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一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用

阅读：138发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种维氏气单胞菌，于2019年7月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019580。本申请的维氏单胞菌突变菌株的毒力大幅下降，达到了良好的减毒效果，为制作维氏气单胞菌减毒活疫苗提供了可能性。，下面是一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种维氏气单胞菌，于2019年7月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019580。
2.一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法，包括：通过基因工程技术手段处理如权利要求1所述的维氏气单胞菌的DNA片段，使得所述维氏气单胞菌中ExsA基因敲除、敲减或者沉默。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其中ExsA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其中ExsA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求2所述的构建方法，所述维氏气单胞菌属于气单胞菌属的维氏气单胞菌种。
6.根据权利要求2所述的构建方法，所述基因工程技术手段为同源重组技术。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其中，所述同源重组技术为同源双交换、T-DNA插入、CRISPR/Cas9技术、TALEN技术、Red/ET重组技术中任意一者。
8.根据权利要求2所述的构建方法，所述基因工程技术手段为RNA干扰技术或锌指核酸酶基因打靶技术。
9.一种如权利要求2-8任一所述的构建方法构建的减毒的维氏气单胞菌。
10.如根据权利要求10所述的维氏气单胞菌在制作维氏气单胞菌减毒疫苗方面的应用。

说明书全文

一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别地涉及一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用。

背景技术

[0002] 维氏气单胞菌隶属气单胞菌科，气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌。其普遍存在于淡水、污水、海水乃至土壤中。维氏气单胞菌属于强毒病原菌，致病过程主要包括黏附-侵袭-宿主体内定殖以及毒素分泌等过程，期间产生一系列毒力因子，如气溶素(aerolysin)、肠毒素(enterotoxin)和粘附因子(adherence factor) 等，这些毒力因子在水产动物、畜禽、甚至人类感染中起着举足轻重的作用。

[0003] 近年来，日益增多的病例表明，维氏气单胞菌已成为一种重要的人-鱼共患致病菌，其分布广泛，致病性较强，并在食品安全方面占据举足轻重的地位，部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象。

[0004] 目前主要依赖抗菌药物等对维氏气单胞菌进行防治，但药物防治方法直接导致耐药性病原菌的形成，同时造成药物残留、环境污染等诸多环境问题。现有研究已表明，维氏气单胞菌已经表现出了多种耐药性。疫苗是对维氏气单胞菌进行有效防止的途径之一。

[0005] 减毒活疫苗具有保护力强、保护时间长、成本低廉、易于生产等优点。因此，削减维氏气单胞菌的毒力，以构建维氏气单胞菌减毒活性疫苗具有重要意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii)，于2019年7月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019580。

[0007] 一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法，包括：通过基因工程技术手段处理如权利要求1所述的维氏气单胞菌的DNA片段，使得所述维氏气单胞菌中 ExsA基因敲除、敲减或者沉默。

[0008] 如上所述的构建方法，其中ExsA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 如上所述的构建方法，其中ExsA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 如上所述的构建方法，所述维氏气单胞菌属于气单胞菌属的维氏气单胞菌种。

[0011] 如上所述的构建方法，所述基因工程技术手段为同源重组技术。

[0012] 如上所述的构建方法，其中，所述同源重组技术为同源双交换。

[0013] 如上所述的构建方法，其中，所述同源重组技术为T-DNA插入、 CRISPR/Cas9技术、TALEN技术、Red/ET重组技术中任意一者。

[0014] 如上所述的构建方法，所述基因工程技术手段为RNA干扰技术或锌指核酸酶基因打靶技术。

[0015] 一种如上任一所述的构建方法构建的减毒的维氏气单胞菌。

[0016] 如上所述的维氏气单胞菌在制作维氏气单胞菌减毒疫苗方面的应用。

[0017] 本申请的维氏单胞菌突变菌株的毒力大幅下降，达到了良好的减毒效果，为制作维氏气单胞菌减毒活疫苗提供了可能性。附图说明

[0018] 下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：

[0019] 图1是根据本发明的一个实施例的携带敲除质粒pRE112-ΔexsA的大肠杆菌WM3064阳性转化子菌落PCR鉴定；其中，M列表示DL5000的DNA marker，M列左侧表示对应条带所含核苷酸数量；1列表示维氏气单胞菌野生型菌株；2列表示携带敲除质粒pRE112-ΔexsA的大肠杆菌WM3064阳性转化子。

[0020] 图2是根据本发明的一个实施例的维氏气单胞菌exsA基因敲除株菌落 PCR验证；其中，M列表示DL5000的DNA marker，M列左侧表示对应条带所含核苷酸数量；1列及2列表示使用维氏气单胞菌C4特异性引物A.veronii C4-F/A.veronii C4-R进行菌落PCR克隆得到的核苷酸数量；3列及4列表示使用exsA敲除型验证引物exsA-F0/exsA-R0进行菌落PCR克隆得到的核苷酸数量；5列及6列表示使用pRE112质粒特异性引物pRE112-F-(2869)/ pRE112-R-(3448)进行菌落PCR克隆得到的核苷酸数量；其中第1、3、5列使用同一菌落作为菌落PCR模板，第2、4、6列使用同一菌落作为菌落PCR模板。

[0021] 图3是根据本发明的一个实施例的维氏气单胞菌野生型(WT，实心圆点表示)及exsA敲除型(ΔExsA，实心方形表示)生长曲线；以及

[0022] 图4是根据本发明的一个实施例的罗非鱼注射维氏气单胞菌菌株后的累积死亡率统计；其中，图4A是根据本发明的一个实施例的罗非鱼注射维氏气单胞菌野生型菌株后的累积死亡率统计；图4B是根据本发明的一个实施例的罗非鱼注射维氏气单胞菌exsA敲除型菌株后的累计死亡率统计；其中，实心圆点表示阳性对照，为向罗非鱼体内注射水的罗非鱼死亡率统计结果；实心方形表示向罗非鱼体内注射109cfu/ml浓度的exsA敲除型菌株后罗非鱼死亡率统计结果；实心正三角表示向罗非鱼体内注射108cfu/ml浓度的exsA敲除型菌株后罗非鱼死亡率统计结果；实心倒三角表示向罗非鱼体内注射107cfu/ml浓度的 exsA敲除型菌株后罗非鱼死亡率统计结果，图4A与图4B均使用相同的附图标记；以及[0023] 图5是根据本发明的一个实施例的罗非鱼C4-ΔexsA攻毒后的相关酶活性检测；其中，图5A为C4-ΔexsA攻毒一周内碱性磷酸酶(AKP)的活性变化；图5B为C4-ΔexsA攻毒一周内超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化；其中，横坐标0表示未注射C4-ΔexsA时，罗非鱼体内AKP与SOD活性，横坐标2、4、 6分别表示注射C4-ΔexsA 2、4、6天后，罗非鱼体内AKP与SOD活性。

具体实施方式

[0024] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0025] 在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。

[0026] 基因：是指表达功能性分子诸如但不限于特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指如自然界中存在那样具有其自身调控序列的基因。

[0027] ORF：开放阅读框(Open Reading Frame)，从起始密码子开始，是DNA序列中具有编码蛋白质潜能，一段无终止密码子打断的碱基序列。

[0028] 突变基因：是已通过人工干预被改变的基因。这种突变基因的序列与相应的非突变基因的序列的不同之处在于包含至少一个核苷酸添加、缺失或置换。在本发明的某些实施方案中，突变基因包含由如本文所公开的同源交换引起的改变。突变的维氏气单胞菌为包含突变基因的维氏气单胞菌。

[0029] 同源重组，在本申请中是指发生在维氏气单胞菌染色体上，由于ExsA基因两侧含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，使得ExsA基因被敲除、敲减或者沉默。

[0030] 重组DNA：是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

[0031] CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR相关)：是经工程改造的核酸酶系统，为可用于基因组工程改造的细菌系统，是许多细菌和古菌的适应性免疫应答的一部分。

[0032] Cas9：涉及一种CAS蛋白编码的内切核酸酶cas9基因，能够将双链断裂引入DNA靶序列中。其通常与侧翼CRISPR基因座偶联、相关或接近或在侧翼CRISPR基因座的附近。

[0033] 限制性内切酶：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。NcoI 是一种限制性内切酶，特异性识别并切割序列CCATGG。

[0034] 靶位点，靶序列，目标序列：在本文可互换使用，是指在基因组的多核苷酸序列(包括叶绿体和线粒体DNA)中被内切核酸酶基因特异识别的一段序列。例如，CCATGG为限制性内切酶NcoI的靶位点。

[0035] 转化：本申请中，将质粒或者外源基因转移到目标菌株基因组中，称为转化。涵盖可将核酸分子导入这种菌株中的所有技术。

[0036] TALEN：即Transcription Activator-Like(TAL)Effector Nucleases，转录激活因子效应蛋白核酸酶。TALEN是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子——一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计为识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALEN。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。

[0037] RNAi：即RNA干扰技术。双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA 干预(RNA interference,RNAi)双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为 siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，就会导致mRNA失去功能，使该蛋白的表达水平降低，也就是使基因“沉默”了。

[0038] T-DNA：即转移DNA，又名三螺旋DNA，是一种由三股ssDNA旋转螺旋形成的一种特殊脱氧核糖核苷酸结构。T-DNA是能插入宿主细胞染色体的一段DNA，插入的位置通常是随机的。通过把一段T-DNA插入正常的染色体中，构建T-DNA插入突变体。

[0039] Red/ET重组技术：是一种基于λ噬菌体Red操纵子(Redα/Redβ/Redγ)和 Rac噬菌体RecE/RecT系统介导的DNA同源重组技术。

[0040] 锌指核酸酶基因打靶技术：是指由锌指核酸酶(ZFN)驱动的通过向靶基因引入双链断裂后重组而产生的高基因修饰效率的基因组编辑方法锌指核酸酶基因打靶技术[0041] 革兰氏阴性菌泛指革兰氏染色反映呈红色或粉色的细菌。与之相对应的为革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌细胞壁较阳性菌更薄，其细胞壁除包括与阳性菌相同的肽聚糖外，还包括脂多糖、核糖等。现有研究表明，革兰式阴性菌的病原能力通常与其细胞壁的组成相关。

[0042] 三型分泌系统(T3SS)存在于多种革兰氏阴性菌中，是一个由多组分蛋白复合体组成的跨膜通道。其在革兰氏阴性菌组装鞭毛蛋白、分泌胞外蛋白等生理活动中具有重要作用。同时，其又是细菌向宿主细胞分泌毒力因子的重要途径，如革兰氏阴性菌通过其将毒力蛋白运输到真核细胞细胞质中。

[0043] ExsA是革兰氏阴性菌AraC型DNA结合蛋白，属于是AraC型转录激活蛋白，由约100个氨基酸的羧基末端结构域(ExsA-CTD)和约170个氨基酸的氨基末端结构域(ExsA-NTD)组成。其中，ExsA-CTD含有两个与T3SS相关启动子结合所需的螺旋-转角-螺旋结构，能识别并结合T3SS基因启动子区域中的两个相邻的高度保守的共有序列，激活T3SS的表达。同时ExsA-NTD 介导同源二聚化。ExsA又与其他三种AraC型DNA结合蛋白ExsC、ExsD和 ExsE构成伴侣转换模型共同调控T3SS的表达和分泌。ExsA是T3SS基因表达的主激活剂，因此ExsA可能通过影响T3SS而影响细菌的毒力。

[0044] 维氏气单胞菌隶属弧菌科气单胞菌属，是一种革兰氏阴性短杆菌，属于无芽孢兼性厌氧型，具有鞭毛，能运动。维氏气单胞菌内具有三型分泌系统 (T3SS)，其主要毒力因子包括外膜蛋白、气溶素、T3SS相关效应蛋白、鞭毛蛋白等。

[0045] 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是典型的人、鱼共患致病菌，是世界范围内普遍存在于水产养殖中的病原菌。维氏气单胞菌作为一种强毒性病原菌，可以引起尼罗罗非鱼等多种鱼类发病，产生细菌性败血症、器官衰竭等症状，对水产养殖业造成巨大的损失。并且其对人类也有致病性，已有文献报道过该菌可以使人引起菌血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等病症。

[0046] 本申请中涉及的维氏气单胞菌本实验室自行测序获得，并已于2019年7 月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019580。本申请中涉及的维氏气单胞菌(C4)均为此种基因型菌株，根据其野生型基因组序列分析可知，其exsA基因位于基因组DNA序列正义链的2009710-2010525区域，由共计816bp核苷酸组成。

[0047] 在本申请中，利用DNA同源重组原理敲除维氏气单胞菌基因组中的exsA 基因，构建exsA突变体菌株，以进一步检测exsA基因对维氏气单胞菌毒力的影响，以及维氏气单胞菌exsA基因敲除菌株作为减毒疫苗应用的可能性。

[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0050] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0051] 实施例1：利用同源双交换技术构建维氏气单胞菌exsA敲除菌株

[0052] 1.设计引物并扩增同源臂片段

[0053] 在不影响exsA上游基因以及下游基因编码的情况下，本申请选取包含exsA 起始密码子的DNA序列正义链2009697-2010213，共计516bp核苷酸作为敲除片段。针对其上游同源臂及下游同源臂分别设计引物exsA-F1/R1和exsA-F2/R2，并在引物中添加限制性内切酶BstXI酶切位点，在BstXI酶识别位点的中间序列加入载体双酶切所需的限制性内切酶KpnI和SacI的识别序列。其中，上游同源臂DNA序列见SEQ ID NO.4，下游同源臂DNA序列见SEQ ID NO.5。所设计的引物均见表1。

[0054] 提取维氏气单胞菌C4野生型基因组DNA为模板，分别使用引物 exsA-F1/R1和exsA-F2/R2扩增上、下游同源臂。

[0055] 表1维氏气单胞菌exsA敲除菌株的构建所需引物

[0056]引物名称核甘酸序列
exsA-F1 CTGCAGAACCAGGTACCTGGCACACCATTAAGTCTGAGTC
exsA-R1 CTGCAGAACCAGAATTCTGGGAATCTGCGTGTAGTACCAG
exsA-F2 CTGCAGAACCAGAATTCTGGCCAGGTCGAGCGGTTGCAAC
exsA-R2 CTGCAGAACCAGAGCTCTGGCTGTGCCGTGTCGGGCACGG
exsA-F0 CTGCTTGTGACTGTTGTAGG
exsA-R0 GCTATGCCTTGCTCATCTTG
A.veronii C4-F ATGGTCGCAGAGCTTGTC
A.veronii C4-R CAGCACAATAGAACACCAGAC
pRE112-F-(2869) ACATAGCCCCACTGTTCGT
pRE112-R-(3448) TTTTCGTCTCAGCCAATCC

[0057] 2.构建pER112-ΔexsA敲除载体

[0058] 基因片段扩增：通过PCR，并利用上述引物扩增上游同源臂片段(Up-exsA) 和下游同源臂片段(Down-exsA)。

[0059] 基因片段回收：使用PCR产物回收试剂盒分别回收扩增得到的上、下游同源臂片段Up-exsA和Down-exsA。

[0060] 酶切：将回收得到的Up-exsA、Down-exsA以及pRE112质粒分别进行酶切。其中酶切时间及条件可根据所使用的限制性内切酶具有的不同属性而不同。例如，37℃3小时，或者4℃过夜等。酶切完成后进行酶切回收。此处可进行凝胶电泳回收，也可以直接进行回收。无论哪种回收方式，均可使用直接从公司购买的试剂盒完成。

[0061] 连接并转化：利用连接酶分别将上、下游同源臂片段Up-exsA和Down-exsA 与pRE112质粒连接。根据使用的酶，以及连接方式的不同，连接条件也不同。本申请使用T4连接酶在4℃过夜连接。连接完成后，转入大肠杆菌WM3064 感受态细胞中。本申请使用的转化方式为电转。此处并不限制其转化方式。转化后的大肠杆菌涂布于固体培养基(如LB培养基)上，在37℃培养箱中过夜培养。

[0062] 菌落PCR：挑取单菌落，使用引物exsA-F1/R2进行菌落PCR验证，对照维氏气单胞菌中相应的PCR产物，以筛选阳性菌株。验证结果如图1所示。

[0063] 从验证结果可知，大肠杆菌WM3064阳性菌株进行菌落PCR后，可得到大小约为540bp的单一清晰条带(图2)，而且维氏气单胞菌C4野生型菌株中则得到一条大小约为1350的条带，结果符合预期。培养阳性菌株并提取质粒，用exsA-F1/R2引物进行测序，测序结果经比对后与基因组序列一致，证明上、下游同源臂已成功连接到pRE112载体中，将该重组质粒命名为pER112-ΔexsA。

[0064] 3.构建exsA缺失突变菌株

[0065] 以维氏气单胞菌野生型为受体菌，以上述过程中获得的携带有exsA敲除载体pRE112-ΔexsA的大肠杆菌WM3064为供体菌进行接合转移实验，将 pRE112-ΔexsA转移到维氏气单胞菌C4野生型中，再通过蔗糖压力筛选同源双交换菌株。

[0066] 挑取筛选后的单菌落，使用预先设计的敲除验证引物exsA-F0/exsA-R0以及维氏气单胞菌特异性引物A.veronii C4-F/A.veronii C4-R进行菌落PCR验证，得到两株阳性突变株。敲除验证引物扩增得到的条带约为600bp，分子量明显低于野生型菌株中的产物条带(约1100bp)。而特异性引物验证结果显示，所验证菌株均为维氏气单胞菌。随后使用pRE112载体特异性引物 pRE112-F-(2869)/pRE112-R-(3448)对以上两株阳性菌株进行PCR验证，均未得到条带，证明外源pRE112质粒已经自发丢失(如图2所示)。

[0067] 使用敲除验证引物exsA-F0/R0对两株阳性菌株进行PCR扩增，由于产生了非特异性条带，因此对产物进行了切胶回收后送样测序。将测序结果与基因组序列进行比对后证明exsA所选敲除部分的序列已经缺失，其中敲除后的ΔexsA DNA序列见SEQ ID NO.3。

[0068] 上述一系列实验结果表明，通过敲除质粒pRE112-ΔexsA介导的同源重组双交换，已经成功敲除了维氏气单胞菌C4基因组中的exsA基因，将该突变体菌株命名为C4-ΔexsA。

[0069] 实施例2：维氏气单胞菌exsA敲除型菌株毒力检测

[0070] 1.生长曲线测定

[0071] 图3为同等条件下，维氏气单胞菌C4野生型和exsA敲除型的生长曲线。如图所示，C4-ΔexsA与C4野生型相比，菌的生长速度、繁殖能力、对外界营养的感受与吸收等均无明显差别。表明exsA基因对维氏气单胞菌的生长不具有明显影响。

[0072] 2.C4-ΔexsA对罗非鱼半致死浓度(LD50)检测

[0073] 对罗非鱼进行攻毒实验。本申请实验使用对罗非鱼进行腹腔注射的方法攻毒。将罗非鱼分成实验组与对照组，每组至少80条。其中对实验组罗非鱼注射维氏气单胞菌C4-ΔexsA，而对对照组罗非鱼注射等量的维氏气单胞菌C4野生型。

[0074] 首先，配置注射用菌液。将所需菌体(包括维氏气单胞菌C4野生型和 C4-ΔexsA突变体)加入灭菌的0.9％生理盐水或者PBS缓冲液中，配置浓度分别为107CFU/mL、108CFU/mL和109CFU/mL的野生型和突变体注射菌液。根据本申请的一个实施例，菌体的量由菌体悬浊液的OD600值换算得到。例如，维氏气单胞菌的悬浊液的OD600约为0.8-1时，其1ml悬浊液所含菌体浓度约为2×108CFU。取所需量悬浊液并离心，即可得到所需量的菌体。

[0075] 然后，分别称量2组的罗非鱼总质量，并计算平均体重，按照10μL/g体重的注射量对罗非鱼进行腹腔注射攻毒(例：若罗非鱼平均体重为10g，则每条鱼注射100μL菌液)。

[0076] 攻毒所用的罗非鱼体重为10g±1g，每个菌种设置3个浓度梯度，每个梯度20条鱼，连续观察7天，记录累积死亡率。使用改良寇氏法公式 LD50＝10Xk-i(∑p-0.5)计算菌株的半致死浓度(LD50)。其中Xk为最大剂量的对数值，p为每个浓度梯度的累积死亡率，i为相邻两组剂量对数值的差。

[0077] 经过改良寇氏法计算可得，维氏气单胞菌C4野生型的半致死浓度(LD50) 为1.41×107cfu/mL(如图4A所示)，维氏气单胞菌exsA敲除型的半致死浓度 (LD50)为3.98×108cfu/mL(如图4B)，与野生型相比毒力下降了28.23倍。

[0078] 3.攻毒后罗非鱼相关酶活检测

[0079] 从上述实验结果可以得出，维氏气单胞菌exsA敲除型菌株对罗非鱼腹腔注射攻毒实验验证表明已经发生了毒力的减弱，达到了预期效果。但是动物疫苗如果想应用于生产开发，就必须确定一个应用浓度，使得该疫苗在对动物完全不造成死亡的情况下，又能刺激机体免疫活动的产生。根据实验前查阅的文献资料得知，碱性磷酸酶(AKP)可以通过发生酶促反应在革兰氏阴性菌毒力因子之一LPS中去除关键的磷酸基团来进行解毒反应，并且经常有文献将AKP 作为鱼类攻毒实验后检测的重要免疫指标之一。超氧化物歧化酶(SOD)则2- +
可以通过以下反应：2O2 +2H →H2O2+O2将细胞生命活动以及细菌侵染等过程中产生的有害物质超氧阴离子自由基2O22-转化为过氧化氢和氧气，而过氧化氢则会继续被体内的过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)类分解为对机体完全无害的水。因此SOD在机体初步对抗细菌侵染造成的氧化损伤中具有重要作用，也有诸多文献报道SOD已成为鱼类攻毒实验后检测的重要免疫指标。因此本申请选择了碱性磷酸酶(AKP)以及超氧化物歧化酶(SOD)进行攻毒后检测。

[0080] 为了进一步验证维氏气单胞菌exsA敲除型作为减毒活疫苗的可能性，找到可以应用于后续实际生产的菌株浓度，本申请计划验证在使用C4-ΔexsA完全不至死罗非鱼的浓度攻击罗非鱼后，能否在罗非鱼体内产生免疫。于是选择维氏气单胞菌exsA敲除型半致死浓度(LD50)的1/5、1/25以及1/125对罗非鱼进行腹腔注射攻毒实验。

[0081] 攻毒所用的罗非鱼体重为10g±1g，每个浓度梯度40条鱼。经过注射后观察发现，攻毒浓度为LD50的1/5和1/25的两组罗非鱼在两天内均发生了死亡，只有注射浓度为LD50的1/125的一组没有发生任何死亡。因此选取攻毒0d以及1/125LD50浓度攻毒后2d、4d和6d的罗非鱼进行解剖并取得内脏，按照超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒以及组织及血液碱性磷酸酶(AKP/ALP) 活性检测试剂盒的说明书进行SOD及AKP活性检测。

[0082] 检测结果发现，AKP活性在攻毒4天后达到最大值，约为未攻毒时活性的 7-8倍，但在第6天有所下降，其活性基本与未攻毒时活性相同。SOD活性则在攻毒后第2天达到最大值，约为未攻毒时活性的2-3倍。后逐渐减少，到攻毒后第6天后，其活性基本与未攻毒时活性相同。

[0083] 上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

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弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法及用途	2020-05-08	553
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一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用

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