所述肽插入物是TGVMRSTNSGLN(SEQ ID NO:153)。在一些情况下，所述肽插入物是TGEVDLAGGGLS(SEQ ID NO:154)。在一些情况下，所述肽插入物是TSPYSGSSDGLS(SEQ ID NO:155)。在一些情况下，所述肽插入物是TGGHDSSLDGLS(SEQ ID NO:156)。在一些情况下，所述肽插入物是TGDGGTTMNGLS(SEQ ID NO:157)。在一些情况下，所述肽插入物是
TGGHGSAPDGLS(SEQ ID NO:158)。在一些情况下，所述肽插入物是TGMHVTMMAGLN(SEQ ID NO:159)。在一些情况下，所述肽插入物是TGASYLDNSGLS(SEQ ID NO:160)。在一些情况下，所述肽插入物是TVVSTQAGIGLS(SEQ ID NO:161)。在一些情况下，所述肽插入物是
TGVMHSQASGLS(SEQ ID NO:162)。在一些情况下，所述肽插入物是TGDGSPAAPGLS(SEQ ID NO:163)。在一些情况下，所述肽插入物是TGSDMAHGTGLS(SEQ ID NO:164)。在一些情况下，所述肽插入物是TGSDGTRDHGLSPVTWT(SEQ ID NO:166)。在一些情况下，所述肽插入物是NGAVADYTRGLSPATGT(SEQ ID NO:167)。在一些情况下，所述肽插入物是TGGDPTRGTGLSPVTGA(SEQ ID NO:168)。在一些情况下，所述肽插入物是LQKNARPASTESVNFQ(SEQ ID NO:169)。在一些情况下，所述肽插入物是LQRGVRIPSVLEVNGQ(SEQ ID NO:170)。在一些情况下，所述肽插入物是LQRGNRPVTTADVNTQ(SEQ ID NO:171)。在一些情况下，所述肽插入物是
LQKADRQPGVVVVNCQ(SEQ ID NO:172)。
166)；NGAVADYTRGLSPATGT(SEQ ID NO:167)；TGGDPTRGTGLSPVTGA(SEQ ID NO:168)；
LQKNARPASTESVNFQ(SEQ ID NO:169)；LQRGVRIPSVLEVNGQ(SEQ ID NO:170)；
LQRGNRPVTTADVNTQ(SEQ ID NO:171)；和LQKADRQPGVVVVNCQ(SEQ ID NO:172)。在一些情况下，所述肽插入物是TGVMRSTNSGLN(SEQ ID NO:153)。在一些情况下，所述肽插入物是TGEVDLAGGGLS(SEQ ID NO:154)。在一些情况下，所述肽插入物是TSPYSGSSDGLS(SEQ ID NO:155)。在一些情况下，所述肽插入物是TGGHDSSLDGLS(SEQ ID NO:156)。在一些情况下，所述肽插入物是TGDGGTTMNGLS(SEQ ID NO:157)。在一些情况下，所述肽插入物是
TGGHGSAPDGLS(SEQ ID NO:158)。在一些情况下，所述肽插入物是TGMHVTMMAGLN(SEQ ID NO:159)。在一些情况下，所述肽插入物是TGASYLDNSGLS(SEQ ID NO:160)。在一些情况下，所述肽插入物是TVVSTQAGIGLS(SEQ ID NO:161)。在一些情况下，所述肽插入物是
TGVMHSQASGLS(SEQ ID NO:162)。在一些情况下，所述肽插入物是TGDGSPAAPGLS(SEQ ID NO:163)。在一些情况下，所述肽插入物是TGSDMAHGTGLS(SEQ ID NO:164)。在一些情况下，所述肽插入物是TGSDGTRDHGLSPVTWT(SEQ ID NO:166)。在一些情况下，所述肽插入物是NGAVADYTRGLSPATGT(SEQ ID NO:167)。在一些情况下，所述肽插入物是TGGDPTRGTGLSPVTGA(SEQ ID NO:168)。在一些情况下，所述肽插入物是LQKNARPASTESVNFQ(SEQ ID NO:169)。在一些情况下，所述肽插入物是LQRGVRIPSVLEVNGQ(SEQ ID NO:170)。在一些情况下，所述肽插入物是LQRGNRPVTTADVNTQ(SEQ ID NO:171)。在一些情况下，所述肽插入物是
LQKADRQPGVVVVNCQ(SEQ ID NO:172)。
[0152] 在一些情况下，插入位点介于AAV2的氨基酸587与588之间、AAV1的氨基酸590与591之间、AAV5的氨基酸575与576之间、AAV6的氨基酸590与591之间、AAV7的氨基酸589与
590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间、或AAV10的氨基酸588与589之间。
590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间、或AAV10的氨基酸588与589之间。
[0153] 作为另一个示例，在一些情况下，本公开的变体衣壳多肽与亲本AAV衣壳蛋白相比包含氨基酸取代。一个或多个氨基酸取代可位于衣壳中的溶剂可接近位点，例如，溶剂可接近环。例如，一个或多个氨基酸取代可位于AAV衣壳蛋白的GH环中。在一些情况下，所述变体衣壳蛋白与AAV6衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)或除AAV6以外的血清型中的相应氨基酸相比包含在氨基酸451和/或532处的氨基酸取代。在一些情况下，所述变体衣壳蛋白与AAV6衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)或除AAV6以外的血清型中的相应氨基酸相比包含在氨基酸319和/或451和/或532和/或642处的氨基酸取代。在一些情况下，所述变体衣壳蛋白与AAV6衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)相比包含一个或多个以下取代：I319V、N451D、D532N和H642N。
[0154] 异源基因产物
[0155] 如上所述，本公开的rAAV病毒体包含异源核酸，所述异源核酸包含编码一种或多种基因产物(一种或多种异源基因产物)的核苷酸序列。在一些情况下，所述基因产物是多肽。在一些情况下，所述基因产物是RNA。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列编码异源核酸基因产物和异源多肽基因产物。当基因产物是RNA时，在一些情况下，RNA基因产物编码多肽，当基因产物是RNA时，在一些情况下，RNA基因产物不编码多肽。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含单一异源核酸，其包含编码单一异源基因产物的核苷酸序列。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含单一异源核酸，其包含编码两种异源基因产物的核苷酸序列。当单一异源核酸编码两种异源基因产物时，在一些情况下，编码两种异源基因产物的核苷酸序列可操作地连接至相同的启动子。当单一异源核酸编码两种异源基因产物时，在一些情况下，编码两种异源基因产物的核苷酸序列可操作地连接至两个不同的启动子。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含单一异源核酸，其包含编码三种异源基因产物的核苷酸序列。当单一异源核酸编码三种异源基因产物时，在一些情况下，编码三种异源基因产物的核苷酸序列可操作地连接至相同的启动子。当单一异源核酸编码三种异源基因产物时，在一些情况下，编码三种异源基因产物的核苷酸序列可操作地连接至两个或三个不同的启动子。在一些情况下，本公开的rAAV病毒体包含两种异源核酸，其各自包含编码异源基因产物的核苷酸序列。
[0156] 在一些情况下，所述基因产物是编码多肽的RNA。在一些情况下，所述基因产物是干扰RNA。在一些情况下，所述基因产物是微RNA(miRNA)。在一些情况下，所述基因产物是适体。在一些情况下，所述基因产物是多肽。在一些情况下，所述基因产物是治疗性多肽，例如，提供临床益处的多肽。在一些情况下，所述基因产物是位点特异性核酸酶，其提供基因功能的位点特异性敲减。在一些情况下，所述基因产物是RNA指导的核酸内切酶，其提供靶核酸的修饰。在一些情况下，所述基因产物是：i)提供靶核酸修饰的RNA指导的核酸内切酶；及ii)指导RNA，其包含结合至靶核酸中的靶序列的第一区段和结合至RNA指导的核酸内切酶的第二区段。在一些情况下，所述基因产物是：i)提供靶核酸修饰的RNA指导的核酸内切酶；ii)第一指导RNA，其包含结合至靶核酸中的第一靶序列的第一区段和结合至RNA指导的核酸内切酶的第二区段；及iii)第一指导RNA，其包含结合至靶核酸中的第二靶序列的第一区段和结合至RNA指导的核酸内切酶的第二区段。
[0157] 核酸基因产物
[0158] 当基因产物是干扰RNA(RNAi)时，合适的RNAi包括降低细胞中凋亡或血管生成因子的水平的RNAi。例如，RNAi可以是降低基因产物的水平的shRNA或siRNA，所述基因产物诱导或促进细胞中的凋亡。其基因产物诱导或促进凋亡的基因在本文中被称为“促凋亡基因”且其基因产物(mRNA；蛋白质)被称为“促凋亡基因产物”。促凋亡基因产物包括例如Bax、Bid、Bak和Bad基因产物。参见，例如美国专利号7,846,730。
[0159] 作为一个示例，在一些情况下，干扰RNA特异性地降低缺陷型等位基因的RNA和/或多肽产物的水平。例如，在一些情况下，RNAi特异性地降低编码享延顿的RNA的水平和/或特异性地降低享延顿多肽的水平。
[0160] 作为另一个示例，在一些情况下，miRNA特异性地降低缺陷型等位基因的RNA和/或多肽产物的水平。
[0161] 作为另一个示例，在一些情况下，RNAi特异性地降低编码过氧化物歧化酶-1(SOD1)RNA的RNA的水平和/或特异性地降低SOD1多肽的水平，例如，当SOD1 RNA和多肽由缺陷型等位基因编码时。
[0162] 作为另一个示例，在一些情况下，RNAi特异性地降低编码运动神经元生存蛋白-1(SMN1)的RNA的水平和/或特异性地降低SMN1多肽的水平，例如，当SMN1 RNA和多肽由缺陷型等位基因编码时。
[0163] 干扰RNA也可针对血管生成产物，例如，血管内皮生长因子(VEGF)(例如，Cand5；参见，例如美国专利公布号2011/0143400；美国专利公布号2008/0188437；及Reich等人(2003)Mol.Vis.9:210)；VEGF受体-1(VEGFR1)(例如，Sirna-027；参见，例如Kaiser等人(2010)Am.J.Ophthalmol.150:33；及Shen等人(2006)Gene Ther.13:225)；或VEGF受体-2(VEGFR2)(Kou等人(2005)Biochem.44:15064)。也参见，美国专利号6,649,596、6,399,586、5,661,135、5,639,872和5,639,736；及美国专利号7,947,659和7,919,473。
[0164] 当基因产物是适体时，示例性目标适体包括针对VEGF的适体。参见，例如Ng等人(2006)Nat.Rev.Drug Discovery 5:123；及Lee等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:18902。例如，VEGF适体可包含核苷酸序列5’-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3’(SEQ ID NO:12)。血小板衍生生长因子(PDGF)特异性适体也是适用的，例如E10030；参见，例如Ni和Hui(2009)Ophthalmologica 223:401；及Akiyama等人(2006)J.Cell Physiol.207:407)。
[0165] 多肽基因产物
[0166] 当基因产物是多肽时，在一些情况下，所述多肽是增强神经干细胞、神经祖细胞或神经元细胞的功能的多肽。
[0167] 在一些情况下，所述基因产物是诱导神经干细胞分化的多肽，例如，诱导神经干细胞分化成神经元、胶质细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞。诱导神经干细胞分化的多肽的非限制性示例包括盾片(achaete-scute)家族基本螺旋-环-螺旋转录因子1(MASH1；Deng等人(2010)Biochem.Biophys.Res.Commun.392:548)、配对样同源盒2a(PHOX2A)、神经原质蛋白1(NGN1)、配对盒6(PAX6)、性别决定区Y-盒1(SOX1)、神经原性分化1(NeuroD1)、NeuroD相关因子(NDRF)、少突胶质细胞转录因子2(Olig2)。参见，例如Ohtsuka等人(1998)Cell Tissue Res.293:23；及Bond等人(2015)Cell Stem Cell 17:385。
[0168] 示例性多肽包括神经保护性多肽(例如，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、纤毛神经营养因子(CNTF)、神经营养蛋白-4(NT4)、神经生长因子(NGF)和神经秩蛋白(NTN))；芳族L-氨基酸脱羧酶；谷氨酸脱羧酶；三肽基肽酶；天冬氨酸酰化酶；抗血管生成多肽(例如，可溶性VEGF受体；VEGF结合抗体；VEGF结合抗体片段(例如单链抗VEGF抗体)；内皮抑素；肿瘤抑素；制管张素；可溶性Flt多肽(Lai等人(2005)Mol.Ther.12:659)；包含可溶性Flt多肽的Fc融合蛋白(参见，例如Pechan等人(2009)Gene Ther.16:10)；纤毛神经营养因子；垂体腺苷酸环化酶激活多肽；组织金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)；转录因子，例如神经原性分化1(Neuro D1)、少突胶质细胞转录因子1(Olig1)、少突胶质细胞转录因子2(Olig2)、盾片家族BHLH转录因子1(ASCii)、DNA-蛋白抑制因子ID-1(Id1)、DNA-蛋白抑制因子ID-2(Id2)、神经原质蛋白、信号转导蛋白和转录激活因子3、NK2转录因子样蛋白B；等等。合适的多肽包括但不限于神经胶质源性神经营养因子(GDNF)；成纤维细胞生长因子；成纤维细胞生长因子2；神经秩蛋白(NTN)；纤毛神经营养因子(CNTF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-4(NT4)；脑源性神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子；X连锁的凋亡抑制蛋白；和音猬因子。
[0169] 位点特异性核酸内切酶
[0170] 在一些情况下，目标基因产物是位点特异性核酸内切酶，其提供基因功能的位点特异性敲减，例如，其中核酸内切酶敲除与神经疾病有关的等位基因。例如，当显性等位基因编码基因的缺陷拷贝(当其为野生型时是神经结构蛋白和/或提供正常的神经功能)时，位点特异性核酸内切酶可靶向缺陷型等位基因并敲除缺陷型等位基因。在一些情况下，位点特异性核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶。
[0171] 位点特异性核酸酶也可用于刺激与供体DNA的同源重组，所述供体DNA编码由缺陷型等位基因所编码的蛋白质的功能性拷贝。因此，例如，本发明的rAAV病毒体可用于递送敲除缺陷型等位基因的位点特异性核酸内切酶，并且可用于递送缺陷型等位基因的功能性拷贝，从而修复缺陷型等位基因，由此产生功能性神经蛋白。在一些情况下，本发明的rAAV病毒体包含：异源核酸，其包含编码位点特异性核酸内切酶的核苷酸序列；和异源核苷酸序列，其编码缺陷型等位基因的功能性拷贝，其中所述功能性拷贝编码功能性神经蛋白。
[0172] 可包含与神经学疾病和病症有关或导致神经疾病和病症的突变的基因的示例包括但不限于次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(phosphoriboxyltransferase)(HPRT1)、神经纤维瘤病II型(NF2)、ATP1A3(编码Na+/K+-ATP酶的α3亚基)、DYNC1H1(编码胞质动力蛋白-1的重链)、HTT(编码享延顿)、SOD1、SMN1、ATX3(编码脊髓小脑共济失调-3)、FXN/X25(编码共济失调蛋白)、DMPK(编码肌营养不良性肌强直蛋白激酶)、ATXN2(编码ataxin-2)、atrophin-1、NR4A2(编码核受体亚家族4，A组，成员2蛋白)、PINK1(编码PTEN诱导的推定激酶1)、LRRK2(编码富亮氨酸的重复激酶2)、MeCP2(编码甲基-CpG-结合蛋白-2)等等。
[0173] 适用的位点特异性核酸内切酶包括例如锌指核酸酶(ZFN)；大范围核酸酶；及转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)，其中这类位点特异性核酸内切酶不是天然存在的并且被修饰以靶向特定的基因。这类位点特异性核酸酶可被工程化以切割基因组内的特定位置，并且非同源末端结合可随后修复在若干核苷酸的插入或缺失之时的断裂。这类位点特异性核酸内切酶(也称为“INDEL”)则将蛋白质扔出框外并有效地敲除基因。参见，例如美国专利公布号2011/0301073。合适的位点特异性核酸内切酶包括工程化的大范围核酸酶重新工程化的归巢核酸内切酶。合适的核酸内切酶包括I-Tevl核酸酶。合适的大范围核酸酶包括I-Sce1(参见，例如Bellaiche等人(1999)Genetics 152:1037)；及I-Cre1(参见，例如Heath等人(1997)Nature Structural Biology 4:468)。
[0174] RNA指导的核酸内切酶
[0175] 在一些情况下，基因产物是RNA指导的核酸内切酶。在一些情况下，基因产物是包含编码RNA指导的核酸内切酶的核苷酸序列的RNA。在一些情况下，基因产物是指导RNA，例如，单指导RNA。在一些情况下，基因产物是：1)指导RNA；和2)RNA指导的核酸内切酶。指导RNA可包含：a)结合至RNA指导的核酸内切酶的蛋白质结合区；和b)结合至靶核酸的区域。RNA指导的核酸内切酶在本文中也称为“基因组编辑核酸酶”。
[0176] RNA指导的核酸内切酶的示例是CRISPR/Cas核酸内切酶(例如，2类CRISPR/Cas核酸内切酶，如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。合适的基因组编辑核酸酶是CRISPR/Cas核酸内切酶(例如，2类CRISPR/Cas核酸内切酶，如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。在一些情况下，合适的RNA指导的核酸内切酶是2类CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，合适的RNA指导的核酸内切酶是2类II型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cas9蛋白)。在一些情况下，基因组靶标组合物包括2类V型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cpf1蛋白、C2c1蛋白或C2c3蛋白)。在一些情况下，合适的RNA指导的核酸内切酶是2类VI型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如C2c2蛋白；也称为“Cas13a”蛋白)。CasX蛋白也适用。CasY蛋白也适用。
[0177] 在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是II型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是Cas9多肽。Cas9蛋白借助于其与Cas9指导RNA的蛋白结合区段的结合被引导到靶核酸序列(例如，染色体序列或染色体外序列，例如游离序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)内的靶位点(例如，在靶位点处稳定)。在一些情况下，Cas9多肽包含与图18A中所描绘的酿脓链球菌Cas9具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或大于99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的组合物或方法中使用的Cas9多肽是金黄色葡萄球菌Cas9(saCas9)多肽。在一些情况下，saCas9多肽包含与图19中所描绘的saCas9氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0178] 在一些情况下，合适的Cas9多肽是高保真(HF)Cas9多肽。Kleinstiver等人(2016)Nature 529:490。例如，图18A中所描绘的氨基酸序列的氨基酸N497、R661、Q695和Q926被例如丙氨酸取代。例如，HF Cas9多肽可包含与图19A中所描绘的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸N497、R661、Q695和Q926被例如丙氨酸取代。合适的Cas9多肽包含图18A-18F的任一个中所列的氨基酸序列。
[0179] 在一些情况下，合适的Cas9多肽呈现出改变的PAM特异性。参见，例如Kleinstiver等人(2015)Nature 523:481。
[0180] 在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是V型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，V型CRISPR/Cas核酸内切酶是Cpf1蛋白。在一些情况下，Cpf1蛋白包含与图20中所描绘的Cpf1氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0181] 在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是CasX或CasY多肽。CasX和CasY多肽描述于Burstein等人(2017)Nature 542:237中。
[0182] RNA指导的核酸内切酶
[0183] RNA指导的核酸内切酶在本文中也称为“基因组编辑核酸酶”。合适的基因组编辑核酸酶的示例是CRISPR/Cas核酸内切酶(例如，2类CRISPR/Cas核酸内切酶，如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。合适的基因组编辑核酸酶是CRISPR/Cas核酸内切酶(例如，2类CRISPR/Cas核酸内切酶，如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸内切酶)。在一些情况下，合适的基因组编辑核酸酶是2类CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，合适的基因组编辑核酸酶是2类II型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cas9蛋白)。在一些情况下，合适的基因组编辑核酸酶是2类V型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如，Cpf1蛋白、C2c1蛋白或C2c3蛋白)。在一些情况下，合适的基因组编辑核酸酶是2类VI型CRISPR/Cas核酸内切酶(例如C2c2蛋白；也称为“Cas13a”蛋白)。CasX蛋白也适用。CasY蛋白也适用。
[0184] 在一些情况下，基因组编辑核酸酶是融合至异源多肽的融合蛋白(也称为“融合伴侣”)。在一些情况下，基因组编辑核酸酶融合至提供亚细胞定位的氨基酸序列(融合伴侣)，即，融合伴侣是亚细胞定位序列(例如，用于靶向核的一个或多个核定位信号(NLS)、两个或更多个NLS、三个或更多个NLS等)。
[0185] 在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是II型CRISPR/Case核酸内切酶。在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是Cas9多肽。Cas9蛋白借助于其与Cas9指导RNA的蛋白结合区段的结合被引导到靶核酸序列(例如，染色体序列或染色体外序列，例如游离序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)内的靶位点(例如，在靶位点处稳定)。在一些情况下，Cas9多肽包含与图18A中所描绘的酿脓链球菌Cas9具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或大于99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的组合物或方法中使用的Cas9多肽是金黄色葡萄球菌Cas9(saCas9)多肽。在一些情况下，saCas9多肽包含与图19中所描绘的saCas9氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0186] 在一些情况下，合适的Cas9多肽包含与图18A中所描绘的酿脓链球菌Cas9具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或大于99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，但具有K848A、K1003A和R1060A取代。Slaymaker等人(2016)Science 351:84-88。在一些情况下，合适的Cas9多肽包含图18E中所描绘的氨基酸序列。合适的Cas9多肽包含图18A至图18F的任一个中所描绘的氨基酸序列。
[0187] 在一些情况下，合适的Cas9多肽是高保真(HF)Cas9多肽。Kleinstiver等人(2016)Nature 529:490。例如，图18A中所描绘的氨基酸序列的氨基酸N497、R661、Q695和Q926被例如丙氨酸取代。例如，HF Cas9多肽可包含与图18A中所描绘的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸N497、R661、Q695和Q926被例如丙氨酸取代。在一些情况下，合适的Cas9多肽包含图18F中所描绘的氨基酸序列。
[0188] 在一些情况下，合适的Cas9多肽呈现出改变的PAM特异性。参见，例如Kleinstiver等人(2015)Nature 523:481。
[0189] 在一些情况下，基因组编辑的核酸内切酶是V型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，V型CRISPR/Cas核酸内切酶是Cpf1蛋白。在一些情况下，Cpf1蛋白包含与图20A中所描绘的Cpf1氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Cpf1蛋白包含与图20B中所描绘的Cpf1氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Cpf1蛋白包含与图20C中所描绘的Cpf1氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Cpf1蛋白包含与图20C中所描绘的Cpf1氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少90％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0190] 无酶活性的RNA指导的核酸内切酶
[0191] 具有降低的酶活性的RNA指导的核酸内切酶也是适用的。这样一种RNA指导的核酸内切酶被称为“死”RNA指导的核酸内切酶；例如，包含某些氨基酸取代以使其大体上不呈现核酸内切酶活性但当与指导RNA复合时仍结合至靶核酸的Cas9多肽被称为“死”Cas9或“dCas9”。在一些情况下，“死”Cas9蛋白具有降低的裂解双链靶核酸的互补和非互补链的能力。例如，“核酸酶缺陷型”Cas9缺少功能RuvC结构域(即，不裂解双链靶DNA的非互补链)且缺少功能HNH结构域(即，不裂解双链靶DNA的互补链)。作为非限制性示例，在一些情况下，核酸酶缺陷型Cas9蛋白在对应于SEQ ID NO:40(或Cas9的同源物的相应残基)的残基D10和H840(例如D10A和H840A)的氨基酸位置处具有突变以使得所述多肽具有降低的裂解(例如不裂解)靶核酸的互补和非互补链的能力。这类Cas9蛋白具有降低的裂解靶核酸(例如单链或双链靶核酸)的能力，但保留结合靶核酸的能力。不能裂解靶核酸(例如，由于一个或多个突变，例如在RuvC和HNH结构域的催化结构域中)的Cas9蛋白被称为“核酸酶缺陷型Cas9”、“死Cas9”或简称为“dCas9”。其它残基可突变以达到上述效果(即，使一个或另一个核酸酶部分失活)。作为非限制性示例，酿脓链球菌Cas9(或Cas9同源物的相应氨基酸)的残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987可改变(即取代)。在一些情况下，酿脓链球菌Cas9(或Cas9同源物的相应氨基酸)的D10、E762、H840、N854、N863和D986中的两个或更多个被取代。在一些情况下，酿脓链球菌Cas9(或Cas9同源物的相应氨基酸)的D10和N863被Ala取代。除丙氨酸取代以外的突变也是合适的。
[0192] 在一些情况下，基因组编辑核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶(及其相应指导RNA)，被称为Cas9协同激活介质(Cas9-SAM)。Cas9-SAM系统的RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9)是融合至转录激活结构域(其中合适的转录激活结构域包括例如VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA和SET7/9)或转录阻遏结构域(其中合适的转录阻遏结构域包括例如KRAB结构域、NuE结构域、NcoR结构域、SID结构域和SID4X结构域)的“死”Cas9。Cas9-SAM系统的指导RNA包含结合衔接蛋白的环，所述衔接蛋白融合至转录激活结构域(例如，VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA或SET7/9)或转录阻遏结构域(例如，KRAB结构域、NuE结构域、NcoR结构域、SID结构域或SID4X结构域)。例如，在一些情况下，指导RNA是包含插入sgRNA的一个或两个环中的MS2 RNA适体的单指导RNA；dCas9是包含融合至VP64的dCas9的融合多肽；且衔接/功能蛋白是包含以下各物的融合多肽：i)MS2；ii)p65；和iii)HSF1。参见，例如美国专利公布号2016/0355797。
[0193] 包含以下各物的嵌合多肽也适用：a)死的RNA指导的核酸内切酶；和b)异源融合多肽。合适的异源融合多肽的示例包括具有以下活性的多肽：例如甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA裂解活性、DNA裂解活性、DNA整合活性或核酸结合活性。
[0194] 指导RNA
[0195] 结合至2类CRISPR/Cas核酸内切酶(例如Cas9蛋白；V型或VI型CRISPR/Cas蛋白；Cpf1蛋白；等)并将复合物靶向靶核酸内的特定位置的核酸在本文中被称为“指导RNA”或“CRISPR/Cas指导核酸”或“CRISPR/Cas指导RNA”。指导RNA通过包括靶区段提供对复合物(RNP复合物)的靶特异性，所述靶区段包含指导序列(在本文中也称为靶序列)，指导序列是与靶核酸序列互补的核苷酸序列。
[0196] 在一些情况下，指导RNA包含两个单独的核酸分子：“激活子”和“靶标子”且在本文中称作“双指导RNA”、“双分子指导RNA”、“两分子指导RNA”或“dgRNA”。在一些情况下，指导RNA是一个分子(例如，对于一些2类CRISPR/Cas蛋白，相应的指导RNA是单分子；且在一些情况下，激活子和靶标子彼此共价连接，例如经由插入核苷酸)，指导RNA被称为“单指导RNA”、“单分子指导RNA”、“一分子指导RNA”或简称为“sgRNA”。
[0197] 当基因产物是RNA指导的核酸内切酶或既是RNA指导的核酸内切酶又是指导RNA时，所述基因产物可修饰靶核酸。在一些情况下，例如，当靶核酸在缺陷型等位基因中包含有害突变(例如，在神经细胞靶核酸中的有害突变)时，RNA指导的核酸内切酶/指导RNA复合物以及包含纠正有害突变的核苷酸序列的供体核酸(例如，包含编码由缺陷型等位基因所编码的蛋白质的功能性拷贝的核苷酸序列的供体核酸)可用于纠正有害突变，例如经由同源定向修复(HDR)。
[0198] 在一些情况下，基因产物是RNA指导的核酸内切酶和2个单独的sgRNA，其中这2个单独的sgRNA经由非同源末端结合(NHEJ)提供靶核酸的缺失。
[0199] 在一些情况下，所述基因产物是：i)RNA指导的核酸内切酶；和ii)一个指导RNA。在一些情况下，所述指导RNA是单分子(或“单引导”)引导的RNA(“sgRNA”)。在一些情况下，所述指导RNA是双分子(或“双引导”)指导RNA(“dgRNA”)。
[0200] 在一些情况下，所述基因产物是：i)RNA指导的核酸内切酶；和ii)2个单独的sgRNA，其中这2个单独的sgRNA经由非同源末端结合(NHEJ)提供靶核酸的缺失。在一些情况下，指导RNA是sgRNA。在一些情况下，指导RNA是dgRNA。
[0201] 在一些情况下，所述基因产物是：i)Cpf1多肽；和ii)指导RNA前体；在这些情况下，所述前体可通过Cpf1多肽裂解以产生2个或更多个指导RNA。
[0202] 本公开提供了一种修饰个体中神经元细胞中的靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下各物的异源核酸：i)编码RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码sgRNA的核苷酸序列，sgRNA包含与靶核酸互补的核苷酸序列；及iii)编码供体DNA模板的核苷酸序列，所述供体DNA模板包含纠正有害突变的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过HDR矫正靶核酸中的有害突变。
[0203] 本公开提供了一种修饰个体中神经元细胞中的靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下各物的异源核酸：i)编码RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码第一sgRNA的核苷酸序列，第一sgRNA包含与靶核酸中的第一序列互补的核苷酸序列；及iii)编码第二sgRNA的核苷酸序列，第二sgRNA包含与靶核酸中的第二序列互补的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过NHEJ切除靶核酸中的有害突变。
[0204] 本公开提供了一种修饰个体中神经干细胞中的靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下各物的异源核酸：i)编码RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码sgRNA的核苷酸序列，sgRNA包含与靶核酸互补的核苷酸序列；及iii)编码供体DNA模板的核苷酸序列，所述供体DNA模板包含纠正有害突变的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过HDR矫正靶核酸中的有害突变。
[0205] 本公开提供了一种修饰个体中神经干细胞中的靶核酸的方法，其中所述靶核酸包含有害突变，所述方法包括向所述个体施用本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有以下各物的异源核酸：i)编码RNA指导的核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的核苷酸序列；ii)编码第一sgRNA的核苷酸序列，第一sgRNA包含与靶核酸中的第一序列互补的核苷酸序列；及iii)编码第二sgRNA的核苷酸序列，第二sgRNA包含与靶核酸中的第二序列互补的核苷酸序列。rAAV病毒体的施用通过NHEJ切除靶核酸中的有害突变。
[0206] 药物组合物
[0207] 本公开提供了一种药物组合物，其包含：a)如上所述的本发明rAAV病毒体；和b)药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。在一些情况下，所述药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂适于用于人。
[0208] 此类赋形剂、载剂、稀释剂和缓冲剂包括可在无不当毒性的情况下施用的任何药物试剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可包括在内，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。这类媒介物中还可能存在辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。广泛多种药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的并且不必在本文中详细论述。药学上可接受的赋形剂已详细地描述于多种出版物中，包括例如A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”第20版,Lippincott,Williams,&Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人编著,第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；and Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人编著,第3版
Amer.Pharmaceutical Assoc。
Amer.Pharmaceutical Assoc。
[0209] 方法
[0210] 递送基因产物的方法
[0211] 本公开提供了一种将基因产物递送到个体中的神经元细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用如上所述的本发明rAAV病毒体。所述基因产物可以是多肽或干扰RNA(例如，shRNA、siRNA等)、适体、或位点特异性核酸内切酶(例如，RNA指导的核酸内切酶)，如上所述。将基因产物递送到神经元细胞可提供对神经疾病的治疗。
[0212] 本公开提供了一种修饰神经元细胞中的靶核酸的方法，所述方法包括使所述神经元细胞与以下各物接触：1)本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有核苷酸序列的异源核酸，所述核苷酸序列编码结合指导RNA的RNA指导的核酸内切酶；和2)指导RNA。本公开提供了一种修饰神经元细胞中的靶核酸的方法，所述方法包括使所述神经元细胞与本公开的rAAV病毒体接触，其中所述rAAV病毒体包含含有编码以下的核苷酸序列的异源核酸：i)结合指导RNA的RNA指导的核酸内切酶；和ii)指导RNA。在一些情况下，所述方法包括使所述神经元细胞与供体DNA模板接触。在一些情况下，RNA指导的核酸内切酶是Cas9多肽。
在一些情况下，指导RNA是单指导RNA。
在一些情况下，指导RNA是单指导RNA。
[0213] 本公开提供了一种将基因产物递送到个体中的NSC细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用如上所述的本发明rAAV病毒体。所述基因产物可以是多肽或干扰RNA(例如，shRNA、siRNA等)、适体、或位点特异性核酸内切酶(例如，RNA指导的核酸内切酶)，如上所述。将基因产物递送到NSC可提供对神经疾病的治疗。
[0214] 本公开提供了一种修饰NSC中的靶核酸的方法，所述方法包括使所述神经干细胞与以下各物接触：1)本公开的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体包含含有核苷酸序列的异源核酸，所述核苷酸序列编码结合指导RNA的RNA指导的核酸内切酶；和2)指导RNA。本公开提供了一种修饰NSC中的靶核酸的方法，所述方法包括使所述NSC与本公开的rAAV病毒体接触，其中所述rAAV病毒体包含含有编码以下的核苷酸序列的异源核酸：i)结合指导RNA的RNA指导的核酸内切酶；和ii)指导RNA。在一些情况下，所述方法包括使所述NSC与供体DNA模板接触。在一些情况下，RNA指导的核酸内切酶是Cas9多肽。在一些情况下，指导RNA是单指导RNA。
[0215] 本公开提供了一种治疗神经疾病(例如，神经疾病)的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的如上所述的本发明rAAV病毒体。本发明rAAV病毒体可经由颅内注射或通过任何其它方便的方式或施用途径来施用。其它方便的方式或施用途径包括例如脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内等。
[0216] “治疗有效量”将落在相对较宽的范围内，该范围可通过实验和/或临床试验确定。例如，关于体内注射(即直接注射到脑中)，治疗有效剂量可为约106至约1015个rAAV病毒体，例如约108至1012个rAAV病毒体。关于体外转导，有待递送到细胞的rAAV病毒体的有效量为约108至约1013个rAAV病毒体。本领域的普通技术人员可通过建立剂量反应曲线的常规试验容易地确定其它有效剂量。
[0217] 在一些情况下，一次以上施用(例如，二、三、四次或更多次施用)可用于实现所需的基因表达水平。在一些情况下，在不同时间间隔下进行一次以上施用，例如每日、每周、每半月、每月、每3个月、每6个月、每年等。在一些情况下，在以下时间段进行多次施用：1个月至2个月、2个月至4个月、4个月至8个月、8个月至12个月、1年至2年、2年至5年、或大于5年。
[0218] 治疗神经系统疾病或疾患的方法
[0219] 可使用本发明方法治疗的神经疾病包括中枢神经系统(CNS)的神经疾病和疾患，及外周神经系统(PNS)的神经疾病和疾患。
[0220] 神经疾病和疾患包括但不限于弥漫性轴突损伤、围产期缺氧缺血性损伤、外伤性脑损伤、中风、缺血性梗塞、栓塞和高血压性出血；暴露于CNS毒素、中枢神经系统感染如细菌性脑膜炎；代谢疾病，如涉及缺氧缺血性脑病、周围神经病和糖原贮积病的那些；或慢性神经损伤或神经变性疾病，包括但不限于多发性硬化症、路易体痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿舞蹈病。
[0221] 神经疾病和疾患包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体疾病、杜-阿二氏肌萎缩、多系统萎缩症、痴呆、精神分裂症、瘫痪、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤、脑神经病症、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、高山疾病(Alper's disease)、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症(Batten disease)、皮层基底节变性、贝尔麻痹(Bell's palsy)、格-巴综合征、皮克氏病、雷特综合征、额颞叶痴呆、和孤独症。
[0222] PNS的神经疾病和疾患包括例如糖尿病性神经病变；多神经病；慢性炎症性脱髓鞘多神经病(CIPD)；等等。
[0223] 本公开提供了治疗神经病症的方法。在一些情况下，所述方法包括向有此需要的个体的脑施用本公开的rAAV病毒体或包含本公开的rAAV病毒体的组合物。
[0224] 本领域普通技术人员可容易通过测试对一个或多个参数(如与神经疾病或病症有关的症状)的效果来确定rAAV病毒体的有效量。在一些情况下，施用有效量的本公开的rAAV病毒体造成脑功能、解剖完整性或脑健康的损失率降低，例如，2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍损失率的降低，且因此疾病进展，例如，10倍或更多倍损失率的降低且因此疾病进展。在一些情况下，施用有效量的本公开的rAAV病毒体造成脑功能提高、脑解剖或健康情况改善和/或脑功能稳定，例如，2倍、3倍、4倍或5倍或更多倍的脑功能、脑解剖或健康情况的改善，例如10倍或更多倍脑功能、脑解剖或健康情况、和/或脑稳定性的改善。
[0225] 核酸和宿主细胞
[0226] 本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码如上所述的本发明变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列。
[0227] 本发明的重组AAV载体可用于产生如上所述的本发明的重组AAV病毒体。因此，本公开提供了一种重组AAV载体，当引入合适的细胞中时，其可产生本发明的重组AAV病毒体。
[0228] 本公开还提供了宿主细胞，例如分离的(遗传修饰的)宿主细胞，其包含本发明核酸。本发明宿主细胞可以是分离的细胞，例如在体外培养中的细胞。本发明宿主细胞适用于产生本发明rAAV病毒体，如下所述。当本发明宿主细胞用于产生本发明rAAV病毒体时，其被称为“包装细胞”。在一些情况下，用本发明核酸稳定地遗传修饰本发明宿主细胞。在其它情况下，用本发明核酸瞬时遗传修饰本发明宿主细胞。
[0229] 使用已确定的技术将本发明核酸稳定地或瞬时引入宿主细胞中，所述技术包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染等等。为进行稳定的转化，本发明核酸通常还包含可选标记物，例如，如新霉素抗性等几种公知的可选标记物中的任一种。
[0230] 通过将本发明核酸引入多种细胞的任一种中生成本发明宿主细胞，所述多种细胞是例如包括例如鼠细胞和灵长类细胞(例如，人细胞)的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于原代细胞和细胞系，其中合适的细胞系包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等等。合适的宿主细胞的非限制性示例包括例如HeLa细胞(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(ATCC号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC号CCL10)、PC12细胞(ATCC号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HLHepG2细胞等等。本发明宿主细胞也可使用感染昆虫细胞如Sf9细胞的杆状病毒(其产生AAV)产生(参见，例如美国专利号7,271,
002；美国专利申请12/297,958)。
002；美国专利申请12/297,958)。
[0231] 在一些情况下，本发明的遗传修饰的宿主细胞除包含编码如上所述的变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸之外还包括包含编码一种或多种AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它情况下，本发明宿主细胞还包含rAAV载体。rAAV病毒体可使用本发明宿主细胞产生。产生rAAV病毒体的方法描述于例如美国专利公布号2005/0053922和美国专利公布号2009/0202490中。
[0232] 本公开的非限制性方面的实施例
[0233] 如上所述的本发明主题的方面(包括实施方案)可单独或与一个或多个其它方面或实施方案组合而为有利的。不限制上述说明，本公开编号1-65的某些非限制性方面在下文中提供。对于本领域技术人员而言在阅读本公开后将显而易见的是，每个单独编号的方面可使用或与任一之前或之后单独编号的方面组合。旨在提供对方面的所有这些组合的支持并且不限于下文明确提供的方面的组合。
[0234] 方面1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白赋予以下特性中的一种或多种：i)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比，提高的对所述神经干细胞的感染性；ii)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经元的感染性相比，提高的对所述神经元的感染性；以及iii)与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的抗性相比，提高的对人AAV中和抗体的抗性；和b)包含编码异源基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
[0235] 方面2.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及来自所述第二AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
[0236] 方面3.如方面2所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
[0237] 方面4.如方面2所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
[0238] 方面5.如方面2所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
[0239] 方面6.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的氨基酸51-320的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的氨基酸101-480的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的氨基酸151-640的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；以及来自第四AAV血清型的氨基酸201至C末端的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段。
[0240] 方面7.如方面6所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
[0241] 方面8.如方面6所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
[0242] 方面9.如方面6所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
[0243] 方面10.如方面6所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
[0244] 方面11.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：来自第一AAV血清型的氨基酸1-160的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；第三AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段；来自第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约
160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。
160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。
[0245] 方面12.如方面11所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
[0246] 方面13.如方面11所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
[0247] 方面14.如方面11所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
[0248] 方面15.如方面11所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
[0249] 方面16.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白按从N末端到C末端的顺序包含：来自第一AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第一区段；来自第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第二区段；来自第三AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第三区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第四区段；来自第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第五区段；来自所述第四AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第六区段；来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第七区段；以及来自所述第二AAV血清型的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸的第八区段。
[0250] 方面17.如方面16所述的rAAV病毒体，其中所述第一AAV血清型是AAV6。
[0251] 方面18.如方面16所述的rAAV病毒体，其中所述第二AAV血清型是AAV9。
[0252] 方面19.如方面16所述的rAAV病毒体，其中所述第三AAV血清型是AAV8。
[0253] 方面20.如方面16所述的rAAV病毒体，其中所述第四AAV血清型是AAV2。
[0254] 方面21.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比呈现出提高至少5倍的对所述神经干细胞的感染性。
[0255] 方面22.如方面21所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
[0256] 方面23.如方面21所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
[0257] 方面24.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比呈现出提高至少10倍的对所述神经干细胞的感染性。
[0258] 方面25.如方面24所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
[0259] 方面26.如方面24所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
[0260] 方面27.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出(及图8中所描绘)的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0261] 方面28.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:1中列出(及图8中所描绘)的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0262] 方面29.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1中列出(及图8中所描绘)的氨基酸序列。
[0263] 方面30.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:2中列出(及图9中所描绘)的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0264] 方面31.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:2中列出(及图9中所描绘)的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0265] 方面32.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含SEQ ID NO:2中列出(及图9中所描绘)的氨基酸序列。
[0266] 方面33.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出提高的所述抗性。
[0267] 方面34.如方面34所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV9。
[0268] 方面35.如方面34所述的rAAV病毒体，其中所述对照AAV病毒体是AAV2。
[0269] 方面36.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出至少约1.5倍的所述抗性。
[0270] 方面37.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出至少约3倍的所述抗性。
[0271] 方面38.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出至少约5倍的所述抗性。
[0272] 方面39.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比呈现出至少约10倍的所述抗性。
[0273] 方面40.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述神经干细胞来自室管膜下区。
[0274] 方面41.如方面1所述的rAAV病毒体，其中所述浦肯野细胞来自小脑。
[0275] 方面42.如方面1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是干扰RNA或适体。
[0276] 方面43.如方面1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是多肽。
[0277] 方面44.如方面43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是神经保护性多肽、抗血管生成多肽、诱导神经干细胞分化的多肽，或增强神经干细胞功能的多肽。
[0278] 方面45.如方面43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是脑活素、层粘连蛋白-IKVAV、cripto、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、纤毛神经营养因子、表皮生长因子、X连锁的凋亡抑制蛋白，或音猬因子。
[0279] 方面46.如方面43所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是基因组编辑酶。
[0280] 方面47.如方面46所述的rAAV病毒体，其中所述基因组编辑酶是Cas9多肽、锌指核酸酶、TALEN，或无酶活性的II型CRISPR/Cas多肽。
[0281] 方面48.如方面47所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是选自以下的RNA指导的核酸内切酶：II型CRISPR/Cas多肽、V型CRISPR/Cas多肽，以及VI型CRISPR/Cas多肽。
[0282] 方面49.如方面1-41中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述基因产物是RNA指导的核酸内切酶和指导RNA。
[0283] 方面50.一种药物组合物，其包含：a)方面1-49中任一项的重组腺相关病毒病毒体；和b)药学上可接受的赋形剂。
[0284] 方面51.一种将基因产物递送到个体中的神经干细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用根据方面1-49中任一项的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体或方面50的组合物。
[0285] 方面52.如方面51的方法，其中所述施用是通过颅内、脑室内、鞘内、小脑延髓池内或静脉内注射。
[0286] 方面53.如方面51所述的方法，其中所述基因产物是短干扰RNA或适体。
[0287] 方面54.如方面51所述的方法，其中所述基因产物是多肽。
[0288] 方面55.如方面43所述的方法，其中所述多肽是神经保护性多肽、抗血管生成多肽，或增强神经干细胞功能的多肽。
[0289] 方面56.如方面44所述的rAAV病毒体，其中所述多肽是脑活素、层粘连蛋白-IKVAV、cripto、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子2、神经秩蛋白、纤毛神经营养因子、表皮生长因子、X连锁的凋亡抑制蛋白、芳族L-氨基酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、三肽基肽酶、天冬氨酸环化酶，或音猬因子。
[0290] 方面57.如方面54所述的方法，其中所述多肽是基因组编辑酶。
[0291] 方面58.如方面57所述的方法，其中所述基因组编辑酶是Cas9多肽、锌指核酸酶、TALEN，或无酶活性的II型CRISPR/Cas多肽。
[0292] 方面59.如方面57所述的方法，其中所述多肽是选自以下的RNA指导的核酸内切酶：II型CRISPR/Cas多肽、V型CRISPR/Cas多肽，以及VI型CRISPR/Cas多肽。
[0293] 方面60.如方面51所述的方法，其中所述基因产物是RNA指导的核酸内切酶和指导RNA。
[0294] 方面61.一种治疗神经病症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的根据方面1-49中任一项的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体或方面50的组合物。
[0295] 方面62.如方面62所述的方法，其中所述神经病症是脊髓小脑共济失调、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、溶酶体贮积症、弗里德希共济失调、成胶质细胞瘤、雷特综合征、额颞叶痴呆，或癫痫。
[0296] 方面63.一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白赋予以下特性中的一种或多种：i)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比，提高的对所述神经干细胞的感染性；ii)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经元的感染性相比，提高的对所述神经元的感染性；以及iii)与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比，提高的所述抗性。
[0297] 方面64.一种分离的、遗传修饰的宿主细胞，其包含如方面63所述的核酸。
[0298] 方面65.一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含来自至少3种不同AAV血清型的至少5个区段，其中每个区段的长度为约50个氨基酸至约160个氨基酸，且其中所述变体衣壳蛋白赋予以下特性中的一种或多种：i)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经干细胞的感染性相比，提高的对所述神经干细胞的感染性；ii)与包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体对神经元的感染性相比，提高的对所述神经元的感染性；以及iii)与由包含相应亲本AAV衣壳蛋白或包含野生型AAV衣壳的对照AAV病毒体所呈现的对人AAV中和抗体的抗性相比，提高的所述抗性。
[0299] 实施例
[0300] 给出下列实施例，以便为所属领域普通技术人员提供有关如何完成和采用本发明的实施方式的代表性示例的全面内容和说明，但不对本发明人所述的本发明的范围构成限定，也不代表下列实验是全部或仅有的实施过的实验。已经努力确保所用数值(例如，量、温度等)的精确性，但是应说明某些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏温度，且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
[0301] 实施例1：嵌合AAV文库的SCHEMA指导设计
[0302] 材料和方法
[0303] 除外另外指出，以下材料和方法一般适用于本文所述的实施例中所示的结果。
[0304] SCHEMA文库设计
[0305] 使用SCHEMA评分功能和RASPP算法设计嵌合AAV文库，参见，例如Voigt等人(2002)Nature Struct.Mol.Biol.6；及Endelman等人(2004)PEDS 17–代表多个系统发育演化支，参见，例如Gao等人(2004)J.Virol.78，具有不同的受体结合特性，参见，例如Asokan等人(2012)Mol.Ther.20，并在诊所取得了一些成功，参见，例如Kotterman等人(2015)Annu.Rev.Biomed.Eng.17。使用MUSCLE比对AAV2、4、5、6、8和9的氨基酸序列，参见，例如Edgar等人(2004)Nucleic Acids Res.32，以产生亲本序列比对。对SCHEMA进行修改以考虑多聚AAV衣壳中的亚基内和亚基间氨基酸接触，其中如果一对残基在4.5埃内含有非氢原子，则它们是接触的。用于AAV2(1LP3)、AAV4(2G8G)、AAV5(3NTT)、AAV6(3OAH)、AAV8(2QA0)及AAV9(3UX1)的晶体结构，以计算接触残基位置。最终接触图含有在至少50％的这6个亲本结构中接触的残基对。为了实现高文库多样性，应在衣壳结晶区内设计包含6个交叉的文库，并在非晶VP1区(氨基酸1-216)的位置128处设计第七个交叉，这是基于在该位置处成功重组的先前实施例。参见，例如Excoffon等人(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106。含有来自6个亲本血清型的8个衣壳蛋白区块的文库产生超过1.6百万(68)嵌合变体的理论文库多样性。嵌合衣壳的SCHEMA破环是含有不存在于任一亲本序列中的新氨基酸组合的接触数目。嵌合衣壳的是来自最亲近的亲本序列的突变数目。
[0306] 图1.将RASPP算法用于设计平衡平均结构破环与平均序列多样性的文库。对SCHEMA评分功能进行另外的修改以搜索适合于供文库构建用的组合金门装配的交叉位置，其需要在所有AAV亲本序列中保守的四个核苷酸段。为了增加可能的交叉位点的数目且由此探测硅中(in silico)的更大序列空间，将四个核苷酸段包括在内，它们可在文库装配期间沉默突变以便在所有亲本序列中相同。关于文库设计，考虑到20个氨基酸的最小允许序列区块长度和250个氨基酸的最大长度。基于其低、其均匀区块大小和关键衣壳结构特点的重组来选择最终文库。
[0307] SCHEMA文库构建
[0308] 图2.为了促进用IIs型限制酶BsaI的组合金门克隆，通过QuikChange定点诱变沉默突变见于pBluescript SK(+)、AAV2、4、5、6、8和9中的所有BsaI识别位点。图3和图4.使用在j5(一种DNA装配设计自动化软件)中设计的PCR引物将对应于每个改组区块的48个DNA序列从亲本cap基因中进行PCR扩增。参见，例如Hillson等人(2012)ACS Synth.Biol.1。图5.引物被设计来在区块接合处并入沉默突变以促进组合金门克隆到pBluescript载体主链8
中。将金门反应转化到电转感受态DH10B大肠杆菌中以获得理论多样性大于6 个克隆的文库大小。然后使用限制酶HindIII和NotI将文库从pBluescript亚克隆到AAV包装质粒pSub2FloxCap中。
中。将金门反应转化到电转感受态DH10B大肠杆菌中以获得理论多样性大于6 个克隆的文库大小。然后使用限制酶HindIII和NotI将文库从pBluescript亚克隆到AAV包装质粒pSub2FloxCap中。
[0309] 在包装之前和之后，使用Illumina测序分析SCHEMA文库。使用HindIII和NotI位点将含有AAV cap基因的2.5-kb片段从pSub2FloxCap载体中切割掉并进行凝胶提取。将这些凝胶提取的插入物用作Nextera XT DNA Sample Prep Kit(Illumina)的输入。每个样品都用不同的指数引物作条码标记。使用高灵敏度Bioanalyzer芯片(Agilent)、Qubit Assay Kit(Invitrogen)和最终定量PCR(Kapa Biosystems)对所得文库进行定量。平均序列片段是～1,400bp。将两个文库以等摩尔比例汇集并使用MiSeq,版本3测序，用5％PhiX对照添加物进行2×300轮。使用Bowtie2将测序读数针对所有AAV亲本作图，参见，例如Langmead等人(2009)Genome Biol.10，并且根据读取位置及与亲本的序列同一性来确定存在的特定序列区块。
[0310] 设计用于Cre依赖性选择的AAV构建体
[0311] 用于构建体设计和cap扩增的PCR引物示于图2中。使用pSub2RepKO和pRepHelper。pSub2RepKO(即在AAV包装质粒pSub2中的rep敲除，参见，例如Maheshri等人(2006)Nature Biotechnol.24)是通过用SgraI和BamHI消化、Klenow反应及钝端连接而产生。通过用PmeI和BsmI连续消化pAAV2/rh10、Klenow反应及钝端连接产生pRepHelper，它用于在AAV包装期间提供转运中的Rep。为了在cap的5’处插入lox66位点，使用引物BglIIFwd和BglIIRev，通过定点诱变将独特的BglII位点引入pSub2RepKO中。使寡核苷酸Lox66Fwd和Lox66Rev退火并连接到pSub2RepKO的BglII和HindIII位点中以形成pSub2Lox66。为了在cap的3’处插入lox71位点，分别用引物XhoIFwd/XhoIRev和KpnIFwd/KpnIRev，通过定点诱变将独特的XhoI和KpnI位点引入pSub2Lox66中。通过剪接重叠延伸装配寡核苷酸SOELox71Fwd和
SOELox71Rev并用Lox71Fwd和Lox71Rev扩增。用XhoI和KpnI消化生成的片段和pSub2Lox66并连接以产生pSub2Flox。用HindIII和NotI消化在此选择中使用的pSub2Flox和AAV cap文库并连接以产生用于病毒包装的pSub2FloxCap文库。
SOELox71Rev并用Lox71Fwd和Lox71Rev扩增。用XhoI和KpnI消化生成的片段和pSub2Lox66并连接以产生pSub2Flox。用HindIII和NotI消化在此选择中使用的pSub2Flox和AAV cap文库并连接以产生用于病毒包装的pSub2FloxCap文库。
[0312] AAV载体产生
[0313] HEK293T细胞是获自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)并在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的杜尔贝克改质的伊格尔培养基(DMEM,Gibco)中在37℃和5％CO2下培养。如先前Koerber等人(2008)Mol.Ther.16及Maheshri等人(2006)Nature Biotechnol.24中所述在HEK293T细胞中包装AAV文库或自补重组AAV载体，所述自补重组AAV载体在巨细胞病毒早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子的控制下驱动绿色荧光蛋白(GFP)或Cre重组酶的表达。简言之，通过三重瞬时转染产生AAV载体，通过iodixanol密度离心纯化，并通过Amicon过滤将缓冲液更换成磷酸盐缓冲盐水(PBS)。使用Biorad iCycler(Bio-Rad,Hercules,CA)，通过定量实时PCR测量DNase抗性病毒基因组滴度。
[0314] SCHEMA AAV变体的体内选择和表征
[0315] 用异氟烷麻醉7周龄的GFAP-Cre 73.12(Jackson Laboratory Stock012886)、C57BL/6J(Jackson Laboratory Stock 000664)或Ai9 tdTomato小鼠(Jackson Laboratory Stock 007909)并将它们置于立体定位器中。在颅骨上开一个切口，并钻孔进行注射。关于文库选择，如先前100所述使用汉弥尔顿(Hamilton)注射器将5微升的AAV文库的等摩尔混合物(1x 1010个病毒基因组/μl)以2.5mm深度立体定位注射到GFAP-Cre小鼠(n＝3)的右侧脑室中，坐标在前卤后侧0.05mm和外侧1.0mm处。使用小鼠脑图谱(Franklin and Paxinos,2007)选择注射坐标并在用0.1％FastGreen染料(Sigma)测试注射后进行调整。在整个研究过程中，通过报告基因在脉络膜丛和对侧脑室周围的表达证实了注射的准确性。注射后三周处死小鼠并取脑组织。使用研钵和杵将注射部位对侧的半球在干冰上匀质化。在55℃下将均质化组织在具有蛋白酶K(New England Biolabs)和RNase A
(ThermoFisher)的Hirt溶解缓冲液中消化3小时并且使用如先前Arad等人(1998)
BioTechniques 24中所述的Hirt方法分离染色体外DNA。PCR引物Cap_ISF和Cap_R用于扩增反向cap，而引物Cap_NSF和Cap_R特异性地扩增非反向cap。如果反向cap的扩增有困难，则引物Internal_Cap_ISF和Internal_Cap_R可用于嵌套式PCR。在三轮选择之后，通过Sanger测序(UC Berkeley DNA Sequencing Facility)测定衣壳序列并且用HindIII和NotI消化显性变体并连接到pXX2Not中以用于重组AAV包装。
(ThermoFisher)的Hirt溶解缓冲液中消化3小时并且使用如先前Arad等人(1998)
BioTechniques 24中所述的Hirt方法分离染色体外DNA。PCR引物Cap_ISF和Cap_R用于扩增反向cap，而引物Cap_NSF和Cap_R特异性地扩增非反向cap。如果反向cap的扩增有困难，则引物Internal_Cap_ISF和Internal_Cap_R可用于嵌套式PCR。在三轮选择之后，通过Sanger测序(UC Berkeley DNA Sequencing Facility)测定衣壳序列并且用HindIII和NotI消化显性变体并连接到pXX2Not中以用于重组AAV包装。
[0316] 为了体内表征SCH9和AAV9，使用汉弥尔顿注射器将5微升的表达GFP或Cre的自补10
重组载体(1x 10 个病毒基因组/μl)以2.5mm深度立体定位注射到C57BL/6或Ai9 tdTomato小鼠的右侧脑室中，坐标分别在前卤后侧0.05mm和外侧1.0mm处。在注射单链SCH9CAG-Cre之前，Ai9小鼠接受50mg/kg BrdU(Sigma-Aldrich)的注射连续三日。关于深部小脑核的注射，使用汉弥尔顿注射器将4微升表达GFP的重组AAV载体(2x 109个病毒基因组/μl)以距小脑表面2.2mm的深度立体定位注射到右半球中，坐标在前卤后侧6.0mm和外侧2.0mm处。动物程序由加州大学伯克利分校实验实动物护理和使用委员会(UC Berkeley Laboratory Animal Care and Use Committee)批准，并按照NIH的动物护理指导方针进行。
重组载体(1x 10 个病毒基因组/μl)以2.5mm深度立体定位注射到C57BL/6或Ai9 tdTomato小鼠的右侧脑室中，坐标分别在前卤后侧0.05mm和外侧1.0mm处。在注射单链SCH9CAG-Cre之前，Ai9小鼠接受50mg/kg BrdU(Sigma-Aldrich)的注射连续三日。关于深部小脑核的注射，使用汉弥尔顿注射器将4微升表达GFP的重组AAV载体(2x 109个病毒基因组/μl)以距小脑表面2.2mm的深度立体定位注射到右半球中，坐标在前卤后侧6.0mm和外侧2.0mm处。动物程序由加州大学伯克利分校实验实动物护理和使用委员会(UC Berkeley Laboratory Animal Care and Use Committee)批准，并按照NIH的动物护理指导方针进行。
[0317] 免疫组织化学
[0318] 通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪使小鼠麻醉并且心脏灌注0.9％盐水，接着是4％聚甲醛。将脑在4℃下在4％聚甲醛中后固定过夜，在PBS中洗涤，并储存在30％蔗糖中直到它们下沉。在系列8000滑动切片机(Bright)上以40μm厚度切割连续的冠状或矢状切片并在-20℃下储存在低温保护剂中直到使用。将自由漂浮的切片在PBS中洗涤三次，用阻断溶液(10％驴血清和1％Triton X-100，于PBS中)在室温下培育2小时，并且在4℃下在阻断溶液中用第一抗体染色72小时。将以下第一抗体用于这项研究中：小鼠抗钙结合蛋白(1:2000；Abcam,ab82812)、兔抗GFP(1:1000；Life Technologies,A-11122)、山羊抗GFAP(1:750；Abcam,ab53554)、豚鼠抗DCX(1:1000，EMD Millipore,AB2253)、大鼠抗VCAM1(1:50；EMD Millipore,MAB2627)、鸡抗GFAP(1:750；Abcam,ab4674)、大鼠抗BrdU(1:
750；Abcam,ab6326)、及兔抗tdTomato(1:750；Rockland,600-401-379)。在PBS中洗涤三次之后，将切片用第二抗体在室温下培育2小时并用DAPI(Thermo Fisher)染色十分钟。将染色的切片在PBS中洗涤三次，并使用VectaShield HardSet Antifade Mounting Medium(Vector Laboratories)固定到载玻片上。
750；Abcam,ab6326)、及兔抗tdTomato(1:750；Rockland,600-401-379)。在PBS中洗涤三次之后，将切片用第二抗体在室温下培育2小时并用DAPI(Thermo Fisher)染色十分钟。将染色的切片在PBS中洗涤三次，并使用VectaShield HardSet Antifade Mounting Medium(Vector Laboratories)固定到载玻片上。
[0319] 成像和分析
[0320] 使用Zeiss Axio Scan.Z1或共焦Zeiss LSM 880NLO AxioExaminer(UC Berkeley Molecular Imaging Center)采集图像。所有的图像分析都是在相同设置下采集的原始图像上进行。数据表示为平均值±SEM并且通过双尾Student t检验确定统计显著性。
[0321] SVZ是由多个细胞类型构成，包括室管膜细胞、成年NSC(B细胞)、转运扩增细胞(C型细胞)、成神经细胞(A型细胞)和成熟星形胶质细胞。参见，例如Lim等人(2016)Cold Spring Harb.Perspect.Biol.8。为了评价SVZ中的NSC转导效率，首先评估在NSC内选择性表达的分子标记物。虽然大多数标记物在SVZ的多个细胞类型中表达，反映了在谱系发展期间基因表达的连续性，但血管细胞粘附分子1(VCAM1)特异性地定位在与脑室接触的NSC的端脚处。参见，例如Kokovay等人(2012)Cell Stem Cell 11。
[0322] 为了测定SVZ中的转导体积，使用CellProfiler从阈值图像量化在SVZ中GFP表达的表面积，参见，例如Carpenter等人(2006)Genome Biol.7，从侧脑室前角至前联合，跨越SVZ的6个冠状切面中，每组三只小鼠。总表面积乘以切面厚度(40μm)和切面之间的距离以获得转导体积。将相同的阈值图像用于使用CellProfiler进行的GFP表达积分强度的定量。
[0323] 为了量化tdTomato阳性成神经细胞在嘴侧迁移流中的比例，将CellProfiler的细胞分割能力应用于嘴侧迁移流中双皮质素和tdTomato阳性细胞体的阈值、分割和评分。在每只动物中对含有嘴侧迁移流的2至5个矢状组织切片进行测量，每组4-5只小鼠。为了评价成年神经干细胞的转导，通过与tdTomato和GFAP或DCX的共定位对室管膜下区中所有BrdU阳性细胞的身份进行评分。在5只小鼠中，每只动物有4至5个切片，对跨越SVZ的每5个矢状切面的共焦图像进行计数。
[0324] 为了计算tdTomato阳性的钙结合蛋白染色区域的百分比，将CellProfiler管道用于产生钙结合蛋白染色的阈值掩模。将此掩模应用于阈值tdTomato图像，并且将tdTomato阳性面积除以总钙结合蛋白面积。还记录了钙结合蛋白掩模内阈值tdTomato的积分强度。对跨越小脑的4至7个40μm矢状组织切片进行测量，每组4至5只小鼠。
[0325] SCHEMA AAV变体的体外表征
[0326] 除非另有说明，将所有细胞系在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco)中在37℃和5％CO2下培养。如先前Jang等人(2011)Mol.Ther.19中所述测定SCH9、SCH2及野生型AAV2的肝素亲和力。用150mM NaCl和50mM Tris(pH 7.5)平衡1ml HiTrap肝素柱。将1x 1011个纯化的病毒基因组粒子加载到柱上并通过在NaCl中50mM逐步增至950mM的最终浓度来洗脱，接着1M NaCl洗涤。将每次洗脱的一小部分用于感染HEK293T细胞，并在感染后48小时使用Guava EasyCyte 6HT流式细胞仪(EMD/Millipore)(UC Berkeley Stem Cell Center,Berkeley,CA)定量GFP阳性细胞的百分比。
[0327] 如先前Shen等人(2013)J.Biol.Chem.288中所述表征用于细胞转导的半乳糖和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的AAV利用。在它们的表面上存在末端半乳糖残基的CHO-Lec2细胞是获自加州大学伯克利分校(the University of California,Berkeley)的组织培养机构并且在37℃和5％CO2下于补充有10％胎牛血清(Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的MEMα核苷(Gibco)中培养。接种后一天，将细胞在4℃下培育30分钟，接着将完全培养基更换成有或没有100μg/mL鸡冠珊瑚树凝集素(ECL)(Vector Labs)的MEM。将自补rAAV CAG-GFP病毒体在PBS中用可溶性肝素(500μg/mL)处理或模拟处理1小时，然后以
12,000的基因组MOI(n＝3)感染细胞。用病毒培育1小时之后，将Lec2细胞在冷PBS中洗涤三次以除去未结合的AAV，并且在感染后72小时通过流式细胞术定量表达GFP的细胞的百分比。
12,000的基因组MOI(n＝3)感染细胞。用病毒培育1小时之后，将Lec2细胞在冷PBS中洗涤三次以除去未结合的AAV，并且在感染后72小时通过流式细胞术定量表达GFP的细胞的百分比。
[0328] 为了分析抗体逃避特性，在37℃下将SCH9、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9用热灭活IVIG(Gammagard)的连续稀释液培育1小时，然后用于以8,000的基因组MOI(n＝3)感染HEK293T细胞，如先前Santiago-Ortiz等人(2015)Gene Ther.22中所述。感染后48小时，通过流式细胞术定量表达GFP的细胞的百分比。中和抗体滴度被记录为第一IVIG浓度，在该浓度下观察到50％或更大的GFP表达减少。
[0329] 为了研究对AAVR的依赖性，用载有自补CAG-GFP的SCH9、SCH2或AAV2以20,000的基因组MOI(n＝6)感染野生型HeLa或AAVRKO细胞(Clone KIAA0319L)。感染后72小时，通过流式细胞术定量表达GFP的细胞的百分比。
[0330] 结果
[0331] 设计嵌合AAV文库，重组6个天然血清型-AAV2、4、5、6、8和9。图1.在指定设计参数之后，应用RASPP方法(Recombination as a Shortest Path Problem，参见，例如Endelman等人(2004)PEDS 17)以在突变水平范围内快速鉴别160个破坏性最小的文库设计(7个交叉位置的集合)。对于这些设计中的每个，计算平均文库破坏分数和相对于最亲近亲本血清型引入的氨基酸突变的数目(图1A)，且所有RASPP设计的交叉位置示于图1B中。出于若干原因选择在衣壳结晶区中每亚基具有59的平均破坏分数和82的平均突变数目的最终设计(图1A-C)。首先，此设计是在一组RASPP文库(图1A)中，代表在高突变水平下的相对极小。第二，选择的设计改组关键衣壳结构特点，包括表面暴露的环和高变区，代表了在天然AAV血清型进化中的最多样性区域(图1C)。在这些富接触区内的重组导致了更大的破坏，但也更有可能产生具有新的和有趣的功能的AAV嵌合体。例如，通过组合区块5和区块6可以显著降低破坏分数，但这样做会产生具有从单亲本序列衍生的表面暴露环区的衣壳。最后，选择这组交叉位置是因为它提供了相对均匀的区块大小分布。RASPP编程时考虑了20-250个氨基酸的允许区块大小范围。大多数最低设计含有两个长区块(关于区块3和4，>175个氨基酸)，然后是一系列短区块(关于区块5-7，<30个氨基酸)(图1B)。相比之下，选择的交叉位置组(图1C)提供了更均匀的区块大小分布，确保整个衣壳在亲本序列的多样性有限的几个区域内与限制交叉相对的改组。
[0332] 通过组合金门克隆装配选择的文库设计，参见，例如Engler等人(2013)Methods Mol.Biol.1073，于电转感受态大肠杆菌中克隆以产生超过5x 106个转化体，并包装到AAV病毒体中。在病毒包装之前和之后，通过深度测序分析亲本血清型在每个区块位置处的频率(图1F)。在病毒包装之前，每个亲本血清型序列都得到很好的表示并分布在每个区块位置处，但包装可能对稳定衣壳施加了显著的选择压力，从而导致文库组成发生巨大变化。例如，在整个包装文库中，AAV4和AAV5的频率平均分别降低了348倍和372倍，这可能是由于这些血清型与用于文库装配的其它AAV亲本的平均氨基酸序列同一性较低(AAV4：60％，AAV5：65％)。每结晶亚基的平均破坏分数从59减至4及平均突变数目从82减至28也反映了包装后文库组成的变化。按照如Meyer等人(2006)PEDS 19及Otey等人(2004)Chem.&
Biol.11中所述的SCHEMA先前应用，较低的嵌合体因此在文库中大量富集。对于AAV2，优选区块5和6，且对于AAV9，优选区块8。这些趋势可在未来用于指导合理的衣壳工程化。
Biol.11中所述的SCHEMA先前应用，
[0333] 实施例2：关于AAV定向进化的Cre依赖性选择策略
[0334] 为了特异性地靶向NSC，体内Cre依赖性定向进化和选择策略被设计来驱动在SVZ中感染NSC的AAV变体的阳性选择。在此研究过程中报告概念上类似但不同的Cre依赖性系统。参见Deverman等人(2016)Nature Biotechnol.34。
[0335] 开发超过300个转基因小鼠，其在细胞类型特异性启动子控制下驱动Cre表达。参见，例如Heffner等人(2012)Nature Commun.3。图6.建立Cre表达的细胞类型特异性以介导通过使cap基因侧接一对loxP位点来进行的AAV cap基因的选择性恢复。进行表达Cre的细胞的AAV感染，继之以第二链AAV基因组合成，造成floxed cap的反转，且仅在反向基因模板中充当正向和反向对的PCR引物被用于选择性地恢复来自脑组织的Cre反向cap基因(图6A、B)。利用突变loxP位点lox66和lox71 40来驱动Cre重组的平衡朝向单向反转进行。最初将loxP位点插入cap的3’UTR中，其中它们侧接有短填充物序列，这些序列含有用于Cre依赖性恢复的反向引物的靶序列。在细菌质粒增殖期间以低水平发生重组，甚至在如图7所描绘的Sure2重组酶缺陷型大肠杆菌中。为了防止在体内选择期间反向cap的不希望有的恢复，使loxP位点重新定位以侧接cap，使得在细菌增殖期间载体质粒文库的不真实的反转将产生反向cap序列，该序列不编码病毒蛋白且因此随后不会在293细胞中包装，即不包括在替代设计中的供应。参见，例如Deverman等人(2016)Nature Biotechnol.34。注意到侧接有cap基因的loxP位点的插入改变了rep基因的阅读框。因此除去rep的翻译起始密码子，保留驱动cap表达的病毒启动子(图6A)，并且rep反倒通过单独的rep编码辅助物的瞬时转染在转运中提供病毒包装。对病毒包装质粒的这些修饰产生如通过qPCR所定量的高AAV病毒基因组产量(图6C)。
[0336] SVZ中的成年NSC表达神经胶质标记物，包括神经胶质-纤丝酸性蛋白(GFAP)，参见，例如Doetsch等人(1999)Cell 97，谷氨酸天冬氨酸转运蛋白(GLAST)，参见，例如Platel等人(2009)Glia 57，及脑脂质结合蛋白(BLBP)，参见，例如Giachino等人(2014)Stem Cells 32。为了选择成年NSC转导，利用GFAP-Cre 73.12小鼠品系，其中通过小鼠GFAP启动子控制Cre重组酶表达。在表达成年GFAP的神经干细胞和成熟星形胶质细胞中观察到Cre表达。参见，例如Garcia等人(2004)Nature Neurosci.7。虽然Cre除神经干细胞之外还在星形胶质细胞中表达，但脑室内(ICV)施用途径造成其中神经干细胞驻留的SVZ的优先转导，并且GFAP充当NSC身份的重要标记物。参见，例如Doetsch等人(1999)Cell 97。为了证实cap的Cre依赖性恢复，经由脑室内注射将含有floxed cap基因(pSub2FloxCap)的AAV文库递送到GFAP-Cre 73.12或C57BL/6J对照小鼠。反向cap只能从表达Cre的小鼠的脑组织中扩增，而非反向cap则存在于两个组中(图6D)。关于Cre重组的发生，AAV基因组必须呈双链形式，根据需要用于治疗性转基因的表达。因此，从GFAP-Cre 73.12小鼠中扩增的非反向cap基因池可能代表未能感染GFAP阳性细胞的衣壳，在病毒生命周期的某些方面存在缺陷(例如，衣壳脱壳、内体逃逸)，或者没有完成第二链合成。因此，Cre依赖性选择策略排外地恢复了衣壳变体，完成了在靶细胞类型中稳健的转基因表达所必需的所有步骤。
[0337] 实施例3：集中于显性SCHEMA AAV变体的体内文库选择
[0338] 在证实cap的Cre依赖性恢复之后，使用6个AAV文库的等摩尔混合物开始体内选择，每个含有106至107个独特变体：(i)新SCHEMA AAV，(ii)易错AAV9，(iii)祖先AAV，参见，例如Santiago-Ortiz等人(2015)Gene Ther.22，(iv)通过DNase I消化及AAV1、2、4、5、6、8和9的重新装配产生的改组AAV，参见，例如Koerber等人(2008)Mol.Ther.16，(v)易错AAV2,参见，例如Koerber等人(2006)Nature Protoc.1，及(vi)在氨基酸588处的AAV27聚体肽插入物，参见，例如Muller等人(2003)Nature Biotechnol.21。文库iii-vi先前在我们的定向进化选择中产生高度感染性克隆并且提供SCHEMA文库的进化竞争。参见，例如Dalkara等人(2013)Sci.Transl.Med.5；Tervo等人(2016)Neuron；Steines等人(2016)JCI Insight 1；Koerber等人(2008)Mol.Ther.16；及Santiago-Ortiz等人(2015)Gene Ther.22。将文库组合并经由脑室内注射施用到成年GFAP-Cre小鼠(n＝3)的右侧脑室中以在两个半球的整个SVZ中转导NSC。相反，定向SVZ注射对局部组织的破坏更大，需要多次注射才能覆盖相同的组织体积。
[0339] 注射之后三周，获取对侧脑半球，提取基因组DNA，并且通过PCR从表达GFAP的细胞中恢复Cre-重组AAV cap变体。获取对侧半球以确保与经侧脑室上皮层的注射道有关的转导不能恢复cap变体。在三轮体内选择之后，24个克隆的Sanger测序分析揭示了来源于SCHEMA文库的两个变体的收敛性。SCH9(嵌合体6、9、8、9、9、2、9、9；9、49)代表54％恢复的克隆，而SCH2(嵌合体6、9、8、9、2、2、9、9；4、37)代表33％。剩余克隆衍生自AAV27聚体插入物(8％)和祖先文库(4％)。SCH9不同于最亲近亲本AAV9之处为总计58个突变(92％氨基酸同一性)。这些()中的49个在衣壳的结晶区中，且9个在非晶区中。SCH9、SCH2和多个亲本AAV血清型的氨基酸序列比对分别示于图8、9和10中。两个SCHEMA变体的不同之处仅在区块5，产生18个氨基酸的差异。图11.SCH9的三维结构模型描绘了在衣壳表面上环VR-IV处的AAV9、在环V-VIII处的AAV2、及在五倍孔隙结构处的AAV8。基于这些精妙特征及其所选池的优势，完成SCH9的体内表征。
[0340] 实施例4：SCH9在成年小鼠的SVZ中有效地转导成年神经干细胞
[0341] 为了评估SCH9在SVZ中的转导概况，成功地包装载有自补CAG-GFP盒的rAAV(重组AAV包装产量在图12中报告)并将其递送到成年C57BL/6J小鼠的右侧脑室。SCH9因其在CNS中的广泛应用以及在鞘内注射后从脑脊液(CSF)中导入脑实质的能力而以AAV9为基准。参见，例如Samaranch等人(2012)Hum.Gene Ther.23；及Schuster等人(2014)Front.Neuroanat.8。此外，在天然血清型中，AAV9是与SCH9最密切相关的序列。
[0342] 图13.注射之后4周分析对侧半球的转导，并且GFP表达主要与脑室周围的区域有关，其中最大强度在室管膜下区中(图13A)。通过GFP表达的强度和对GFP呈阳性的SVZ的总体积评价转导效率。与AAV9相比，SCH9的积分GFP荧光强度要高24倍，并且GFP以12倍更大的SVZ转导体积表达(图13B、C)。作为初始表征，通过室管膜下区中的SCH9转导GFP/GFAP/VCAM1阳性成年神经干细胞(图13D)。
[0343] 重组AAV基因组保持游离并在SVZ中的成年神经发生特征的细胞分裂期间逐渐丧失。具体来说，从神经干细胞到嗅球中间神经元的谱系进展涉及七次以上的细胞分裂。参见，例如Ponti等人(2013)Cell Cycle 12。作为伴随AAV基因组稀释的结果，在注射后的后期时间点，继续表达转基因的大多数细胞缓慢分裂NSC或有丝分裂后细胞。此外，使用整合逆转录病毒载体的先前研究指出成神经细胞横穿嘴侧迁移流到嗅球所需的时间是9天，且在注射之时SVZ中存在的所有转运扩增细胞和成神经细胞分化和/或迁移到嗅球并在注射后30天时建立树突。参见，例如Petreanu等人(2002)J.Neurosci.22；及Lois等人(1994)Science 264。这些结果表明在注射之后的后期时间点在嘴侧迁移流中存在的成神经细胞衍生自NSC，即先前用于建立NSC在SVZ中的慢病毒或非病毒转导的结论。参见，例如Consiglio等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101；及Barnabe-Heider等人(2008)Nature Methods 5。类似的谱系分析策略被设计来确定注射后30天表达tdTomato的迁移成神经细胞的数目，作为NSC转导的指示。将编码Cre重组酶的重组SCH9或AAV9注射到成年Ai9 floxed STOP tdTomato小鼠的右侧脑室中，参见，例如Madisen等人(2010)Nature Neurosci.13，其中Cre活性导致tdTomato在转导细胞及其子代中的表达。大多数(注射的右半球83.2±3.6％，左半球50.3±4.4％)成神经细胞在注射表达Cre的SCH9后30天在嘴侧迁移流中是tdTomato阳性的(图13E、G)，AAV9转导超过4倍。此外，观察到大量tdTomato阳性成神经细胞在嗅球中径向迁移并且采用颗粒细胞神经元形态(图13F)。
[0344] 为了进一步表征NSC转导，在注射单链SCH9 CAG-Cre之前施用胸苷类似物BrdU(5-溴-2'-脱氧尿苷)以标记SVZ中的分裂细胞。在两周洗脱期之后，分析tdTomato表达与并入GFAP+NSC中的BrdU的共定位(图13H)。定量成年NSC(GFAP+、BrdU+、双皮质素-)、转运扩增细胞(GFAP-、BrdU+、双皮质素-)和表达tdTomato的成神经细胞(GFAP-、BrdU+、双皮质素+)在SVZ中的百分比(图13I)。大约60％的NSC在两个半球中转导，支持使用单链和自补形式的SCH9被基因递送到NSC的功效。
[0345] 实施例5：SCH9也显示对小脑浦肯野细胞的趋向性
[0346] 增强靶细胞类型的感染的衣壳突变同时改善大脑其它区域的转导。图14.虽然脑室内注射之后的SCH9转导主要与SVZ有关，但还在小脑浦肯野细胞中观察到增加的报告基因表达，该区域是脑中直接能接触在脑脊液中循环的载体的区域(图14A)。浦肯野细胞是用于包括脊髓小脑共济失调的神经变性疾病的基因疗法的关键靶标。参见，例如Orr等人(2012)J.Cell Biol.197。与AAV9-Cre相比，12.2倍更强且覆盖9.3倍更大的钙结合蛋白阳性面积的SCH9-Cre激活的tdTomato报告基因表达的递送(图14B、C)，如通过CellProfiler所定量。
[0347] SCH9转导来自脑脊液的浦肯野细胞的成功提示其作为用于小脑的基因递送载体的潜能。小脑基因疗法已采用rAAV向深度小脑核的递送，深度小脑核是接受来自浦肯野细胞的抑制性输入的小脑回路中的主要中枢。参见，例如Keiser等人(2015)Brain:J.Neurol.138；及Dodge等人(2008)Mol.Ther.16。通过利用此回路，rAAV向深度小脑核的单注射可通过载体的逆向转运转导整个小脑皮层中的浦肯野细胞。图15.在单侧注射到右半球的深度小脑核中之后比较AAV1对SCH9的转导模式，AAV1是最常用于向小脑的基因递送的血清型。这两种载体都支持浦肯野细胞遍及同侧半球小脑的强转导，表明SCH9可在逆向方向上转运。
[0348] 实施例6：SCH9可利用硫酸乙酰肝素蛋白多糖和半乳糖用于细胞转导
[0349] 考虑到SCH9有前景的感染特性，接下来检查其嵌合性质以确定其是否可通过调节其多个亲本血清型的受体结合能力向SCH9赋予选择性优势。SCH9的区块6含有AAV2衣壳的肝素结合袋。参见，例如Kern等人(2003)J.Virol.77。另外，区块2和5含有AAV9的半乳糖结合残基D271、N272、N470和Y446，而区块6含有保守残基W503。参见，例如Bell等人(2012)J.Virol.86。相反，SCH2由于在区块5处用AAV2取代AAV9而缺少两个关键的半乳糖结合残基。
[0350] 图16.首先使用色谱法来说明两个SCHEMA变体的肝素亲和力可与AAV2相当，表明在肝素袋外的嵌合序列内容不显著影响结合亲和力(图16A)。接下来通过感染在细胞表面上表达末端半乳糖残基和HSPG的CHO-Lec2细胞评价硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)和半乳糖的双重利用的潜力。如先前在Shen等人(2013)J.Biol.Chem.288中所述，添加鸡冠珊瑚树凝集素(ECL)阻断末端半乳糖，而用可溶性肝素培育病毒竞争性地抑制利用HSPG进入细胞的AAV血清型。如所预期，AAV2和AAV9对照载体分别利用HSPG和半乳糖。有趣的是，SCH2仅依赖于HSPG，而SCH9既能使用HSPG也能使用半乳糖，且实际上需要两者皆被阻断以防止细胞转导(图16B)。在表征SCH2和SCH9的不同聚糖结合特性之后，检查两个变体以确定它们是否保留了AAVR的利用，AAVR是最近描述的一种蛋白质受体，其对于天然AAV血清型中的AAV感染至关重要。参见，例如Pillay等人(2016)Nature 530。图17.SCH2、SCH9和AAV2对照都明显依赖于AAVR。
[0351] 最终，由于DNA改组已显示破坏中和抗体表位，参见，例如Maheshri等人(2006)Nature Biotechnol.24及Grimm等人(2008)J.Virol.82，所以定量SCH9对人静脉内免疫球蛋白(IVIG)的抗性，IVIG是针对天然AAV血清型的多克隆抗体混合物。中和SCH9所需的抗体滴度如本文表1中所示是其所来源于的亲本序列的2至10倍(图16C)。显然，最大倍数改善是相对于AAV9，即最密切相关的亲本序列。
[0352] 表1：SCH9和其所来源于的亲本血清型的中和IVIG滴度。中和滴度表示第一IVIG浓度，在该浓度下观察到50％或更大的GFP表达减少。
[0353]变体 中和IVIG浓度(mg/mL) SCH9倍数改善
SCH9 0.20 N/A
AAV2 0.10 2
AAV6 0.10 2
AAV8 0.10 2
AAV9 0.02 10
SCH9 0.20 N/A
AAV2 0.10 2
AAV6 0.10 2
AAV8 0.10 2
AAV9 0.02 10
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[0458] 尽管已参考其具体实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的实际精神和范围下，可以对本发明进行各种修改且用等价物替换。另外，可以进行很多修改，使特定的情形、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。所有这类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
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