耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
阅读：108发布：2020-05-12
专利汇可以提供耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于大肠杆菌技术领域，具体涉及一种耐高温的大肠杆菌 噬菌体 及其组合物、 试剂 盒 和应用。噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9），保藏编号为CCTCC M 2018937。本发明的噬菌体对正常 微 生物 菌群无毒害作用且其DNA无法编码毒 力 基因，耐高温， 稳定性 高，为开发新型抗菌制剂提供了优良菌种资源，具有良好的应用开发前景。，下面是耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用专利的具体信息内容。
1.一种耐高温的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9），保藏编号为CCTCC M 2018937。
2.根据权利要求1所述耐高温的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9）为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为120nm,尾部长约200nm,属于肌尾科噬菌体；且在pH3～pH11、在4℃～70℃条件下具有耐性，MOI=1条件下培养6h，其效价为3.9×109 pfu/mL。
3.根据权利要求1所述耐高温的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9）具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1 所述宽裂解谱的大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9）的主要结构蛋白相对分子量为43kDa。
5.一种含有权利要求1所述耐高温的大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物至少含有大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9）。
6.根据权利要求5所述耐高温的大肠杆菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体CL9（Escherichia coli phage CL9），大肠杆菌噬菌体CL23（Escherichia coli phage CL23）和大肠杆菌噬菌体D257P（Escherichia coli phage D257P）中的两种或两种以上。
7.一种含有权利要求1～6任一项所述耐高温的大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
8.一种根据权利要求7所述耐高温的大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体组合物或含有大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在制备大肠杆菌引发的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎等疾病的药物中的应用。
耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
技术领域
[0001] 本发明属于大肠杆菌的研发技术领域，具体涉及耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
背景技术
[0002] 大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，是为人和动物肠道中的常居菌。大多数大肠杆菌菌株无害。然而，有些大肠杆菌可引起食源性疾病。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原 (O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。
[0003] 噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。
[0004] 孙利厂等人(《中国动物传染病学报》2018,12，10)从养殖场采集的污水样品中分离到宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体，并进行了噬菌斑、噬菌谱、形态学(透射电镜)、遗传物质、酸碱及热稳定性、一步生长曲线等生物学特性及控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染研究。
[0006] 中国专利CN106591241A公开了一种新型肠出血性大肠杆菌O157，以用于防治污水排放或回用引发的肠出血性大肠杆菌O157的污染。
[0007] 中国专利CN110129283A公开了一种短尾强裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为PD38，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年9月26日，保藏编号为CGMCC No.16391。该噬菌体对大肠杆菌具有较好的裂解作用，对食品、养殖环境中的大肠杆菌具有良好的消杀作用，同时可以防治鸡大肠杆菌引起的疾病。
[0008] 中国专利CN109251899A公开了一种耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。分类命名为 Escherichia phage vB_EcoP-EG1，保藏号为：CCTCC M 2018562，保藏日期为2018年8月 21日。
[0009] 中国专利CN106754751A一种肠出血性大肠杆菌噬菌体及其应用，该噬菌体菌株保藏号为CCTCC NO：M 2016539，于2016年9月29日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，分类命名为肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_ECM_MIE， Entero-hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 phage vB_ECM_MIE；对EHEC具有高效杀菌能力。
[0010] 韩国专利KR102003786B1公开了一种新的大肠杆菌特异性噬菌体EcoH7及其制备方法。更噬菌体EcoH7对产大肠杆菌具有非常高的特异性，可以解决抗生素对抗生素的耐药性，食品中的残留问题，以及广泛的宿主范围，因此可广泛用于抗生素，组合物，饲料，消毒剂或清洗剂领域。
[0011] 美国专利US10265353B2公开了一种从自然界中分离的能够特异性杀死肠出血性大肠杆菌菌株的肌病毒科噬菌体ESC-CHP-1，保藏号:KCTC12660bp，使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物可以预防和治疗肠出血性大肠杆菌的感染。
[0012] 美国专利US7635584B2公开了一种对大肠杆菌O157:H7菌株具有强裂解活性的分离的噬菌体，以及使用该噬菌体和/或衍生自该噬菌体的后代或衍生物来控制大肠杆菌O157:H7 在各种环境中的生长的方法。
[0013] 目前，关于大肠杆菌噬菌体的研究主要集中于肠出血性噬菌体裂解性方面，针对大肠杆菌噬菌体稳定性及其应用方面的研究鲜见报道。综上，急需开发新的稳定性高、耐高温的新型大肠杆菌噬菌体。
发明内容
[0014] 本发明的目的在于提供一种耐高温的大肠杆菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，具有耐高温，稳定性高，安全性好的特点。
[0015] 本发明采用一种耐高温的大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体 CL9(Escherichia coli phage CL9)，保藏编号为CCTCC M 2018937。。
[0016] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)为烈性噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)为烈性噬菌体，有一呈多面体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为120nm,尾部长约200nm,属于肌尾科噬菌体；且在pH3～ pH11、在4℃～70℃条件下具有耐性，MOI＝1条件下培养6h，其效价为3.9×109pfu/mL。
[0017] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)具有SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。。
[0018] 进一步的，所述大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)的主要结构蛋白相对分子量为43kDa。
[0019] 一种含有所述耐高温的大肠杆菌噬菌体的组合物，所述组合物至少含有大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)。
[0020] 进一步的，所述组合物含有大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)，大肠杆菌噬菌体CL23(Escherichia coli phage CL23)和大肠杆菌噬菌体D257P(Escherichia coli phage D257P)中的两种或两种以上。
[0021] 一种含有上述耐高温的大肠杆菌噬菌体或大肠杆菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。
[0023] 本发明具有如下有益效果：(1)本发明大肠杆菌噬菌体CL9为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存12个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明的3株大肠杆菌噬菌体能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。大肠杆菌噬菌体CL9在50℃下水浴
24h，效价仅降低一个数量级，在60℃下水浴48h依然有107PFU/ml的噬菌体存在，同时在70℃水浴2h仍具有80％存活率，具有良好的耐高温特性。
24h，效价仅降低一个数量级，在60℃下水浴48h依然有107PFU/ml的噬菌体存在，同时在70℃水浴2h仍具有80％存活率，具有良好的耐高温特性。
[0024] (2)本发明大肠杆菌噬菌体CL9、CL23以及D257P或其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由携带大肠杆菌引起的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎综合征的药剂或试剂。
[0025] (3)本发明大肠杆菌噬菌体CL9、CL23以及D257P可选取一株或多株被制备成作为有效成分应用于携带携带大肠杆菌引起的仔猪黄痢，鸡白痢，犊牛腹泻，奶牛乳房炎综合征的快速检测试剂或试剂盒。其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的携带大肠杆菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，噬菌体稳定性高，同时可有效确保检测的灵敏度。附图说明
[0026] 图1是电镜鉴定的大肠杆菌噬菌体CL9形态结构示意图。
具体实施方式
[0027] 以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
[0028] 以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
[0029] 大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018937，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体CL23(Escherichia coli phage CL23)，保藏编号为CCTCC NO: M
2018935，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体D257P1(Escherichia coli phage D257P1)，保藏编号为CCTCC NO: M
2018934，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。
大肠杆菌噬菌体CL23(Escherichia coli phage CL23)，保藏编号为CCTCC NO: M
2018935，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日；
大肠杆菌噬菌体D257P1(Escherichia coli phage D257P1)，保藏编号为CCTCC NO: M
2018934，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年12月28日。
[0030] 以下实例中，TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水
1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水
1000mL；
SM液配方为.氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水
1000mL。
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水
1000mL；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水
1000mL；
SM液配方为.氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水
1000mL。
[0032] 噬菌体的分离：取10mL过滤后上清液，加入10mL 2倍TSB培养基中，同时加入1mL 噬菌体宿主菌对数期菌液，放置于37℃条件下培养6h后取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用。取0.5mL噬菌体宿主菌对数期菌液，加入 5mL，48℃半固体TSB培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板。取过滤后的上清液10μl，点滴于已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于37℃培养6h，形成噬菌体点滴斑。
[0033] 噬菌体的纯化：挑取噬菌体点滴斑至1mL SM缓冲液中震荡1min，进行10倍梯度稀2 4 6
释，取10 ，10 和10 稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入 5mL，
48℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于 37℃温箱培养6h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培6h。取培养物在
8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化的大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)，保藏编号为CCTCC M 2018937。
释，取10 ，10 和10 稀释液分别加入对数期宿主菌0.5mL，混合均匀静置15min后，加入 5mL，
48℃半固体TSB培养基，立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于 37℃温箱培养6h后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板。挑起单个噬菌斑至1mL SM缓冲液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在形成噬菌斑的平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB培养基中，37℃条件下180rpm摇培6h。取培养物在
8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，即为得到的纯化的大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)，保藏编号为CCTCC M 2018937。
[0034] 实施例2：噬菌体的电镜观察分别取实施例1制得的各噬菌体培养物上清作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸(PTA)于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察：结果如图1所示，大肠杆菌噬菌体CL9形态发现，有一呈多面体的头部和较长的尾部，长径L为50～60nm,横径W为50～60nm， L/WY≈1；尾长60～70nm，宽2～8nm,有可收缩的肌鞘(参见图1)。
[0035] 实施例3：噬菌体基因组的提取与测序分别取实施例1制得的各噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件孵育60min后加入5.84g Nacl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。4℃条件下，11000rpm 离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％，即100mL加入
10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA 至终浓度
20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10 μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本发明选取43种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定大肠杆菌噬菌体CL9的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明供试噬菌体不含有下列毒力基因。
10g)，完全溶解后，冰浴至少1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA 至终浓度
20mmol/L(即1mL SM液加入40μL0.5mol/L EDTA)，同时每1mLSM液中加入10 μL10％SDS。从加入蛋白酶步骤开始，使用DP315-R TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒(Tiangen)试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至军事医学科学院测序得：
大肠杆菌噬菌体CL9(Escherichia coli phage CL9)具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
实施例4：噬菌体的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本发明选取43种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表1)，通过测定大肠杆菌噬菌体CL9的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。结果显示，本发明供试噬菌体不含有下列毒力基因。
[0036] 表1病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因实施例5：大肠杆菌噬菌体CL9对大肠杆菌最佳感染复数(MOI)的测定挑取大肠杆菌DC9单个菌落，接种到盛有3mL TSB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm 振荡培养6h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1∶100比例转接到10mL TSB培养液，37℃ 160rprn振荡培养至对数前期。按照感染复数分别为10、1、0.01和0.0001的比例加入噬菌体 CL9的纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中
160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体CL9原液(由实施例1制得)分别10 倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌大肠杆菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至48℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。
每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
160rpm振荡培养6h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清，按如下方法测定噬菌体效价：用SM液做稀释液，将噬菌体CL9原液(由实施例1制得)分别10 倍梯度稀释至107倍。分别取105、106及107稀释度的噬菌体培养液100μL与其宿主菌大肠杆菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至48℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。
每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(pfu/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。结果如表2所示。
[0037] 结果表明，培养6h条件下，大肠杆菌噬菌体CL9效价达到最高(3.9×109pfu/mL)时，其MOI＝1；表2不同感染复数下大肠杆菌噬菌体CL9的效价
实施例6大肠杆菌噬菌体CL9的热稳定性试验
取1mL噬菌体CL9纯培养液装于无菌EP管中，分别于50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用
2h、12h、24h和48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
实施例6大肠杆菌噬菌体CL9的热稳定性试验
取1mL噬菌体CL9纯培养液装于无菌EP管中，分别于50℃、60℃、70℃、80℃水浴中作用
2h、12h、24h和48h。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
[0038] 结果如表3所示，与对照相比大肠杆菌噬菌体CL9在50℃下水浴24h，效价仅降低一个数量级，在60℃下水浴48h依然有107PFU/ml的噬菌体存在，同时在70℃水浴2h仍具有 80％存活率，由此说明大肠杆菌噬菌体CL9具有良好的耐高温特性。
[0039] 表3大肠杆菌噬菌体CL9于不同温度下的效价实施例7：噬菌体CL9的pH稳定性试验
取无菌EP管分别加入不同pH(1-14)的TSB培养基900μl后将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，初始效价为1*1010PFU/ml，室温下静置1h。
待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于4h、
8h、 24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。
取无菌EP管分别加入不同pH(1-14)的TSB培养基900μl后将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，初始效价为1*1010PFU/ml，室温下静置1h。
待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。之后分别于4h、
8h、 24h及96h后重复上述过程，重复实验3次。
[0040] 结果如表3所示，大肠杆菌噬菌体CL9在pH5～pH9之间，效价无显著变化，表明其在中性，微酸和微碱条件下有较好的稳定性。
[0041] 在pH＝2的酸性条件下和pH＝12的碱性条件下，噬菌体的效价1个小时内下降为0，说明该噬菌体能够耐受的pH为3-11。
[0042] 表4反应不同时间后大肠杆菌噬菌体CL9 pH值实施例8大肠噬菌体CL9的存活稳定性试验
取5mL大肠噬菌体CL9纯培养液分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
取5mL大肠噬菌体CL9纯培养液分装于无菌试管中，分别于4℃、25℃、30℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。
[0043] 结果如表5所示，4℃条件下大肠噬菌体CL9存放50周效价仅仅降低一半左右，仍具 6x 109PFU/ml；25℃下大肠噬菌体CL9存放12周内效价数量级未降低超过一个数量级，到
41周仍能检测出效价；30℃下大肠噬菌体CL9可在8周内效价维持在同一数量级上，到32 周仍能检测出效价；各保存温度下噬菌体均对宿主菌具有较强裂解能力。噬菌体适宜4℃下存放。
41周仍能检测出效价；30℃下大肠噬菌体CL9可在8周内效价维持在同一数量级上，到32 周仍能检测出效价；各保存温度下噬菌体均对宿主菌具有较强裂解能力。噬菌体适宜4℃下存放。
[0044] 表5大肠噬菌体CL9于不同保存温度下的存活稳定性实施例9大肠噬菌体CL9对大肠杆菌裂解范围试验及大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P 组合物的制备和裂解范围试验
分别取效价为5x109PFU/ml大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P的1:1:1的鸡尾酒组合。
分别取效价为5x109PFU/ml大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P的1:1:1的鸡尾酒组合。
[0045] 采用双层平板点滴法来测定噬菌体的裂解谱。分别挑取100株动物源大肠杆菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μL各噬菌体及其鸡尾酒混合物溶液滴于平板的不同位置上。加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。
[0046] 试验重复三次。结果如表6所示，大肠杆菌噬菌体CL9裂解率分别76％。其噬菌体鸡尾酒混合物CL9+CL23+D257P的裂解率分别为84％。由此表明，采用上述3种噬菌体的鸡尾酒混合物，对动物源大肠杆菌裂解谱范围要高于单株噬菌体。
[0047] 表6大肠杆菌噬菌体CL9、CL23及D257P的裂解谱测定结果注：“+++”完全透亮，“++”中等透亮，“+”轻微透亮，不裂解的为“-”实施例10：大肠噬菌体CL9对非宿主性致病性细菌的裂解试验
挑取20株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株。分别接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm 培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取10μl噬菌体培养液及含有大肠杆菌噬菌体CL9，CL23和D257P(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
挑取20株非宿主性病原细菌单菌落，包括无乳链球菌4株，停乳链球菌4株，铜绿假单胞杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，鲍曼不动杆菌3株。分别接种于盛有3mL TSB的试管中，160rpm 培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取10μl噬菌体培养液及含有大肠杆菌噬菌体CL9，CL23和D257P(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。
[0048] 结果显示，噬菌体CL9及其鸡尾酒混合物均无法识别20株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株(表7)。说明供试噬菌体具有极强的特异性，且对微生物群落无损伤作用。
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