同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半
套式RT-PCR方法
技术领域
背景技术
[0002] 目前，国内外对于猪流行性腹泻病毒的检测已有许多种方法，包括ELISA，RT-PCR及
荧光定量PCR，但都是针对猪流行性腹泻病毒原始毒
力株和变异株中的某一种或两种毒株所设计、建立的。因此，目前的方法只能检测或区分这两种基因型的毒株。但目前的研究报道显示当前世界范围内已经发现并鉴定了三种基因型的猪流行性腹泻病毒毒株，且还没有任何一种检测方法能够同时区别这三种病毒毒株。
发明内容
[0003] 本发明的目的就是针对上述
现有技术中的
缺陷，提供了一种能够同时检测并鉴定目前世界范围内出现的三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法，为该病毒的
鉴别、诊断提供帮助。
[0004] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
[0005] 上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
[0006] 上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
[0007] 上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
[0008] 下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’。
[0009] 本发明的第二个目的是提供了同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，包括以下步骤：
[0010] 1）提取样品总RNA；
[0011] 2）反转录得到样本cDNA；
[0012] 3）利用上述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株；
[0013] 4）分别利用上述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始
毒力株和变异株。
[0014] 用QIAGEN公司的RNA提取
试剂盒，参照使用
说明书提取样品总RNA。用AMV反转录酶在42℃反转录1小时合成cDNA。反应体系为25μl，内含反转录缓冲液5 μl、dNTP 3 μl、AMV反转录酶 0.5μl、下游引物2μl、RNA酶
抑制剂0.5μl、无菌
水4μl和RNA模板10μl。
[0015] 进一步的，上述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、
权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃ 35秒、60℃35秒、72℃ 30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
[0016] 通过第一轮RT-PCR可分别特异性扩增出三种病毒株的大小不同的
片段，其中原始毒力株可扩增出大小为884bp的核酸片段，变异株可扩增出大小为875bp的核酸片段，S197aa缺失株则可扩增出大小为293bp的核酸片段。通过第一轮PCR反应，可区分出S197aa缺失株和其它两个毒株，结果如图1所示。
[0017] 进一步的，上述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃ 20秒、
72℃ 15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
[0018] 利用F2和UR特异性扩增原始毒力株时，可扩增得到大小为650bp的核酸片段，而变异株不产生条带。而利用F3和UR特异性扩增变异株时，可扩增得到大小为358bp的核酸片段，而原始毒力株不产生条带。通过第二次扩增，可利用F2和UR，F2和UR这两个引物对，进一步地区分出原始毒力株和变异株，结果如图2所示。
[0019] 三种猪流行性腹泻病毒毒株是通过样品采集，分离并鉴定的猪流行性腹泻病毒流行毒株，其分子特点及基因组序列以上传至GenBank中，序列号分别为：PC177 (KM392229), PC22A (KM392224) and Iowa106 (KM392232)。
[0020] 本发明的有益效果为：本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法，可以通过一种方法，在一次试验中同时鉴定并区别目前已报道出现的全部三种猪流行性腹泻病毒毒株，是世界上首次建立的一种能够同时检测三种不同基因型猪流行性腹泻病毒流行毒株的检测方法，为今后该病毒的鉴别及临床诊断提供新的、有效的检测方法。
附图说明
[0021] 图1为本发明方法中第一轮PCR反应结果图。
[0022] 图2为本发明方法中第二轮PCR反应结果图。
[0023] 图3为本发明的引物设计思路图。
[0024] 图4为本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法的特异性检测结果。
[0025] 图5为本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法的敏感性检测结果。
具体实施方式
[0027] 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
[0028] 上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
[0029] 上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
[0030] 上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
[0031] 下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’。
[0032] F1、F2、F3、UR分别如
序列表中序列1-4所示。
[0033] 本发明的引物设计思路如图3所示。
[0034] 使用了上述引物组合的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，包括以下步骤：
[0035] 1）提取样品总RNA；
[0036] 2）反转录得到样本cDNA；
[0037] 3）利用上述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株；
[0038] 4）分别利用上述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始毒力株和变异株。
[0039] 用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，参照使用说明书提取样品总RNA。用AMV反转录酶在42℃反转录1小时合成cDNA。反应体系为25μl，内含反转录缓冲液5 μl、dNTP 3 μl、AMV反转录酶 0.5μl、下游引物2μl、RNA酶抑制剂0.5μl、无菌水4μl和RNA模板10μl。
[0040] 所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃ 35秒、60℃35秒、72℃ 30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
[0041] 通过第一轮RT-PCR，利用引物F1/UR组合，可分别特异性扩增出三种病毒株的大小不同的片段，其中原始毒力株可扩增出大小为884bp的核酸片段，变异株可扩增出大小为875bp的核酸片段，S197aa缺失株则可扩增出大小为293bp的核酸片段。通过第一轮PCR反应，可区分出S197aa缺失株和其它两个毒株，结果如图1所示。
[0042] 所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl2 2.5μl、dNTP 1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、Taq DNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
[0043] 利用F2和UR特异性扩增原始毒力株时，可扩增得到大小为650bp的核酸片段，而变异株不产生条带。而利用F3和UR特异性扩增变异株时，可扩增得到大小为358bp的核酸片段，而原始毒力株不产生条带。通过第二次扩增，可利用F2和UR，F2和UR这两个引物对，进一步地区分出原始毒力株和变异株，结果如图2所示。
[0044] 三种猪流行性腹泻病毒毒株是通过样品采集，分离并鉴定的猪流行性腹泻病毒流行毒株，其分子特点及基因组序列以上传至GenBank中，序列号分别为：PC177 (KM392229), PC22A (KM392224) and Iowa106 (KM392232)。
[0045] 特异性检测过程的描述：如图4所示，其中M为DNA marker，1-9分别是PEDV S197aa缺失株，原始毒力株，变异株,三个毒株1:1:1混合物，10:1:1混合物，1:10:1混合物，1:1:10混合物，猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。图4A是利用F1/UR组合进行第一轮RT-PCR，结果显示，只有PEDV S197aa缺失株（1）和含有PEDV S197aa缺失株的混合物（4-7）会扩增出大小为293bb左右的核酸片段，而原始毒力株、变异株及它们的混合物则会扩增出大小为0.88kb左右的核酸片段。而同病毒属内的两种其它猪腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）则不产生任何条带；图4B是利用F2/UR组合进行第二轮RT-PCR，结果显示，只有原始毒力株及其混合物（2、4、5、6、7）会扩增出650bp大小的核酸片段，其它毒株不会产生任何条带；图4C是利用F3/UR组合进行第二轮RT-PCR，结果显示，只有变异株及其混合物（3、4、5、6、7）会扩增出358bp大小的核酸片段，其它毒株不会产生任何条带。以上结果显示三对不同的引物组合对其相对应的毒株具有很高的特异性。
[0046] 敏感性检测过程的描述：如图5所示，其中M为DNA marker，1-6分别是PEDV 不同毒株的原始毒液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、10000倍稀释液及100000倍稀释液。 图5A、B、C中的毒株分别是S197aa缺失株、原始毒力株及变异株，所用引物组合分别是F1/UR、F2/UR及F3/UR。敏感性检测结果显示，引物组合F1/UR、F2/UR及F3/UR对S197aa缺失株、原始毒力株及变异株的敏感性分别达到10-4倍稀释、10-3倍稀释及10-5倍稀释，具有较高的敏感性。
[0047] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
