超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用
阅读：1017发布：2020-06-30
专利汇可以提供超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种超强毒 力 鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCC NO:V201316，以及该超强 毒力 鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒 疫苗 、诊断用 抗原 试剂 、诊断用阳性血清试剂和 治疗 用卵黄 抗体 、抗血清中的应用。本发明的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株，具有超强流行毒株特性，具有良好的免疫原性，而且适应细胞规模化培养。本发明的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株的TCID50为10‑8.0/0.1 ml，对超强毒株IBDV‑CL的致死性攻击，具有100%的保护率，同时免疫效力稳定、持续时间长，对 预防 和控制鸡传染性法氏囊超强毒流行具有重要的价值。，下面是超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用专利的具体信息内容。
1.超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCC NO:V201316。
2.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。
3.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。
4.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。
5.如权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。
6.一种预防超强毒力鸡传染性法氏囊病的疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性成分包含灭活后的权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株。
7.如权利要求6所述的预防超强毒力鸡传染性法氏囊病的疫苗的制备方法，其特征在于：将传染性法氏囊病病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF或鸡胚源细胞系DF-1进行培养，得到病毒毒液，病毒毒液用甲醛灭活后，与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相混合乳化即得所述疫苗。
超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种鸡急性、高度接触性、病毒性传染病，是目前危害养禽业的主要疫病之一。IBDV属双RNA病毒科，禽双RNA病毒属。法氏囊病病毒有Ⅰ型和Ⅱ型两个血清型，Ⅰ型鸡传染性法氏囊病病毒对鸡有致病性，Ⅱ型病毒对鸡无致病性，Ⅰ型病毒又分为不同的亚型，如经典毒株、变异毒株、超强毒株和致弱毒株等。IBDV在鸡体内主要侵害中枢免疫器官法氏囊，不仅造成鸡只发病死亡，也可导致免疫抑制，从而使鸡对其它疫病更易感，降低疫苗接种的免疫效果。
[0003] IBDV于1979年传入我国并开始大面积流行，随着弱毒疫苗的推广使用，该病得到了控制。但近年来该病在我国呈区域性流行，且发病鸡群多为免疫鸡群。研究表明，鸡传染性法氏囊病超强毒株(vvIBDV)能够突破原有的弱毒疫苗较高滴度抗体水平的保护，造成雏鸡法氏囊的损伤，成为鸡群中的安全隐患。中等毒力活疫苗或强毒灭活疫苗对鸡的保护效果较好，但是中等毒力疫苗和强毒疫苗毒株在抗原性上与超强毒毒株有一定的差异，伴随着免疫压力的持续，鸡传染性法氏囊病病毒流行株的毒力不断加强，中等毒力活疫苗或强毒灭活疫苗的保护效果存在下降的风险。因此，分离国内的鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株，经过鉴定、筛选，选取一批抗原性好、毒价高的鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株，经过鸡胚、鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚源DF1细胞培育，筛选出一株优良的、具有超强毒力抗原特征的细胞适应疫苗毒株，对预防鸡传染性法氏囊病流行和提高疫苗保护效果有极高的价值，是一款符合生产实际需求的疫苗产品。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一株已适应DF-1细胞增殖的鸡传染性法氏囊病病毒毒株，该毒株源于超强毒力的流行毒株，免疫原性强且适应细胞规模化培养。
[0006] 本发明的再一目的是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒灭活疫苗的制备方法。
[0007] 本发明的目的是以下述方式实现的：超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号：CCTCC NO：V201316，分类命名为：双链RNA病毒科双链RNA病毒属禽法式囊病毒IBDV/CL40。所用毒株为本单位2011年分离、鉴定的鸡传染性法氏囊病新毒株IBDV-CL株，将其VP2基因与已经发现主要超强毒株进行了序列分析和比较，发现其与超强毒株D6948、Gx、HZ、UK661核苷酸同源性较高，分别为99.1％、98.6％、98.9％、98.7％，同时存在显著不同，具有独特性。其对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-6.7/0.2ml，以2×103ELD50/只的剂量接种4周龄SPF鸡，发病率为100％，死亡率达到60％，结合以上，综合判断IBDV-CL株为超强毒株。
[0008] IBDV-CL株经过鸡胚上传代5次之后，在鸡胚成纤维细胞上培养20代次后适应细胞培养，继续在DF1细胞上传代10次，得到可以在DF1细胞上稳定、大量的培养的细胞适应毒株。病毒的TCID50为10-8.0，命名为CL40。使用CL40灭活疫苗保护的SPF鸡，对超强毒株IBDV-CL的致死性攻击，具有100％的保护率，免疫攻毒保护鸡临床不发病、无精神沉郁、食欲废绝现象。与国内外部分同类疫苗进行的比较研究中，本超强毒灭活苗的各项参数：抗体阳性率、抗体滴度及对超强毒的保护率，在参与比对的同类疫苗中，均居于首位。
[0009] 上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。
[0010] 上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。
[0011] 上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。
[0012] 上述超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。
[0014] 将传染性法氏囊病病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF或鸡胚源细胞系DF-1进行培养，得到病毒毒液，病毒毒液用甲醛灭活后，与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白油和司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相混合乳化即得所述疫苗。
[0015] 本发明的有益效果：(1)本发明的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株，具有超强流行毒株特性，具有良好的免疫原性，而且适应细胞规模化培养。
[0016] (2)本发明的鸡传染性法氏囊病病毒CL40毒株的TCID50为10-8.0/0.1ml，对超强毒株IBDV-CL的致死性攻击，具有100％的保护率，同时免疫效力稳定、持续时间长，对预防和控制鸡传染性法氏囊超强毒流行具有重要的价值。附图说明
[0018] 图2是IBDV分离毒株IBDV-CL的RT-PCR扩增VP2基因片段的结果，M为DL2000Marker，1、2分别为IBDV-CL和CL40细胞适应毒株VP2基因片段的PCR鉴定结果。
[0019] 图3是细胞适应毒株CL40的琼脂免疫扩散试验结果，M：细胞培养物；1-6：依次2倍梯度稀释的IBDV抗体。
具体实施方式
[0020] 为了使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021] 超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株，其保藏编号为：CCTCC NO:V201316。
[0022] 超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。
[0023] 超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用抗原试剂中的应用。
[0024] 超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。
[0025] 超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株在制备鸡传染性法氏囊病治疗用卵黄抗体、抗血清中的应用。
[0026] 一种预防超强毒力鸡传染性法氏囊病的疫苗，所述疫苗的活性成分包含灭活后的权利要求1所述的超强毒力鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株。
[0027] 将传染性法氏囊病病毒接种鸡胚成纤维细胞CEF或鸡胚源细胞系DF-1进行培养，得到病毒毒液，病毒毒液用甲醛灭活后，与吐温-80混合均匀，得到水相；将注射用白 油和司本-80混合均匀，得到油相；将水相和油相混合乳化即得所述疫苗。
[0028] 实施例1：鸡传染性法氏囊病病毒IBDV-CL株的分离与鉴定2011年3月河南某大型养鸡场出现疑似鸡传染性法氏囊病疫情，选择临床症状典型的发病鸡，无菌采集法氏囊及肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织。匀浆研磨，按体积1：5的比例加入含青霉素1,000U/mL、链霉素1,000U/mL灭菌生理盐水，制成组织悬液，置2～8℃冰箱，抑菌
2h，反复冻融3次后，4000rpm离心10min，取上清液，无菌滤器过滤，置于-20℃保存备用。
2h，反复冻融3次后，4000rpm离心10min，取上清液，无菌滤器过滤，置于-20℃保存备用。
[0029] 1.病毒鸡胚接种上述处理获得的病料经绒毛尿囊膜接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，37℃孵化，每日照蛋2次，将24h以前死亡的鸡胚弃去。24h后，每4～6h照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120h，不论死亡或存活，取出所有鸡胚，人工气室向上横卧，置2～8℃冰箱冷却8～16h，观察有无病理变化，收获绒毛尿囊膜及尿囊液。以上组织匀浆研磨，加入2倍体积的含青链霉素的PBS缓冲液后，反复冻融三次后，离心取上清液为E1代次。将病毒在鸡胚上连续传5代至E5代次。
[0030] 2.HA试验对疑似鸡传染性法氏囊组织上清液与鸡胚E1代次培养物分别进行HA试验，结果HA均为
0，该分离病毒无血凝性。
0，该分离病毒无血凝性。
[0031] 3.琼脂免疫扩散试验(AGID)制备1％的琼脂平板(其中含8％NaCl，pH6.8)，按常规打梅花形孔，中心孔加入IBDV标准阳性血清，周围孔加入待检的IBDV待检抗原(鸡法氏囊组织上清液与鸡胚培养物)，同时设阴性对照(无菌PBS液)和阳性对照(鸡法氏囊病标准抗原)。将琼脂板置于湿盒内，37℃放置24h后，观察到待检的疑似IBDV待检抗原、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性抗原与标准血清之间出现沉淀线，且阴性对照与标准血清之间无沉淀线，结果判定所分离病毒为IBDV，命名为IBDV-CL，如图1所示。
[0033] 引物的确定：从GenBank中下载已经登录的IBDV部分代表株(B-SD-RZ株)VP2基因全序列，应用引物分析软件Primer Premier5.0在IBDVVP2基因编码区设计了两条引物，如下：上游引物P1：5'-GGATGGAACTCCTCCTTCTACAATG-3'；
下游引物P2：5'-GAGTATCCCAGGTGAAGCGAGAATC-3'。P12扩增片段的预期大小为1694bp。
引物由北京某基因科技股份有限公司合成。
下游引物P2：5'-GAGTATCCCAGGTGAAGCGAGAATC-3'。P12扩增片段的预期大小为1694bp。
引物由北京某基因科技股份有限公司合成。
[0034] 5.IBDV-CL病毒VP2基因片段的序列分析将得到的VP2基因片段连接载体，测序。IBDV-CL病毒的基因序列与已经报道的超强毒株D6948、Gx、HZ、UK661核苷酸同源性较高，分别为99.1％、98.6％、98.9％、98.7％，但也存在显著不同，具有独特性。
[0035] 实施例2：细胞适应毒株的筛选及鉴定1.细胞适应毒株毒种制备
按照《中国兽药典》2010版的方法，制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，待CEF细胞长成单层后，弃去细胞培养液，用PBS液洗3次除去未贴壁、衰老死亡细胞及细胞表面血清，将E5代次的病毒用无菌培养基(DMEM培养液)作稀释后，接种于单层细胞上，37℃温箱吸附1h，加入病毒维持液(2％血清DMEM培养液)，37℃CO2培养箱培养96h，或病变达80％左右时收取，冻融3次后收获于灭菌容器内，-70℃保存备用。依此方法连续盲传20代至细胞产生稳定典型病变。继续将得到的病毒在DF-1细胞上连续培养10代，使其适应DF1细胞。
按照《中国兽药典》2010版的方法，制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，待CEF细胞长成单层后，弃去细胞培养液，用PBS液洗3次除去未贴壁、衰老死亡细胞及细胞表面血清，将E5代次的病毒用无菌培养基(DMEM培养液)作稀释后，接种于单层细胞上，37℃温箱吸附1h，加入病毒维持液(2％血清DMEM培养液)，37℃CO2培养箱培养96h，或病变达80％左右时收取，冻融3次后收获于灭菌容器内，-70℃保存备用。依此方法连续盲传20代至细胞产生稳定典型病变。继续将得到的病毒在DF-1细胞上连续培养10代，使其适应DF1细胞。
[0036] AGID试验方法检测细胞病毒抗原，结果阳性，如图3所示。
[0037] 2.CL40毒株的抗原特异性试验将CL40毒株分别与等量与等量的IBDV、AIVH3、H5、H9亚型、IB、ND等阳性血清混合，37℃中和1h，接种DF-1细胞，同时设未中和对照组。观察细胞病变。细胞培养结果表明，毒种可被鸡传染性法氏囊病病毒的特异性血清中和。而AIV H3、H5、H9亚型、IB、ND等阳性血清不能抑制病毒的增殖。结果见表1。
表1 CL40毒株的抗原特异性
表1 CL40毒株的抗原特异性
[0038] 3.RT-PCR鉴定以细胞适应毒株CL40病毒的RNA为模板，经RT-PCR扩增VP2基因片段，配制1％琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小约1694p的目的片段，条带大小与预期一致，如图3所示。
[0039] 4.CL40病毒VP2基因片段的序列分析将得到的VP2基因片段测序，序列如SEQUENCE LISTING所示。
[0040] 实施例3：鸡传染性法氏囊病病毒株的生物学特性测定1.IBDV-CL毒株鸡胚半数致死量(ELD50)的测定
将IBDV-CL毒株进行10倍梯度稀释，经CAM途径接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，接种量均为0.1mL，横卧于37℃孵化器中培养，剔除24h内死亡胚，观察至144h，记录各组鸡胚死亡情况。按Reed-Mueneh法计算每0.1mL细胞培养液中病毒的鸡胚半数致死量(ELD50)，结果见表2。
表2 接种的SPF鸡胚死亡率与IBDV分离株的ELD50
将IBDV-CL毒株进行10倍梯度稀释，经CAM途径接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，接种量均为0.1mL，横卧于37℃孵化器中培养，剔除24h内死亡胚，观察至144h，记录各组鸡胚死亡情况。按Reed-Mueneh法计算每0.1mL细胞培养液中病毒的鸡胚半数致死量(ELD50)，结果见表2。
表2 接种的SPF鸡胚死亡率与IBDV分离株的ELD50
[0041] 2.CL40毒株的细胞半数感染量(TCID50)的测定将稳定传至第8代的病毒进行10倍梯度稀释，接种于DF-1长成单层的96孔板中，每个稀释度按照《中国兽药典》的要求接种6孔，每孔接种0.1mL，设正常细胞对照。逐日观察至120h并记录结果。按Reed-Mueneh法计算每0.1mL细胞培养液中病毒的TCID50，结果见表3。
表3 接种的DF-1细胞感染率与IBDV分离株的TCID50
表3 接种的DF-1细胞感染率与IBDV分离株的TCID50
[0042] 3.CL40毒株对雏鸡的毒力用105.0×ELD50或TCID50的剂量对4周龄SPF鸡进行对雏鸡的毒力试验。结果见表4。
表4 细胞适应毒株CL40对雏鸡的毒力
表4 细胞适应毒株CL40对雏鸡的毒力
[0044] 实施例5细胞适应毒株CL40对SPF鸡免疫效果实验1.病毒灭活与乳化
细胞培养的病毒用终浓度为0.1％甲醛37℃48h进行灭活。水相：细胞适应毒株于0.1％甲醛中37℃灭活充分后加入2％无菌吐温-80，充分振荡，使其溶化，即为制苗水相。油相按兽用生物制品规程要求制备。水相与油相按1:3比例，按要求乳化，于4℃保存。
细胞培养的病毒用终浓度为0.1％甲醛37℃48h进行灭活。水相：细胞适应毒株于0.1％甲醛中37℃灭活充分后加入2％无菌吐温-80，充分振荡，使其溶化，即为制苗水相。油相按兽用生物制品规程要求制备。水相与油相按1:3比例，按要求乳化，于4℃保存。
[0045] 2.CL40毒株的免疫原性试验用4周龄SPF鸡15只，其中10只皮下接种CL40灭活疫苗0.2mL(含0.5×108TCID50)，另5只接种空白细胞培养液作对照，饲养2周后采血分离血清，用标准IBDV抗原作AGID试验。在免疫CL40毒株灭活疫苗后，鸡血清中和抗体结果见表5。
表5 CL40灭活疫苗的免疫原性
表5 CL40灭活疫苗的免疫原性
[0046] 3.中和试验用CL40毒株制备的灭活疫苗免疫4周龄SPF鸡，21d后采血分离血清，将制备的CL40毒株阳性血清置56℃水浴中处理30min，用培养液做10倍梯度稀释，分别与含100TCID 50的CL40病毒液等量混合，37℃孵育1h，依次加入DF-1细胞培养板，每个稀释度加8孔，培养96h观察细胞病变，按Reed-Muench方法计算血清的中和效价。计算得血清的中和效价为10-4.02，表明细胞毒制备的血清在1:10471稀释时，可保护50％ 的细胞不出现CPE。结果见表6。
表6 CL40毒株中和试验结果
表6 CL40毒株中和试验结果
[0047] 4.疫苗免疫后的SPF鸡攻毒保护试验取4周龄的SPF鸡45只，分为1、2、3、4组和对照组，1、2、3组分别使用农业部已经批准的鸡传染性法氏囊灭活疫苗株SD、HQ、VNJ0按照说明书进行免疫，4组使用CL40灭活疫苗0.4ml颈部皮下和胸部肌肉进行免疫，对照组为生理盐水。免疫后第28天用IBDV-CL超强毒株
0.2ml(含104EID50)进行攻毒试验，正常对照组同样攻毒。攻毒后观察发病和死亡情况，第4天分别将试验鸡只剖杀，检查鸡只病变情况，取其法氏囊进行研磨处理后经CAM途径接种鸡胚，观察其法氏囊组织中是否含有足以致病的病毒。结果表明，面对超强毒株的攻击，CL40灭活疫苗的保护效果优于HQ、VNJ0株的灭活疫苗；而保护效果较好的HQ株灭活疫苗，在攻毒后SPF鸡的法氏囊组织中的病毒含量的比较中，逊色于CL40株灭活疫苗。通过以上结果表明，CL40株灭活疫苗的保护效果在同类产品中位居首位。
表7 与同类疫苗比较结果
0.2ml(含104EID50)进行攻毒试验，正常对照组同样攻毒。攻毒后观察发病和死亡情况，第4天分别将试验鸡只剖杀，检查鸡只病变情况，取其法氏囊进行研磨处理后经CAM途径接种鸡胚，观察其法氏囊组织中是否含有足以致病的病毒。结果表明，面对超强毒株的攻击，CL40灭活疫苗的保护效果优于HQ、VNJ0株的灭活疫苗；而保护效果较好的HQ株灭活疫苗，在攻毒后SPF鸡的法氏囊组织中的病毒含量的比较中，逊色于CL40株灭活疫苗。通过以上结果表明，CL40株灭活疫苗的保护效果在同类产品中位居首位。
表7 与同类疫苗比较结果
[0048] 5.抗体消涨规律的测定CL40疫苗免疫后所采血清分别做AGID试验，免疫CL40后的SPF鸡在第4周达到抗体最高水平。
表8 免疫后血清AGID试验
表8 免疫后血清AGID试验
[0049] 以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
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