肠炎沙门菌glpK基因缺失的应用
阅读：1018发布：2020-05-20
专利汇可以提供肠炎沙门菌glpK基因缺失的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种肠炎沙 门 菌glpK基因缺失的应用，利用λ-Red重组技术构建肠炎沙门菌glpK基因缺失株，并对其 生物 学特性和毒 力 进行研究，明确了glpK基因缺失引起肠炎沙门菌 毒力 下降，为设计肠炎沙门菌 疫苗 靶点提供参考，进而防治肠炎沙门菌感染。，下面是肠炎沙门菌glpK基因缺失的应用专利的具体信息内容。
1.肠炎沙门菌glpK基因缺失用于降低肠炎沙门菌的毒力。
2.肠炎沙门菌glpK基因缺失在肠炎沙门菌疫苗中的应用。
3.肠炎沙门菌glpK基因缺失株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)利用引物P1和P2，经PCR扩增，构建glpK基因敲除打靶片段；所述引物序列为：
P1：5’-GCGGTCGTTATGGATCATGACGCGAATATCGTCAGCGTATCACAGCGTGAATTTGAGCATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
P2：5’-CATCAGCATAAAGCAGCCGGTGCCGTAGGTATTCTTTGCCATTCCTTCCTTTACGCACACATATGAATATCCTCCTTAG-3’，SEQ ID NO.2；
(2)将glpK基因敲除打靶片段电转化进入c50336/pKD46感受态细胞，获得阳性重组子c50336::cat；
(3)利用阳性c50336::cat菌株制备感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，消除氯霉素抗性标记，得到目的菌株c50336ΔglpK；
(4)对目的菌株c50336ΔglpK进行PCR验证。
4.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌glpK基因缺失株的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板2μL，2.5mM dNTP 4μL，10μM上/下游引物各1μL，5×PCR Buffer 10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水31.5μL。
5.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌glpK基因缺失株的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后
72℃延伸5min。
肠炎沙门菌glpK基因缺失的应用
技术领域
背景技术
[0002] 肠炎沙门菌可感染多种畜禽和人类，是具有公共卫生意义的重要胞内寄生菌。沙门菌病在世界范围内广泛流行，可在不同动物间传播，威胁动物和人类健康。尽管采取了大量的防控措施，但并未得到有效的控制。持续不断的研究沙门菌的致病机制，开发安全有效的疫苗是防控沙门菌病的重要手段。沙门菌主要以粪-口途径传染，并在细胞内存活和增殖。作为胞内寄生菌，细胞内的沙门菌可调控某些基因的表达，抵御细胞杀伤和逃避免疫监视，这些基因通常能够显著影响沙门菌的毒力，可作为基因敲除弱毒疫苗开发的靶点。
[0003] 基于此，本发明利用Red同源重组方法构建肠炎沙门菌glpK基因缺失株，并对其生物学特性和毒力进行研究，明确glpK基因缺失与肠炎沙门菌毒力之间的关系，为探索肠炎沙门菌疫苗开发提供工具和基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于明确glpK基因缺失与肠炎沙门菌毒力之间的关系。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 肠炎沙门菌glpK基因缺失用于降低肠炎沙门菌的毒力。
[0007] 进一步，肠炎沙门菌glpK基因缺失在肠炎沙门菌疫苗中的应用。
[0008] 进一步，肠炎沙门菌glpK基因缺失株的构建方法，具体步骤如下：
[0009] (1)利用引物P1和P2，经PCR扩增，构建glpK基因敲除打靶片段；所述引物序列为：
[0010] P1：5’-GCGGTCGTTATGGATCATGACGCGAATATCGTCAGCGTATCACAGCGTGAATTTGAGCATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
[0011] P2：5’-CATCAGCATAAAGCAGCCGGTGCCGTAGGTATTCTTTGCCATTCCTTCCTTTACGCACACATATGAATATCCTCCTTAG-3’，SEQ ID NO.2；
[0012] (2)将glpK基因敲除打靶片段电转化进入c50336/pKD46感受态细胞，获得阳性重组子c50336::cat；
[0013] (3)利用阳性c50336::cat菌株制备感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，消除氯霉素抗性标记，得到目的菌株c50336ΔglpK；
[0014] (4)对目的菌株c50336ΔglpK进行PCR验证。
[0015] 进一步，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板2μL，2.5mM dNTP 4μL，10μM上/下游引物各1μL，5×PCR Buffer 10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水31.5μL；
[0016] PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
[0017] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明利用λ-Red重组技术构建肠炎沙门菌glpK基因缺失株，并对其生物学特性和毒力进行研究，明确了glpK基因缺失引起肠炎沙门菌毒力下降，为设计肠炎沙门菌疫苗靶点提供参考，进而防治肠炎沙门菌感染。附图说明
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0019] 图1附图为本发明肠炎沙门菌glpK基因敲除株的鉴定；
[0020] 其中，M：DL5000 Marker；1：c50336野生型菌株；2：c50336::cat；3：c50336ΔglpK；
[0021] 图2附图为本发明菌株生长曲线测定；
[0022] 图3附图为本发明热应激(42℃)对glpK基因敲除株生长的影响；
[0023] 图4附图为本发明酸应激(pH 3.5)对glpK基因敲除株生长的影响；
[0024] 图5附图为本发明碱应激(pH 10.0)对glpK基因敲除株生长的影响；
[0026] 图7附图为本发明生物被膜形成能力分析；
[0027] 图8附图为本发明胞内存活试验；其中，**:p<0.01；
[0028] 图9附图为本发明小鼠攻毒实验结果；
[0029] 其中，图2-图9中，WT：野生型菌株c50336；RO：敲除菌株c50336ΔglpK；RS：回复菌株c50336ΔglpK+glpK。
具体实施方式
[0030] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031] 鼠源巨噬细胞Raw264.7由河北省预防兽医学重点实验室保存。沙门菌标准菌株c50336、质粒pKD4、pKD46、pCP20、pBR322由扬州大学朱国强教授惠赠。DNA Mixture、Maker均购自康为世纪生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；L-阿拉伯糖购自Sigma-Aldrich公司；生化鉴定试纸条购自梅里埃公司。
[0032] 实施例1构建glpK基因敲除打靶片段
[0033] 根据肠炎沙门菌基因组序列(基因登录号：NC_011294.1)，设计引物，并由上海生工合成。
[0034] 以质粒pKD4为模板，使用引物P1和P2进行PCR扩增，获得glpK基因敲除打靶片段，引物P1和P2由glpK基因和氯霉素基因的同源片段两部分组成；PCR反应体系为DNA模板2μL，dNTP 2.5mM 4μL，10μM上/下游引物(P1、P2)各1μL，5×PCR Buffer 10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水31.5μL；PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min；反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，获得1104bp大小的条带；其中，引物P1和P2为：
[0035] P1：5’-GCGGTCGTTATGGATCATGACGCGAATATCGTCAGCGTATCACAGCGTGAATTTGAGCATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
[0036] P2：5’-CATCAGCATAAAGCAGCCGGTGCCGTAGGTATTCTTTGCCATTCCTTCCTTTACGCACACATATGAATATCCTCCTTAG-3’，SEQ ID NO.2；
[0037] 引物P1、P2分别由前后两部分组成，5’端加下划线的部分为glpK基因的同源片段，3’端未加下划线部分为氯霉素的同源片段。
[0038] 实施例2肠炎沙门菌glpK基因缺失株的构建
[0039] 挑取带有pKD46质粒的肠炎沙门菌c50336单菌落，在LB(含Amp 100μg/μL)液体培养基中摇菌至对数期，加入阿拉伯糖(终浓度30mmol/L)诱导培养2h；取出培养后的菌液冰上放置10min后，使用冰冷的去离子水重悬3次，制备感受态细胞c50336/pKD46；将打靶片段与感受态细胞混匀，使用1mm电极杯，1.8kV电压电击转化到c50336/pKD46感受态细胞中，涂布氯霉素平板，培养24h后挑取单菌落进行PCR鉴定。42℃热激去除质粒pKD4，得到一次重组菌株c50336::cat；利用引物P3、P4对一次重组菌株进行PCR鉴定，PCR扩增的反应体系为DNA模板2μL，2.5mM dNTP 4μL，10μM上/下游引物(P3、P4)各1μL，5×PCR Buffer 10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水31.5μL；PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。挑取一次重组菌株单菌落摇菌至对数期，冰冷的去离子水重悬三次，制备感受态细胞，电转化质粒pCP20，消除氯霉素抗性标记，得到二次重组菌株c50336ΔglpK；利用引物P3、P4对其进行PCR鉴定，得到966bp大小的条带(如图1所示)。同时，将PCR产物连接pMD18-T，送生工测序，确认缺失菌株。结果表明glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK(KO)构建成功。
[0040] 其中，引物P3和P4为：
[0041] P3：5’-CCTTACTTCCTGGTGCCACTGTTT-3’；SEQ ID NO.3；
[0042] P4：5’-CGGTAGTTACGCTCGGTGGTTT-3’；SEQ ID NO.4。
[0043] 实施例3肠炎沙门菌glpK基因回补菌株的构建
[0044] 以肠炎沙门菌基因组为模板，利用P5、P6引物(根据glpK基因ORF序列设计的引物)PCR扩增glpK基因片段，PCR扩增的反应体系为DNA模板2μL，2.5mM dNTP 4μL，10μM上/下游引物(P5、P6)各1μL，5×PCR Buffer 10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，去离子水31.5μL；PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。获得1509bp大小的条带，将其克隆到pBR322质粒上，即为pBR322-glpK，电转化至菌株c50336ΔglpK中，构建回补菌株c50336ΔglpK+glpK(RS)。
[0045] 其中，引物P5和P6为：
[0046] P5：5’-CGAAGCTTATGACTGAAAAAAAATATATCGTTG-3’；Hind III；SEQ ID NO.5；
[0047] P6：5’-ACCATATGTTACTTGTCGTGCTCTTCCCACGCC-3’；Nde I；SEQ ID NO.6。
[0048] 实施例4重组菌生化特性检测
[0049] (1)挑c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK单菌落接种LB液体培养基中培养过夜，次日按1:50转接新鲜LB，37℃震荡培养；每隔2h测定一次OD600，绘制3种菌的生长曲线。
[0050] 菌株c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK的生长曲线结果如图2所示，在LB液体培养基中，37℃培养条件下，细菌生长速度无明显差异；结果表明，在LB培养条件下，glpK基因敲除不影响沙门菌的生长。
[0051] (2)采用梅里埃ATB自动鉴定系统：挑取单菌落均匀分散于无菌生理盐水，吸取40μL菌液滴加在ID32E生化鉴定试纸条的各孔中，并按要求向需厌氧培养的孔中滴加矿物油，试纸条置于湿盒，37℃培养过夜；次日在吲哚孔滴加一滴James。将试纸条置于ATB自动鉴定系统中进行鉴定。
[0052] 利用ATB全自动生化鉴定系统对菌株c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK的生化反应谱进行测定，表1结果显示：三者生化反应谱无区别，表明glpK基因敲除不影响肠炎沙门菌的生化特性。
[0053] 表1生化反应谱
[0054]
[0055]
[0056] 实施例5重组菌的应激试验
[0057] 取对数期c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK菌液进行应激实验。酸、碱应激条件分别使用pH 3.5和pH 10.0的灭菌生理盐水，37℃孵育30min；热应激条件为42℃，生理盐水中孵育10min；氧化应激条件为含10mmoL/L H2O2的生理盐水，37℃孵育10min，倍比稀释后进行细菌计数；试验重复3次。
[0058] 体外应激试验检测菌株c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK对酸、碱、热和氧化应激的抵抗能力；结果如图3-6所示，结果显示，glpK基因不参与肠炎沙门菌抗应激能力。
[0059] 实施例6重组菌的耐药实验
[0060] 使用多粘菌素B，进行MIC试验：向96孔板第一孔中加入终浓度为1000μg/mL多粘菌素B(LB液体培养基配置，每孔100μL)，2倍倍比稀释至12孔；取对数生长期菌液，统一调整细菌浓度至1×109cfu/mL，以10μL/孔的细菌体积向96孔板中加菌液。37℃培养48h，观察细菌生长情况。设置不加药物的对照组。
[0061] 利用多粘菌素B进行菌株的MIC试验，结果如表2所示；确定野生型菌株c50336(WT)6 3
和回复菌株c50336ΔglpK+glpK(RS)的MIC值为15.625(1/2 ×10)μg/mL，而敲除菌株c50336ΔglpK(RO)的MIC为3.906(1/28×103)μg/mL。结果表明glpK基因参与了肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药。
和回复菌株c50336ΔglpK+glpK(RS)的MIC值为15.625(1/2 ×10)μg/mL，而敲除菌株c50336ΔglpK(RO)的MIC为3.906(1/28×103)μg/mL。结果表明glpK基因参与了肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药。
[0062] 表2多粘菌素B的MIC实验
[0063]
[0064] 注：-：细菌未生长；+：细菌生长。
[0065] 实施例7重组菌的生物被膜实验
[0066] 挑c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK单菌落培养至对数期，菌液按1:100的比例转接LB培养基，再加入96孔板中，150μL/孔；置于30℃恒温摇床(80r/min)中培养
24h；小心弃掉菌液，蒸馏水洗去游离细菌，2％结晶紫室温染色15min，蒸馏水洗涤；用95％的乙醇溶解结晶紫，测量OD575处吸光值；设置空白对照孔。
24h；小心弃掉菌液，蒸馏水洗去游离细菌，2％结晶紫室温染色15min，蒸馏水洗涤；用95％的乙醇溶解结晶紫，测量OD575处吸光值；设置空白对照孔。
[0067] 采用结晶紫染色法定量分析菌株c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK的生物被膜形成能力，以c50336的OD575值为1，其他菌株数值为相应OD575除以c50336的OD575，作图，结果如图7所示，结果显示，基因敲除菌株c50336ΔglpK生物膜形成不足野生型菌株的50％，表明glpK基因编码产物参与肠炎沙门菌的生物被膜形成。
[0068] 实施例8重组菌胞内存活能力的测定
[0069] 取生长良好的的Raw264.7巨噬细胞，于感染前18h以1×105/孔接种24孔细胞板；取对数期c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK，灭菌PBS重悬3次后细菌计数；按照感染比为10(MOI＝10)的剂量加入细胞培养孔中，孵育1h后置换为含20μg/mL庆大霉素的DMEM继续培养，以杀死细胞外的细菌；取不同感染时间点(1h、10h、24h)裂解细胞，进行细菌计数；试验重复3次。
[0070] 取c50336、c50336ΔglpK和c50336ΔglpK+glpK菌液，以MOI＝10的剂量感染鼠源巨噬细胞系Raw264.7，测定胞内存活能力，结果如图8所示，在感染后的10h和24h，glpK基因敲除菌株胞内细菌数量显著降低，其数值Log10(CFU/mL)降低2～3，即活菌数降低100～1000倍。结果表明，在细胞水平上，glpK基因敲除可影响肠炎沙门菌的胞内存活能力。
[0071] 实施例9重组菌的动物攻毒实验
[0072] 取Balb/c小鼠，每组10只，共分为11组；取c50336和c50336ΔicdA菌液，PBS重悬，并梯度稀释为1.0×108cfu/mL、1.0×107cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×105cfu/mL和1.0×104cfu/mL；1～5组腹腔注射0.2mL不同浓度c50336，6～10组腹腔注射不同浓度c50336ΔglpK；第11组注射PBS，作为对照组。攻毒后连续观察小鼠死亡数，根据改良寇氏法计算LD50。
[0073] 取野生型菌株c50336和基因敲除菌株c50336ΔglpK，进行小鼠攻毒实验，攻毒后连续记录小鼠死亡数量，利用寇氏法计算LD50，取Lg(LD50)值作图，结果如图9所示，c50336ΔglpK的Lg(LD50)值增大约2左右，即LD50增大了约100倍。结果表明，glpK基因敲除后肠炎沙门菌的毒力显著降低。
[0074] 本发明利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌glpK基因敲除菌株，进行了体外模拟应激试验，结果显示，glpK基因编码产物并不影响肠炎沙门菌的抵御环境应激能力，但是可影响其生物被膜形成和对抗菌肽类物质多粘菌素B的耐药。利用鼠源巨噬细胞Raw264.7进行胞内存活试验，结果显示glpK基因敲除菌株胞内活菌数降低100～1000倍，同时动物试验也显示出细菌LD50增大2左右，结果表明glpK基因敲除菌株的毒力显著降低。
[0075] 多粘菌素B是一种抗菌肽类物质，是宿主抵御和杀伤病原微生物的重要介质，代表了一大类抗生素。该物质的杀菌方式是在细菌细胞壁上打孔，形成分子通道，促使细胞内容物释放出来，从而引起细菌死亡。本发明利用MIC试验，证明glpK基因编码产物可影响肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药。病原菌能够对抗宿主抗菌肽类物质的杀伤，其作用机制通常为利用外排泵排出，分泌蛋白酶降解和合成吸附抗菌肽的分子等。glpK基因敲除后，肠炎沙门菌耐受抗菌肽能力下降，其具体机制有待深入分析。形成生物被膜是细菌耐药性产生的重要机制，也是其体现致病性的重要方式。由于glpK基因编码产物可影响细菌的耐药性，本发明进一步测定了基因敲除菌株的生物被膜形成能力。通过结晶紫染色法进行分析发现，glpK基因敲除菌株生物膜形成不足野生型菌株的50％，表明glpK基因编码产物参与肠炎沙门菌的生物被膜形成。
[0076] 巨噬细胞内存活能力和动物脏器载菌量是沙门菌毒力的重要体现，本发明结果证明glpK基因敲除菌株毒力显著降低。本发明为肠炎沙门菌新型疫苗开发提供了重要的分子靶标。
[0077] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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