SFTSV抑制剂及其应用
阅读：612发布：2020-05-08
专利汇可以提供SFTSV抑制剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种SFTSV 抑制剂 ，该SFTSV抑制剂是针对SFTSV的单克隆 抗体 ，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO:1中给出的CDR‑H1的序列、SEQ ID NO:2中给出的CDR‑H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDR‑H3的序列，并且轻链的可变结构域包含SEQ ID NO:4中给出的CDR‑L1的序列、SEQID NO:5中给出的CDR‑L2的序列和SEQ ID NO:6中给出的CDR‑L3的序列。本发明还扩展至该抑制剂的 治疗 性用途、组合物和用于检测SFTSV的方法。，下面是SFTSV抑制剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种分离的SFTSV抑制剂，其特征在于，所述SFTSV抑制剂包括：
（1）SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和
（2）SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；所述抑制剂为抗体。
2.根据权利要求1所述的SFTSV抑制剂，其特征在于，所述SFTSV抑制剂包括：
（1）重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和（2）轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.编码权利要求1所述的SFTSV抑制剂的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示。
5.一种包括权利要求3或4所述的核酸分子的重组载体。
6.一种包括权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体的重组细胞。
7.一种包括治疗有效量的权利要求1或2所述的SFTSV抑制剂的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。
9.一种包括权利要求1或2所述的SFTSV抑制剂的检测产品或免疫缀合物。
10.一种非诊断目的的检测SFTSV水平的方法，其特征在于，所述方法包括将含有SFTSV的样品与权利要求1或2所述的SFTSV抑制剂接触。
11.权利要求1或2所述的SFTSV抑制剂的应用，所述应用包括以下任一项：
（1）在制备权利要求9所述的检测产品或免疫缀合物中的应用；
（2）在制备权利要求7或8所述的药物组合物中的应用；
（3）在制备调节SFTSV活性或水平的药物中的应用；
（4）在制备中和SFTSV毒力的药物中的应用；
（5）在制备抗SFTSV感染的药物中的应用；
（6）在制备预防或治疗由SFTSV感染导致的疾病的药物中的应用。
12.权利要求7或8所述的药物组合物的应用，所述应用包括以下任一项：
（1）在制备调节SFTSV活性或水平的药物中的应用；
（2）在制备中和SFTSV毒力的药物中的应用；
（3）在制备抗SFTSV感染的药物中的应用；
（4）在制备预防或治疗由SFTSV感染导致的疾病的药物中的应用。
SFTSV抑制剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子免疫学领域，涉及一种SFTSV抑制剂及其应用。
背景技术
[0002] 发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)属于新型蜱传虫媒出血热，是由新发现和命名的布尼亚病毒目白蛉纤细病毒科白蛉病毒属病毒-发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)感染而引起的一种新发、自然疫源性、急性传染病，俗称“蜱虫病”，自2009年在我国中东部地区被发现以来，随着监测力度的加强，许多地方相继报道了确诊病例，日本、韩国、美国和阿拉伯联合酋长国等也时有病案报道，SFTS已对全球人类健康构成了严重威胁。
[0003] 布尼亚病毒目成员大多由媒介生物，如蜱、螨、蚊、鼠等传播，引起地区或全球性流行。在我国主要有汉坦病毒(汉坦病毒科)和新疆出血热病毒(内罗病毒科)引起地方性流行。2011年中国疾病预防控制中心从SFTS急性期病患血液中分离出SFTSV，经过基因序列比对和同源性分析，认定该病毒属于白蛉病毒属，目前该病毒基因组已被解析：由小(S)、中(M)、大(L)三个单股负链RNA片段组成，与布尼亚病毒目其他病毒相似，病毒基因组3′末端和5′末端序列互补。S片段属双义RNA，主要编码核蛋白NP和非结构蛋白NSS，L片段编码由2084个氨基酸组成的RNA依赖的RNA聚合酶；M片段编码具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，翻译后经宿主细胞内蛋白酶修饰形成的Gn和Gc两个糖蛋白介导了病毒感染宿主的全过程，是刺激宿主产生中和抗体的关键抗原分子体，Gn和Gc已成为目前SFTS疫苗研究的重要靶点。
[0004] SFTS患者通常具有蜱虫叮咬史，感染后典型表现是起病急，高热伴全身乏力、头痛、肌肉关节酸痛，其典型临床特征为白细胞和血小板明显降低，转氨酶升高，血清乳酸脱氢酶明显升高，凝血酶原时间延长，钠、钾、氯等电解质偏低。病例大都生活于丘陵地区，首发病例多为有野外工作经历的中老年人，平均病死率约为10％，死亡原因主要是多脏器功能衰竭。该病例多为散发，亦可引起家庭聚集性暴发，SFTS存在严重人传人现象，接触患者的血液或分泌物可以感染SFTSV。
[0005] 由于该病是一新发自然疫源性传染病，疫情不可能短期内消失；目前尚无有效的疫苗用于预防，人感染了SFTSV，亦无特效药用于临床，主要以对症治疗为主；该病临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在农村地区，交通不便，卫生医疗水平薄弱，等到确诊，病情大多发展到病毒血症、多脏器衰竭，此时临床只能采取对症治疗手段。而作为化学治疗的补充，由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。抗体作为人体内一种最重要的抗病毒免疫介质，抗体分子可以通过阻断病毒颗粒与其受体的结合、激活巨噬细胞、NK细胞等杀伤细胞、激活补体等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒及受感染细胞。抗体制剂不仅可以中和病人体内大量的病毒，降低荷载，转归病情，对病人的密切接触者，如陪护、医护人员进行紧急被动免疫，防止二代、三代感染者的出现。
[0006] 研究表明，临床上使用病毒特异性的康复人血浆，可有效中和病毒，防止病毒在体内各器官扩散，避免发生致死性的多脏器衰竭，对病人病程的转归也起了重要作用。但多抗血浆不仅来源有限，同时其临床应用也受到诸如难以质控、供受体血型不匹配、潜在的传染性因子等条件的限制。鼠源单抗制备简单，治疗机理明确，但是其异源性阻碍了在人体内的应用。而人源单克隆抗体可有效克服上述问题。
[0007] 目前国内外尚没有上市的抗SFTSV抗体，因此建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和诊治用品，对于多种相关性疾病的干预具有重要的现实意义。
发明内容
[0008] 本申请采用构建了一个高容量的人源免疫性噬菌体抗体文库，并以纯化的SFTSV-Gn蛋白为靶标，筛选人源单链抗体片段(single chain variable fragment,scFv)，获得三种人源scFv抗体分子，命名为4-6、2F6、1B2。应用分子生物学手段对该三种单链抗体片段进行全分子化基因构建，并真核表达了4-6IgG1、2F6IgG1、1B2 IgG1。进一步研究表明，三种单抗对SFTS病毒有较强的结合活性以及中和作用。
[0009] 基于以上研究发现，本发明保护对象如下：
[0010] 本发明提供了一种SFTSV抑制剂，所述SFTSV抑制剂是针对SFTSV蛋白的特异性抗体。在本发明的具体实施方案中，所述SFTSV抑制剂是针对SFTSV蛋白的特异性单克隆抗体。
[0011] 本发明的SFTSV抑制剂包括：
[0012] (1)SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；和/或
[0013] (2)SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。
[0014] 作为本发明的一个方面，本发明的SFTSV抑制剂包括：
[0015] (1)重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或[0016] (2)轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0017] 为了方便解释以下抑制剂的功能变体，将上面所述的SFTSV抑制剂称之为亲代抑制剂。
[0018] 本发明的SFTSV抑制剂可以是完整的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。在本发明的具体实施例中，SFTSV抑制剂的完整的免疫球蛋白分子是IgG1类型。
[0019] 本发明的SFTSV抑制剂还可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab片段，Fab'片段，Fab'-SH片段，F(ab')2片段，Fd片段，Fv片段，双抗体，单链Fv(scFv)，仅含有一个轻链可变区的单链多肽，含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽，仅含有一个重链可变区的单链多肽，含有一个重链可变区的三个CDR的单链多肽，重链可变区和VHH。在本发明的具体实施例中，SFTSV抑制剂可以是scFv。
[0020] 本发明的SFTSV抑制剂还包括前面所述的SFTSV抑制剂的功能变体，所述的功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代抑制剂中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代抑制剂的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述抑制剂的结合特性，即所述抑制剂仍能识别并结合其靶位。
[0021] 所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。
[0022] 保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。
[0023] 此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代抑制剂相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合SFTSV蛋白。此后，当使用术语“抑制剂”时，其也涵盖所述抑制剂的功能变体。
[0024] 所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代抑制剂具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。
[0025] 本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代抑制剂或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。
[0026] 本发明提供了编码前面所述的SFTSV抑制剂的核酸分子。编码重链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:9所示，编码重链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:10所示，编码重链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:11所示，编码重链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:12所示；编码轻链CDR1的核酸分子序列如SEQ ID NO:13所示，编码轻链CDR2的核酸分子序列如SEQ ID NO:14所示，编码轻链CDR3的核酸分子序列如SEQ ID NO:15所示，编码轻链可变区的核酸分子序列如SEQ ID NO:16所示。
[0027] 所述的核酸分子还可以包含在严格条件下与编码包含重链或轻链序列的抗体的核酸分子杂交的核苷酸序列。
[0028] 本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。
[0029] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0030] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0031] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的抑制剂(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的抑制剂的序列中。
[0032] 本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的重组载体，除了前面所述的核酸分子之外，重组载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的调控序列。
[0033] 这些重组载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达核酸分子或者蛋白质。
[0034] 所述载体包括克隆载体或者表达载体。克隆载体用于扩增核酸分子，表达载体用于表达核酸分子编码的蛋白质。
[0035] 本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体的重组细胞。
[0036] 重组细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS,293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0037] 本发明提供了一种包括治疗有效量的前面所述的SFTSV抑制剂的药物组合物。
[0038] 进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0039] 本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。
[0040] 可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
[0041] 本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
[0042] 可以和本发明的药物组合物联合应用的药物包括其他抗SFTSV药物。
[0043] 本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个抑制剂以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
[0044] 为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抑制剂的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
[0045] 除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的抑制剂及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码抑制剂的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
[0046] 本发明还提供了一种测定样品中SFTSV的检测产品，所述产品包括前面所述的SFTSV抑制剂。
[0048] 本发明的SFTSV抑制剂，又可以叫做抗SFTSV抗体，可以通过多种技术中的任一种制备。通常，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括通过常规技术产生单克隆抗体，或通过将抗体基因，重链和/或轻链转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许抗体的产生，其中所述抗体可以是重组的。术语“转染”的各种形式意在包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中表达抗体，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这种真核细胞(特别是哺乳动物细胞)更可能比原核细胞组装和分泌正确折叠和免疫活性的抗体。
[0049] 用于表达重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞，本发明包括与DHFR选择标记一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，NS0骨髓瘤细胞，COS细胞，HEK 293T细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达的一段时间，或更优选地，将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
[0050] 宿主细胞也可用于产生功能性抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。应当理解，上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于除去一些或所有编码轻链和重链之一或两者的DNA，其不是结合感兴趣的抗原所必需的。从这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。此外，可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体(即，结合SFTSV蛋白)，并且另一条重链和轻链对于除SFTSV蛋白之外的抗原是特异性的。
[0051] 制备单克隆抗体的方法涉及永生细胞的制备，能够产生具有所需特异性的抗体的细胞系。这样的细胞系可以从获自免疫动物的脾细胞产生。可以用免疫动物生产前面所述的抑制剂或其片段和/或变体。
[0052] 可以从生长的杂交瘤的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中。然后可以从腹水液体或血液收获单克隆抗体。污染物可以通过常规技术例如色谱，凝胶过滤，沉淀和提取从抗体中除去。亲和层析是可用于纯化抗体的方法的实例。
[0053] 本发明提供了一种调节SFTSV活性或水平的方法，所述方法包括施用前面所述的SFTSV抑制剂，或者施用包括前面所述SFTSV抑制剂的药物组合物，或者施用前面所述的包括编码所述SFTSV抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体。
[0054] 本发明提供了一种预防或治疗SFTSV感染的方法。所述方法包括施用本发明的SFTSV抑制剂，或者施用包括SFTSV抑制剂的药物组合物，或者施用包括编码SFTSV抑制剂的核酸分子以及包括所述核酸分子的载体或者细胞。
[0055] 本发明还提供了一种检测或测量样品中SFTSV的方法。该方法包括使样品与本发明的SFTSV抑制剂接触。
[0056] 本发明还提供了前面所述的SFTSV抑制剂在制备检测或测量SFTSV的产品中的应用。
[0057] 所述产品包括前面所述的SFTSV抑制剂；所述产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的SFTSV抑制剂能够检测出SFTSV的产品均包括在本发明的范围之内。
[0058] 本发明还提供了前面所述的SFTSV抑制剂在制备前面所述的免疫缀合物中的应用。
[0059] 本发明还提供了前面所述的SFTSV抑制剂在制备前面所述的药物组合物中的应用。
[0060] 本发明还提供了前面所述的SFTSV抑制剂在制备以下药物中的应用：
[0061] (1)调节SFTSV活性或水平的药物；
[0062] (2)在制备中和SFTSV毒力的药物中的应用；
[0063] (3)在制备抗SFTSV感染的药物中的应用；
[0064] (4)在制备预防或治疗由SFTSV感染导致的疾病的药物中的应用。
[0065] 本发明还提供了前面所述的药物组合物在制备以下药物中的应用：
[0066] (1)调节SFTSV活性或水平的药物；
[0067] (2)在制备中和SFTSV毒力的药物中的应用；
[0068] (3)在制备抗SFTSV感染的药物中的应用；
[0069] (4)在制备预防或治疗由SFTSV感染导致的疾病的药物中的应用。
[0070] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如有冲突，本文件(包括定义)将予以控制。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献通过引用以其全文并入本文。本文公开的材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
[0071] 本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
[0072] 本文所用的术语“施用”是指接触和/或递送SFTSV抑制剂以获得期望的效果。SFTSV抑制剂可以以多种方式施用于受试者，包括但不限于口服，眼部，鼻部，静脉内，局部，气溶胶，栓剂等，并且可以组合使用。
[0073] 本文使用的术语“有效量”是指在所需时间内有效的药物剂量，以实现所需的剂量治疗结果。有效剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据个体的疾病状态，年龄，性别和体重等因素而变化药物在个体中引起所需反应的能力。本文使用的该术语还指在动物，哺乳动物，哺乳动物，或人类，例如减少和/或抑制雌激素受体的功能。治疗有效量可以一次或多次施用(例如，药剂可作为预防性治疗或在疾病进展的任何阶段治疗性地，在症状之前或之后等)，应用或剂量给予，并且不是预期的限于特定的制剂，组合或施用途径。给药次数和剂量取决于几个因素，例如治疗的目标，受试者等，并且可以由本领域技术人员容易地确定。
[0074] 本发明的“样品”可以是血液，组织，尿液，血清，血浆，羊水，脑脊液，胎盘细胞或组织，内皮细胞，白细胞或单核细胞的样品。样品可以直接从患者获得或可以预处理，例如通过过滤，蒸馏，提取，浓缩，离心，干扰组分的灭活，添加试剂等，以修饰样品。
[0075] 可以使用任何细胞类型，组织或体液来获得样品。这样的细胞类型，组织和流体可以包括组织切片，例如活组织检查和尸检样本，为组织学目的取得的冷冻切片，血液(例如全血)，血浆，血清，痰，粪便，眼泪，粘液，唾液，支气管肺泡灌洗液BAL)流体，毛发，皮肤，红细胞，血小板，间质液，眼晶状体液，脑脊髓液，汗液，鼻液，滑液，月经，羊水，精液等。细胞类型和组织也可包括淋巴流体，胃肠液，妇科液，尿，腹膜液，脑脊液，通过阴道冲洗收集的液体或通过阴道冲洗收集的液体。组织或细胞类型可以通过从动物中除去细胞样品来提供，但也可以通过使用先前分离的细胞(例如，由另一个人分离，在另一时间和/或为了另一个目的)来实现。也可以使用存档组织，例如具有治疗或结果历史的那些。蛋白质或核苷酸分离和/或纯化可能不是必需的。
[0076] 本文所用的“患者”指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛，猪，骆驼，骆驼，马，山羊，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，猫，狗，大鼠和小鼠，非人灵长类动物，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。
[0077] 本文所用的“治疗”描述逆转，减轻或抑制该术语适用的疾病或该疾病的一种或多种症状的进展。治疗可以以急性或慢性方式进行。该术语还指在患有疾病之前降低与该疾病相关的疾病或症状的严重性。
[0079] 图1显示Vκ基因的PCR鉴定结果图；
[0080] 图2显示Vλ基因的PCR鉴定结果图；
[0081] 图3显示VH基因的PCR鉴定结果图；
[0082] 图4显示scFv基因的PCR鉴定结果图；
[0083] 图5显示利用Phage-ELISA鉴定抗SFTSV-Gn蛋白单链抗体的结合特异性的结果图；
[0084] 图6显示利用SDS-PAGE检测抗体表达的结果图；
[0085] 图7显示抗体与病毒结合的荧光图；
[0086] 图8显示利用间接免疫荧光检测抗体微量中和的荧光图；
[0087] 图9显示HRP标记4-5IgG1的最佳稀释倍数测定图；
[0088] 图10显示利用ELISA实验研究抗体竞争抑制的曲线图。
具体实施方式
[0089] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0090] 实施例1抗SFTSV-Gn蛋白单链抗体的筛选
[0091] 1、JS-2010-014病毒颗粒的纯化
[0092] 1.1材料
[0093] JS-2010-014，为专利申请者于2010年在一名江苏病人急性期外周血中分离获得。
[0094] 1.2方法和结果
[0095] 该病毒接种Vero细胞后，于37℃、5％CO2的条件下培养5天，无菌收集上清液并测定50％组织感染量(50％tissue culture infective dose，TCID50)。病毒悬液经1:4000β-丙内酯于4℃灭活24h，低速离心去除细胞碎片，再超离2h后用PBS悬浮，经分子筛层析技术进一步纯化。通过上述步骤可以获得纯度较高的JS-2010-014病毒颗粒，所有的病毒操作均在生物安全2级(BSL-2)实验室中进行。
[0096] 2、scFv人源抗体文库构建和抗SFTSV-Gn蛋白单链抗体的筛选
[0097] 2.1材料
[0098] 引物：根据《Phage Display》一书设计家族特异性轻链(Vκ和Vλ)、IgG重链(VH)和overlap-PCR引物，其中Vκ12对、Vλ24对、VH 6对、overlap-PCR 1对。
[0099] Vκ正向引物：
[0100] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC-3’；
[0101] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC-3’；
[0102] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGWTGACRCAGCTCC-3’。
[0103] Vκ反向引物：
[0104] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATYTCCACCTTGGTCCC-3’；
[0105] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’；
[0106] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’；
[0107] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’。
[0108] Vλ正向引物：
[0109] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGBTGACGCAGCCGCCCTC-3’；
[0110] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTC-3’；
[0111] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGT-3’；
[0112] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAATCGCCCTC-3’；
[0113] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCATGCTGACTCAGCCCCACTC-3’；
[0114] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGGTGACYCAGGAGCCMTC-3’；
[0115] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCTTC-3’；
[0116] 5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGGGCAGACTCAGCAGCTCTC-3’。
[0117] Vλ反向引物：
[0118] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCTAGGACGGTCASCTTGGTS-3’；
[0119] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCTAAAATGATCAGCTGGGTT-3’；
[0120] 5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCGAGGACGGTCAGCTSGGTS-3’。
[0121] VH正向引物：
[0122] 5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGGGCGGTGGCTCGGGC-3’；
[0123] 5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGG-3’；
[0124] 5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGTGGCGGTGGCTCGGGC-3’；
[0125] 5’-GGTGGTTCCTCTGATCTTCCTCCTCGGTGGCGGTGGCTCGGGCG-3’；
[0126] 5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGC-3’；
[0127] 5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGTCGGGC-3’。
[0128] VH反向引物：
[0129] 5’-CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACCGATGGGCCCTTGGTGGAR-3’。
[0130] overlap-PCR正向引物：
[0131] 5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC-3’。
[0132] overlap-PCR反向引物：
[0133] 5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGCCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTG-3’。
[0134] 2.2方法
[0135] 2.2.1外周血淋巴细胞的分离及总RNA提取
[0136] 将8名SFTS患者恢复期外周血(经专利申请者所在单位伦理委员会、及相关献血者书面同意)分别与等量的生理盐水混合后按照淋巴细胞分离液说明书吸取单个核细胞，生理盐水洗涤三次后参照总RNA抽提试剂盒说明抽提RNA。
[0137] 2.2.2抗体可变区基因的PCR扩增
[0138] 将抽提的8份总RNA混合后反转录出cDNA第一链，反转录条件如下：55℃30min，85℃5min，4℃30min；再以cDNA为模板PCR扩增人源性抗体Vκ、Vλ和VH基因，PCR反应条件为：94℃预变性10min，然后94℃20s，57℃45s，72℃1min，25个循环，最后72℃延伸20min，凝胶电泳并切胶纯化回收。
[0139] 2.2.3scFv基因的拼接
[0140] 将纯化的Vκ基因片段与Vλ基因片段等摩尔混合后再与VH基因片段等量混合，利用overlap-PCR拼接scFv基因，overlap-PCR反应条件为：94℃预变性10min，然后94℃20s，57℃45s，72℃1min，25个循环，最后72℃延伸20min，凝胶电泳并切胶纯化回收。
[0141] 2.2.4噬菌体单链抗体文库的构建及质量鉴定
[0142] 纯化后的scFv基因与pComb3XSS质粒分别经sfiI酶切，连接胶纯化回收后的目的片段，转入感受态大肠杆菌XL1-Blue，加入20mL 2YT培养液中37℃培养45min后离心，沉淀涂于2YT平板30℃过夜培养。次日将平板上生长的菌苔全部收集于2YT培养基中，37℃培养至OD600为0.7。加入终浓度为1×109PFU/mL的辅助噬菌体VCSM13 37℃培养45min。加入终浓度为50μg/mL的卡纳霉素，37℃继续培养7h，900g离心15min弃沉淀，于上清中加入5×PEG/NaCl，混匀后置于冰上3h，900g离心45min，把沉淀重悬于2mL的PBS中，过0.45μm的滤膜，滤液即为人源性噬菌体单链抗体文库，同时计算文库库容和多样性。
[0143] 2.2.5抗SFTSV-Gn蛋白特异性单链抗体的筛选
[0144] 取100μL扩增后的噬菌体文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白共同孵育，进行4轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选，取第4轮洗脱液感染对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue后，涂布2×YT培养板，37℃培养过夜，随机挑取200个单菌落分别接种96孔深孔板(含100μg/mL氨苄青霉素、12.5μg/mL四环素和1g/mL葡萄糖)，37℃过夜振摇培养，次日1：10分别接种到新96孔深孔板(含100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素)中37℃振摇培养5h，加入辅助噬菌体VCSM13(终浓度为1×109PFU/mL)，37℃孵育1h，加入卡纳霉素(终浓度为50μg/mL)30℃过夜振摇培养制备成噬菌体单链抗体，用0.1μg/孔SFTSV-Gn蛋白包被酶标板，二抗是用PBS缓冲液(含5g/mL脱脂奶粉)按1:2000稀释的HRP标记抗M13抗体，进行Phage-ELISA鉴定并测定OD450值，当Positive/Negative≥2.1时定为阳性，阳性克隆的菌液送上海生工公司测序。
[0145] 2.3结果
[0146] 2.3.1人源性抗体Vκ、Vλ和VH基因的鉴定
[0147] 利用12对Vκ基因引物扩增出12条大小约350bp目的片段，结果见图1，其中M：DNA marker；1-12：PCR产物；13：阴性对照。利用24对Vλ基因引物扩增出24条大小约350bp目的片段，结果见图2，其中M：DNA marker；1：阴性对照；2-25：PCR产物。利用6对VH基因引物扩增出6条大小约400bp目的片段，结果见图3，其中M：DNA marker；1-6：PCR产物；7：阴性对照。结果与预期相符。
[0148] 2.3.2scFv抗体基因的拼接
[0149] 利用overlap-PCR随机拼接得到了750bp左右的目的片段，结果见图4，其中M：DNA marker；1-3：overlap-PCR产物；4：阴性对照。结果与预期相符。
[0150] 2.3.4抗SFTSV-Gn蛋白单链抗体的筛选
[0151] 以SFTSV-Gn蛋白为抗原对人源化SFTSV病毒单链抗体文库进行了4轮亲和筛选，抗SFTSV-Gn蛋白特异性单链抗体得到了选择性富集，产出/投入比值提高了30倍(表1)。随机挑取200个噬菌体单克隆进行Phage-ELISA试验并测定OD450值，结果显示有19个单链抗体与SFTSV-Gn蛋白能特异性结合(图5)。19个阳性克隆菌液经测序分析，获得3种不同氨基酸序列的scFv抗体，分别命名为4-6、2F6、1B2；4-6抗体重、轻链可变区核酸和蛋白序列如下所示：
[0152] 4-6抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7，核酸序列如SEQ ID NO:12所示；重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核酸序列如SEQ ID NO:9所示；重链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2，核酸序列如SEQ ID NO:10所示；重链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，核酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0153] 4-6抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8，核酸序列如SEQ ID NO:16所示；轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4，核酸序列如SEQ ID NO:13所示；轻链可变区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5，核酸序列如SEQ ID NO:14所示；轻链可变区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6，核酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0154] 表1亲和筛选对抗SFTSV-Gn蛋白特异性scFv抗体的富集效应
[0155] 筛选轮数 投入scFv的滴度(PFU) 产出scFv的滴度(PFU) 产出/投入第一轮 5×1012 6×105 1.20×10-7
12 5 -7
第二轮 3.6×10 4×10 1.11×10
第三轮 2.4×1012 8×105 3.33×10-7
第四轮 2.1×1012 7.5×106 3.57×10-6
12 5 -7
第二轮 3.6×10 4×10 1.11×10
第三轮 2.4×1012 8×105 3.33×10-7
第四轮 2.1×1012 7.5×106 3.57×10-6
[0156] 实施例2scFv抗体全分子化构建和真核表达
[0157] 1、杆状病毒重组质粒的构建
[0158] 以4-6、2F6、1B2三种单链抗体质粒为模板分别PCR扩增VH、VL基因，每个扩增体系均包含以下内容：scfv质粒0.1μg，上游引物60pmol，下游引物60pmol，10×PCR缓冲液10μL，dNTP 8μL，MgCl 2 6μL，Ex Taq 0.5μL，加水至100μL。反应条件为：94℃5min；94℃15sec，56℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。胶回收试剂盒回收目的条带。将上述PCR产物，分别用XhoI/NheI(VH)、SacI/HindIII(Vk)进行酶切，同时真核杆状病毒表达载体质粒pAc-K-CH3先进行XhoI/NheI酶切，待VH片段插入后，再进行SacI/HindIII酶切，插入VL片段。酶切休系为：DNA 10μg，XhoI/NheI或SacI/HindIII各10u，10×酶切缓冲液10μL，加水至100μL。37℃酶切20h。1％琼脂糖凝胶电泳切下目的条带，进行胶回收。连接胶回收产物16℃过夜。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定阳性克隆(如上述)，对于VH和VL都有插入的克隆，用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒制备大约10μg纯化的重组质粒。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定阳性克隆(如上述)，对于VH和VL都有插入的克隆，用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒制备大约10μg纯化的重组质粒。
[0159] 2、全抗体分子在昆虫细胞中的表达
[0160] 采用pharmingen公司的BaculoGold共转染试剂盒，将重组质粒转染293T细胞。27℃培养4-5天后，观察感染情况；5天后收集感染上清，得到重组病毒。噬斑纯化及重组病毒扩增将293T细胞传至24孔板后，用重组病毒感染。27℃培养4-5天后收获上清。2000rpm离心10min，去除细胞碎片。将收获的蛋白表达上清液用0.45μL的微孔滤膜后上样至GE Healthcare的proteinA亲和层析柱；PBS洗至基线。洗脱液(0.1mol/L的Gly-HCl，pH2.7)洗脱，用1mol/L的Tris中和至pH7.0；对纯化的样品行SDS-PAGE检测，观察纯度。结果如图6所示，其中1：4-6单抗非还原，2：4-6单抗还原，3：1B2单抗非还原，4：1B2单抗还原，5：2F6单抗非还原，6：2F6单抗还原，7：蛋白Marker，纯化获得的全分子抗体命名为4-6IgG1、2F6IgG1、
1B2IgG1。
1B2IgG1。
[0161] 实施例3全分子抗体与SFTSV结合实验
[0162] 1、方法
[0163] (1)将Vero细胞接种于24孔板，37℃培养，当融合率达到90％时每孔接种病毒液。
[0164] (2)两天后，移除病毒液，每孔加入400μl 4％多聚甲醛，室温固定30min。
[0165] (3)弃掉多聚甲醛，用PBS清洗3次，加入400μl 0.2％Triton X-100通透细胞膜，室温15min。
[0166] (4)弃掉Triton X-100，用PBS清洗3次，加入5mg/ml的BSA进行封闭，室温30min。
[0167] (5)弃掉封闭液，每孔加入300μl纯化后的全分子单抗，设置复孔，同时设置不加入抗体的空白对照组及4-5IgG1单抗(参见专利文献：一种抗SFTSV的人源抗体，授权公告号CN 102942629B)阳性对照组，于37℃孵育1h。
[0168] (6)移除一抗，加入500μl PBST，清洗3次，500转/分钟，震荡5min。
[0169] (7)加入FITC标记的抗人IgG，37℃避光孵育30min。
[0170] (8)移除二抗，加入500μl PBST清洗3次，500转/分钟，震荡5min。
[0171] (9)荧光显微镜下观察。
[0172] 2、结果
[0173] 4-6IgG1、2F6IgG1、1B2IgG1与SFTSV结合具有较高的结合活性(图7)。
[0174] 实施例4全分子单抗微量中和实验
[0175] 1、方法
[0176] (1)Vero细胞接种于96孔板，待细胞融合率达到90％时接种病毒抗体复合物。
[0177] (2)将等量100TCID50病毒与抗体(100μg/ml)混匀，37℃孵育1h。
[0178] (3)弃掉培养液，每孔加入100μl复合物，37℃孵育2h，设置复孔，同时设置无抗体组，无病毒组及4-5IgG1阳性对照组。
[0179] (4)弃掉复合物，每孔加入100μl维持液，37℃培养48h。
[0180] (5)移除维持液，每孔加入200μl 4％多聚甲醛，室温固定30min。
[0181] (6)弃掉多聚甲醛，用PBS清洗3次，加入200μl 0.2％Triton X-100通透细胞膜，室温15min。
[0182] (7)弃掉Triton X-100，PBS清洗3次，加入5mg/ml的BSA进行封闭，室温30min。
[0183] (8)弃掉封闭液，加入抗NP的一抗，每孔100μl，37℃孵育1h。
[0184] (9)移除一抗，加入200μl PBST清洗3次，500转/分钟，震荡5min。
[0185] (10)加入100μl FITC标记的抗人二抗，37℃避光孵育30min。
[0186] (11)移除二抗，加入500μl PBST清洗3次，500转/分钟，震荡5min。
[0187] (12)荧光显微镜下观察。
[0188] 2、结果
[0189] 微量中和实验结果显示，4-6IgG1、2F6IgG1、1B2IgG1对SFTSV均具有中和作用(图8)。
[0190] 实施例5单抗抗原表位初步分析
[0191] 1、HRP标记4-5IgG1最佳稀释倍数测定
[0192] 用纯化的SFTSV-Gn蛋白包被酶标板(100ng/孔)，将HRP标记4-5IgG1从1:100～1:600开始稀释，100μL/孔37℃孵育1h后洗板，TMB显色，测定OD450值，选择OD450值在1.0～
1.5之间的那个HRP标记4-5IgG1稀释度为最佳稀释倍数。结果发现按照1：300稀释时，OD450值(1.363)介于1.0～1.5之间(图9)，因此选择1：300为HRP标记4-5IgG1最佳稀释倍数。
1.5之间的那个HRP标记4-5IgG1稀释度为最佳稀释倍数。结果发现按照1：300稀释时，OD450值(1.363)介于1.0～1.5之间(图9)，因此选择1：300为HRP标记4-5IgG1最佳稀释倍数。
[0193] 2、竞争ELISA实验初步分析3种单抗抗原表位
[0194] 分别用HRP标记4-5IgG1按1:300制成的工作液将4-5IgG1、4-6IgG1、2F6 IgG1、1B2 IgG1、抗SFTSV-NP单抗(无关抗体作为对照)从100ng开始，倍比稀释进行竞争ELISA实验，并读取OD450绘制竞争抑制曲线，实验结果显示(图10)，伴随4-6IgG1、2F6 IgG1、1B2 IgG1倍比稀释，OD450值并没有明显变化，说明4-6IgG1、2F6 IgG1、1B2 IgG1与4-5IgG1结合SFTSV-Gn蛋白互不排斥，没有竞争关系，表明4-6IgG1、2F6 IgG1、1B2 IgG1的抗原表位与4-5IgG1并不相同。
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