产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法
专利汇可以提供产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法，属于工业 微 生物 技术。所述的产核黄素的工程菌株为Bacillus subtilis F4-RH33，其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮 鸟 嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。上述工程菌株生产核黄素的过程包括：将在细菌完全培养基预培养的F4-RH33接种于 种子 培养基中，将培养好的种子液接种于含有初始 发酵 培养基的发醇罐中，在适当的通气速率、搅拌转速、 温度 、和pH值条件下进行培养，并在培养过程以适当的速度加入流加培养基，发酵进行40～60小时后结束，核黄素的终浓度为10～12g/L。本发明的优点在发酵工艺简单，原料廉价且便于生产过程中的控制。，下面是产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法专利的具体信息内容。
1.一种产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，所述的产核黄素的工程菌株，菌 名称为Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物 中心”，保藏编号CGMCC1579，保藏时间：2005年12月26日，该菌株抗150mg/L玫瑰黄 素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉 素，以该菌株生产核黄素，其特征在于包括以下过程：将在细菌完全培养基平板上37℃ 培养24小时的F4-RH33接种于含5μg/mL卡那霉素的种子培养基中，在37℃、240转/ 分钟振荡通气培养8～14小时，将培养好的种子液按体积比3～7％的接种量，接种于含 2.0～2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，在通气速率0.6～1.5vvm，搅拌转速600～ 1200r/min，培养温度36～43℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和2mol/L NaOH，或体积比15％的氨水控制pH值在6.2～7.4之间；调节罐压0.02～0.05MPa，使 发酵过程中的溶氧维持在10％以上，当培养液中的残糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入 流加培养基，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在2～10g/L，发酵进行40～60小时后 结束，核黄素的终浓度为10～12g/L；所述使用的细菌完全培养基的组分及其含量为： 10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/L NaCl，pH 7.0；所述使用的种子培养基的组分及 其含量为：20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，5g/L玉米浆，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.005g/L卡那霉素，pH 7.2；所述使用的 初始发酵培养基的组分及其含量为：15～20g/L的碳源，2～10g/L的有机氮源，5～ 10g/L的无机氮源，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，0.5～1.0g/L KH2PO4，0.5～1.0g/L K2HPO4， 10～30mg/L FeCl2，10～40mg/L MnSO4；所述使用的流加培养基的组分及其含量为：500～ 650g/L的碳源，2～15g/L的有机氮源，5～20g/L的无机氮源，0.5～2.0g/L MgSO4·7H2O，1～8g/L KH2PO4，1～5g/L K2HPO4。
2.按权利要求1所述的产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，其特征在于；碳源 是葡萄糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、蔗糖、果糖、麦芽糖、糊精、淀粉或甘油；有机氮源是 脲、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、酵母抽提物、玉米浆、酸水解酪素、豆粉、豆饼水解液、 牛肉膏或鱼粉；无机氮源是氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾或硝酸钠。
技术领域
本发明涉及一种产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法，属于工业微生物技术。
背景技术
核黄素可以通过以葡萄糖为起始原料的全化学法合成，以D-核糖作为主要原料的化 学半合成法，以及微生物发酵法生产，其中微生物发酵法生产核黄素至今已有约60年的 历史。发酵法具有生产工艺简单、原料廉价并可再生、对环境污染小等优点。真菌和细菌 均可用于生产核黄素，主要生产菌种有棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、解朊假丝酵母 (Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomyces sp.)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等。Stepanov 等(法国专利2546907)用基因工程方法构建了产核黄素工程菌B.subtilis 304/pMX45，采 用流加工艺发酵48小时产核黄素可达4.5g/L。Perkins等(美国专利5925538)构建的工 程菌B.subtilis RB50::[pRF69]60在限制流加葡萄糖的条件下发酵48小时后可产核黄素 13-14g/L，56小时后达15g/L。但仍然需要对发酵培养基进行优化、用廉价的原料发酵来 降低成产成本，并简化工艺控制过程。
发明内容
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种产核黄素的工程菌株，该菌名称为 Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”， 保藏编号CGMCC1579，保藏时间：2005年12月26日。其特征在于，该菌株可抗150mg/L 玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L 6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L 卡那霉素。
以上述的产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，其特征在于包括以下过程：
将在细菌完全培养基(LB)平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于含5μg/mL 卡那霉素的种子培养基中，在37℃、240转/分钟振荡通气培养8～14小时，将培养好的种 子液按3～7％(V/V)的接种量，接种于含2.0～2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，在通 气速率0.6～1.5vvm，搅拌转速600～1200r/min，培养温度36～43℃的条件下进行培养， 发酵过程中用1mol/LH2SO4和2mol/LNaOH或15％(V/V)氨水将pH值控制在6.2～7.4。 发酵过程中的溶氧维持在10％以上，调节罐压0.02～0.05MPa。当培养液中的残糖低于10g/L 时开始向发酵罐中加入流加培养基，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在2～10g/L，发 酵进行40～60小时后结束，核黄素的终浓度为10～12g/L。
所述使用的细菌完全培养基(LB)的组分及其含量为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提 物，5g/L NaCl，pH 7.0；所述使用的种子培养基的组分及其含量为：20g/L葡萄糖，4g/L 酵母提取物，5g/L玉米浆，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.005g/L卡那霉素，pH 7.2；所述使用的初始发酵培养基的组分及其含量为：15～ 20g/L的碳源，2～10g/L的有机氮源，5～10g/L的无机氮源，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O， 0.5～1.0g/L KH2PO4，0.5～1.0g/L K2HPO4，10～30mg/L FeCl2，10～40mg/L MnSO4；所述 使用的流加培养基的组分及其含量为：500～650g/L的碳源，2～15g/L的有机氮源，5～ 20g/L的无机氮源，0.5～2.0g/L MgSO4·7H2O，1～8g/L KH2PO4，1～5g/L K2HPO4。
上述的碳源是葡萄糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、蔗糖、果糖、麦芽糖、糊精、淀粉或甘 油；有机氮源是脲、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、酵母抽提物、玉米浆、酸水解酪素、豆 粉、豆饼水解液、牛肉膏或鱼粉；无机氮源是氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾或 硝酸钠。
本发明的优点在于该培养方法可以用工业葡萄糖替代季节性较强的、运输和储存不便 的糖蜜为碳源进行核黄素生产，该培养方法可用廉价的无机氮源来减少较为昂贵的酵母抽 提物等有机氮源的用量，可以进一步降低生产成本。本发明中的发酵工艺简单，便于生产 过程中的控制。
具体实施方式
实施例1
将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的 1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液 按5％(V/V)的接种量，接种于含2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养 基为15g/L葡萄糖，2g/L酵母抽提物，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4， 1g/L K2HPO4，20mg/L FeCl2，30mg/L MnSO4，通气速率1.0vvm，，搅拌转速800r/min，41 ℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发酵 过程中的溶氧维持在15％以上，罐压为0.02MPa。当培养液中的残糖低于10g/L时开始向 发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为650g/L葡萄糖，2g/L酵母抽提物，15g/L NaNO3， 0.5g/L MgSO4，5g/L K2HPO4，5g/L KH2PO4，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在5g/L 以下，发酵进行48小时后结束。整个发酵过程大约补充2.0L流加培养基，发酵液中核黄 素的终浓度可达12g/L以上。
实施例2
将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的 1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养8小时，将培养好的种子液 按7％(V/V)的接种量，接种于含2.2L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养 基为15g/L葡萄糖，10g/L酵母抽提物，5g/L NaNO3，0.8g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4， 0.5g/L K2HPO4，20mg/L FeCl2，20mg/L MnSO4，通气速率1.2vvm，搅拌转速1000r/min， 41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/LH2SO4和15％氨水将pH值控制在6.5。发 酵过程中的溶氧维持在10％以上，罐压为0.02MPa。当培养液中的残糖低于1％时开始向 发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为600g/L葡萄糖，15g/L酵母抽提物，5g/L NaNO3， 1g/L MgSO4，5g/L KH2PO4，5g/L K2HPO4，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在10g/L 以下，发酵进行40小时后结束。整个发酵过程大约补充2.2L流加培养基，发酵液中核黄 素的终浓度可达11g/L。
实施例3
将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的 1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液 按5％的接种量，接种于含2.0L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L 蔗糖，10g/L酵母粉，5g/L NaNO3，0.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L KH2PO4，20mg/L FeCl2，20mg/L MnSO4，通气速率1.0vvm，，搅拌转速1000r/min，41℃的条件下进行培养， 发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发酵过程中的溶氧维持在10 ％以上，罐压为0.03MPa。当培养液中的葡萄糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加 培养基，流加培养基为500g/L蔗糖，25g/L酵母粉，5g/L NaNO3，3g/L MgSO4，2g/L KH2PO4， 3g/L KH2PO4，控制流加速度使发酵罐中葡萄糖浓度维持在10g/L以下，发酵进行56小时 后结束。整个发酵过程大约补充2.3L流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达10g/L。
实施例4
将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种子装有150mL种子培养基的 1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液 按7％的接种量，接种于含2.0L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L 糖蜜(按糖含量计)，2g/L酵母抽提物，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4， 1g/L K2HPO4，10mg/L FeCl2，10mg/L MnSO4，，通气速率1.2vvm，搅拌转速1000r/min， 41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发 酵过程中的溶氧维持在10％以上，罐压为0.04MPa。当培养液中的葡萄糖浓度低于10g/L 时开始向发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为450g/L糖蜜(按糖含量计)，2g/L酵母 抽提物，15g/L NaNO3，1g/L MgSO4，8g/L K2HPO4，5g/L KH2PO4，控制流加速度使发 酵罐中糖浓度维持在6g/L以下，发酵进行42小时后结束。整个发酵过程大约补充2.5L 流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达12g/L。
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