一种淡水真菌的抑菌新用途
阅读：1024发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种淡水真菌的抑菌新用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 淡 水 真菌 的抑菌新用途，即 淡水 真菌Helicosporiumsp.的次生代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用，该真菌的分离代谢产物对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、志贺菌和沙 门 氏菌均具有良好的抑菌效果。，下面是一种淡水真菌的抑菌新用途专利的具体信息内容。
1.淡水真菌（Helicosporiumsp.）的次生代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：淡水真菌的次生代谢产物是将淡水真菌接种到PDB液态培养基中进行液体发酵，发酵结束后，在发酵液中加入乙酸乙酯进行萃取，静置后滤除菌体，收集乙酸乙酯萃取液，过滤，浓缩干燥后制得。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：食源性病原细菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌（Shigella Castellani）或沙门氏菌（Salmonella sp.）。
一种淡水真菌的抑菌新用途
技术领域
背景技术
[0002] 淡水真菌在人类生产生活的多个方面都发挥着重要作用。淡水真菌在生态系统中扮演着重要角色。它们能分解有机物引起营养物质和碳源释放，这样既可以清洁水环境，又可以帮助原生动物利用营养物质，还可以促进碳循环；有些淡水真菌还能够产生多种多样的胞外蛋白酶，如淀粉酶、木聚糖内切酶、果胶酶、多酚氧化酶、蛋白酶等，其中很多酶都是分解植物结构所需的材料；除此之外，有些淡水真菌的代谢产物还具有一定的抑菌效果。据统计，淡水真菌一共有超过3000种被鉴定分离。但是仅发现了87株被鉴定于淡水真菌的属中或从淡水中分离出来的种有关于抑菌活性研究记录的报道，并且其中的82株菌在抑制真菌或者细菌方面有活性。
[0003] 从淡水真菌的代谢产物中获得具有抑制食源性病原细菌的物质，比从植物中提取或人工合成具有周期短、成本低等优良特性。合理开发利用淡水真菌资源，有利于资源的合理利用。
发明内容
[0004] 本发明目的是提供淡水真菌Helicosporiumsp.的代谢产物的新用途，即其次生代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：（1）将淡水真菌Helicosporium sp.培养在PDA培养基上，放在恒温箱中进行倒置扩大培养；
（2）待步骤（1）扩大培养的淡水真菌长出较大面积菌落时，用打孔器将淡水真菌打成菌饼；
（3）配制PDB液态培养基，将步骤（2）得到的菌饼接种到PDB液态培养基中，将接种过菌饼的液态培养基进行发酵；
（4）发酵结束后，在发酵液中加入液态培养基等体积的乙酸乙酯，进行超声提取，静置后滤除菌体，收集乙酸乙酯萃取层，过滤浓缩，得到淡水真菌的次生代谢产物。
（2）待步骤（1）扩大培养的淡水真菌长出较大面积菌落时，用打孔器将淡水真菌打成菌饼；
（3）配制PDB液态培养基，将步骤（2）得到的菌饼接种到PDB液态培养基中，将接种过菌饼的液态培养基进行发酵；
（4）发酵结束后，在发酵液中加入液态培养基等体积的乙酸乙酯，进行超声提取，静置后滤除菌体，收集乙酸乙酯萃取层，过滤浓缩，得到淡水真菌的次生代谢产物。
[0006] 本发明所述的应用，是以该次生代谢产物作为活性物质制成药物或其他便于利用的产品形式，还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
[0007] 本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
[0009] 本发明所述淡水真菌（Helicosporium sp.）是从泰国巴蜀府的小河中的竹段上分离获得的，其分离鉴定内容已经在文献“Goos RD. On the Anamorph Genera Helicosporium and Drepanospora[J]. Mycologia, 1989, 81(3):356-374.”中公开过。
[0010] 所述食源性病原细菌均购于上海鲁微科技有限公司，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌种编号ATCC25923、李斯特菌（Listeria monocytogenes）菌种编号ATCC19115、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种编号ATCC6633、大肠杆菌（Escherichia coli）菌种编号ATCC25922、志贺菌（Shigella Castellani）菌种编号CMCC51105，沙门氏菌（Salmonella sp.）菌种编号CMCC50093。
[0011] 本发明的优点和技术效果：本发明为食源性病原细菌的预防和抑制提供了一种新的方法，本发明淡水真菌Helicosporium sp.的次生代谢产物对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、志贺菌和沙门氏菌有良好的抑菌效果，次生代谢产物制备简单、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
附图说明
[0012] 图1 为本发明淡水真菌代谢产物对六种食源性病原细菌的抑菌实验结果，其中a为大肠杆菌，b为金黄色葡萄球菌，c为枯草芽孢杆菌，d为李斯特菌，e为沙门氏菌，f为志贺菌，g为DMSO空白对照。
具体实施方式
[0014] 实施例1：淡水真菌Helicosporiumsp.的次生代谢产物的制备（1）固态培养基的制备：称取PDA培养基加入蒸馏水溶解后，在高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20min，将灭菌后的培养基均匀的倒在培养皿中；
（2）淡水真菌扩大培养：步骤（1）的培养皿中的PDA培养基完全凝固后，将淡水真菌Helicosporium sp.菌丝接种到培养基上，用封口膜封口，倒置放在恒温培养箱中，在27℃下进行培养；
（3）液态培养基的配制：称取PDB培养基，放在250mL锥形瓶中，加入蒸馏水溶解后，在高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20min，制得PDB液体培养基；
（4）淡水真菌的液态发酵：将步骤（2）培养好的淡水真菌Helicosporiumsp.，用打孔器在PDA培养基上打成直径6mm的菌饼，并接入步骤（3）配制的液体培养基中，在恒温摇床上以
27℃、160 r/min的条件进行培养；
（5）淡水真菌代谢产物的制备：在步骤（4）液态发酵得到的发酵液中加入液态培养基等体积的乙酸乙酯，超声提取30min，提取后静置1天，用滤网过滤菌体，用分液漏斗分液，取上层乙酸乙酯层，得到萃取液；
（6）淡水真菌发酵萃取液的浓缩：将步骤（5）乙酸乙酯萃取液用滤纸过滤后，在旋转蒸发仪上以38℃、80 r/min 条件进行蒸发，得到淡水真菌的代谢产物。
（2）淡水真菌扩大培养：步骤（1）的培养皿中的PDA培养基完全凝固后，将淡水真菌Helicosporium sp.菌丝接种到培养基上，用封口膜封口，倒置放在恒温培养箱中，在27℃下进行培养；
（3）液态培养基的配制：称取PDB培养基，放在250mL锥形瓶中，加入蒸馏水溶解后，在高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20min，制得PDB液体培养基；
（4）淡水真菌的液态发酵：将步骤（2）培养好的淡水真菌Helicosporiumsp.，用打孔器在PDA培养基上打成直径6mm的菌饼，并接入步骤（3）配制的液体培养基中，在恒温摇床上以
27℃、160 r/min的条件进行培养；
（5）淡水真菌代谢产物的制备：在步骤（4）液态发酵得到的发酵液中加入液态培养基等体积的乙酸乙酯，超声提取30min，提取后静置1天，用滤网过滤菌体，用分液漏斗分液，取上层乙酸乙酯层，得到萃取液；
（6）淡水真菌发酵萃取液的浓缩：将步骤（5）乙酸乙酯萃取液用滤纸过滤后，在旋转蒸发仪上以38℃、80 r/min 条件进行蒸发，得到淡水真菌的代谢产物。
[0015] 实施例2：淡水真菌的次生代谢产物对食源性病原细菌的抑制实验（1）细菌液体培养基的制备：称取LB肉汤培养基，加入蒸馏水溶解后，在高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20 min，冷却后待用；
（2）病原菌的活化：将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌（Shigella Castellani）或沙门氏菌（Salmonella sp.）接种于LB琼脂培养基上，37℃培养24h后，挑取单个菌落，接种于含5mL的LB液体培养基的15mL离心管中，置于37℃、160r/min恒温培养过夜；
（3）病原细菌悬液的标准曲线：取活化的病原菌液4mL置于10000r/min，4℃下离心
1min，取沉淀加生理盐水混匀，再以4℃、10000 r/min来离心1min，吸弃上清液，重复两次后用5mL生理盐水重悬得到菌悬液，漩涡震荡混合均匀，用生理盐水进行梯度稀释，在波长600 nm下测定稀释后的菌液吸光度，取吸光度值在0.2–0.6之间的7个不同浓度的菌液，每份菌液都取100μL加到LB固体培养基上，涂布均匀，在37℃恒温箱中倒置培养24h，对菌落数在
30–300之间的平板进行菌落计数；根据菌落数及吸光度值，绘制标准曲线，得到计算公式：
革兰氏阳性菌（金葡为例）菌落：y = 613.68x-10.921；
革兰氏阴性菌（大肠为例）菌落：y = 142.4x+110.1；
（4）细菌悬液的制备：根据病原细菌悬液的标准曲线，将病原细菌的浓度用生理盐水调整为0.8–2×105 cfu/mL；
（5）发酵提取物抑菌试验：称取10 mg干燥的实施例1淡水真菌代谢产物，加入1mL DMSO进行溶解，配制成10mg/mL的浓度的样品；在LB琼脂的平板上，加入80μL的病原细菌菌液，涂匀；每个平板放置3个牛津杯，并在每个牛津杯中加入10μL的样品；水平放置，37℃培养18–
24h，观察，抑菌圈直径用游标卡尺来进行测量，每种致病菌测量三组数据取平均值，实验结果见图1和表1；
表1 代谢产物对六种食源性病原细菌抑菌圈直径（单位：mm）
菌种 空白 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 志贺菌 沙门氏菌 李斯特菌 枯草芽孢杆菌平均值 8 13.03 9.86 13.02 12.79 10.08 12.04
平均偏差 0.31 0.59 0.43 0.60 0.47 0.82
从上述结果可以看出：本发明淡水真菌Helicosporium sp.的代谢产物对对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、志贺菌和沙门氏菌有良好的抑菌效果。
（2）病原菌的活化：将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌（Shigella Castellani）或沙门氏菌（Salmonella sp.）接种于LB琼脂培养基上，37℃培养24h后，挑取单个菌落，接种于含5mL的LB液体培养基的15mL离心管中，置于37℃、160r/min恒温培养过夜；
（3）病原细菌悬液的标准曲线：取活化的病原菌液4mL置于10000r/min，4℃下离心
1min，取沉淀加生理盐水混匀，再以4℃、10000 r/min来离心1min，吸弃上清液，重复两次后用5mL生理盐水重悬得到菌悬液，漩涡震荡混合均匀，用生理盐水进行梯度稀释，在波长600 nm下测定稀释后的菌液吸光度，取吸光度值在0.2–0.6之间的7个不同浓度的菌液，每份菌液都取100μL加到LB固体培养基上，涂布均匀，在37℃恒温箱中倒置培养24h，对菌落数在
30–300之间的平板进行菌落计数；根据菌落数及吸光度值，绘制标准曲线，得到计算公式：
革兰氏阳性菌（金葡为例）菌落：y = 613.68x-10.921；
革兰氏阴性菌（大肠为例）菌落：y = 142.4x+110.1；
（4）细菌悬液的制备：根据病原细菌悬液的标准曲线，将病原细菌的浓度用生理盐水调整为0.8–2×105 cfu/mL；
（5）发酵提取物抑菌试验：称取10 mg干燥的实施例1淡水真菌代谢产物，加入1mL DMSO进行溶解，配制成10mg/mL的浓度的样品；在LB琼脂的平板上，加入80μL的病原细菌菌液，涂匀；每个平板放置3个牛津杯，并在每个牛津杯中加入10μL的样品；水平放置，37℃培养18–
24h，观察，抑菌圈直径用游标卡尺来进行测量，每种致病菌测量三组数据取平均值，实验结果见图1和表1；
表1 代谢产物对六种食源性病原细菌抑菌圈直径（单位：mm）
菌种 空白 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 志贺菌 沙门氏菌 李斯特菌 枯草芽孢杆菌平均值 8 13.03 9.86 13.02 12.79 10.08 12.04
平均偏差 0.31 0.59 0.43 0.60 0.47 0.82
从上述结果可以看出：本发明淡水真菌Helicosporium sp.的代谢产物对对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、志贺菌和沙门氏菌有良好的抑菌效果。
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