基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法
阅读：1020发布：2020-07-22
专利汇可以提供基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于焦 磷酸 测序的检测甲型H1N1流感病毒致病 力 的方法，包括对H1N1病毒血凝素基因进行RT-PCR扩增；对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。通过将检验结果与甲型H1N1流感病毒标准株的HA基因裂解位点序列比较，可高度准确的检测出甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位点的突变。本 发明 对于确定病毒 毒力 、致病性及宿主范围提供了简单、快捷的实验方案,避开了全基因测序所涉及的繁琐实验步骤，还能准确掌握病毒的变异方向,方便对其进行监测，隔离传染源切断传播途径，阻止疫情的进一步扩大。，下面是基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法专利的具体信息内容。
基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，具体涉及一种基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，属于病毒检测技术领域。
背景技术
[0002] 2009年3月爆发的甲型H1N1流感是继SARS、高致病性禽流感后又一次重大公共卫生事件,给世界各国人民造成了巨大恐慌。甲型流感病毒是单股负链分节段的RNA病毒，易发生抗原漂移、抗原转换和基因重组，尤其是病毒的外膜蛋白血凝素(HA)的突变和重组，可形成各种突变株或重组株，导致病毒的毒力及宿主范围的变化，从而引起不同程度的流感流行。血凝素（HA)能否被切割成HA1和HA2是决定流感病毒致病性的重要因素，裂解位点的变异可引起病毒致病性的变化，分析裂解位点的序列,研究其进化规律可以让我们更深入地了解H1N1的致病性、毒力大小、宿主范围.
[0003] 裂解位点处的氨基酸序列是决定流感病毒致病力的因素之一。一般高致病性流感病毒在裂解位点附近都有连续4个以上碱性氨基酸(RRRR)，而低致病性流感病毒的HA裂解位点处一般就只有单个的碱性氨基酸(R)。高致病性流感病毒的HA裂解位点处多个连续的碱性氨基酸,可以被多种蛋白酶所裂解,因而病毒可以在宿主不同组织细胞中生长繁殖,导致宿主的全身感染、衰竭并导致死亡。而低致病性流感病毒的HA蛋白裂解位点只能被呼吸道等少数组织细胞中的蛋白酶所裂解,因而只能在宿主的呼吸道中繁殖,导致温和感染。HA蛋白的裂解位点的序列特征对病毒的宿主范围、组织嗜性和致病性有着关键性影响,是病毒在机体中传播的必要条件]。低致病性流感病毒有可能通过HA1区和HA2区之间的连接肽中的多种碱性氨基酸的基因突变增强毒力,变成高致病性的病毒株，因此，HA的裂解位点序列分析和监测是非常重要
[0004] 为了加强对H1N1快速传播的控制及避免其爆发流行，发展快速、可靠高通量的检测病毒突变技术是研究的热点，传统的基于Sanger法的全自动DNA测序技术，在检测病毒基因突变存在费时、费力的缺点。焦磷酸测序技术为新一代短片段DNA序列分析技术，可以快速、准确、实时地进行短DNA序列分析，检测通量高，操作简单方便，可程序化，利用焦磷酸测序技术对甲型H1N1流感HA基因的裂解位点进行检测的研究未见报道。
发明内容
[0005] 本发明目的是提供一种基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，其使用焦磷酸测序方法检测甲型H1N1流感病毒血凝素（HA)裂解位点的序列方法，判断血凝素(HA)的裂解位点是否发生突变，导致病毒的毒力的变化，从而引起不同程度的流感流行。
[0006] 由于血凝素（HA)能否被切割成HA1和HA2是决定流感病毒致病性的重要因素，裂解位点的变异可引起病毒致病性的变化，因此本发明的技术构思是针对甲型H1N1流感病毒裂解位点进行焦磷酸测序检测。本发明的检测型H1N1流感病毒致病力变化的方法，首先采用RT-PCR扩增H1N1病毒血凝素(HA)基因中片段（包含裂解位点序列），随后以焦磷酸测序法对扩增片段进行准确测序，从而建立了一种快速、有效的裂解位点突变检测方法。对于确定病毒毒力、致病性及宿主范围提供了简单、快捷的实验方案，避开了全基因测序所涉及的繁琐实验步骤，还能准确掌握病毒的变异方向,方便对其进行监测，隔离传染源切断传播途径，阻止疫情的进一步扩大。
[0007] 本发明的主要原理为:
[0008] 焦磷酸测序技术
[0010] 2)焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，基本原理如下：将1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出摩尔数的焦磷酸基团。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。加入另一种dNTP，使第2～4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
[0011] 3)焦磷酸测序操作系统中共有2个模式能进行碱基突变的检测，即序列分析模式（Sequence Analysis，SQA）和单核苷酸多态性模式（Single Nucleotide polymorphism，SNP）。其中SQA模式的核苷酸加样顺序为循环顺序加样法，即通过循环反复的加入A、G、C、T四种核苷酸以检测出待检样品的序列，该法一次能准确判读40bp左右的碱基，将所测定序列与已知序列比对后自行判读突变情况。SNP模式的核苷酸加样顺序为特定顺序加样法，即系统根据设定的待检位点及位点周围的序列自动生成核苷酸的加样顺序，仅对单个位点的碱基变化进行检测，不对整个序列进行测定。针对不同的检测对象，需要摸索不同的焦磷酸测序检测方法。
[0012] 本发明的基于焦磷酸测序的检测甲型H1N1流感病毒致病力的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0013] 步骤1，对H1N1病毒血凝素(HA)基因进行RT-PCR扩增；
[0014] 步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。
[0015] 上述步骤1中，对H1N1病毒血凝素(HA)基因进行两次PCR扩增，其中第一次RT-PCR扩增以标本甲型H1N1流感病毒RNA提取物为模板，第二次扩增以第一次RT-PCR扩增产物为模板。
[0016] 上述第一次扩增使用的PCR引物具有H1F和H1R所示序列，引物扩增片段长度950bp，且包含裂解位点序列，
[0017] 第一PCR引物序列如下：H1F:ACGTGTTACCCAGGAGATTTC ,H1R:TCTTTACCYACTRCTGTGAA
[0018] 针对甲型H1N1流感HA基因的裂解位点设计焦磷酸测序引物；
[0019] 上述第二次扩增使用的PCR引物具有带有生物素标记，此引物在甲型H1N1流感病毒血凝素（HA)基因序列是高度保守和唯一的；所用的第二次扩增使用的PCR引物序列和测序引物序列详见表1
[0020] 表1.HA基因裂解位点测序引物和二次扩增使用PCR引物
[0021]
[0022] 上述第一次扩增使用的PCR引物和第二次扩增使用的PCR引物的浓度为50nml/L。
[0023] 上述步骤1中RT-PCR扩增反应过程包括下列步骤：
[0024] 以标本甲型H1N1流感病毒RNA提取物为模板，采用一步法进行RT-PCR扩增，扩增950bp甲型H1N1流感病毒的HA1基因片段，RT-PCR反应条件为:50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃15s，55℃30s，68℃1min，45个循环;68℃5min。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定检测扩增结果。
[0025] 通过将检验结果与甲型H1N1流感病毒标准株的HA基因裂解位点序列相比较，可高度准确的检测出甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位点的突变，在临床研究中可以方便将其应用在检测之中。
[0026] 甲型H1N1流感病毒标准株的HA1基因裂解位点标准株序列见表2
[0027] 表2.甲型H1N1流感病毒标准株裂解位点氨基酸及基因的组成和位置[0028]
[0029] 2.对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT，具体如下：
[0030] （1）将第二轮PCR扩增产物固定在磁珠上，
[0031] （2）将磁珠吸附在真空样品转移器上，再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5～10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA，[0032] （3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入序列测序引物，测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L，再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交；
[0033] 测序引物的序列：5-GTTACTTTGGC CGTT-3
[0034] （4）焦磷酸测序：利用测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息，
[0035] （5）将焦磷酸测序检验结果与甲型H1N1流感病毒标准株的HA1基因裂解位点序列相比较，进而判断甲型H1N1流感HA基因的裂解位点是否具有突变。
[0036] 利用焦磷酸测序技术进行甲型H1N1流感病毒的HA1基因裂解位点检测较其他分子检测方法具有独特的优势，对于确定病毒毒力、致病性及宿主范围提供了简单、快捷的实验方案,避开了全基因测序所涉及的繁琐实验步骤，还能准确掌握病毒的变异方向,方便对其进行监测，隔离传染源切断传播途径，阻止疫情的进一步扩大。附图说明
[0037] 图1是本发明对甲型H1N1流感病毒的HA基因片段RT-PCR扩增检测结果。
[0038] 其中，M泳道：DNA标志物，其他泳道：HA基因片段RT-PCR产物
[0039] 图2是用SQA模式测序甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位点焦磷酸结果。
具体实施方式
[0040] 以下通过实施例对本发明内容作进一步的详细说明。
[0041] 1、RNA提取
[0042] 用新鲜繁殖病毒感染的MDCK传代细胞作为RNA提取的模板，采用Roche公司生产的HighPure Viral RNA Kit提取病毒RNA，具体操作按试剂盒说明书进行，提取的RNA立即用于RT-PCR扩增或置-80℃保存。
[0043] 2、RT-PCR反应扩增HA1基因片段
[0044] 用具有H1F所示序列的PCR引物和具有和H1R所示序列的PCR引物进行第一轮扩增，以提取的病毒RNA为模板。在50μL反应体系中，第一引物最佳的浓度为50nmol/L。RT-PCR反应条件为:50℃反转录30min;94℃预变性2min;94℃15s,55℃30s,68℃1min,45个循环;68℃5min。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定检测扩增结果。
[0045] 3、用带有生物素（Biotin）标记的Reverse PCR引物和Forward PCR引物进行第二轮扩增，模板为第一轮扩增的PCR产物。在50μL反应体系中，第二引物最佳的浓度为50nmol/L。PCR反应过程如下：
[0046] 先在94℃下进行预热10分钟；在94℃下保持45秒进行变性、64℃下保持45秒进行退火、72℃下保持90秒进行扩增和延伸，循环退火过程30次；最后在72℃下保持10分钟。
[0047] 取2μL的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在12V/cm电位梯度下电泳20分钟，后在紫外灯下检查扩增效果。图1是对甲型H1N1流感病毒的HA1基因片段RT-PCR产物电泳图，其中M为标准带，1～8为甲型H1N1流感病毒的HA基因片段RT-PCR产物。图中可以看到存在一条单一信号较强的条带，并且没有剩余的引物，也没有引物二聚体或其他非特异的条带存在。
[0048] 具有H1F所示序列的第一引物和Forward引物所示序列的PCR第二引物为两条正向引物。具有H1R所示序列的PCR第一引物和具有Reverse引物所示序列的PCR第二引物为两条反向引物，带有生物素标记的引物在检测中起到标记作用。
[0049] 焦磷酸测序
[0050] 1.检测试剂配制
[0051] 结合缓冲液：将10mmol/L Tris-HCl、2mol/L NaCl、1mmol/L EDTA和0.1%Tween20去离子水溶解，用1mol/L HCl调pH至7.6。
[0052] 变性缓冲液（denatureation buffer）：0.5mol/L NaOH。
[0053] 退火缓冲液：将20mmol/L Tris-Acetate、2mmol/L MgAc2溶液混合，用4mol/L乙酸调pH至7.6。
[0054] 洗涤缓冲液（washing buffer）：用4mol/L乙酸将10mmol/L Tris-Acetate溶液调pH至7.6。70%乙醇：在70mL无水乙醇中加入高纯水20mL，充分混匀后定容至100mL。
[0055] 2.检测仪器及配套试剂
[0056] （1）德国QIAGEN公司的PyroMark Q96ID全自动焦磷酸测序仪、单链制备工具台（Vacuumprepworkstation）、真空样品转移器（Vacuum prep tool）、真空泵、涡旋振荡器、PCR仪。
[0057] （2）德国QIAGEN公司生产的焦磷酸微测序试剂盒（PSQ96MA SQA Upgrade Kit）和美国GE Healthcare公司生产的链亲和素包被的磁珠（Streptavidin Sepharose High Performance,Cat.No.17-5113-01）。
[0058] 3.焦磷酸测序检测步骤
[0059] （1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的具有PCR扩增产物，再分别加入37μL的结合缓冲液和3μL链亲和素包被的磁珠。将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上。
[0060] （2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上。再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5～10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA。
[0061] （3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物。测序引物的浓度为20nmol/L。再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交。
[0062] 测序引物的序列：5-GTTACTTTGGC CGTT-3
[0063] 焦磷酸测序：利用由德国QIAGEN公司的PyroMark Q96ID测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应。通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
[0064] 图2是采用SQA模式甲型H1N1流感病毒的HA基因裂解位点焦磷酸测序结果，检测得出的序列为aggaatgttcc gtct attcaatctagaggc ctatttggg。将其与甲型H1N1流感病毒标准株的HA基因裂解位点序列相比，可得出裂解位点基因序列是否突变。
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